JPH04218383A - プラスミド、形質転換された動物細胞及び異種蛋白質の製造方法 - Google Patents
プラスミド、形質転換された動物細胞及び異種蛋白質の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、（１） 動物細胞での
発現を制御できるプロモーター及びウロキナーゼ（ＵＫ
）プロモーターを上流部に付加させたジヒドロ葉酸還元
酵素（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡを組み込んでなる
プラスミド、（２） 動物細胞での発現を制御できるプ
ロモーターを上流部に付加させた異種蛋白をコードする
ＤＮＡ及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを上流部
に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコー
ドするＤＮＡを組み込んでなるプラスミド、（３） 上
記（２） のプラスミドを用いて形質転換させた動物細
胞、（４） 動物細胞での発現を制御できるプロモータ
ーを上流部に付加させた異種蛋白をコードするＤＮＡを
担持させたプラスミド及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモ
ーターを上流部に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ
ＨＦＲ）をコードするＤＮＡを担持させたプラスミドを
同時に用いて形質転換させた動物細胞、（５） 上記（
３） または（４） の動物細胞を培養して異種蛋白質
を発現させることによる異種蛋白質の製造方法に関する
。 【０００２】 【従来の技術】遺伝子組換え技術によって目的の生理活
性物質を生産する宿主としては、当初大腸菌を中心に研
究が進められ、さらに、酵母、枯草菌等の微生物が、そ
の培養の簡便さ及び宿主−ベクター系の研究の進展等か
ら繁用されていた［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．， Ｉｔ
ａｋｕｒａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７６， １
０６（１９７９）およびＮａｇａｔａ， Ｓ．， Ｔａ
ｉｒａ， Ｓ．Ｈ． ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ，
Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ．２８４， １３１６（１９８０
） 参照］ 。 【０００３】しかし、近年高分子糖蛋白質を天然型に近
い形で、しかも可溶な型で遺伝子組換え技術によって物
質生産を行うための宿主として、動物細胞を用いる発現
系に焦点が移っている。 【０００４】例えば、動物細胞による発現の例として、
特開昭６１−１７７９８７ 号公報等に記載の方法が知
られている。 【０００５】さらに、動物細胞での発現を高めるために
、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡにより増幅を行う手法が
考え出された。また、動物細胞による発現ベクターは、
できるだけ高率にクローン化した遺伝子を発現させるた
めに強いプロモーターの選択が必要である。これについ
ては、当初はＤＨＦＲをコードするＤＮＡをシミアンウ
ィルス（ＳＶ４０）プロモーターを用いて制御する方法
がとられていた（特開昭６３−１０５９７５ 号公報）
が、最近では、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡをＤＨＦ
Ｒプロモーターを用いて制御する方法が提案されている
（特開昭６３−２７３４８１ 号公報）。 【０００６】よって、外来の遺伝子（ここでは蛋白質）
を組み込んだ発現ベクターは、その発現の増幅の度合い
を高めるために高率の転写を起こさせるプロモーターを
有する発現ベクターであることが、組換えタンパク質の
量産に望まれている。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
事情に鑑み、各種研究を重ねた結果、ＤＨＦＲをコード
するＤＮＡによる増幅の過程において、ＤＨＦＲをコー
ドするＤＮＡを制御するプロモーターとしてＵＫプロモ
ーターを用いることにより、増幅の度合いが従来知られ
た水準に比べ、はるかに優れていることを見出し、本発
明を完成した。 【０００８】すなわち、本発明は、（１） 動物細胞で
の発現を制御できるプロモーター及びウロキナーゼ（Ｕ
Ｋ）プロモーターを付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（
ＤＨＦＲ）遺伝子を組み込んでなるプラスミド、（２）
動物細胞での発現を制御できるプロモーターを上流部
に付加させた異種蛋白遺伝子及びウロキナーゼ（ＵＫ）
プロモーターを付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨ
ＦＲ）遺伝子を組み込んでなるプラスミド、（３） 上
記（２） のプラスミドを用いて形質転換させた動物細
胞、（４） 動物細胞での発現を制御できるプロモータ
ーを上流部に付加させた異種蛋白をコードするＤＮＡを
担持させたプラスミド及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモ
ーターを上流部に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ
ＨＦＲ）をコードするＤＮＡを担持させたプラスミドを
同時に用いて形質転換させた動物細胞、（５） 上記（
３） または（４） の動物細胞を培養して異種蛋白質
を発現させることによる異種蛋白質の製造方法に関する
。 【０００９】以下、これを詳述する。 〔Ｉ〕プラスミド■ 本発明においてプラスミド■は、 （ｉ） 動物細胞での発現を制御できるプロモーター
、及び （ｉｉ） ウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを、上流
部に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ） を
コードするＤＮＡを組み込んでなる。 【００１０】当該プラスミド■は、異種蛋白質をコード
するＤＮＡを動物細胞での発現を制御できるプロモータ
ーの下流に組み込み、それを動物細胞において発現させ
るためのユニットとして利用できるものである。 【００１１】動物細胞での発現を制御できるプロモータ
ーは、ポリオーマ、アデノウイルス．２、あるいは最も
多用されているシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来
である。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーター
は特に有用である。というのは、これらは、ＳＶ４０の
複製起点を含む断片として容易にウイルスから得られる
からである〔Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ
， ２７３， １１３（１９７８）］ 。ウイルスの
ＨｉｎｄＩＩＩ 部位から複製起点のＢｇｌＩ部位まで
の約２５０ ｂｐを含む断片も使用できる。更に目的と
する遺伝子に関連したプロモーターや制御配列（エンハ
ンサー） も宿主とコンバーチブルならば使用できる。 【００１２】動物細胞発現ベクターに用いるプロモータ
ー・エンハンサーとしては、ＳＶ４０初期遺伝子又は後
期遺伝子のプロモーター・エンハンサーやアデノウイル
スメジャーレート・プロモーター領域、グロブリンエン
ハンサー・プロモーター領域、ＲＮＡウイルスのＬＴＲ
、メタロチオネインプロモーター領域、β−アクチンプ
ロモーターなどが使用できる。複製起点は、ＳＶ４０や
他のウイルス（ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等
） 由来のものをベクターに組み込んでもよいし、宿主
細胞染色体の複製機構を用いてもよい。ベクターが宿主
細胞の染色体に組み込まれるならば後者で十分である。 【００１３】ＵＫプロモーターを上流部に付加させたＤ
ＨＦＲをコードするＤＮＡは、ＵＫプロモーターの支配
下にＤＨＦＲをコードするＤＮＡが働く様にしたもので
ある。当該ＵＫプロモーター及びＤＨＦＲコードするＤ
ＮＡは、共に公知のものであり、ＵＫプロモーターはＮ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３， ２７５９−
２７７１（１９８５）等に、ＤＨＦＲをコードするＤＮ
Ａは特開昭５９−１９２０８９ 、同６３−１０５６７
５ 等に開示されている。 【００１４】また、当該プラスミド■は、動物細胞での
発現を制御できるプロモーターの上流側に複製起点、下
流側に、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、
ポリＡ付加部位あるいは転写終結配列を有していてもよ
い。 【００１５】〔ＩＩ〕 プラスミド■本発明において
、プラスミド■は、 （ｉ） 動物細胞での発現を制御できるプロモーター
を上流部に付加させた異種蛋白をコードするＤＮＡ、及
び（ｉｉ） ウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを上流
部に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコ
ードするＤＮＡを組み込んでなる。 【００１６】当該プラスミド■においては、動物細胞で
の発現を制御できるプロモーターを異種蛋白をコードす
るＤＮＡの上流部に付加させ、動物細胞での発現を制御
できるプロモーターの支配下に異種蛋白をコードするＤ
ＮＡが働くようにしたものである。 【００１７】異種蛋白をコードするＤＮＡとしては、プ
ロＵＫ（特開昭６０−１８０５９１ 号公報） 、修飾
プロＵＫ（特開昭６３−１４６７８９ 号公報， 特願
平１−１２６４３３号公報， 同１−１２６４３４号公
報） 、ｔ−ＰＡ（特開昭５９−１８３６９３ 号公報
， 同５９−４２３２１号公報） 、ＨＢｓＡｇ（特開
昭５９−３６６９８号公報） 、ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ
（特開昭５６−６３９９５ 号公報） 、ＩＦＮ−γ
（ 特開昭６１− １０８３９７号公報） 、ＣＳＦ（
特開昭６１−１９９７８７ 号公報） 等が挙げられる
。また、これらの異種蛋白の活性断片あるいは誘導体で
あってよい。 【００１８】なお、当該プラスミド■において、動物細
胞での発現を制御できるプロモーターと異種蛋白をコー
ドするＤＮＡからなるユニット、及びＵＫプロモーター
とＤＨＦＲをコードするＤＮＡからなるユニットは、順
方向に配置されていてもよく、逆方向に配置されていて
もよい。また、当該プラスミド■は、動物細胞での発現
を制御できるプロモーターを上流側に付加した異種蛋白
をコードするＤＮＡユニットの上流側に複製起点、下流
側に、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポ
リＡ付加部位あるいは転写終結配列を有していてもよい
。 【００１９】［ＩＩＩ］ プラスミド■及びプラスミ
ド■本発明において、プラスミド■は、動物細胞での発
現を制御できるプロモーターを上流部に付加させた異種
蛋白をコードするＤＮＡを担持させたプラスミドであっ
て、プラスミド■は、ウロキナーゼ（ＵＫ）プロモータ
ーを上流部に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦ
Ｒ）をコードするＤＮＡを担持させたプラスミドである
。 【００２０】当該プラスミド■及び■はそれぞれ前項〔
ＩＩ〕−（ｉ） 及び（ｉｉ）記載と同一のＤＮＡを担
持させたプラスミドであり、これら二つのプラスミドを
同時に用いて動物細胞を形質転換させ、異種蛋白質を動
物細胞において発現させるためのユニットとして用いら
れる。 【００２１】〔ＩＶ〕 形質転換体 形質転換体は〔ＩＩ〕のプラスミド■または［ＩＩＩ］
のプラスミド■とプラスミド■とを同時に用いて動物
細胞を形質転換させたものである。 【００２２】本発明で使用される動物細胞としては、細
胞株として有用な例として、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ細胞、
Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ （ＣＨ
Ｏ） ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ 、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯ
Ｓ−７ 、ＭＤＣＫ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、Ｃ１２７、
ＨＫＧ 、Ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ ｌｉ
ｎｅなどが挙げられる。具体的にはＣＨＯ−Ｋ１（チャ
イニーズハムスター卵巣細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）
、ＢＨＫ（新生子ハムスター腎細胞：ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ１０） 、ＣＯＳ−７（ＣＶ−１ Ｏｒｉｇｉｎ，
ＳＶ−４０細胞：ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１） 、Ｖｅ
ｒｏ（ アフリカミドリザル腎細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ
−８１）等がある。また、このような細胞としては特に
ＤＨＦＲ遺伝子欠損細胞であることが好ましい。 【００２３】動物細胞の形質転換は公知の方法、例えば
、リン酸カルシウム沈澱法、プロトプラストポリエチレ
ングリコール融合法、エレクトロポレーション法などに
より行うことができる。 【００２４】また、ＭＴＸ（メトトレキセート）による
増幅のかけ方としては、形質転換体を１０ｎＭ〜４ｎＭ
のＭＴＸを含む培地（ＭＴＸは段階的に上げていっても
よく、最初から高濃度でシングルステップで行ってもよ
い）中で耐性株を選択すればよい。 【００２５】培地としては、１ 〜１０％ＦＣＳを含ん
だＭＥＭ−ａｌｐｈａ 、或いはダルベッコ変法−ＭＥ
Ｍ（Ｄ−ＭＥＭ）等が挙げられる。培養条件は１０〜３
７℃，１〜２００時間程度である。 【００２６】〔Ｖ〕異種蛋白質の製造方法〔ＩＶ〕の形
質転換体を培養し、自体既知の手段にて異種蛋白質を発
現させる。 【００２７】 【発明の効果】本発明においては、ＤＨＦＲをコードす
るＤＮＡを用いて異種蛋白質の発現を増幅する方法にお
いて、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡをＵＫプロモーター
の支配下に配列することにより、増幅の度合が従来の水
準よりはるかに優れていることが判明した。 【００２８】従って、本発明は、遺伝子工学分野におけ
る動物細胞を用いての異種蛋白質大量生産に極めて有用
な方法と考えられる。 【００２９】 【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例を
挙げるが、本発明は、これらによって何ら限定されるも
のではない。 【００３０】実施例１ 〔Ｉ〕ｐＨＲ２４の構築 〔ＥＧＦドメインにアスパラギン結合糖鎖を持つヒトプ
ロウロキナーゼ（ＰＵＫ）をコードするＤＮＡ配列を組
み込んでなるプラスミドの構築〕ＰＵＫのＥＧＦドメイ
ン内に新たな糖鎖結合部位を２４位に持つ変異ヒトＰＵ
Ｋ（天然型ヒトＰＵＫのＴｙｒ２４をＡｓｎ２４に置換
）の発現ベクターを作製した。これらの発現ベクターの
作製の詳細を以下に述べる。なお、本実施例において、
合成ＤＮＡは変成ポリアクリルアミドゲルで精製した。 制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡポリメレース、Ｍ１３シークエ
ンスキット、ライゲーションキットなどの酵素・キット
類、大腸菌ＨＢ１０１及びＪＭ１０９コンピテントセル
は宝酒造製のものを用いた。子牛小腸アルカリフォスフ
ァテースはベーリンガー マンハイム社製を用いた。 また組換ＤＮＡテクニックは、■Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ’ Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載
の方法に準じた。 【００３１】（ｉ）オリゴヌクレオチドの合成自動ＤＮ
Ａ合成機（３８１Ａ、アプライドバイオシステム社製）
を用いて、一本鎖ＤＮＡ２個（ＤＮＡ−１、ＤＮＡ−２
）を作製した。各々の塩基配列を以下に示す。 【００３２】Ｔｙｒ２４をＡｓｎ２４に置換（Ａｓｎ２
４に糖鎖付加） ５’−ＣＧＡＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＴＧＧ
ＡＧＧＴＡＣＣＴＧＴ３’− ＴＴＧＡＣＡＣＴ
ＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡ
ＡｓｎＣｙｓＡｓｐＣｙｓＬｅｕＡｓｎ
ＧｌｙＧｌｙＴｈｒＣｙｓ ｋｐｎ
Ｉ ＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＡ
ＴＴＣＡＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＡＧＧＴＴＧＴＴＣＴＴ
ＧＡＡＧＡＧＧＴＴＡＴＡＡＧＴＧＡＣＣＡＣＧＶａｌ
ＳｅｒＡｓｎＬｙｓＡｓｎＰｈｅＳｅｒＡｓｎＩｌｅＨ
ｉｓＴｒｐＣｙｓＳｓｐＩ ＡＡＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＧＧＡＧＧＧＣ
ＡＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＴＴＴＣＴＴ
ＴＡＡＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡｓｎ
ＣｙｓＰｒｏＬｙｓＬｙｓＰｈｅＧｌｙＧｌｙＧｌｎＨ
ｉｓＣｙｓＧｌｕＡＴ −３’ ＤＮＡ−１
ＴＡＧＣ−５’ Ｄ
ＮＡ−２ Ｉｌｅ 【００３３】ＤＮＡ−１、ＤＮＡ−２はＰＵＫの２４位
チロシン残基がアスパラギン残基に置換されたＤＮＡ配
列を含んでいる。また、ＧＧＡＡＣＡをＧＧＴＡＣＣに
変換してＫｐｎＩ認識部位を、ＡＡＣＡＴＴをＡＡＴＡ
ＴＴに変換してＳｓｐＩ認識部位を導入した。 【００３４】合成したオリゴヌクレオチドは、保護基の
脱離処理後、全合成量の６４／１００を１２％アクリル
アミド尿素ゲル電気泳動で精製した結果、ＤＮＡ−１，
１９．０μｇ；ＤＮＡ−２，２１．１μｇの一本鎖ＤＮ
Ａとして得た。 【００３５】（ｉｉ）プラスミドの構築図１にｐＴＴ０
３及びｐＨＲ２４の構築の概略を示した。 【００３６】ｐＴＴ０３の構築
ＳＶ４０由来のエンハンサー・プロモーター領域とプラ
スミノーゲンプロアクチベーター（ＰＰＡ）のシグナル
配列並びにＰＵＫのＮ末端４アミノ酸をコードする遺伝
子を含んだプラスミドｐＴＴ０３を構築した。ＳＶ４０
のエンハンサー・プロモーターのＢａｍＨＩ 認識部位
の５’領域を得るために、ｐＵＨ７（特開昭６３−１４
６７８９ 号公報）ＨｉｎｄＩＩＩ とＢａｍＨＩ で
消化し、４２０ｂｐ の断片をアガロースゲル電気泳動
により単離・精製した。一方、ｐＵＨ３（特開昭６３−
１４６７８９号公報）もＨｉｎｄＩＩＩ とＢａｍＨＩ
で消化し、直線状になった３．５ｋｂ のＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動により単離・精製し、これを
先の４２０ ｂｐの断片とＤＮＡリガーゼで連結した。 ＨｉｎｄＩＩＩ とＢａｍＨＩ で消化して、３．５ｋ
ｂ および４２０ｂｐ の断片を与えたプラスミドをｐ
ＴＴ０３とした。１２個の形質転換体について確認をお
こなったが、全てｐＴＴ０３の形質転換体であった（図
２参照） 。 【００３７】ｐＨＲ２３の構築 ＳＶ４０のエンハンサー・プロモーターとＰＵＫのシグ
ナル配列並びにＰＵＫの２４位チロシン残基がアスパラ
ギン残基に置換されたｐＨＲ２３を構築した。ｐＴＴ０
３をＣｌａＩで消化し、直線状になった３．９ ｋｂの
断片をアガロースゲル電気泳動により単離・精製した。 これを子牛小腸アルカリフォスファターゼで末端の脱リ
ン酸化を行った。一方、前記（ｉ）で合成したオリゴヌ
クレオチドＤＮＡ−１とＤＮＡ−２をカイネーション後
、アニーリングし、脱リン酸化した３．９ ｋｂの断片
とライゲーションした。ＨｉｎｄＩＩＩ とＣｌａＩで
消化して、８００ ｂｐのＤＮＡ断片を与えたプラスミ
ドをｐＨＲ２３とした。１２個の形質転換体のスクリー
ニングを行った結果、１２個のうち８個が目的のプラス
ミドを持った形質転換体であった。なお、プラスミドの
合成ＤＮＡを使用した部分の確認は、その塩基配列を決
定することによっても行った。 【００３８】ｐＨＲ２４の構築 ｐＨＲ２３はＰＵＫの４４位のイソロイシン残基までコ
ードするＤＮＡ配列を持っているので、これに４５位ア
スパラギン酸よりＣ末端側をコードするＤＮＡを連結し
、ｐＨＲ２４を構築した。 【００３９】ｐＵＨ７をＣｌａＩで消化し、４．２ ｋ
ｂの断片をアガロースゲル電気泳動により単離・精製し
た。これを子牛小腸アルカリフォスファターゼで末端の
脱リン酸化を行い、ｐＨＲ２３のＨｉｎｄＩＩＩ −
ＣｌａＩ 消化で得た８００ ｂｐのＤＮＡ断片とＣｌ
ａＩ認識部位を使ってライゲーションした。次にＴ４Ｄ
ＮＡポリメレースでＨｉｎｄＩＩＩ 認識部位並びにも
う一方のＣｌａＩ認識部位を平滑末端とした後、再びラ
イゲーションした。２４株について一次スクリーニング
は環状プラスミドの大きさを指標にした。即ち、目的の
プラスミドよりも１００ ｂｐ小さいｐＵＨ７の環状プ
ラスミドとの比較を行った。その結果、２４個のうち５
個が目的の大きさのプラスミドであった。この構築手順
では、挿入するＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ断片が逆向き
に連結される可能性もあるので、ＫｐｎＩ消化で９００
ｂｐのＤＮＡ断片を与えるプラスミドのスクリーニン
グを次に行った。その結果、５個のうち１個が目的のプ
ラスミドであることがわかった。 【００４０】〔ＩＩ〕ｐＴＴ０６の構築〔動物細胞での
発現を制御できるプロモーター（ＳＶ４０）及びウロキ
ナーゼ（ＵＫ）プロモーターを上流部に付加させたジヒ
ドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡを組
み込んでなるプラスミドの構築〕【００４１】（ｉ）
ｐＵＫＰ−１の構築：ウロキナーゼ（ＵＫ）プロモー
ターをコードするＤＮＡの調製【００４２】■ プロ
ーブの作製 ヒトウロキナーゼｃＤＮＡの一部を含むプラスミドｐＵ
Ｋ４（特開昭６１−１７７９８７ 号公報） をＰｓｔ
Ｉで消化して、１％アガロースゲルで電気泳動後、約４
００ ｂｐの断片をエレクトロエリューションにより回
収した。このＤＮＡ断片０．４ μｇをマルチプライム
により〔α− ３２Ｐ］ｄＣＴＰ（アマーシャム， Ｐ
Ｂ１０２０５）でラベルした。 ＤＮＡ断片 ０．４ μｇ （８ μｌ）
│←１００
℃， ３分間加熱後、氷水上で急冷
│←マルチプライムｓｏｌｎ １を１５μ
ｌ 添加 │← ［α
− ３２Ｐ］ｄＣＴＰ ２５μｌ （２５０μＣｉ）
添加 │←マルチプライムｓｏ
ｌｎ ２を２ μｌ 添加
│←室温で１．５ 時間インキュベート
│←カラムバッ
ファー（０．１％ ＳＤＳ−１ｍＭ ＥＤＴＡ−１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
│ ｐＨ ７．４） で平衡化したニック
カラムに反応液をアプライ
↓←１００ μｌ ずつ分画した。 目的分画を集めてＣｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏｕｎｔを調べ
た結果、９．６９×１０７ｃｐｍであった。ラベルの収
率は４１％ラベルの比放射活性は２．４ ×１０８ ｃ
ｐｍ／μｇと計算された。 【００４３】■ ＨＫＧ細胞ＤＮＡのサザンハイブリ
ダイゼーション Ｒｉｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．［（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．， １３， ２７５９−２７７１ （１９８
５）］ の報告によれば、ヒトウロキナーゼプロモータ
ー領域はヒト染色体ＤＮＡの５．８ ｋｂ ＥｃｏＲＩ
断片及び１２ ｋｂ のＢａｍＨＩ 断片として得られ
る。ＨＫＧ細胞高分子ＤＮＡをＥｃｏＲＩ 及びＢａｍ
ＨＩ で消化し各１０μｇ を０．８％アガロースゲル
で電気泳動後、■で調製したプローブを用いてサザンハ
イブリダイゼーションによりこれを確認した。その結果
、それぞれのサイズに相当する位置にシグナルが検出さ
れた。 【００４４】■ ５．８ ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片の調
製ＨＫＧ細胞高分子ＤＮＡ ２００μｇ を１０００ユ
ニットのＥｃｏＲＩ で３７℃、一夜消化した。０．８
％アガロースゲル（宝酒造、ＨＥ−１２ 泳動装置）で
電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、マーカーと
して泳動した。λ−ＤＮＡ ＨｉｎｄＩＩＩ消化物から
求めた５．８ ｋｂの位置を中心に２ｍｍ幅でゲルを切
り出し（ゲル２）、更にその上（ゲル１）下（ゲル３）
各３ｍｍ幅についてもゲルを切り出し、エレクトロエリ
ューションによりＤＮＡ断片を抽出した。抽出したＤＮ
Ａの一部を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、サザ
ンハイブリダイゼーションにより目的のＤＮＡ断片が含
まれているかどうか確認した。ゲル２から抽出したＤＮ
Ａ断片中に目的のウロキナーゼプロモーター領域が存在
すると推定された。 【００４５】■ ＤＮＡライブラリーの作製とスクリ
ーニング 前項で抽出したＤＮＡについてファージベクターλｇｔ
１０を用いてＤＮＡライブラリーを作製した。合計６．
５×１０５ 個の組み換えファージをプラークハイブリ
ダイゼーションにより一次スクリーニングした。一次ス
クリーニングで２８個のポジティブクローンが得られた
。これを更にプラークハイブリダイゼーションによる二
次スクリーニングしたところ、５個のポジティブクロー
ンに絞られた。ポジティブクローンの組み換えファージ
より簡易抽出法でＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩ 消化後
、１％アガロースゲルで電気泳動し、サザンハイブリダ
イゼーションを行った。その結果、２種類の組み換えフ
ァージがポジティブと判定された。クローン１，４，５
は同じクローン由来であり１種類とみなした。クローン
１５はこれらとは別のクローン由来である。 【００４６】■ ５．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ 断片のサ
ブクローニングサザンハイブリダイゼーションでポジテ
ィブと判定されたクローンよりファージＤＮＡを簡易抽
出法にて調製し、 ＥｃｏＲＩ消化した。これをフェノ
ールクロロホルム抽出し、水相を更にクロロホルム抽出
後エタノール沈澱した。プラスミドｐＵＣ９（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ 社）を ＥｃｏＲＩ消化後アルカリフォス
ファターゼ処理し、その一部（１μｇ）と上記ファージ
ＤＮＡの ＥｃｏＲＩ消化物をライゲーションし、 Ｅ
．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ を形質転換させた。形質転換
菌のいくつかについて簡易抽出法にてプラスミドＤＮＡ
を抽出し、 ＥｃｏＲＩ消化後１％アガロースゲルで電
気泳動した。その結果、いくつかのサブクローンが５．
８ ｋｂに相当するＤＮＡ断片を有していた。これらの
クローン１と４を更に各種制限酵素で消化後１％アガロ
ースゲルで電気泳動した。クローン１と４は切断様式は
異なったものの、いくつかの共通する断片も見られたの
で５．８ ｋｂ断片が逆方向に挿入されたものと推定さ
れた。それぞれのプラスミドとｐＵＫＰ１（図３参照）
及びｐＵＫＰ２と命名した 【００４７】■ ｐＵＫＰ１の制限酵素処理Ｒｉｃｃ
ｉｏ等（前述）が報告したヒトウロキナーゼ遺伝子の塩
基配列から推定した制限酵素切断部位地図を基に、この
図から推定される酵素断片が得られるかどうかを確認し
た。ｐＵＫＰ１を有するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を４
０μｇ／ｍｌ アンピシリン含有スパーブロス１００
ｍｌで３７℃、一夜培養後、アルカリ−ＳＤＳ法にてプ
ラスミドＤＮＡを調製した。このＤＮＡについて各種制
限酵素処理を行った。また、表１にはプラスミドについ
て推定される制限酵素断片のサイズとその有無について
示した。表１に示したように推定される断片はすべて検
出され、目的のヒトウロキナーゼプロモーター部位をコ
ードするＤＮＡ断片がクローニングされたことが確認さ
れた。 【００４８】 【表１】 【００４９】■ ｐＵＫＰ１の一部塩基配列の確認前
項で調製したプラスミドＤＮＡについてダイデオキシ法
にて塩基配列の一部を調べた結果、Ｒｉｃｃｉｏ等の報
告（前述）と一致した。 【００５０】（ｉｉ） ｐＴＴ０６の構築〔ＵＫプロモ
ーター，ｄｈｆｒ ｃＤＮＡ， ＳＶ４０ポリＡを含む
プラスミドの構築〕図４にプラスミド構築の概要を示し
た。ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（特開昭６３−１０５６７５
号公報）をＰｖｕＩＩ， ＰｓｔＩ で処理して得たＳ
Ｖ４０エンハンサー・プロモーター、ｄｈｆｒ ｃＤＮ
Ａ， ＳＶ４０ ｌａｔｅ ポリＡ付加シグナルを含む
２．５ ＫｂのＤＮＡ断片をさらにＨｉｎｄＩＩＩ で
切断しＳＶ４０エンハンサー・プロモーターを除いた２
．１ ＫｂのＤＮＡ断片を得た。このＨｉｎｄＩＩＩ−
ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平
滑末端した後、ｐＵＣ１９（宝酒造）のＳｍａＩ切断部
位にクローニングした。その結果、ｄｈｆｒ ｃＤＮＡ
の５’側（タンパクのＮ末側）がｐＵＣ１９のポリリン
カーのＨｉｎｄＩＩＩ の方を向いたｐＴＴ０４が得ら
れた。プラスミドの確認はＢａｍＨＩ 消化によりｐＵ
Ｃ１９のポリリンカー中のＢａｍＨＩ とＳＶ４０ポリ
Ａ付加シグナルの後ろにあるＢａｍＨＩ で切り出され
るＤＮＡ断片の大きさにより行った。ｐＴＴ０４からは
１．６ ｋｂのＤＮＡ 断片が得られた。次に、ｐＵＫ
Ｐ−１をＨｐａＩとＳｍａＩで切断し、ウロキナーゼ遺
伝子転写開始点より下流約３０ ｂｐ のＳｍａＩ認識
部位と転写開始点より上流約８００ ｂｐのＨｐａＩ認
識部位より切り出される約８００ ｂｐのＤＮＡ 断片
を回収した。このＵＫプロモーター部位を含むＤＮＡ断
片をｐＴＴ０４のｄｈｆｒ ｃＤＮＡの上流に挿入した
。すなわちｐＴＴ０４をＸｂａＩで消化後、ＢＡＰ処理
、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ＵＫプロ
モーターのＨｐａＩ−ＳｍａＩ断片とライゲーションを
行った。トランスフォーメーション後、得られたコロニ
ーよりｄｈｆｒ遺伝子とＵＫプロモーターが同じ転写方
向を向いたクローンを選択した。ｐＴＴ０４からはＵＫ
プロモーターＤＮＡ断片の５’近傍のＥｃｏＲＶ とｐ
ＵＣ１９のＳａｌＩでの切断で ２８０ ｂｐのＤＮＡ
断片を与えるプラスミドを選び、ｐＴＴ０６とした。プ
ラスミドはさらに、 ＥｃｏＲＶ＋ＳａｃＩ， Ｅｃｏ
ＲＶ ＋ＢａｍＨＩ の切断によりその構造を確認した
。ｐＴＴ０６の ＥｃｏＲＶ， ＳａｃＩ消化では、０
．９， １．８， ２，９ ｋｂの断片が、ＥｃｏＲＶ
，ＢａｍＨＩ消化では０．６， １．６， ３．５ ｋ
ｂの断片が得られた。これらの断片のサイズは、目的と
するプラスミドの制限酵素地図と一致した。 【００５１】［ＩＩＩ］ ｐＴＴ０８及びｐＴＴ０９
の調製〔ＵＫプロモーターに支配されるＤＨＦＲ転写ユ
ニットとＳＶ４０プロモーターに支配されるＡｓｎ２４
−ＰＰＡ 転写ユニットを含むプラスミドの構築〕図５
にプラスミド構築の概要を示した。ＳａｌＩ、 Ｅｃｏ
ＲＩによりｐＴＴ０６を消化することによりＵＫプロモ
ーター、ＤＨＦＲｃＤＮＡ、ＳＶ４０ｌａｔｅポリＡの
付加シグナルを含む２．９ ｋｂの断片を得た。一方、
〔Ｉ〕で調製したｐＨＲ２４をＳａｌＩ消化することに
より直鎖化した後、ＢＡＰにより５’脱リン酸を行った
。これら２本のＤＮＡ断片のライゲーションを行い、ｐ
ＨＲ２４の片方のＳａｌＩ末端とＵＫ−ＤＨＦＲ ＤＮ
Ａ断片の ＳａｌＩ 末端とをつないだ。続いてＴ４
ＤＮＡポリメラーゼを作用させｐＨＲ２４の残ったＳａ
ｌＩ末端とＵＫ−ＤＨＦＲ ＤＮＡ断片の ＥｃｏＲＩ
末端を平滑化し、再びライゲーションを行った。このラ
イゲーション液を用い、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を
トランスフォームし、トランスフォーマントの中からＤ
ＨＦＲ転写ユニットとｍ−ＰＰＡ 転写ユニットが逆方
向に配置されたｐＴＴ０８、同方向に配置されたｐＴＴ
０９を得た。それぞれのプラスミドの確認はＣｌａＩと
ＳａｌＩの二重消化とＢａｍＨＩ の消化により行った
。ｐＴＴ０８は、ＣｌａＩとＳａｌＩの消化で７．２
ｋｂと０．８ ｋｂの断片を、ＢａｍＨＩ の消化で３
．１ 、１．６ 、１．４ 、１．３ 及び０．３ ｋ
ｂの断片を与えた。一方ｐＴＴ０９は、ＣｌａＩとＳａ
ｌＩの消化で４．２ ｋｂと３．８ ｋｂの断片を、Ｂ
ａｍＨＩ の消化で３．４ 、１．６ 、１．４ 、１
．０及び０．３ ｋｂの断片を与えた。 【００５２】〔ＩＶ〕動物細胞への導入（ｉ） 材料
と方法 ■ プラスミドＤＮＡ（図６参照） ｐＴＴ０８：ＵＫプロモーターに支配されるＤＨＦＲ転
写ユニットとＳＶ４０プロモーターに支配さるＡｓｎ２
４−ＰＰＡ 転写ユニットが逆方向に配置されたプラス
ミド。 ｐＴＴ０９：ＵＫプロモーターに支配されるＤＨＦＲ転
写ユニットの下流にＳＶ４０プロモーターに支配される
Ａｓｎ２４−ＰＰＡ 転写ユニットが順方向に配置され
たプラスミド。 【００５３】■ 細胞 ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来ＤＨＦＲ欠損株 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ） ７
７， ４２１６ （１９８０） に記載の方法で調製、
増殖させた。 【００５４】■ メトトレキセート（ＭＴＸ）Ｓｉｇ
ｍａ 社製（＋）Ａｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎを０．１４
Ｍ ＮａＣｌ， ０．０２ Ｍ ＨＥＰＥＳ （ナカ
ライテスク）に溶解し、２ｍＭストック液を調製した。 これを培地に、目的の濃度になるように添加し使用した
。 【００５５】■ 培地と血清 ＭＥＭ−α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオ
シド入り）（Ｇｉｂｃｏ） ＭＥＭ−α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオ
シド無し）（Ｇｉｂｃｏ） それぞれ、ＭＥＭ−α（ｗ）、ＭＥＭ−α（ｗ／ｏ）と
略す。血清は牛胎児血清（ＦＣＳ）（三菱化成 ＭＨ０
１）を非働化し使用した。 【００５６】■ ＤＮＡ導入とトランスフェクタント
の選択 ＭＥＭ−α（ｗ），１０％ＦＣＳ で継代しているＤＨ
ＦＲ欠損ＣＨＯ 細胞をトリプシン（０．２５％， ト
リプシン、０．０２％ ＥＤＴＡ） 処理により、ディ
ッシュよりはがし１０７ ｃｅｌｌ／ｍｌ となるよう
Ｈａｎｋｓ液に懸濁した。この懸濁液０．５ ｍｌ，
５×１０６ 個の細胞に５ μｇのプラスミドＤＮＡを
エレクトロポレーション法により導入した。この細胞を
１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ となるように５枚の１０
ｃｍ ｄｉｓｈ に播いた。２日間、ＭＥＭ−α（ｗ）
，１０％ＦＣＳ で培養後、選択培地であるＭＥＭ−α
（ｗ／ｏ），１０％ＦＣＳ に交換した。２〜３日毎に
培地交換を行い、１０日間程培養するとコロニーの形成
が見られたので、各コロニーを９６ ｗｅｌｌｓ Ｐｌ
ａｔｅに移し、さらに培養を続けた。９６ ｗｅｌｌｓ
Ｐｌａｔｅ中で細胞がほぼＦｕｌｌ Ｓｈｅｅｔを形
成したところで各種培養上清中のプラスミノーゲン・ア
クチベーター（ＰＡ）活性を測定した。最も高い活性を
与えた細胞をスケールアップし、さらに再クローニング
を行った後、ＭＴＸによるＤＮＡ増幅に供した。 【００５７】■ ＭＴＸによる導入遺伝子の増幅■で
得られたＡｓｎ２４−ＰＰＡ 産生細胞をＭＥＭ−α（
ｗ／０）， １０％ＦＣＳ， １０ｎＭ ＭＴＸを培地
として５×１０４ ｃｅｌｌ／ｍｌ の濃度で６ ｃｍ
ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ， ３８０２） に２ ｍｌ
植え込んだ。培養３〜４日でかなりの細胞が死滅するが
、３日毎に培地交換を続けていると細胞の成長が見られ
た。２〜４週間で充分な細胞数になるので、次の段階の
ＭＴＸ 濃度の培地に継代した。このように １０ｎＭ
のＭＴＸ濃度からスタートして順次２〜４倍ずつＭＴ
Ｘ濃度を上げていった。各濃度のＭＴＸ耐性細胞はそれ
ぞれ６ ｃｍｄｉｓｈ 又は、１０ｃｍ ｄｉｓｈ （
Ｆａｌｃｏｎ，３８０３） で培養し、上清中のＰＡ活
性を測定した。 【００５８】■ 培養上清中のＰＡ活性測定フィブリ
ン平板法及びペプチドＭＣＡ法により、各細胞の培養上
清中のＰＡ活性を測定した。 【００５９】サンプル中の一本鎖プロ酵素含有量は次の
ようにして求めた。即ち、プラスミン処理したサンプル
とプラスミン非処理のサンプルの活性をペプチド−ＭＣ
Ａ法により求め、プラスミン処理サンプルの活性よりプ
ラスミン非処理サンプルの活性を減じた値を、一本鎖プ
ロ酵素の活性とした。尚、活性測定の標準品としてウロ
キナーゼ比較標準品（ミドリ十字社製、Ｌｏｔ．Ｓ−０
０４）を用いた。 【００６０】（ｉｉ） 結果 ■ 初期トランスフェクタントＡｓｎ２４−ＰＰＡ
産生図６に示したｄｈｆｒ遺伝子とＡｓｎ２４−ＰＰＡ
の位置関係の異なるプラスミド、ｐＴＴ０８とｐＴＴ
０９を、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞に導入した。本細胞は
ＤＨＦＲ活性を有していないので、ヌクレオシド合成が
できない。そこでｄｈｆｒをコードするＤＮＡを取り込
んだ細胞を選択するため、ヌクレオシドを含まない Ｍ
ＥＭ−α（ｗ／ｏ） 培地中でトランスフェクタントの
選択を行った。この培地中で形成されたコロニーを９６
ｗｅｌｌｓｐｌａｔｅに移し、ほぼ集密したところで
、上清中のＰＡ活性をフィブリン平板法により測定した
。その結果を表２に示した。 【００６１】 【表２】 【００６２】得られたコロニーのうち、ほぼ半数が、Ｐ
Ａ活性を示した。プラスミドの違いによるトランスフェ
クションのＰＡ発現への影響は見られなかった。 こ
れらの細胞のうち１０ ＩＵ／ｍｌ以上の活性を示した
ものをスケールアップし、再度活性を測定した。このう
ち１０ｃｍ ｄｉｓｈ で４７ ＩＵ／ｍｌのＰＡ活性
を示した細胞（ＰＴＴ０８をＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞に
導入した細胞） をＭＴＸによる増幅試験に供した。こ
の細胞は、再クローニングを行っても９６−ｗｅｌｌｓ
ｐｌａｔｅ ですべてのクローンが２０ＩＵ／ｍｌの
ＰＡ活性を示し、もともと均質な細胞集団であることが
わかった。 【００６３】■ ＭＴＸ添加によるＡｓｎ２４−ＰＰ
Ａ の産生量増大 ■で選択した細胞にＭＴＸを作用させ、ｄｈｆｒをコー
ドするＤＮＡの増幅と共に、近傍のＡｓｎ２４−ＰＰＡ
をコードするＤＮＡにも増幅が起こり、Ａｓｎ２４−
ＰＰＡ 産生量が増加するかどうかを調べた。図７にＭ
ＴＸ濃度と各耐性細胞上清のＰＡ活性の関係を示した。 ＭＴＸ濃度の濃度は１０ ｎＭ から始めたが、ほとん
どの細胞は、３〜４日で死滅した。ｄｈｆｒをコードす
るＤＮＡにＳＶ４０プロモーターを付けた転写ユニット
を持つプラスミドのトランスフェクタントでは、５０
ｎＭ のＭＴＸ濃度から始めてもそれほど細胞障害がな
かった。Ａｓｎ２４−ＰＰＡ 産生量は１０ｎＭＭＴＸ
耐性細胞では初期トランスフェクタントと比較して特に
上昇は認められなかったが、ＭＴＸ濃度を５０， １０
０， ２００， ５００ｎＭと上げるに従い、ほぼそれ
に比例するように上昇した。２００ ×１０４ ｃｅｌ
ｌｓ／１０ｃｍ ｄｉｓｈ の植え込み細胞数、４ 日
間の培養で初期トランスフェクタントで２０〜５０ＩＵ
／ｍｌ の産生量であったのが、５００ ｎＭ耐性細胞
では１０００ＩＵ／ｍｌ（６．７ｍｇ／１ｌ）前後にな
った。ＭＴＸ濃度をさらに１μＭ，２μＭ，４μＭと上
昇させ、各耐性細胞上清のＰＡ活性を調べたが、若干の
上昇が見られただけで本培養条件では、１０００〜２０
００ＩＵ／ｍｌ で頭打ちになった。 【００６４】■ 高濃度ＭＴＸ耐性細胞のＡｓｎ２４
−ＰＰＡ 産生 ０．５ μＭ 以上のＭＴＸ耐性細胞について、ＭＴＸ
添加培地、ＭＴＸ非添加培地の両方でＡｓｎ２４−ＰＰ
Ａ のプロフィールを調べた。 【００６５】１０ｃｍディッシュに、細胞を２００ ×
１０４ ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌ播き、培養２日目より上
清のＰＡ活性をフィブリン平板法により測定した。細胞
は、この条件で３〜４日でほぼＦｕｌｌ Ｓｈｅｅｔを
形成し、５〜６日頃より障害を受けはがれ始めた。ＭＴ
Ｘ添加培地で培養した細胞は、ＭＴＸ非添加培地での細
胞より僅かではあるが細胞増殖は遅かった。上清中のＰ
Ａ活性は細胞数を反映してか、ＭＴＸ非添加培地の方が
高かった。どの細胞も培養４〜５日で最高のＰＡ活性を
示し、それ以降ほとんど活性の上昇はなかった。本条件
で１μＭ ＭＴＸ耐性細胞で１８００−２０００ ＩＵ
／ｍｌ（１２−１３ｍｇ／ｌ） 、２ μＭ， ４μＭ
ＭＴＸ 耐性細胞で２７００−３２００ ＩＵ／ｍｌ
（１８−２１ ｍｇ／ｌ） のＰＡ活性に達した。しか
し、８ μＭ 耐性細胞では産生量が若干減少し、２０
００ ＩＵ／ｍｌのＰＡ活性しか示さなかた。尚、４
μＭ ＭＴＸ耐性細胞のＡｓｎ２４−ＰＰＡ 産生の様
子を表３に示す。細胞がＦｕｌｌ Ｓｈｅｅｔを形成し
た時、約１０７ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ の細胞数である
ので、１日当たりの最高産生高は、２００ ＩＵ（１．
３μｇ）／ｍｌ／ １０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙであった
。 【００６６】 【表３】 【００６７】■ 産生されたＡｓｎ２４−ＰＰＡ の
一本鎖含有率培養上清中のＰＡ活性をペプチド−ＭＣＡ
法で測定しサンプル中の一本鎖型プロ酵素量を調べた。 その結果、各サンプルの一本鎖含有率は３〜４日培養し
たもので８５％前後であった。また、一日だけの培養で
は９０％の一本鎖含有率が保たれていた。 【００６８】〔Ｖ〕従来技術との産生量の比較比較例 ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６；ＳＶ−４
０プロモーターの下流域にＤＨＦＲをコードするＤＮＡ
を配置してなるプラスミド） およびｐＨＲ２４を用い
て、常法により、ＳＶ４０プロモーターに支配されるＤ
ＨＦＲ転写ユニットと他のＳＶ４０プロモーターに支配
されるＡｓｎ２４−ＰＰＡ転写ユニットが逆方向に配置
されたプラスミドを構築し、対照プラスミドとした。シ
グナルステップにより、２μＭ のＭＴＸ に対して耐
性を獲得したＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞を用いて、対照プ
ラスミド（ＳＶ４０プロモーター型） と本発明プラス
ミド（ＵＫプロモーター型） とでＡｓｎ２４−ＰＰＡ
の産生量を比較した。結果を表４に示す。 【００６９】 【表４】 【００７０】実施例２ 実施例１−〔Ｉ〕で調製したｐＨＲ２４（１０μｇ）と
実施例１−〔ＩＩ〕で調製したｐＴＴ０６（１μｇ）と
を同時に５×１０６ 個のＣＨＯ−Ｋ１細胞由来ＤＨＦ
Ｒ欠損株に導入する以外は実施例１−〔ＩＶ〕記載の方
法に準じて行い、実施例１と同様にＡｓｎ２４−ＰＰＡ
の発現を確認した。 【００７１】実施例３ 〔Ｉ〕ｐＴＹ００７及びｐＴＹ００８の構築〔ＵＫプロ
モーターに支配されるＤＨＦＲ転写ユニットとＳＶ４０
プロモーターに支配されるヒトＡＴＩＩＩ 転写ユニッ
トをを含むプラスミドの構築］ （ｉ）オリゴヌクレオチドの合成自動ＤＮＡ合成機（前
記）を用いて、２種類のプローブ（プローブ−１、プロ
ーブ−２）及び、プライマー（プライマー−１）を作製
した。各々の塩基配列をそれぞれ以下に示す。 【００７２】プローブ−１（翻訳開始コドンからの５１
塩基配列の相補鎖ＤＮＡ） ５’−ＡＴＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＣＡＧ
ＡＧＧＴＴＡＣＡＧＴ ＴＣＣＴＡＴＣ
ＡＣＡＴＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴ−３’【００７３】プロ
ーブ−２（成熟ＡＴＩＩＩ の２４４ 番目のグリシン
残基のコドンからの５１塩基配列の相補鎖ＤＮＡ） ５’−ＣＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＴＧＧ
ＧＣＡＡＧＡＴＧＡＧ ＧＡＣＣＡＴＧ
ＧＴＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣ−３’【００７４】プラ
イマー−１（翻訳停止コドン（下線）を含む３２塩基Ｄ
ＮＡ。４塩基（＊印）が置換されている）
＊＊ ＊＊ ５’−Ｇ
ＴＧＴＴＡＡＧＴＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴ
ＴＧＣＡ【００７５】（ｉｉ） ヒトＡＴＩＩＩ をコ
ードするｃＤＮＡのクローニング ヒト肝臓細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をオ
リゴｄＴカラムを用いて単離し（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８ ：５２９４−５２９
９， １９７９）、ショ糖密度勾配遠心法により、サイ
ズ分画した（Ｓｃｈｗｅｉｎｆｅｓｔ ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９ ：４９７
９，１９８２）。適切な大きさのｍＲＮＡ（至２８Ｓ）
を材料に、常法（Ｏｋａｙａｍａ ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ． ２ ：１６１， １９８２）に従って
、λｇｔ１０（Ｈｕｙｎｔｈら、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ １ ： ４９， １９８５）をベクターとしてｃＤ
ＮＡを作製した。報告されているＡＴＩＩＩ のｃＤＮ
Ａの塩基配列をもとに作製した２種類のプローブ（プロ
ーブ−１・プローブ−２：前記）を用いてプラークハイ
ブリダイゼーション（Ｂｅｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
１９６ ： １８１， １９７７）を行った。陽性ク
ローンを単離し、ファージＤＮＡを調製した。制限酵素
ＥｃｏＲＩ で消化し、約１５００ｂｐのｃＤＮＡ挿入
部を切り出し、プラスミドｐＵＣ１１８（Ｖｉｅｉｒａ
ら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３
：３， １９８７） にリクローニングした。このプラ
スミドをｐＥＡ００１と命名し、その挿入配列に関して
ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４ ： ５４６３ １９
７７）によって塩基配列を確認した。 【００７６】（ｉｉｉ） ＡＴＩＩＩ 発現用プラスミ
ド（ｐＴＹ００７，ｐＴＹ００８）の作製 該プラスミドは以下の３種のプラスミドを用いて作製す
る。■ｐＥＡ００３：ｐＵＣ１１８にＡＴＩＩＩ ｃＤ
ＮＡを組み込んだプラスミドで、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃ
ｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ によりＡＴＩＩＩ
ｃＤＮＡのｐｏｌｙＡ付加配列の上流にＥｃｏＲＩ サ
イトとＨｉｎｄＩＩＩサイトが導入されている。■ｐＳ
Ｖ１１−ｄｈｆｒ：ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒはｐＳＶ２−
ｄｈｆｒのＥｃｏＲＩ サイト近傍にＸｂａＩサイトを
導入したプラスミドで、ＳＶ４０由来の初期プロモータ
ーとエンハンサー、マウスｄｈｆｒｃＤＮＡ、ＳＶ４０
由来のスプライシングジャンクションとｐｏｌｙＡ付加
配列を含んでいる。 ■ｐＴＴ０６：実施例１のｐＴＴ０６に相当する。 【００７７】ｐＥＡ００３の構築 部位特異的塩基置換法（Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６ ： ７９１， １９８８）
により、プライマー（前記）を用いて、ｐＥＡ００１
中のＡＴＩＩＩ のコード領域とポリアデニル酸テール
の間にＨｉｎｄＩＩＩ 及び、ＥｃｏＲＩ サイト設け
た。このプラスミドをｐＥＡ００３（図８参照）と命名
した。 ｐＥＡ００３はＥｃｏＲＩ で消化することにより、約
１４００ｂｐのポリアデニル酸テールを含まないＡＴＩ
ＩＩ のｃＤＮＡを取り出すことが可能である。 【００７８】ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒの構築ｐＳＶ２−ｄ
ｆｈｒ（前記）をＥｃｏＲＩ で消化し、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を用いて平滑末端とした
後、ＸｂａＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿
入した。このプラスミドをプラスミドｐＳＶ１１−ｄｈ
ｆｒとした。 【００７９】ｐＴＴ０６の構築 実施例１記載の方法に従った。 【００８０】ｐＴＹ００７及びｐＴＹ００８の作製ＡＴ
ＩＩＩ 発現用プラスミド（ｐＴＹ００７及びｐＴＹ０
０８）の構築方法を図８に示した。まず、ｐＥＡ００３
よりＥｃｏＲＩ でＡＴＩＩＩ ｃＤＮＡを切り出し、
ｆｉｌｌ−ｉｎ の後、ＢｇｌＩＩ リンカーと結合し
た。一方、ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒはＨｉｎｄＩＩＩ 消
化、ｆｉｌｌ−ｉｎ の後、ＢｇｌＩＩ リンカーと結
合し、さらに、ＢｇｌＩＩ で消化してマウスｄｈｆｒ
ｃＤＮＡを取り除いた。これらをライゲーションし、Ｓ
Ｖ４０プロモーターの支配下にＡＴＩＩＩ ｃＤＮＡを
発現するプラスミド（ｐＴＹ００６）を作製した。 【００８１】一方、ｐＴＴ０６を制限酵素で消化後、ｆ
ｉｌｌ−ｉｎ し、ＵＫプロモーターの支配下にマウス
ｄｈｆｒｃＤＮＡを発現するユニット（ＥｃｏＲＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩフラグメント） を単離した。制限酵素処
理の際には、ＡｐａＬＩ を用いて発現ユニット以外の
部分を切断することにより、目的のフラグメントの分離
を容易にした。得られたｄｆｈｒ発現ユニットは、あら
かじめＸｂａＩ消化とｆｉｌｌ−ｉｎ 処理を行ったｐ
ＴＹ００６とライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１に導入した。出現したコロニーをスクリーニングし
た結果、ＳＶ４０プロモーターの制御下にヒトＡＴＩＩ
Ｉ を発現するユニットと、ＵＫ−プロモーターの制御
下にマスウｄｈｆｒを発現するユニットが同じ向きに配
置された目的のプラスミド（ｐＴＹ００７）を持つ株を
得た。 【００８２】次に、ｐＴＹ００７のＸｂａＩサイトがｆ
ｉｌｌ−ｉｎ とライゲーションの後再生される事を利
用して、ｄｈｆｒ発現ユニットが逆向きに挿入されたプ
ラスミド（ｐＴＹ００８）を構築した。まず、ｐＴＹ０
０７をＸｂａＩで消化し、酵素を熱失活した後そのまま
ライゲーション反応を行った。反応産物でＥ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１及びＪＭ１０９ を形質転換し、得られた
コロニーを分析した結果、ＪＭ１０９ のコロニーから
ｐＴＹ００８を持つクローンを得た。 【００８３】尚、ｐＴＹ００７の制限酵素地図と遺伝子
の配置を図９に示した。図９において、１：ＳＶ４０の
ＰｖｕＩＩ サイト（２７０） からＨｉｎｄＩＩＩ（
５１７１） までの領域を含む約３４０ ｂｐのフラグ
メント、２：ポリアデニレーションシグナルとＰｏｌｙ
（Ａ）配列は含まず、また両末端のＥｃｏＲＩ サイ
トは再生されている約１．５ ｋｂのヒトＡＴＩＩＩ
ｃＤＮＡ、３：ＳＶ４０のＭｂｏＩ（４７１０）からＭ
ｂｏＩ（４１００）までの領域（スプライシングジャン
クション）と、その下流にＳＶ４０のＢｇｌＩ（２７７
３）からＥｃｏＲＩ（１７８２）までの領域（ポリアデ
ニレーションシグナル） を含む約１．６ ｋｂのフラ
グメント、４：ヒトウロキナーゼのプロモーター領域を
含む約８００ｂｐのフラグメント、５、マウスｄｈｆｒ
ｃＤＮＡ を含む約７４０ｂｐのフラグメント、６：
３と異なる点は、ポリアデニレーションシグナルの部分
がＳＶ４０のＰｓｔＩ部位（１９８８）までしか含まれ
ていないことであり、３’末端のＥｃｏＲＩ 部位は再
生されているフラグメント、７：ｐＢＲ３２２由来の１
．８４ ｋｂ の、ＥｃｏＲＩ（４３６１） からＰｖ
ｕＩＩ（２０６６） までのフラグメントをそれぞれ示
している。 【００８４】〔ＩＩ〕動物細胞への導入（ｉ） 材料
と方法 ■ プラスミド ｐＴＹ００７：ＵＫプロモーターに支配されるＤＨＦＲ
転写ユニットとＳＶ４０プロモーターに支配さるヒトＡ
ＴＩＩＩ 転写ユニットが順方向に配置されたプラスミ
ド。 ｐＴＴ００８：ＵＫプロモーターに支配されるＤＨＦＲ
転写ユニットの下流にＳＶ４０プロモーターに支配され
るヒトＡＴＩＩＩ 転写ユニットが逆方向に配置された
プラスミド。プラスミドは調製後、塩化セシウム平衡密
度勾配遠心法で精製した。 【００８５】■ 細胞 ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来ＤＨＦＲ欠損株 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ） ７
７， ４２１６ （１９８０） に記載の方法で調製、
増殖させた。 【００８６】■ メトトレキセート（ＭＴＸ）Ｓｉｇ
ｍａ 社製（＋）Ａｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎを０．８２
％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ， ０．０２ ％（ｗ／ｖ）
Ｎａ２ＨＰＯ４， ０．５６％（ｗ／ｖ） ＨＥＰＥＳ
（ナカライテスク）に溶解し、２ｍＭストック液を調製
した。これを培地に、目的の濃度になるように添加し使
用した。 【００８７】■ 培地と血清 ＭＥＭ−α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオ
シド入り）（Ｇｉｂｃｏ） ＭＥＭ−α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオ
シド無し）（Ｇｉｂｃｏ） それぞれ、ＭＥＭ−α（ｗ）、ＭＥＭ−α（ｗ／ｏ）と
略す。血清は牛胎児血清（ＦＣＳ）（三菱化成 ＭＨ０
１）を非働化し使用した。 【００８８】■ ＤＮＡ導入とトランスフェクタント
の選択 ＭＥＭ−α（Ｗ）， １０％ＦＣＳ で継代しているＤ
ＨＦＲ欠損ＣＨＯ 細胞をトリプシン（０．２５ ％ト
リプシン）処理により、ディッシュよりはがし、１．５
×１０５ 個の細胞を１０ｃｍディッシュに植え込み、
リン酸カルシウム法によりトランスフェクションを行っ
た。リン酸カルシウム沈澱は、ファルマシア社のＣｅｌ
ｌＰｈｅｃｔ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔを用い
て調製した。まず、１０μｇ 発現プラスミドを２４０
μｌ の滅菌水に溶解した。ここにキットのＡ液を２
４０ μｌ 添加し、混合した後、室温で１０分間放置
した。ここに４８０ μｌ のＢ液を添加し、室温で１
５分間放置した（全容 ９６０μｌ ）。得られたリン
酸カルシウム沈澱は、時間を置かずに細胞に添加した。 ５．５時間培養した後、培地を除去、洗浄後、３ｍｌの
グリセロール液（組成は以下の通り）を添加した。 【００８９】 ５０％ グリセロール ３０ｍｌ２×ＨＢ
Ｓ＊） ５０ｍｌＨ２ Ｏ
２０ｍｌ＊
）２×ＨＢＳ（ｐＨ７．１）：１．６３６ ％（ｗ／ｖ
） ＮａＣｌ， １．１１８ ％（ｗ／ｖ） ＨＥＰＥ
Ｓ，０．０４％（ｗ／ｖ） Ｎａ２ＨＰＯ４ 【００９
０】３７℃で正確に２分間インキュベート後、グリセロ
ール液を除去し、洗浄後、３日間、ＭＥＭ−α（ｗ），
１０％ＦＣＳ で培養後、選択培地であるＭＥＭ−α（
ｗ／ｏ），１０％ＦＣＳ に交換した。２〜３日毎に培
地交換を行い、２週間程度後、トランスフェクタントの
コロニー形成が見られた。トランスフェクタントを９６
穴プレートに０．７細胞／ｗｅｌｌの割合で植え込んだ
。各ｗｅｌｌを検鏡し、１個のクローンのみが成育して
いるｗｅｌｌを選択した。そして上清のＡＴＩＩＩ 量
を測定した。高い活性を与えた細胞をスケールアップし
、さらに再クローニングを行った後、ＭＴＸによるＤＮ
Ａ増幅に供した。 【００９１】■ ＭＴＸによる導入遺伝子の増幅■で
得られたＡＴＩＩＩ 産生細胞をＭＥＭ−α（ｗ／ｏ）
，１０％ＦＣＳ ； ５ｎＭＭＴＸを培地として２×１
０５ 細胞／ｗｅｌｌ の濃度で６ウェルプレートに植
え込んだ。３日毎に培地交換を続けていると耐性株の出
現が得られた。２〜４週間で充分な細胞数になるので、
次の段階のＭＴＸ濃度の培地に継代した。このように５
ｎＭのＭＴＸ濃度からスタートして５〜２０μＭのＭＴ
Ｘ濃度まで順次２〜４倍づつＭＴＸ濃度を上げていった
。各濃度のＭＴＸ耐性細胞はそれぞれ６ウェルプレート
にて培養し、上清中のＡＴＩＩＩ 量を測定した。 【００９２】■ ＡＴＩＩＩ 産生量の検出ＡＴＩＩ
Ｉ の遺伝子を導入したＣＨＯ細胞を１０％ＦＣＳを加
えたＭＥＭ−αに懸濁し、６ウェルプレートまたは直径
１０ｃｍのペトリディッシュで培養した。３日毎に培地
を変換し、細胞が飽和密度（約１×１０６ 細胞／ｍｌ
）に達した後、培地を交換し、更に３日間培養を行った
。培養上清を回収し、上清中のＡＴＩＩＩ をＥＬＩＳ
Ａ法（ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８４ ： ３８８６， １９
８７）により測定した。また、細胞を０．２５％トリプ
シン（Ｓｉｇｍａ 社から購入） 処理で回収し、細胞
数を計測した。 【００９３】（ｉｉ） 結果 ■ 初期トランスフェクタントのＡＴＩＩＩ 産生ｐ
ＴＹ００７とｐＴＹ００８を、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞
に導入した。ｐＴＹ００７を導入した１４０株、ならび
にｐＴＹ００８を導入した８０株につき、ｄｈｆｒをコ
ードするＤＮＡを組み込んだ細胞を選択するため、ヌク
レオシドを含まないＭＥＭ−α（ｗ／ｏ）培地中でトラ
ンスフェクトタントの選択を行った。この培地中で形成
されたコロニーを９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ に移し
、ほぼ集密したところで、上清中（１００ μｌ／ｗｅ
ｌｌ） のＡＴＩＩＩ 量をＥＩＡ法で測定した。 【００９４】ｐＴＹ００７を導入した細胞とｐＴＹ００
８を導入した細胞では、産生量に差異が見られた。ｐＴ
Ｙ００７を導入した細胞では１０００ ｎｇ／ｍｌ以上
の高産生株があったのに対し、ｐＴＹ００８を導入した
細胞のＡＴＩＩＩ 産生量は一般的に低かった（図１０
）。 【００９５】■ ＭＴＸ添加によるＡＴＩＩＩ 量の
産生量増大 ｐＴＹ００７を導入した１４０株の中からＡＴＩＩＩ
産生量の高い４０株について、メトトレキセート（ＭＴ
Ｘ）処理を行い、遺伝子増幅によっる産生量の上昇を試
みた。 【００９６】代表的なＭＴＸ耐性株について、０〜２０
μＭ ＭＴＸに対する耐性時のＡＴＩＩＩ 量の産生
量を表５及び表６に示した。 【００９７】 【表５】 【００９８】 【表６】 【００９９】表５では、培養液量あたりの産生量（ｎｇ
／ｍｌ／３ ｄａｙｓ） 、表６では細胞あたりの産生
量（ｎｇ／１０６ ｃｅｌｌｓ／３ｄａｙｓ）で表示し
た。また各株について、最大のＡＴＩＩＩ 産生を示し
た時の産生量とＭＴＸ耐性度、更にＭＴＸ処理による産
生量の増加率を、表７に示した。 【０１００】 【表７】 【０１０１】産生量は、ＭＴＸ処理前の株で培養液量あ
たり、１００ 〜１０００ ｎｇ／ｍｌ、細胞あたりで
は、２０〜６００ｎｇ／１０６ ｃｅｌｌｓ であった
。一般的な傾向としてＭＴＸ耐性度が増すにつれて産生
量は増加し、プラトーに達した後は、減少した。最大産
生に対するＭＴＸ耐性度は株によって異なっていた。Ａ
ＴＩＩＩ の最大産生量は株の種類をによって異なって
いたが、培養液量あたりでは１０μｇ／ｍｌ／３ ｄａ
ｙｓ） 、細胞あたりでも１０μｇ／１０６ ｃｅｌｌ
ｓ／３ ｄａｙｓ 程度であった。
発現を制御できるプロモーター及びウロキナーゼ（ＵＫ
）プロモーターを上流部に付加させたジヒドロ葉酸還元
酵素（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡを組み込んでなる
プラスミド、（２） 動物細胞での発現を制御できるプ
ロモーターを上流部に付加させた異種蛋白をコードする
ＤＮＡ及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを上流部
に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコー
ドするＤＮＡを組み込んでなるプラスミド、（３） 上
記（２） のプラスミドを用いて形質転換させた動物細
胞、（４） 動物細胞での発現を制御できるプロモータ
ーを上流部に付加させた異種蛋白をコードするＤＮＡを
担持させたプラスミド及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモ
ーターを上流部に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ
ＨＦＲ）をコードするＤＮＡを担持させたプラスミドを
同時に用いて形質転換させた動物細胞、（５） 上記（
３） または（４） の動物細胞を培養して異種蛋白質
を発現させることによる異種蛋白質の製造方法に関する
。 【０００２】 【従来の技術】遺伝子組換え技術によって目的の生理活
性物質を生産する宿主としては、当初大腸菌を中心に研
究が進められ、さらに、酵母、枯草菌等の微生物が、そ
の培養の簡便さ及び宿主−ベクター系の研究の進展等か
ら繁用されていた［Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．， Ｉｔ
ａｋｕｒａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｈ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７６， １
０６（１９７９）およびＮａｇａｔａ， Ｓ．， Ｔａ
ｉｒａ， Ｓ．Ｈ． ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ，
Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ．２８４， １３１６（１９８０
） 参照］ 。 【０００３】しかし、近年高分子糖蛋白質を天然型に近
い形で、しかも可溶な型で遺伝子組換え技術によって物
質生産を行うための宿主として、動物細胞を用いる発現
系に焦点が移っている。 【０００４】例えば、動物細胞による発現の例として、
特開昭６１−１７７９８７ 号公報等に記載の方法が知
られている。 【０００５】さらに、動物細胞での発現を高めるために
、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡにより増幅を行う手法が
考え出された。また、動物細胞による発現ベクターは、
できるだけ高率にクローン化した遺伝子を発現させるた
めに強いプロモーターの選択が必要である。これについ
ては、当初はＤＨＦＲをコードするＤＮＡをシミアンウ
ィルス（ＳＶ４０）プロモーターを用いて制御する方法
がとられていた（特開昭６３−１０５９７５ 号公報）
が、最近では、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡをＤＨＦ
Ｒプロモーターを用いて制御する方法が提案されている
（特開昭６３−２７３４８１ 号公報）。 【０００６】よって、外来の遺伝子（ここでは蛋白質）
を組み込んだ発現ベクターは、その発現の増幅の度合い
を高めるために高率の転写を起こさせるプロモーターを
有する発現ベクターであることが、組換えタンパク質の
量産に望まれている。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
事情に鑑み、各種研究を重ねた結果、ＤＨＦＲをコード
するＤＮＡによる増幅の過程において、ＤＨＦＲをコー
ドするＤＮＡを制御するプロモーターとしてＵＫプロモ
ーターを用いることにより、増幅の度合いが従来知られ
た水準に比べ、はるかに優れていることを見出し、本発
明を完成した。 【０００８】すなわち、本発明は、（１） 動物細胞で
の発現を制御できるプロモーター及びウロキナーゼ（Ｕ
Ｋ）プロモーターを付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（
ＤＨＦＲ）遺伝子を組み込んでなるプラスミド、（２）
動物細胞での発現を制御できるプロモーターを上流部
に付加させた異種蛋白遺伝子及びウロキナーゼ（ＵＫ）
プロモーターを付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨ
ＦＲ）遺伝子を組み込んでなるプラスミド、（３） 上
記（２） のプラスミドを用いて形質転換させた動物細
胞、（４） 動物細胞での発現を制御できるプロモータ
ーを上流部に付加させた異種蛋白をコードするＤＮＡを
担持させたプラスミド及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモ
ーターを上流部に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ
ＨＦＲ）をコードするＤＮＡを担持させたプラスミドを
同時に用いて形質転換させた動物細胞、（５） 上記（
３） または（４） の動物細胞を培養して異種蛋白質
を発現させることによる異種蛋白質の製造方法に関する
。 【０００９】以下、これを詳述する。 〔Ｉ〕プラスミド■ 本発明においてプラスミド■は、 （ｉ） 動物細胞での発現を制御できるプロモーター
、及び （ｉｉ） ウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを、上流
部に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ） を
コードするＤＮＡを組み込んでなる。 【００１０】当該プラスミド■は、異種蛋白質をコード
するＤＮＡを動物細胞での発現を制御できるプロモータ
ーの下流に組み込み、それを動物細胞において発現させ
るためのユニットとして利用できるものである。 【００１１】動物細胞での発現を制御できるプロモータ
ーは、ポリオーマ、アデノウイルス．２、あるいは最も
多用されているシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来
である。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーター
は特に有用である。というのは、これらは、ＳＶ４０の
複製起点を含む断片として容易にウイルスから得られる
からである〔Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ
， ２７３， １１３（１９７８）］ 。ウイルスの
ＨｉｎｄＩＩＩ 部位から複製起点のＢｇｌＩ部位まで
の約２５０ ｂｐを含む断片も使用できる。更に目的と
する遺伝子に関連したプロモーターや制御配列（エンハ
ンサー） も宿主とコンバーチブルならば使用できる。 【００１２】動物細胞発現ベクターに用いるプロモータ
ー・エンハンサーとしては、ＳＶ４０初期遺伝子又は後
期遺伝子のプロモーター・エンハンサーやアデノウイル
スメジャーレート・プロモーター領域、グロブリンエン
ハンサー・プロモーター領域、ＲＮＡウイルスのＬＴＲ
、メタロチオネインプロモーター領域、β−アクチンプ
ロモーターなどが使用できる。複製起点は、ＳＶ４０や
他のウイルス（ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等
） 由来のものをベクターに組み込んでもよいし、宿主
細胞染色体の複製機構を用いてもよい。ベクターが宿主
細胞の染色体に組み込まれるならば後者で十分である。 【００１３】ＵＫプロモーターを上流部に付加させたＤ
ＨＦＲをコードするＤＮＡは、ＵＫプロモーターの支配
下にＤＨＦＲをコードするＤＮＡが働く様にしたもので
ある。当該ＵＫプロモーター及びＤＨＦＲコードするＤ
ＮＡは、共に公知のものであり、ＵＫプロモーターはＮ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３， ２７５９−
２７７１（１９８５）等に、ＤＨＦＲをコードするＤＮ
Ａは特開昭５９−１９２０８９ 、同６３−１０５６７
５ 等に開示されている。 【００１４】また、当該プラスミド■は、動物細胞での
発現を制御できるプロモーターの上流側に複製起点、下
流側に、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、
ポリＡ付加部位あるいは転写終結配列を有していてもよ
い。 【００１５】〔ＩＩ〕 プラスミド■本発明において
、プラスミド■は、 （ｉ） 動物細胞での発現を制御できるプロモーター
を上流部に付加させた異種蛋白をコードするＤＮＡ、及
び（ｉｉ） ウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを上流
部に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコ
ードするＤＮＡを組み込んでなる。 【００１６】当該プラスミド■においては、動物細胞で
の発現を制御できるプロモーターを異種蛋白をコードす
るＤＮＡの上流部に付加させ、動物細胞での発現を制御
できるプロモーターの支配下に異種蛋白をコードするＤ
ＮＡが働くようにしたものである。 【００１７】異種蛋白をコードするＤＮＡとしては、プ
ロＵＫ（特開昭６０−１８０５９１ 号公報） 、修飾
プロＵＫ（特開昭６３−１４６７８９ 号公報， 特願
平１−１２６４３３号公報， 同１−１２６４３４号公
報） 、ｔ−ＰＡ（特開昭５９−１８３６９３ 号公報
， 同５９−４２３２１号公報） 、ＨＢｓＡｇ（特開
昭５９−３６６９８号公報） 、ＰｒｅＳ−ＨＢｓＡｇ
（特開昭５６−６３９９５ 号公報） 、ＩＦＮ−γ
（ 特開昭６１− １０８３９７号公報） 、ＣＳＦ（
特開昭６１−１９９７８７ 号公報） 等が挙げられる
。また、これらの異種蛋白の活性断片あるいは誘導体で
あってよい。 【００１８】なお、当該プラスミド■において、動物細
胞での発現を制御できるプロモーターと異種蛋白をコー
ドするＤＮＡからなるユニット、及びＵＫプロモーター
とＤＨＦＲをコードするＤＮＡからなるユニットは、順
方向に配置されていてもよく、逆方向に配置されていて
もよい。また、当該プラスミド■は、動物細胞での発現
を制御できるプロモーターを上流側に付加した異種蛋白
をコードするＤＮＡユニットの上流側に複製起点、下流
側に、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポ
リＡ付加部位あるいは転写終結配列を有していてもよい
。 【００１９】［ＩＩＩ］ プラスミド■及びプラスミ
ド■本発明において、プラスミド■は、動物細胞での発
現を制御できるプロモーターを上流部に付加させた異種
蛋白をコードするＤＮＡを担持させたプラスミドであっ
て、プラスミド■は、ウロキナーゼ（ＵＫ）プロモータ
ーを上流部に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦ
Ｒ）をコードするＤＮＡを担持させたプラスミドである
。 【００２０】当該プラスミド■及び■はそれぞれ前項〔
ＩＩ〕−（ｉ） 及び（ｉｉ）記載と同一のＤＮＡを担
持させたプラスミドであり、これら二つのプラスミドを
同時に用いて動物細胞を形質転換させ、異種蛋白質を動
物細胞において発現させるためのユニットとして用いら
れる。 【００２１】〔ＩＶ〕 形質転換体 形質転換体は〔ＩＩ〕のプラスミド■または［ＩＩＩ］
のプラスミド■とプラスミド■とを同時に用いて動物
細胞を形質転換させたものである。 【００２２】本発明で使用される動物細胞としては、細
胞株として有用な例として、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ細胞、
Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ （ＣＨ
Ｏ） ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ 、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯ
Ｓ−７ 、ＭＤＣＫ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ、Ｃ１２７、
ＨＫＧ 、Ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ ｌｉ
ｎｅなどが挙げられる。具体的にはＣＨＯ−Ｋ１（チャ
イニーズハムスター卵巣細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）
、ＢＨＫ（新生子ハムスター腎細胞：ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ１０） 、ＣＯＳ−７（ＣＶ−１ Ｏｒｉｇｉｎ，
ＳＶ−４０細胞：ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１） 、Ｖｅ
ｒｏ（ アフリカミドリザル腎細胞：ＡＴＣＣ ＣＣＬ
−８１）等がある。また、このような細胞としては特に
ＤＨＦＲ遺伝子欠損細胞であることが好ましい。 【００２３】動物細胞の形質転換は公知の方法、例えば
、リン酸カルシウム沈澱法、プロトプラストポリエチレ
ングリコール融合法、エレクトロポレーション法などに
より行うことができる。 【００２４】また、ＭＴＸ（メトトレキセート）による
増幅のかけ方としては、形質転換体を１０ｎＭ〜４ｎＭ
のＭＴＸを含む培地（ＭＴＸは段階的に上げていっても
よく、最初から高濃度でシングルステップで行ってもよ
い）中で耐性株を選択すればよい。 【００２５】培地としては、１ 〜１０％ＦＣＳを含ん
だＭＥＭ−ａｌｐｈａ 、或いはダルベッコ変法−ＭＥ
Ｍ（Ｄ−ＭＥＭ）等が挙げられる。培養条件は１０〜３
７℃，１〜２００時間程度である。 【００２６】〔Ｖ〕異種蛋白質の製造方法〔ＩＶ〕の形
質転換体を培養し、自体既知の手段にて異種蛋白質を発
現させる。 【００２７】 【発明の効果】本発明においては、ＤＨＦＲをコードす
るＤＮＡを用いて異種蛋白質の発現を増幅する方法にお
いて、ＤＨＦＲをコードするＤＮＡをＵＫプロモーター
の支配下に配列することにより、増幅の度合が従来の水
準よりはるかに優れていることが判明した。 【００２８】従って、本発明は、遺伝子工学分野におけ
る動物細胞を用いての異種蛋白質大量生産に極めて有用
な方法と考えられる。 【００２９】 【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例を
挙げるが、本発明は、これらによって何ら限定されるも
のではない。 【００３０】実施例１ 〔Ｉ〕ｐＨＲ２４の構築 〔ＥＧＦドメインにアスパラギン結合糖鎖を持つヒトプ
ロウロキナーゼ（ＰＵＫ）をコードするＤＮＡ配列を組
み込んでなるプラスミドの構築〕ＰＵＫのＥＧＦドメイ
ン内に新たな糖鎖結合部位を２４位に持つ変異ヒトＰＵ
Ｋ（天然型ヒトＰＵＫのＴｙｒ２４をＡｓｎ２４に置換
）の発現ベクターを作製した。これらの発現ベクターの
作製の詳細を以下に述べる。なお、本実施例において、
合成ＤＮＡは変成ポリアクリルアミドゲルで精製した。 制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡポリメレース、Ｍ１３シークエ
ンスキット、ライゲーションキットなどの酵素・キット
類、大腸菌ＨＢ１０１及びＪＭ１０９コンピテントセル
は宝酒造製のものを用いた。子牛小腸アルカリフォスフ
ァテースはベーリンガー マンハイム社製を用いた。 また組換ＤＮＡテクニックは、■Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ’ Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載
の方法に準じた。 【００３１】（ｉ）オリゴヌクレオチドの合成自動ＤＮ
Ａ合成機（３８１Ａ、アプライドバイオシステム社製）
を用いて、一本鎖ＤＮＡ２個（ＤＮＡ−１、ＤＮＡ−２
）を作製した。各々の塩基配列を以下に示す。 【００３２】Ｔｙｒ２４をＡｓｎ２４に置換（Ａｓｎ２
４に糖鎖付加） ５’−ＣＧＡＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡＴＧＧ
ＡＧＧＴＡＣＣＴＧＴ３’− ＴＴＧＡＣＡＣＴ
ＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡ
ＡｓｎＣｙｓＡｓｐＣｙｓＬｅｕＡｓｎ
ＧｌｙＧｌｙＴｈｒＣｙｓ ｋｐｎ
Ｉ ＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＡ
ＴＴＣＡＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＡＧＧＴＴＧＴＴＣＴＴ
ＧＡＡＧＡＧＧＴＴＡＴＡＡＧＴＧＡＣＣＡＣＧＶａｌ
ＳｅｒＡｓｎＬｙｓＡｓｎＰｈｅＳｅｒＡｓｎＩｌｅＨ
ｉｓＴｒｐＣｙｓＳｓｐＩ ＡＡＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＧＧＡＧＧＧＣ
ＡＧＣＡＣＴＧＴＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＴＴＴＣＴＴ
ＴＡＡＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＧＴＧＡＣＡＣＴＴＡｓｎ
ＣｙｓＰｒｏＬｙｓＬｙｓＰｈｅＧｌｙＧｌｙＧｌｎＨ
ｉｓＣｙｓＧｌｕＡＴ −３’ ＤＮＡ−１
ＴＡＧＣ−５’ Ｄ
ＮＡ−２ Ｉｌｅ 【００３３】ＤＮＡ−１、ＤＮＡ−２はＰＵＫの２４位
チロシン残基がアスパラギン残基に置換されたＤＮＡ配
列を含んでいる。また、ＧＧＡＡＣＡをＧＧＴＡＣＣに
変換してＫｐｎＩ認識部位を、ＡＡＣＡＴＴをＡＡＴＡ
ＴＴに変換してＳｓｐＩ認識部位を導入した。 【００３４】合成したオリゴヌクレオチドは、保護基の
脱離処理後、全合成量の６４／１００を１２％アクリル
アミド尿素ゲル電気泳動で精製した結果、ＤＮＡ−１，
１９．０μｇ；ＤＮＡ−２，２１．１μｇの一本鎖ＤＮ
Ａとして得た。 【００３５】（ｉｉ）プラスミドの構築図１にｐＴＴ０
３及びｐＨＲ２４の構築の概略を示した。 【００３６】ｐＴＴ０３の構築
ＳＶ４０由来のエンハンサー・プロモーター領域とプラ
スミノーゲンプロアクチベーター（ＰＰＡ）のシグナル
配列並びにＰＵＫのＮ末端４アミノ酸をコードする遺伝
子を含んだプラスミドｐＴＴ０３を構築した。ＳＶ４０
のエンハンサー・プロモーターのＢａｍＨＩ 認識部位
の５’領域を得るために、ｐＵＨ７（特開昭６３−１４
６７８９ 号公報）ＨｉｎｄＩＩＩ とＢａｍＨＩ で
消化し、４２０ｂｐ の断片をアガロースゲル電気泳動
により単離・精製した。一方、ｐＵＨ３（特開昭６３−
１４６７８９号公報）もＨｉｎｄＩＩＩ とＢａｍＨＩ
で消化し、直線状になった３．５ｋｂ のＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動により単離・精製し、これを
先の４２０ ｂｐの断片とＤＮＡリガーゼで連結した。 ＨｉｎｄＩＩＩ とＢａｍＨＩ で消化して、３．５ｋ
ｂ および４２０ｂｐ の断片を与えたプラスミドをｐ
ＴＴ０３とした。１２個の形質転換体について確認をお
こなったが、全てｐＴＴ０３の形質転換体であった（図
２参照） 。 【００３７】ｐＨＲ２３の構築 ＳＶ４０のエンハンサー・プロモーターとＰＵＫのシグ
ナル配列並びにＰＵＫの２４位チロシン残基がアスパラ
ギン残基に置換されたｐＨＲ２３を構築した。ｐＴＴ０
３をＣｌａＩで消化し、直線状になった３．９ ｋｂの
断片をアガロースゲル電気泳動により単離・精製した。 これを子牛小腸アルカリフォスファターゼで末端の脱リ
ン酸化を行った。一方、前記（ｉ）で合成したオリゴヌ
クレオチドＤＮＡ−１とＤＮＡ−２をカイネーション後
、アニーリングし、脱リン酸化した３．９ ｋｂの断片
とライゲーションした。ＨｉｎｄＩＩＩ とＣｌａＩで
消化して、８００ ｂｐのＤＮＡ断片を与えたプラスミ
ドをｐＨＲ２３とした。１２個の形質転換体のスクリー
ニングを行った結果、１２個のうち８個が目的のプラス
ミドを持った形質転換体であった。なお、プラスミドの
合成ＤＮＡを使用した部分の確認は、その塩基配列を決
定することによっても行った。 【００３８】ｐＨＲ２４の構築 ｐＨＲ２３はＰＵＫの４４位のイソロイシン残基までコ
ードするＤＮＡ配列を持っているので、これに４５位ア
スパラギン酸よりＣ末端側をコードするＤＮＡを連結し
、ｐＨＲ２４を構築した。 【００３９】ｐＵＨ７をＣｌａＩで消化し、４．２ ｋ
ｂの断片をアガロースゲル電気泳動により単離・精製し
た。これを子牛小腸アルカリフォスファターゼで末端の
脱リン酸化を行い、ｐＨＲ２３のＨｉｎｄＩＩＩ −
ＣｌａＩ 消化で得た８００ ｂｐのＤＮＡ断片とＣｌ
ａＩ認識部位を使ってライゲーションした。次にＴ４Ｄ
ＮＡポリメレースでＨｉｎｄＩＩＩ 認識部位並びにも
う一方のＣｌａＩ認識部位を平滑末端とした後、再びラ
イゲーションした。２４株について一次スクリーニング
は環状プラスミドの大きさを指標にした。即ち、目的の
プラスミドよりも１００ ｂｐ小さいｐＵＨ７の環状プ
ラスミドとの比較を行った。その結果、２４個のうち５
個が目的の大きさのプラスミドであった。この構築手順
では、挿入するＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ断片が逆向き
に連結される可能性もあるので、ＫｐｎＩ消化で９００
ｂｐのＤＮＡ断片を与えるプラスミドのスクリーニン
グを次に行った。その結果、５個のうち１個が目的のプ
ラスミドであることがわかった。 【００４０】〔ＩＩ〕ｐＴＴ０６の構築〔動物細胞での
発現を制御できるプロモーター（ＳＶ４０）及びウロキ
ナーゼ（ＵＫ）プロモーターを上流部に付加させたジヒ
ドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡを組
み込んでなるプラスミドの構築〕【００４１】（ｉ）
ｐＵＫＰ−１の構築：ウロキナーゼ（ＵＫ）プロモー
ターをコードするＤＮＡの調製【００４２】■ プロ
ーブの作製 ヒトウロキナーゼｃＤＮＡの一部を含むプラスミドｐＵ
Ｋ４（特開昭６１−１７７９８７ 号公報） をＰｓｔ
Ｉで消化して、１％アガロースゲルで電気泳動後、約４
００ ｂｐの断片をエレクトロエリューションにより回
収した。このＤＮＡ断片０．４ μｇをマルチプライム
により〔α− ３２Ｐ］ｄＣＴＰ（アマーシャム， Ｐ
Ｂ１０２０５）でラベルした。 ＤＮＡ断片 ０．４ μｇ （８ μｌ）
│←１００
℃， ３分間加熱後、氷水上で急冷
│←マルチプライムｓｏｌｎ １を１５μ
ｌ 添加 │← ［α
− ３２Ｐ］ｄＣＴＰ ２５μｌ （２５０μＣｉ）
添加 │←マルチプライムｓｏ
ｌｎ ２を２ μｌ 添加
│←室温で１．５ 時間インキュベート
│←カラムバッ
ファー（０．１％ ＳＤＳ−１ｍＭ ＥＤＴＡ−１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ−１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
│ ｐＨ ７．４） で平衡化したニック
カラムに反応液をアプライ
↓←１００ μｌ ずつ分画した。 目的分画を集めてＣｅｒｅｎｋｏｖ ｃｏｕｎｔを調べ
た結果、９．６９×１０７ｃｐｍであった。ラベルの収
率は４１％ラベルの比放射活性は２．４ ×１０８ ｃ
ｐｍ／μｇと計算された。 【００４３】■ ＨＫＧ細胞ＤＮＡのサザンハイブリ
ダイゼーション Ｒｉｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．［（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．， １３， ２７５９−２７７１ （１９８
５）］ の報告によれば、ヒトウロキナーゼプロモータ
ー領域はヒト染色体ＤＮＡの５．８ ｋｂ ＥｃｏＲＩ
断片及び１２ ｋｂ のＢａｍＨＩ 断片として得られ
る。ＨＫＧ細胞高分子ＤＮＡをＥｃｏＲＩ 及びＢａｍ
ＨＩ で消化し各１０μｇ を０．８％アガロースゲル
で電気泳動後、■で調製したプローブを用いてサザンハ
イブリダイゼーションによりこれを確認した。その結果
、それぞれのサイズに相当する位置にシグナルが検出さ
れた。 【００４４】■ ５．８ ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片の調
製ＨＫＧ細胞高分子ＤＮＡ ２００μｇ を１０００ユ
ニットのＥｃｏＲＩ で３７℃、一夜消化した。０．８
％アガロースゲル（宝酒造、ＨＥ−１２ 泳動装置）で
電気泳動後、エチジウムブロマイド染色し、マーカーと
して泳動した。λ−ＤＮＡ ＨｉｎｄＩＩＩ消化物から
求めた５．８ ｋｂの位置を中心に２ｍｍ幅でゲルを切
り出し（ゲル２）、更にその上（ゲル１）下（ゲル３）
各３ｍｍ幅についてもゲルを切り出し、エレクトロエリ
ューションによりＤＮＡ断片を抽出した。抽出したＤＮ
Ａの一部を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、サザ
ンハイブリダイゼーションにより目的のＤＮＡ断片が含
まれているかどうか確認した。ゲル２から抽出したＤＮ
Ａ断片中に目的のウロキナーゼプロモーター領域が存在
すると推定された。 【００４５】■ ＤＮＡライブラリーの作製とスクリ
ーニング 前項で抽出したＤＮＡについてファージベクターλｇｔ
１０を用いてＤＮＡライブラリーを作製した。合計６．
５×１０５ 個の組み換えファージをプラークハイブリ
ダイゼーションにより一次スクリーニングした。一次ス
クリーニングで２８個のポジティブクローンが得られた
。これを更にプラークハイブリダイゼーションによる二
次スクリーニングしたところ、５個のポジティブクロー
ンに絞られた。ポジティブクローンの組み換えファージ
より簡易抽出法でＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩ 消化後
、１％アガロースゲルで電気泳動し、サザンハイブリダ
イゼーションを行った。その結果、２種類の組み換えフ
ァージがポジティブと判定された。クローン１，４，５
は同じクローン由来であり１種類とみなした。クローン
１５はこれらとは別のクローン由来である。 【００４６】■ ５．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ 断片のサ
ブクローニングサザンハイブリダイゼーションでポジテ
ィブと判定されたクローンよりファージＤＮＡを簡易抽
出法にて調製し、 ＥｃｏＲＩ消化した。これをフェノ
ールクロロホルム抽出し、水相を更にクロロホルム抽出
後エタノール沈澱した。プラスミドｐＵＣ９（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ 社）を ＥｃｏＲＩ消化後アルカリフォス
ファターゼ処理し、その一部（１μｇ）と上記ファージ
ＤＮＡの ＥｃｏＲＩ消化物をライゲーションし、 Ｅ
．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ を形質転換させた。形質転換
菌のいくつかについて簡易抽出法にてプラスミドＤＮＡ
を抽出し、 ＥｃｏＲＩ消化後１％アガロースゲルで電
気泳動した。その結果、いくつかのサブクローンが５．
８ ｋｂに相当するＤＮＡ断片を有していた。これらの
クローン１と４を更に各種制限酵素で消化後１％アガロ
ースゲルで電気泳動した。クローン１と４は切断様式は
異なったものの、いくつかの共通する断片も見られたの
で５．８ ｋｂ断片が逆方向に挿入されたものと推定さ
れた。それぞれのプラスミドとｐＵＫＰ１（図３参照）
及びｐＵＫＰ２と命名した 【００４７】■ ｐＵＫＰ１の制限酵素処理Ｒｉｃｃ
ｉｏ等（前述）が報告したヒトウロキナーゼ遺伝子の塩
基配列から推定した制限酵素切断部位地図を基に、この
図から推定される酵素断片が得られるかどうかを確認し
た。ｐＵＫＰ１を有するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を４
０μｇ／ｍｌ アンピシリン含有スパーブロス１００
ｍｌで３７℃、一夜培養後、アルカリ−ＳＤＳ法にてプ
ラスミドＤＮＡを調製した。このＤＮＡについて各種制
限酵素処理を行った。また、表１にはプラスミドについ
て推定される制限酵素断片のサイズとその有無について
示した。表１に示したように推定される断片はすべて検
出され、目的のヒトウロキナーゼプロモーター部位をコ
ードするＤＮＡ断片がクローニングされたことが確認さ
れた。 【００４８】 【表１】 【００４９】■ ｐＵＫＰ１の一部塩基配列の確認前
項で調製したプラスミドＤＮＡについてダイデオキシ法
にて塩基配列の一部を調べた結果、Ｒｉｃｃｉｏ等の報
告（前述）と一致した。 【００５０】（ｉｉ） ｐＴＴ０６の構築〔ＵＫプロモ
ーター，ｄｈｆｒ ｃＤＮＡ， ＳＶ４０ポリＡを含む
プラスミドの構築〕図４にプラスミド構築の概要を示し
た。ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（特開昭６３−１０５６７５
号公報）をＰｖｕＩＩ， ＰｓｔＩ で処理して得たＳ
Ｖ４０エンハンサー・プロモーター、ｄｈｆｒ ｃＤＮ
Ａ， ＳＶ４０ ｌａｔｅ ポリＡ付加シグナルを含む
２．５ ＫｂのＤＮＡ断片をさらにＨｉｎｄＩＩＩ で
切断しＳＶ４０エンハンサー・プロモーターを除いた２
．１ ＫｂのＤＮＡ断片を得た。このＨｉｎｄＩＩＩ−
ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平
滑末端した後、ｐＵＣ１９（宝酒造）のＳｍａＩ切断部
位にクローニングした。その結果、ｄｈｆｒ ｃＤＮＡ
の５’側（タンパクのＮ末側）がｐＵＣ１９のポリリン
カーのＨｉｎｄＩＩＩ の方を向いたｐＴＴ０４が得ら
れた。プラスミドの確認はＢａｍＨＩ 消化によりｐＵ
Ｃ１９のポリリンカー中のＢａｍＨＩ とＳＶ４０ポリ
Ａ付加シグナルの後ろにあるＢａｍＨＩ で切り出され
るＤＮＡ断片の大きさにより行った。ｐＴＴ０４からは
１．６ ｋｂのＤＮＡ 断片が得られた。次に、ｐＵＫ
Ｐ−１をＨｐａＩとＳｍａＩで切断し、ウロキナーゼ遺
伝子転写開始点より下流約３０ ｂｐ のＳｍａＩ認識
部位と転写開始点より上流約８００ ｂｐのＨｐａＩ認
識部位より切り出される約８００ ｂｐのＤＮＡ 断片
を回収した。このＵＫプロモーター部位を含むＤＮＡ断
片をｐＴＴ０４のｄｈｆｒ ｃＤＮＡの上流に挿入した
。すなわちｐＴＴ０４をＸｂａＩで消化後、ＢＡＰ処理
、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ＵＫプロ
モーターのＨｐａＩ−ＳｍａＩ断片とライゲーションを
行った。トランスフォーメーション後、得られたコロニ
ーよりｄｈｆｒ遺伝子とＵＫプロモーターが同じ転写方
向を向いたクローンを選択した。ｐＴＴ０４からはＵＫ
プロモーターＤＮＡ断片の５’近傍のＥｃｏＲＶ とｐ
ＵＣ１９のＳａｌＩでの切断で ２８０ ｂｐのＤＮＡ
断片を与えるプラスミドを選び、ｐＴＴ０６とした。プ
ラスミドはさらに、 ＥｃｏＲＶ＋ＳａｃＩ， Ｅｃｏ
ＲＶ ＋ＢａｍＨＩ の切断によりその構造を確認した
。ｐＴＴ０６の ＥｃｏＲＶ， ＳａｃＩ消化では、０
．９， １．８， ２，９ ｋｂの断片が、ＥｃｏＲＶ
，ＢａｍＨＩ消化では０．６， １．６， ３．５ ｋ
ｂの断片が得られた。これらの断片のサイズは、目的と
するプラスミドの制限酵素地図と一致した。 【００５１】［ＩＩＩ］ ｐＴＴ０８及びｐＴＴ０９
の調製〔ＵＫプロモーターに支配されるＤＨＦＲ転写ユ
ニットとＳＶ４０プロモーターに支配されるＡｓｎ２４
−ＰＰＡ 転写ユニットを含むプラスミドの構築〕図５
にプラスミド構築の概要を示した。ＳａｌＩ、 Ｅｃｏ
ＲＩによりｐＴＴ０６を消化することによりＵＫプロモ
ーター、ＤＨＦＲｃＤＮＡ、ＳＶ４０ｌａｔｅポリＡの
付加シグナルを含む２．９ ｋｂの断片を得た。一方、
〔Ｉ〕で調製したｐＨＲ２４をＳａｌＩ消化することに
より直鎖化した後、ＢＡＰにより５’脱リン酸を行った
。これら２本のＤＮＡ断片のライゲーションを行い、ｐ
ＨＲ２４の片方のＳａｌＩ末端とＵＫ−ＤＨＦＲ ＤＮ
Ａ断片の ＳａｌＩ 末端とをつないだ。続いてＴ４
ＤＮＡポリメラーゼを作用させｐＨＲ２４の残ったＳａ
ｌＩ末端とＵＫ−ＤＨＦＲ ＤＮＡ断片の ＥｃｏＲＩ
末端を平滑化し、再びライゲーションを行った。このラ
イゲーション液を用い、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を
トランスフォームし、トランスフォーマントの中からＤ
ＨＦＲ転写ユニットとｍ−ＰＰＡ 転写ユニットが逆方
向に配置されたｐＴＴ０８、同方向に配置されたｐＴＴ
０９を得た。それぞれのプラスミドの確認はＣｌａＩと
ＳａｌＩの二重消化とＢａｍＨＩ の消化により行った
。ｐＴＴ０８は、ＣｌａＩとＳａｌＩの消化で７．２
ｋｂと０．８ ｋｂの断片を、ＢａｍＨＩ の消化で３
．１ 、１．６ 、１．４ 、１．３ 及び０．３ ｋ
ｂの断片を与えた。一方ｐＴＴ０９は、ＣｌａＩとＳａ
ｌＩの消化で４．２ ｋｂと３．８ ｋｂの断片を、Ｂ
ａｍＨＩ の消化で３．４ 、１．６ 、１．４ 、１
．０及び０．３ ｋｂの断片を与えた。 【００５２】〔ＩＶ〕動物細胞への導入（ｉ） 材料
と方法 ■ プラスミドＤＮＡ（図６参照） ｐＴＴ０８：ＵＫプロモーターに支配されるＤＨＦＲ転
写ユニットとＳＶ４０プロモーターに支配さるＡｓｎ２
４−ＰＰＡ 転写ユニットが逆方向に配置されたプラス
ミド。 ｐＴＴ０９：ＵＫプロモーターに支配されるＤＨＦＲ転
写ユニットの下流にＳＶ４０プロモーターに支配される
Ａｓｎ２４−ＰＰＡ 転写ユニットが順方向に配置され
たプラスミド。 【００５３】■ 細胞 ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来ＤＨＦＲ欠損株 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ） ７
７， ４２１６ （１９８０） に記載の方法で調製、
増殖させた。 【００５４】■ メトトレキセート（ＭＴＸ）Ｓｉｇ
ｍａ 社製（＋）Ａｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎを０．１４
Ｍ ＮａＣｌ， ０．０２ Ｍ ＨＥＰＥＳ （ナカ
ライテスク）に溶解し、２ｍＭストック液を調製した。 これを培地に、目的の濃度になるように添加し使用した
。 【００５５】■ 培地と血清 ＭＥＭ−α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオ
シド入り）（Ｇｉｂｃｏ） ＭＥＭ−α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオ
シド無し）（Ｇｉｂｃｏ） それぞれ、ＭＥＭ−α（ｗ）、ＭＥＭ−α（ｗ／ｏ）と
略す。血清は牛胎児血清（ＦＣＳ）（三菱化成 ＭＨ０
１）を非働化し使用した。 【００５６】■ ＤＮＡ導入とトランスフェクタント
の選択 ＭＥＭ−α（ｗ），１０％ＦＣＳ で継代しているＤＨ
ＦＲ欠損ＣＨＯ 細胞をトリプシン（０．２５％， ト
リプシン、０．０２％ ＥＤＴＡ） 処理により、ディ
ッシュよりはがし１０７ ｃｅｌｌ／ｍｌ となるよう
Ｈａｎｋｓ液に懸濁した。この懸濁液０．５ ｍｌ，
５×１０６ 個の細胞に５ μｇのプラスミドＤＮＡを
エレクトロポレーション法により導入した。この細胞を
１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ となるように５枚の１０
ｃｍ ｄｉｓｈ に播いた。２日間、ＭＥＭ−α（ｗ）
，１０％ＦＣＳ で培養後、選択培地であるＭＥＭ−α
（ｗ／ｏ），１０％ＦＣＳ に交換した。２〜３日毎に
培地交換を行い、１０日間程培養するとコロニーの形成
が見られたので、各コロニーを９６ ｗｅｌｌｓ Ｐｌ
ａｔｅに移し、さらに培養を続けた。９６ ｗｅｌｌｓ
Ｐｌａｔｅ中で細胞がほぼＦｕｌｌ Ｓｈｅｅｔを形
成したところで各種培養上清中のプラスミノーゲン・ア
クチベーター（ＰＡ）活性を測定した。最も高い活性を
与えた細胞をスケールアップし、さらに再クローニング
を行った後、ＭＴＸによるＤＮＡ増幅に供した。 【００５７】■ ＭＴＸによる導入遺伝子の増幅■で
得られたＡｓｎ２４−ＰＰＡ 産生細胞をＭＥＭ−α（
ｗ／０）， １０％ＦＣＳ， １０ｎＭ ＭＴＸを培地
として５×１０４ ｃｅｌｌ／ｍｌ の濃度で６ ｃｍ
ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ， ３８０２） に２ ｍｌ
植え込んだ。培養３〜４日でかなりの細胞が死滅するが
、３日毎に培地交換を続けていると細胞の成長が見られ
た。２〜４週間で充分な細胞数になるので、次の段階の
ＭＴＸ 濃度の培地に継代した。このように １０ｎＭ
のＭＴＸ濃度からスタートして順次２〜４倍ずつＭＴ
Ｘ濃度を上げていった。各濃度のＭＴＸ耐性細胞はそれ
ぞれ６ ｃｍｄｉｓｈ 又は、１０ｃｍ ｄｉｓｈ （
Ｆａｌｃｏｎ，３８０３） で培養し、上清中のＰＡ活
性を測定した。 【００５８】■ 培養上清中のＰＡ活性測定フィブリ
ン平板法及びペプチドＭＣＡ法により、各細胞の培養上
清中のＰＡ活性を測定した。 【００５９】サンプル中の一本鎖プロ酵素含有量は次の
ようにして求めた。即ち、プラスミン処理したサンプル
とプラスミン非処理のサンプルの活性をペプチド−ＭＣ
Ａ法により求め、プラスミン処理サンプルの活性よりプ
ラスミン非処理サンプルの活性を減じた値を、一本鎖プ
ロ酵素の活性とした。尚、活性測定の標準品としてウロ
キナーゼ比較標準品（ミドリ十字社製、Ｌｏｔ．Ｓ−０
０４）を用いた。 【００６０】（ｉｉ） 結果 ■ 初期トランスフェクタントＡｓｎ２４−ＰＰＡ
産生図６に示したｄｈｆｒ遺伝子とＡｓｎ２４−ＰＰＡ
の位置関係の異なるプラスミド、ｐＴＴ０８とｐＴＴ
０９を、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞に導入した。本細胞は
ＤＨＦＲ活性を有していないので、ヌクレオシド合成が
できない。そこでｄｈｆｒをコードするＤＮＡを取り込
んだ細胞を選択するため、ヌクレオシドを含まない Ｍ
ＥＭ−α（ｗ／ｏ） 培地中でトランスフェクタントの
選択を行った。この培地中で形成されたコロニーを９６
ｗｅｌｌｓｐｌａｔｅに移し、ほぼ集密したところで
、上清中のＰＡ活性をフィブリン平板法により測定した
。その結果を表２に示した。 【００６１】 【表２】 【００６２】得られたコロニーのうち、ほぼ半数が、Ｐ
Ａ活性を示した。プラスミドの違いによるトランスフェ
クションのＰＡ発現への影響は見られなかった。 こ
れらの細胞のうち１０ ＩＵ／ｍｌ以上の活性を示した
ものをスケールアップし、再度活性を測定した。このう
ち１０ｃｍ ｄｉｓｈ で４７ ＩＵ／ｍｌのＰＡ活性
を示した細胞（ＰＴＴ０８をＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞に
導入した細胞） をＭＴＸによる増幅試験に供した。こ
の細胞は、再クローニングを行っても９６−ｗｅｌｌｓ
ｐｌａｔｅ ですべてのクローンが２０ＩＵ／ｍｌの
ＰＡ活性を示し、もともと均質な細胞集団であることが
わかった。 【００６３】■ ＭＴＸ添加によるＡｓｎ２４−ＰＰ
Ａ の産生量増大 ■で選択した細胞にＭＴＸを作用させ、ｄｈｆｒをコー
ドするＤＮＡの増幅と共に、近傍のＡｓｎ２４−ＰＰＡ
をコードするＤＮＡにも増幅が起こり、Ａｓｎ２４−
ＰＰＡ 産生量が増加するかどうかを調べた。図７にＭ
ＴＸ濃度と各耐性細胞上清のＰＡ活性の関係を示した。 ＭＴＸ濃度の濃度は１０ ｎＭ から始めたが、ほとん
どの細胞は、３〜４日で死滅した。ｄｈｆｒをコードす
るＤＮＡにＳＶ４０プロモーターを付けた転写ユニット
を持つプラスミドのトランスフェクタントでは、５０
ｎＭ のＭＴＸ濃度から始めてもそれほど細胞障害がな
かった。Ａｓｎ２４−ＰＰＡ 産生量は１０ｎＭＭＴＸ
耐性細胞では初期トランスフェクタントと比較して特に
上昇は認められなかったが、ＭＴＸ濃度を５０， １０
０， ２００， ５００ｎＭと上げるに従い、ほぼそれ
に比例するように上昇した。２００ ×１０４ ｃｅｌ
ｌｓ／１０ｃｍ ｄｉｓｈ の植え込み細胞数、４ 日
間の培養で初期トランスフェクタントで２０〜５０ＩＵ
／ｍｌ の産生量であったのが、５００ ｎＭ耐性細胞
では１０００ＩＵ／ｍｌ（６．７ｍｇ／１ｌ）前後にな
った。ＭＴＸ濃度をさらに１μＭ，２μＭ，４μＭと上
昇させ、各耐性細胞上清のＰＡ活性を調べたが、若干の
上昇が見られただけで本培養条件では、１０００〜２０
００ＩＵ／ｍｌ で頭打ちになった。 【００６４】■ 高濃度ＭＴＸ耐性細胞のＡｓｎ２４
−ＰＰＡ 産生 ０．５ μＭ 以上のＭＴＸ耐性細胞について、ＭＴＸ
添加培地、ＭＴＸ非添加培地の両方でＡｓｎ２４−ＰＰ
Ａ のプロフィールを調べた。 【００６５】１０ｃｍディッシュに、細胞を２００ ×
１０４ ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌ播き、培養２日目より上
清のＰＡ活性をフィブリン平板法により測定した。細胞
は、この条件で３〜４日でほぼＦｕｌｌ Ｓｈｅｅｔを
形成し、５〜６日頃より障害を受けはがれ始めた。ＭＴ
Ｘ添加培地で培養した細胞は、ＭＴＸ非添加培地での細
胞より僅かではあるが細胞増殖は遅かった。上清中のＰ
Ａ活性は細胞数を反映してか、ＭＴＸ非添加培地の方が
高かった。どの細胞も培養４〜５日で最高のＰＡ活性を
示し、それ以降ほとんど活性の上昇はなかった。本条件
で１μＭ ＭＴＸ耐性細胞で１８００−２０００ ＩＵ
／ｍｌ（１２−１３ｍｇ／ｌ） 、２ μＭ， ４μＭ
ＭＴＸ 耐性細胞で２７００−３２００ ＩＵ／ｍｌ
（１８−２１ ｍｇ／ｌ） のＰＡ活性に達した。しか
し、８ μＭ 耐性細胞では産生量が若干減少し、２０
００ ＩＵ／ｍｌのＰＡ活性しか示さなかた。尚、４
μＭ ＭＴＸ耐性細胞のＡｓｎ２４−ＰＰＡ 産生の様
子を表３に示す。細胞がＦｕｌｌ Ｓｈｅｅｔを形成し
た時、約１０７ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ の細胞数である
ので、１日当たりの最高産生高は、２００ ＩＵ（１．
３μｇ）／ｍｌ／ １０６ｃｅｌｌｓ／ｄａｙであった
。 【００６６】 【表３】 【００６７】■ 産生されたＡｓｎ２４−ＰＰＡ の
一本鎖含有率培養上清中のＰＡ活性をペプチド−ＭＣＡ
法で測定しサンプル中の一本鎖型プロ酵素量を調べた。 その結果、各サンプルの一本鎖含有率は３〜４日培養し
たもので８５％前後であった。また、一日だけの培養で
は９０％の一本鎖含有率が保たれていた。 【００６８】〔Ｖ〕従来技術との産生量の比較比較例 ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６；ＳＶ−４
０プロモーターの下流域にＤＨＦＲをコードするＤＮＡ
を配置してなるプラスミド） およびｐＨＲ２４を用い
て、常法により、ＳＶ４０プロモーターに支配されるＤ
ＨＦＲ転写ユニットと他のＳＶ４０プロモーターに支配
されるＡｓｎ２４−ＰＰＡ転写ユニットが逆方向に配置
されたプラスミドを構築し、対照プラスミドとした。シ
グナルステップにより、２μＭ のＭＴＸ に対して耐
性を獲得したＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞を用いて、対照プ
ラスミド（ＳＶ４０プロモーター型） と本発明プラス
ミド（ＵＫプロモーター型） とでＡｓｎ２４−ＰＰＡ
の産生量を比較した。結果を表４に示す。 【００６９】 【表４】 【００７０】実施例２ 実施例１−〔Ｉ〕で調製したｐＨＲ２４（１０μｇ）と
実施例１−〔ＩＩ〕で調製したｐＴＴ０６（１μｇ）と
を同時に５×１０６ 個のＣＨＯ−Ｋ１細胞由来ＤＨＦ
Ｒ欠損株に導入する以外は実施例１−〔ＩＶ〕記載の方
法に準じて行い、実施例１と同様にＡｓｎ２４−ＰＰＡ
の発現を確認した。 【００７１】実施例３ 〔Ｉ〕ｐＴＹ００７及びｐＴＹ００８の構築〔ＵＫプロ
モーターに支配されるＤＨＦＲ転写ユニットとＳＶ４０
プロモーターに支配されるヒトＡＴＩＩＩ 転写ユニッ
トをを含むプラスミドの構築］ （ｉ）オリゴヌクレオチドの合成自動ＤＮＡ合成機（前
記）を用いて、２種類のプローブ（プローブ−１、プロ
ーブ−２）及び、プライマー（プライマー−１）を作製
した。各々の塩基配列をそれぞれ以下に示す。 【００７２】プローブ−１（翻訳開始コドンからの５１
塩基配列の相補鎖ＤＮＡ） ５’−ＡＴＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＣＡＧ
ＡＧＧＴＴＡＣＡＧＴ ＴＣＣＴＡＴＣ
ＡＣＡＴＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴ−３’【００７３】プロ
ーブ−２（成熟ＡＴＩＩＩ の２４４ 番目のグリシン
残基のコドンからの５１塩基配列の相補鎖ＤＮＡ） ５’−ＣＡＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＴＧＧ
ＧＣＡＡＧＡＴＧＡＧ ＧＡＣＣＡＴＧ
ＧＴＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣ−３’【００７４】プラ
イマー−１（翻訳停止コドン（下線）を含む３２塩基Ｄ
ＮＡ。４塩基（＊印）が置換されている）
＊＊ ＊＊ ５’−Ｇ
ＴＧＴＴＡＡＧＴＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴ
ＴＧＣＡ【００７５】（ｉｉ） ヒトＡＴＩＩＩ をコ
ードするｃＤＮＡのクローニング ヒト肝臓細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をオ
リゴｄＴカラムを用いて単離し（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８ ：５２９４−５２９
９， １９７９）、ショ糖密度勾配遠心法により、サイ
ズ分画した（Ｓｃｈｗｅｉｎｆｅｓｔ ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９ ：４９７
９，１９８２）。適切な大きさのｍＲＮＡ（至２８Ｓ）
を材料に、常法（Ｏｋａｙａｍａ ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ． ２ ：１６１， １９８２）に従って
、λｇｔ１０（Ｈｕｙｎｔｈら、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ １ ： ４９， １９８５）をベクターとしてｃＤ
ＮＡを作製した。報告されているＡＴＩＩＩ のｃＤＮ
Ａの塩基配列をもとに作製した２種類のプローブ（プロ
ーブ−１・プローブ−２：前記）を用いてプラークハイ
ブリダイゼーション（Ｂｅｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
１９６ ： １８１， １９７７）を行った。陽性ク
ローンを単離し、ファージＤＮＡを調製した。制限酵素
ＥｃｏＲＩ で消化し、約１５００ｂｐのｃＤＮＡ挿入
部を切り出し、プラスミドｐＵＣ１１８（Ｖｉｅｉｒａ
ら、Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３
：３， １９８７） にリクローニングした。このプラ
スミドをｐＥＡ００１と命名し、その挿入配列に関して
ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４ ： ５４６３ １９
７７）によって塩基配列を確認した。 【００７６】（ｉｉｉ） ＡＴＩＩＩ 発現用プラスミ
ド（ｐＴＹ００７，ｐＴＹ００８）の作製 該プラスミドは以下の３種のプラスミドを用いて作製す
る。■ｐＥＡ００３：ｐＵＣ１１８にＡＴＩＩＩ ｃＤ
ＮＡを組み込んだプラスミドで、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃ
ｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ によりＡＴＩＩＩ
ｃＤＮＡのｐｏｌｙＡ付加配列の上流にＥｃｏＲＩ サ
イトとＨｉｎｄＩＩＩサイトが導入されている。■ｐＳ
Ｖ１１−ｄｈｆｒ：ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒはｐＳＶ２−
ｄｈｆｒのＥｃｏＲＩ サイト近傍にＸｂａＩサイトを
導入したプラスミドで、ＳＶ４０由来の初期プロモータ
ーとエンハンサー、マウスｄｈｆｒｃＤＮＡ、ＳＶ４０
由来のスプライシングジャンクションとｐｏｌｙＡ付加
配列を含んでいる。 ■ｐＴＴ０６：実施例１のｐＴＴ０６に相当する。 【００７７】ｐＥＡ００３の構築 部位特異的塩基置換法（Ｓａｙｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６ ： ７９１， １９８８）
により、プライマー（前記）を用いて、ｐＥＡ００１
中のＡＴＩＩＩ のコード領域とポリアデニル酸テール
の間にＨｉｎｄＩＩＩ 及び、ＥｃｏＲＩ サイト設け
た。このプラスミドをｐＥＡ００３（図８参照）と命名
した。 ｐＥＡ００３はＥｃｏＲＩ で消化することにより、約
１４００ｂｐのポリアデニル酸テールを含まないＡＴＩ
ＩＩ のｃＤＮＡを取り出すことが可能である。 【００７８】ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒの構築ｐＳＶ２−ｄ
ｆｈｒ（前記）をＥｃｏＲＩ で消化し、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を用いて平滑末端とした
後、ＸｂａＩリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿
入した。このプラスミドをプラスミドｐＳＶ１１−ｄｈ
ｆｒとした。 【００７９】ｐＴＴ０６の構築 実施例１記載の方法に従った。 【００８０】ｐＴＹ００７及びｐＴＹ００８の作製ＡＴ
ＩＩＩ 発現用プラスミド（ｐＴＹ００７及びｐＴＹ０
０８）の構築方法を図８に示した。まず、ｐＥＡ００３
よりＥｃｏＲＩ でＡＴＩＩＩ ｃＤＮＡを切り出し、
ｆｉｌｌ−ｉｎ の後、ＢｇｌＩＩ リンカーと結合し
た。一方、ｐＳＶ１１−ｄｈｆｒはＨｉｎｄＩＩＩ 消
化、ｆｉｌｌ−ｉｎ の後、ＢｇｌＩＩ リンカーと結
合し、さらに、ＢｇｌＩＩ で消化してマウスｄｈｆｒ
ｃＤＮＡを取り除いた。これらをライゲーションし、Ｓ
Ｖ４０プロモーターの支配下にＡＴＩＩＩ ｃＤＮＡを
発現するプラスミド（ｐＴＹ００６）を作製した。 【００８１】一方、ｐＴＴ０６を制限酵素で消化後、ｆ
ｉｌｌ−ｉｎ し、ＵＫプロモーターの支配下にマウス
ｄｈｆｒｃＤＮＡを発現するユニット（ＥｃｏＲＩ／Ｈ
ｉｎｄＩＩＩフラグメント） を単離した。制限酵素処
理の際には、ＡｐａＬＩ を用いて発現ユニット以外の
部分を切断することにより、目的のフラグメントの分離
を容易にした。得られたｄｆｈｒ発現ユニットは、あら
かじめＸｂａＩ消化とｆｉｌｌ−ｉｎ 処理を行ったｐ
ＴＹ００６とライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１
０１に導入した。出現したコロニーをスクリーニングし
た結果、ＳＶ４０プロモーターの制御下にヒトＡＴＩＩ
Ｉ を発現するユニットと、ＵＫ−プロモーターの制御
下にマスウｄｈｆｒを発現するユニットが同じ向きに配
置された目的のプラスミド（ｐＴＹ００７）を持つ株を
得た。 【００８２】次に、ｐＴＹ００７のＸｂａＩサイトがｆ
ｉｌｌ−ｉｎ とライゲーションの後再生される事を利
用して、ｄｈｆｒ発現ユニットが逆向きに挿入されたプ
ラスミド（ｐＴＹ００８）を構築した。まず、ｐＴＹ０
０７をＸｂａＩで消化し、酵素を熱失活した後そのまま
ライゲーション反応を行った。反応産物でＥ．ｃｏｌｉ
ＨＢ１０１及びＪＭ１０９ を形質転換し、得られた
コロニーを分析した結果、ＪＭ１０９ のコロニーから
ｐＴＹ００８を持つクローンを得た。 【００８３】尚、ｐＴＹ００７の制限酵素地図と遺伝子
の配置を図９に示した。図９において、１：ＳＶ４０の
ＰｖｕＩＩ サイト（２７０） からＨｉｎｄＩＩＩ（
５１７１） までの領域を含む約３４０ ｂｐのフラグ
メント、２：ポリアデニレーションシグナルとＰｏｌｙ
（Ａ）配列は含まず、また両末端のＥｃｏＲＩ サイ
トは再生されている約１．５ ｋｂのヒトＡＴＩＩＩ
ｃＤＮＡ、３：ＳＶ４０のＭｂｏＩ（４７１０）からＭ
ｂｏＩ（４１００）までの領域（スプライシングジャン
クション）と、その下流にＳＶ４０のＢｇｌＩ（２７７
３）からＥｃｏＲＩ（１７８２）までの領域（ポリアデ
ニレーションシグナル） を含む約１．６ ｋｂのフラ
グメント、４：ヒトウロキナーゼのプロモーター領域を
含む約８００ｂｐのフラグメント、５、マウスｄｈｆｒ
ｃＤＮＡ を含む約７４０ｂｐのフラグメント、６：
３と異なる点は、ポリアデニレーションシグナルの部分
がＳＶ４０のＰｓｔＩ部位（１９８８）までしか含まれ
ていないことであり、３’末端のＥｃｏＲＩ 部位は再
生されているフラグメント、７：ｐＢＲ３２２由来の１
．８４ ｋｂ の、ＥｃｏＲＩ（４３６１） からＰｖ
ｕＩＩ（２０６６） までのフラグメントをそれぞれ示
している。 【００８４】〔ＩＩ〕動物細胞への導入（ｉ） 材料
と方法 ■ プラスミド ｐＴＹ００７：ＵＫプロモーターに支配されるＤＨＦＲ
転写ユニットとＳＶ４０プロモーターに支配さるヒトＡ
ＴＩＩＩ 転写ユニットが順方向に配置されたプラスミ
ド。 ｐＴＴ００８：ＵＫプロモーターに支配されるＤＨＦＲ
転写ユニットの下流にＳＶ４０プロモーターに支配され
るヒトＡＴＩＩＩ 転写ユニットが逆方向に配置された
プラスミド。プラスミドは調製後、塩化セシウム平衡密
度勾配遠心法で精製した。 【００８５】■ 細胞 ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来ＤＨＦＲ欠損株 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ） ７
７， ４２１６ （１９８０） に記載の方法で調製、
増殖させた。 【００８６】■ メトトレキセート（ＭＴＸ）Ｓｉｇ
ｍａ 社製（＋）Ａｍｅｔｈｏｐｔｅｒｉｎを０．８２
％（ｗ／ｖ） ＮａＣｌ， ０．０２ ％（ｗ／ｖ）
Ｎａ２ＨＰＯ４， ０．５６％（ｗ／ｖ） ＨＥＰＥＳ
（ナカライテスク）に溶解し、２ｍＭストック液を調製
した。これを培地に、目的の濃度になるように添加し使
用した。 【００８７】■ 培地と血清 ＭＥＭ−α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオ
シド入り）（Ｇｉｂｃｏ） ＭＥＭ−α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオ
シド無し）（Ｇｉｂｃｏ） それぞれ、ＭＥＭ−α（ｗ）、ＭＥＭ−α（ｗ／ｏ）と
略す。血清は牛胎児血清（ＦＣＳ）（三菱化成 ＭＨ０
１）を非働化し使用した。 【００８８】■ ＤＮＡ導入とトランスフェクタント
の選択 ＭＥＭ−α（Ｗ）， １０％ＦＣＳ で継代しているＤ
ＨＦＲ欠損ＣＨＯ 細胞をトリプシン（０．２５ ％ト
リプシン）処理により、ディッシュよりはがし、１．５
×１０５ 個の細胞を１０ｃｍディッシュに植え込み、
リン酸カルシウム法によりトランスフェクションを行っ
た。リン酸カルシウム沈澱は、ファルマシア社のＣｅｌ
ｌＰｈｅｃｔ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＫｉｔを用い
て調製した。まず、１０μｇ 発現プラスミドを２４０
μｌ の滅菌水に溶解した。ここにキットのＡ液を２
４０ μｌ 添加し、混合した後、室温で１０分間放置
した。ここに４８０ μｌ のＢ液を添加し、室温で１
５分間放置した（全容 ９６０μｌ ）。得られたリン
酸カルシウム沈澱は、時間を置かずに細胞に添加した。 ５．５時間培養した後、培地を除去、洗浄後、３ｍｌの
グリセロール液（組成は以下の通り）を添加した。 【００８９】 ５０％ グリセロール ３０ｍｌ２×ＨＢ
Ｓ＊） ５０ｍｌＨ２ Ｏ
２０ｍｌ＊
）２×ＨＢＳ（ｐＨ７．１）：１．６３６ ％（ｗ／ｖ
） ＮａＣｌ， １．１１８ ％（ｗ／ｖ） ＨＥＰＥ
Ｓ，０．０４％（ｗ／ｖ） Ｎａ２ＨＰＯ４ 【００９
０】３７℃で正確に２分間インキュベート後、グリセロ
ール液を除去し、洗浄後、３日間、ＭＥＭ−α（ｗ），
１０％ＦＣＳ で培養後、選択培地であるＭＥＭ−α（
ｗ／ｏ），１０％ＦＣＳ に交換した。２〜３日毎に培
地交換を行い、２週間程度後、トランスフェクタントの
コロニー形成が見られた。トランスフェクタントを９６
穴プレートに０．７細胞／ｗｅｌｌの割合で植え込んだ
。各ｗｅｌｌを検鏡し、１個のクローンのみが成育して
いるｗｅｌｌを選択した。そして上清のＡＴＩＩＩ 量
を測定した。高い活性を与えた細胞をスケールアップし
、さらに再クローニングを行った後、ＭＴＸによるＤＮ
Ａ増幅に供した。 【００９１】■ ＭＴＸによる導入遺伝子の増幅■で
得られたＡＴＩＩＩ 産生細胞をＭＥＭ−α（ｗ／ｏ）
，１０％ＦＣＳ ； ５ｎＭＭＴＸを培地として２×１
０５ 細胞／ｗｅｌｌ の濃度で６ウェルプレートに植
え込んだ。３日毎に培地交換を続けていると耐性株の出
現が得られた。２〜４週間で充分な細胞数になるので、
次の段階のＭＴＸ濃度の培地に継代した。このように５
ｎＭのＭＴＸ濃度からスタートして５〜２０μＭのＭＴ
Ｘ濃度まで順次２〜４倍づつＭＴＸ濃度を上げていった
。各濃度のＭＴＸ耐性細胞はそれぞれ６ウェルプレート
にて培養し、上清中のＡＴＩＩＩ 量を測定した。 【００９２】■ ＡＴＩＩＩ 産生量の検出ＡＴＩＩ
Ｉ の遺伝子を導入したＣＨＯ細胞を１０％ＦＣＳを加
えたＭＥＭ−αに懸濁し、６ウェルプレートまたは直径
１０ｃｍのペトリディッシュで培養した。３日毎に培地
を変換し、細胞が飽和密度（約１×１０６ 細胞／ｍｌ
）に達した後、培地を交換し、更に３日間培養を行った
。培養上清を回収し、上清中のＡＴＩＩＩ をＥＬＩＳ
Ａ法（ｓｔｅｐｈｅｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８４ ： ３８８６， １９
８７）により測定した。また、細胞を０．２５％トリプ
シン（Ｓｉｇｍａ 社から購入） 処理で回収し、細胞
数を計測した。 【００９３】（ｉｉ） 結果 ■ 初期トランスフェクタントのＡＴＩＩＩ 産生ｐ
ＴＹ００７とｐＴＹ００８を、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞
に導入した。ｐＴＹ００７を導入した１４０株、ならび
にｐＴＹ００８を導入した８０株につき、ｄｈｆｒをコ
ードするＤＮＡを組み込んだ細胞を選択するため、ヌク
レオシドを含まないＭＥＭ−α（ｗ／ｏ）培地中でトラ
ンスフェクトタントの選択を行った。この培地中で形成
されたコロニーを９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ に移し
、ほぼ集密したところで、上清中（１００ μｌ／ｗｅ
ｌｌ） のＡＴＩＩＩ 量をＥＩＡ法で測定した。 【００９４】ｐＴＹ００７を導入した細胞とｐＴＹ００
８を導入した細胞では、産生量に差異が見られた。ｐＴ
Ｙ００７を導入した細胞では１０００ ｎｇ／ｍｌ以上
の高産生株があったのに対し、ｐＴＹ００８を導入した
細胞のＡＴＩＩＩ 産生量は一般的に低かった（図１０
）。 【００９５】■ ＭＴＸ添加によるＡＴＩＩＩ 量の
産生量増大 ｐＴＹ００７を導入した１４０株の中からＡＴＩＩＩ
産生量の高い４０株について、メトトレキセート（ＭＴ
Ｘ）処理を行い、遺伝子増幅によっる産生量の上昇を試
みた。 【００９６】代表的なＭＴＸ耐性株について、０〜２０
μＭ ＭＴＸに対する耐性時のＡＴＩＩＩ 量の産生
量を表５及び表６に示した。 【００９７】 【表５】 【００９８】 【表６】 【００９９】表５では、培養液量あたりの産生量（ｎｇ
／ｍｌ／３ ｄａｙｓ） 、表６では細胞あたりの産生
量（ｎｇ／１０６ ｃｅｌｌｓ／３ｄａｙｓ）で表示し
た。また各株について、最大のＡＴＩＩＩ 産生を示し
た時の産生量とＭＴＸ耐性度、更にＭＴＸ処理による産
生量の増加率を、表７に示した。 【０１００】 【表７】 【０１０１】産生量は、ＭＴＸ処理前の株で培養液量あ
たり、１００ 〜１０００ ｎｇ／ｍｌ、細胞あたりで
は、２０〜６００ｎｇ／１０６ ｃｅｌｌｓ であった
。一般的な傾向としてＭＴＸ耐性度が増すにつれて産生
量は増加し、プラトーに達した後は、減少した。最大産
生に対するＭＴＸ耐性度は株によって異なっていた。Ａ
ＴＩＩＩ の最大産生量は株の種類をによって異なって
いたが、培養液量あたりでは１０μｇ／ｍｌ／３ ｄａ
ｙｓ） 、細胞あたりでも１０μｇ／１０６ ｃｅｌｌ
ｓ／３ ｄａｙｓ 程度であった。
【図１】ｐＴＴ０３及びｐＨＲ２４の調製工程を示す。
【図２】ｐＴＴ０３の調製材料となるｐＵＨ３及びｐＵ
Ｈ７の構造を示す。
Ｈ７の構造を示す。
【図３】サブクローンｐＵＫＰ１の構造を示す。
【図４】ｐＴＴ０６の調製工程を示す。
【図５】ｐＴＴ０８及びｐＴＴ０９の調製工程を示す。
【図６】ｐＴＴ０８及びｐＴＴ０９の構造を示す。
【図７】ＭＴＸ耐性細胞のＡｓｎ２４−ＰＰＡ 産生量
を示す。
を示す。
【図８】ＡＴＩＩＩ 発現用プラスミド（ｐＴＹ００７
及びｐＴＹ００８）の調製工程を示す。
及びｐＴＹ００８）の調製工程を示す。
【図９】ｐＴＹ００７の含まれる遺伝子とその制限酵素
地図を示す。
地図を示す。
【図１０】ｐＴＹ００７及びｐＴＹ００８を導入したＣ
ＨＯ細胞におけるＡＴＩＩＩ 産生クローンの分布を示
す。
ＨＯ細胞におけるＡＴＩＩＩ 産生クローンの分布を示
す。
１： ＳＶ４０起源エンハンサー／プロモーター２：
ヒトＡＴＩＩＩ ｃＤＮＡ ３： ＳＶ４０スプライシングジャンクション及びポ
リアデニレーションシグナル ４： ヒトウロキナーゼプロモーター５： マウス
ｄｈｆｒ ｃＤＮＡ ６： ＳＶ４０スプライシングジャンクション及びポ
リアデニレーションシグナル ７： Ａｍｐｒ
ヒトＡＴＩＩＩ ｃＤＮＡ ３： ＳＶ４０スプライシングジャンクション及びポ
リアデニレーションシグナル ４： ヒトウロキナーゼプロモーター５： マウス
ｄｈｆｒ ｃＤＮＡ ６： ＳＶ４０スプライシングジャンクション及びポ
リアデニレーションシグナル ７： Ａｍｐｒ
Claims (6)
- 【請求項１】 動物細胞での発現を制御できるプロモ
ーター及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを上流部
に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコー
ドするＤＮＡを組み込んでなるプラスミド。 - 【請求項２】 動物細胞での発現を制御できるプロモ
ーターを上流部に付加させた異種蛋白をコードするＤＮ
Ａ及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを上流部に付
加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードす
るＤＮＡを組み込んでなるプラスミド。 - 【請求項３】 請求項２のプラスミドを用いて形質転
換させた動物細胞。 - 【請求項４】 動物細胞での発現を制御できるプロモ
ーターを上流部に付加させた異種蛋白をコードするＤＮ
Ａを担持させたプラスミド及びウロキナーゼ（ＵＫ）プ
ロモーターを上流部に付加させたジヒドロ葉酸還元酵素
（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡを担持させたプラスミ
ドを同時に用いて形質転換させた動物細胞。 - 【請求項５】 請求項３の動物細胞を培養して異種蛋
白質を発現させることによる異種蛋白質の製造方法。 - 【請求項６】 請求項４の動物細胞を培養して異種蛋
白質を発現させることによる異種蛋白質の製造方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3093105A JPH04218383A (ja) | 1990-05-14 | 1991-03-29 | プラスミド、形質転換された動物細胞及び異種蛋白質の製造方法 |
| CA002042005A CA2042005A1 (en) | 1990-05-14 | 1991-05-07 | Plasmids, transformed animal cells and process for producing foreign protein |
| EP91304271A EP0457527A1 (en) | 1990-05-14 | 1991-05-13 | Plasmids, transformed animal cells and process for producing foreign protein |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-123573 | 1990-05-14 | ||
| JP12357390 | 1990-05-14 | ||
| JP3093105A JPH04218383A (ja) | 1990-05-14 | 1991-03-29 | プラスミド、形質転換された動物細胞及び異種蛋白質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04218383A true JPH04218383A (ja) | 1992-08-07 |
Family
ID=26434545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3093105A Pending JPH04218383A (ja) | 1990-05-14 | 1991-03-29 | プラスミド、形質転換された動物細胞及び異種蛋白質の製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0457527A1 (ja) |
| JP (1) | JPH04218383A (ja) |
| CA (1) | CA2042005A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8033319B2 (en) | 2008-04-28 | 2011-10-11 | Sumitomo Metal Industries, Ltd. | Method for continuous casting of steel and electromagnetic stirrer to be used therefor |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994003598A1 (en) * | 1992-08-04 | 1994-02-17 | The Green Cross Corporation | Antiallergic agent |
| US5874404A (en) * | 1992-08-04 | 1999-02-23 | Chisei Ra | Immunoglobulin E receptor α-chain inhibits IgE production and secondary allergic responses |
| WO2004070030A1 (ja) * | 2003-02-03 | 2004-08-19 | Immuno Japan Inc. | 動物細胞用高発現ベクター |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63105675A (ja) * | 1986-10-23 | 1988-05-10 | Green Cross Corp:The | ヒトウロキナ−ゼの製造方法 |
| EP0281246A3 (en) * | 1987-02-04 | 1989-07-12 | Invitron Corporation | Method to enhance amplification and expression of foreign genes |
-
1991
- 1991-03-29 JP JP3093105A patent/JPH04218383A/ja active Pending
- 1991-05-07 CA CA002042005A patent/CA2042005A1/en not_active Abandoned
- 1991-05-13 EP EP91304271A patent/EP0457527A1/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8033319B2 (en) | 2008-04-28 | 2011-10-11 | Sumitomo Metal Industries, Ltd. | Method for continuous casting of steel and electromagnetic stirrer to be used therefor |
| US8191611B2 (en) | 2008-04-28 | 2012-06-05 | Sumitomo Metal Industries, Ltd. | Method for continuous casting of steel and electromagnetic stirrer to be used therefor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0457527A1 (en) | 1991-11-21 |
| CA2042005A1 (en) | 1991-11-15 |
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