JPH04211385A

JPH04211385A - Production of l-malic acid polymer by microorganism

Info

Publication number: JPH04211385A
Application number: JP3055624A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Tabuchi; 田渕　武士
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1990-03-02
Filing date: 1991-02-28
Publication date: 1992-08-03
Anticipated expiration: 2014-11-02
Also published as: JP2971158B2

Abstract

PURPOSE:To obtain the title polymer in high productivity by incubating fungi belonging to Aureobasidium capable of producing the title polymer. CONSTITUTION:The objective L-malic acid polymer can be obtained by incubating fungi belonging to Aureobasidium (pref. Aureobasidium Sp.A-91 strain) capable of producing the title polymer and by collection from the resulting cultured product.

Description

【発明の詳細な説明】【０００１】【産業上の利用分野】本発明は、微生物によるＬ−リン
ゴ酸重合物（ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｍａｌｉｃ　ａｃｉｄ，　
　以下ＰＭＬＡと称する）の製造法に関する。【０００２】ＰＭＬＡは、生体内分解吸収性高分子化合
物として、生体吸収性縫合系、骨接合用材料、人工腱、
人工血管及びドラッグデリバリーの高分子キャリアー等
として、医薬及び医療の分野での用途が大いに期待され
ている。【０００３】【従来の技術】ＰＭＬＡは、リンゴ酸モノベンジル又は
モノメチルエステルを原料とする化学合成法［Ｒｅｐｏ
ｒｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆａｃｕｌｔｙ　Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ，　Ｔｏｔｔｏｒｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
，　８，　１２４　（１９７７）　］、ベンジルマロラ
クトネートを開環重合させる化学合成法［米国特許第４
２６５２４７号明細書］、直接熱縮合法［高分子論文集
、４４、　７０１　（１９８７）］等の化学合成法によ
る製造法が報告されている。【０００４】また、微生物を用いたＰＭＬＡの製造では
、ペニシリウム・サイクロピウム　（Ｐｅｎｉｃｉｌｌ
ｉｕｍ　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）を用いた固体培養による
製造例［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３３　（４），　４５９　
（１９６９）］が報告されている。【０００５】【発明が解決しようとする課題】しかしながら、化学合
成法による製造では原料が高価であるばかりか、多数の
工程を必要とするため収率が低いという欠点を有してい
る。【０００６】一方、前記したペニシリウム・サイクロピ
ウムを用いた固体培養法による製造では、収率が低く、
また精製に多工程を要するため実際的な方法とは言い難
い。従って、従来より安価な原料から高収量で製造する
方法の開発が望まれていた。【０００７】【課題を解決するための手段】本発明は、オウレオバセ
ディウム属に属するＰＭＬＡ産生菌を培養し、培養物よ
りＰＭＬＡを採取することを特徴とするＰＭＬＡの製造
法である。【０００８】オウレオバセディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓ
ｉｄｉｕｍ）　属に属する微生物には、従来プルラリア
（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）属に分類され、後にオウレオ
バセディウム属に再分類された微生物も含まれ、総括的
に黒色酵母（ｂｌａｃｋ　ｙｅａｓｔ）　とも言われて
いる［Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ　ｅｔ　Ｍｙｃｏ
ｌｏｇｉａ　Ａｐｐｌｉｃａｔａ，　１２，　１　（１
９５９），　　同　１７，　１　（１９６２）　］。従
って、ＰＭＬＡを産生し得る黒色酵母であれば、これら
をも本発明の範囲に含むものである。そのような微生物
の具体例としては、例えば以下のものが挙げられる。【０００９】オウレオバセディウム・プルランス（Ａｕ
ｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）　ＩＦ
Ｏ　　４４６４、同ＩＦＯ　　４４６５、同ＩＦＯ　　
４８７５、同ＩＦＯ　　７７５７、同ＡＴＣＣ　　７３
０５、オウレオバセディウム・マンソニー（Ａｕｒｅｏ
ｂａｓｉｄｉｕｍ　ｍａｎｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ　　６４
２１、同ＩＦＯ　　８１９４、同ＩＦＯ　　９２３３、
同ＡＴＣＣ　　１４２４９、オウレオバセディウム・ミ
クロスティクタム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｍｉ
ｃｒｏｓｔｉｃｔｕｍ）ＩＦＯ　　３２０６６、同ＩＦ
Ｏ　　３２０６７、同ＩＦＯ　　３２０６８、同ＩＦＯ
　　３２０６９、オウレオバセデイウム（Ａｕｒｅｏｂ
ａｓｉｄｉｕｍ）　・Ｓｐ．Ａ−９１株及びこれらの変
異株を含むものである。【００１０】上記菌株の中でオウレオバセデイウム・Ｓ
ｐ．Ａ−９１株は、本発明者によって土壌中から新たに
分離された菌株であり、その菌学的性状は次のとおりで
ある。Ａ．培地上の生育状況ａ）顕微鏡的所見（ＹＭ寒天培地で２５℃、５日間培養
後）栄養細胞の大きさ：３〜６×３〜２０μｍ　栄養細胞の
形状　　：菌系及び酵母様の単胞、卵形等の形状を示すｂ）寒天斜面（ポテトグルコース寒天培地）生育：良好光沢：無し色調：３日以上培養すると白色クリーム状から暗色、黒
色のコロニーとなる。ｃ）液体培養ＹＭ液体培地：生育良好Ｂ．子のう胞子の形成ポテトグルコース寒天培地：形成せずコーンミール寒天培地　　　　：形成せずＹＭ寒天培地
　　　　　　　　　　　　：形成せずＶ８　寒天培地　
　　　　　　　　　　　：形成せずＣ．生理学的性質酸素要求性：好気的生育温度　　：５〜３５℃ 生育ｐＨ　　：２〜９ＫＮＯ３　の利用性（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ　合成培地）
：有り（ＮＨ４　）２　ＳＯ４　の利用性（Ｗｉｃｋｅ
ｒｈａｍ　合成培地）：有り尿素の分解：有りゼラチンの液化：無し有機酸の生成：有りビタミンの要求性（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ　合成培地）：
無しＤ．資化可能な炭素源（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ　合成
培地）グルコース、シュークロース、マルトース、アラ
ビノース、キシロース、マンノース、フラクトース、ト
レハロース、グリセロース、マンニトール、デンプン、
エタノール、クエン酸、イソクエン酸、コハク酸、ＤＬ
−リンゴ酸、フマル酸。【００１１】上記の菌学的性質を有する本菌株の分類学
上の位置を“Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒａ　ｏｆ　Ｆｕｎｇｉ
Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ　ｉｎ　ｐｕｒｅ　ｃｕｌｔｕ
ｒｅ　”（第３版）Ｊ．Ａ．　Ｖｏｎ　Ａｒｘ編　Ｌｕ
ｂｒｅｃｈｔ　＆　ｃｒａｍｅｒ社刊（１９８１）によ
り検討した結果、オウレオバセディウム属に属する新菌
株であることが判明し、これをオウレオバセディウム・
Ｓｐ．Ａ−９１株と命名した。【００１２】本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に「微生物受託番号　　微工研菌寄第Ｐ−１１９６６
号」として寄託されている。【００１３】以下に、本発明のＬ−リンゴ酸重合物製造
方法について述べる。【００１４】上記のオウレオバセディウム属菌を培養す
るには、通常の方法に従い、炭素源、窒素源、無機塩等
の栄養分を含む培地を用いて行うことができる。【００１５】培地の炭素源としては、例えば糖質原料と
くにグルコースが好適に用いられ、その添加濃度は１〜
３０重量％、好ましくは１〜２０重量％が適当である。窒素源としては、微生物の培養に際して通常使用される
窒素含有の有機又は無機物質、例えば、アンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム
、コハク酸アンモニウムなどの有機酸アンモニウム塩、
尿素等を単独もしくは混合して用いることができ、また
、無機塩としては、例えば、リン酸−水素カリウム、リ
ン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等を用いること
ができる。この他に菌の生育に必要であれば、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、カ
ザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し用い
ることができる。【００１６】培養は振盪、通気撹拌等の好気的条件下で
行われ、培養温度は一般に２０〜４０℃、好ましくは２
２〜３５℃が好適である。培養ｐＨは２〜１０、好まし
くは、３〜９、さらに好ましくは、３〜７である。【００１７】培養期間は、特に制限されるものではない
が、通常１日〜１０日間で行われる。【００１８】以上述べた培養法により培養液中に生成す
るＰＭＬＡの培養液からの分離・精製は、それ自体既知
の方法に従い、例えば、イオン交換樹脂処理法、沈澱法
例えば、アセトン、メタノール、エタノール、ｎ−プロ
パノール、イソプロパノール、メチルエチルケトン等の
有機溶媒沈澱法等を適宜組合わせて行うことができる。【００１９】以上に述べた方法で製造されるＰＭＬＡの
物理化学的性質は、以下のとおりである。（１）ＧＰＣ法により測定した分子量は、約２，０００
〜５０，０００の範囲内である。（２）１Ｎ硫酸溶液による加水分解処理により、Ｌ−リ
ンゴ酸のみが生成する。【００２０】【発明の効果】本発明によれば、オウレオバセディウム
属に属するＰＭＬＡ産生菌を培養して、高い生成量でＰ
ＭＬＡを得ることができる。【００２１】【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。しかしながら、下記の実施例は本発明につい
て具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり
、これによって本発明は何ら限定されるものではない。【００２２】実施例１培地（グルコース１２％、ＫＨ２　ＰＯ４　０．０５％
、ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ０．０５％、酵母エキス０
．０２％；ｐＨ無調整）５０ｍｌを５００ｍｌ容三角フ
ラスコに分注し、滅菌（１２１℃、１５分間）した後、
別に滅菌した６％硝酸アンモニウム溶液１ｍｌを添加し
た。培養は、該調製培地に炭酸カルシウム１ｇ　を添加
後、第１表に示した微生物を植菌し、２５℃にて３日間
振盪培養を行い、これを前培養物とした。本培養は上記
培地２，０００ｍｌを５，０００ｍｌ容三角フラスコに
分注、滅菌（１２１℃、１５分間）した後、別に滅菌し
た６％硝酸アンモニウムの４０ｍｌと乾熱滅菌した炭酸
カルシウム６０ｇ　を添加後、前培養物の２（ｖ／ｖ）
　％を添加して２５℃にて８日間振盪培養を行った。【００２３】培養終了後、培養物の２００ｍｌを遠心分
離（８，０００ｒｐｍ　、１５分間、室温）後、得られ
た上清液の１００ｍｌにメタノール２００ｍｌを徐々に
添加すると生成物が析出沈澱した。該沈澱物を遠心分離
（８，０００ｒｐｍ　、１０分間、４℃）にて分離し、
メタノール−水（２：１）の混液で洗浄した後、減圧下
デシケーター中で乾燥させ、秤量した。結果を表１に示
した。【００２４】　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表１　　　　　　────────
───────────────────────　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　＊　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　○　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　菌株名　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　生成量　　　（ｍｇ
）　　　　　　　　　　　　　　　─────────
──────────────────────　　　
　　　　　　　　　　　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕ
ｍ　　　　　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　　　　　　　　　　
４４６４　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ＩＦＯ　　　　　　　　　　７７５７　　　　　　　　
　　　　　　４２００　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　　　　　　　　　　４
８７５　　　　　　　　　　　　　　　　５００　　　
　　　　　　　　　　　　　　　──────────
─────────────────────　　　　
　　　　　　　　　　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ
　　　　　ｍａｎｓｏｎｉｉ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　　　　　　　　　　６
４２１　　　　　　　　　　　　　　　　１５０　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＩＦ
Ｏ　　　　　　　　　　９２３３　　　　　　　　　　
　　　　３８００　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　ＡＴＣＣ　　　　　　１４２４９　
　　　　　　　　　　　　　　　　　５０　　　　　　
　　　　　　　　　　　　─────────────
──────────────────　　　　　　　
　　　　　　　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　　　
　　ｍｉｃｒｏｓｔｉｃｔｕｍ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ＩＦＯ　　　　　　　　３２０６６　
　　　　　　　　　　　　　　　９２０　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　　　
　　　　　３２０６８　　　　　　　　　　　　　　　
　４５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　ＩＦＯ　　　　　　　　３２０６９　　　　
　　　　　　　　　　１２００　　　　　　　　　　　
　　　　　　　──────────────────
─────────────　　　　　　　　　　　　
　　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　　　ＳＰ．Ａ−
９１　　　　　　　　　　８３００　　　　　　　　　
　　　　　　　　　────────────────
───────────────　　　　　　　　　　
○　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＊　　生
成物はカルシウム塩として秤量　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　【００２
５】実施例２実施例１の回収した生成物について、分子量の測定はＧ
ＰＣ法（カラム：ＴＳＫ　ｇｅｌ　　Ｇ３０００　ＰＷ
ＸＬ　、移動相：０．０５Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）、２５℃、検出機：ＵＶ（２１０ｎｍ）及び　ＲＩ
　）により分析した結果、菌株及び培養条件により分子
量は異なり、２，０００〜５０，０００であった。【００２６】生成物の５０ｍｇを１Ｎ　　Ｈ２　ＳＯ４
　溶液１０ｍｌに溶解後、該液を１００℃沸騰水中で３
時間加水分解処理を行った。該処理液をペーパークロマ
トグラフィー（展開溶媒、酢酸エチル：酢酸：水＝５０
：１２：１０）により分析した結果、リンゴ酸のＲｆ　
値に相当する単一スポットが認められた。更に高速液体
クロマトグラフィー（島津製ＬＣ−５Ａ型）により有機
酸の分析を行った結果、リンゴ酸の保持時間を示す単一
ピークが得られた。例えばオウレオバシディウム・マン
ソニー（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｍａｎｓｏｎｉ
ｉ）ＩＦＯ　　９２３３の培養物から回収した生成物に
ついて酸加水分解物の高速液体クロマトグラフィー［カ
ラム：ＨＰＸ−８７Ｈ（ＢＩＯ−ＲＡＤ），カラム温度
：６０℃、溶媒：０．０１Ｍ　Ｈ２　ＳＯ４　、流速：
０．７ｍｌ／分、検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）］分析の
結果、標準物質のＬ−リンゴ酸と同一のリテンションタ
イムを示した。【００２７】また、得られた加水分解物をＬ−リンゴ酸
測定キット（ベーリンガー・マンハイム製）により分析
した結果Ｌ−体であることが判明した。【００２８】以上の結果から、本生成物はＬ−リンゴ酸
が重合したものであることが判明した。Detailed Description of the Invention [0001] [Industrial Application Field] The present invention is directed to the production of poly-L-malic acid by microorganisms.
The present invention relates to a method for producing PMLA (hereinafter referred to as PMLA). PMLA is a biodegradable and absorbable polymer compound that is used in bioabsorbable suture systems, bone joint materials, artificial tendons,
It is highly expected to be used in the pharmaceutical and medical fields, such as as a polymer carrier for artificial blood vessels and drug delivery. [0003] PMLA is produced by a chemical synthesis method using monobenzyl malate or monomethyl ester as a raw material [Repo
rts of the Faculty Engine
ering, Tottori University
, 8, 124 (1977)], a chemical synthesis method for ring-opening polymerization of benzylmalolactonate [U.S. Pat.
265247], direct thermal condensation method [Kobunshi Ronshu, 44, 701 (1987)], and other chemical synthesis methods have been reported. [0004] Furthermore, in the production of PMLA using microorganisms, Penicillium cyclopium (Penicillium
Example of production by solid culture using Agricultural Biological
al Chemistry 33 (4), 459
(1969)] has been reported. [0005] However, production by chemical synthesis has the disadvantage that not only the raw materials are expensive, but also the yield is low because many steps are required. On the other hand, the production using the solid culture method using Penicillium cyclopium has a low yield;
In addition, it is difficult to say that it is a practical method because it requires multiple steps for purification. Therefore, it has been desired to develop a method for producing in high yield from materials that are cheaper than conventional ones. [0007] The present invention is a method for producing PMLA, which is characterized by culturing PMLA-producing bacteria belonging to the genus Aureobasedium and collecting PMLA from the culture. [0008] Aureobasedium (Aureobasedium)
Microorganisms belonging to the genus Aureobaseium include microorganisms that were previously classified as the genus Pullularia and later reclassified as the genus Aureobaseium, and are also collectively referred to as black yeast. [Mycopathology and Myco
logia Applicata, 12, 1 (1
959), 17, 1 (1962)]. Therefore, any black yeast that can produce PMLA is included within the scope of the present invention. Specific examples of such microorganisms include the following. [0009] Aureobasedium pullulans (Au
reobasidium pullulans) IF
O 4464, IFO 4465, IFO
4875, IFO 7757, ATCC 73
05, Aureobasedium mansoni (Aureo
basidium mansonii) IFO 64
21, IFO 8194, IFO 9233,
ATCC 14249, Aureobasidium microstictum (Aureobasidium mi
crostictum) IFO 32066, same IF
O 32067, IFO 32068, IFO
32069, Aureobaseium (Aureob)
acidium) ・Sp. This includes the A-91 strain and mutant strains thereof. Among the above strains, Aureobaseium S.
p. Strain A-91 is a strain newly isolated from soil by the present inventor, and its mycological properties are as follows. A. Growth status on medium a) Microscopic findings (after culturing on YM agar medium at 25°C for 5 days) Size of vegetative cells: 3-6 x 3-20 μm Shape of vegetative cells: Fungal and yeast-like single cells, b) Agar slant (potato glucose agar medium) Growth: Good Gloss: None Color tone: When cultured for 3 days or more, colonies change from white creamy to dark to black. c) Liquid culture YM liquid medium: Good growth B. Ascospore formation Potato glucose agar medium: No formation Cornmeal agar medium: No formation YM agar medium: No formation V8 agar medium
: No formation C. Physiological properties Oxygen requirement: Aerobic Growth temperature: 5-35°C Growth pH: 2-9 KNO3 utilization (Wickerham synthetic medium)
: Available (NH4)2 SO4 availability (Wicke
rham synthetic medium): Yes Decomposition of urea: Yes Liquefaction of gelatin: None Production of organic acids: Yes Vitamin requirements (Wickerham synthetic medium):
NoneD. Assimilable carbon sources (Wickerham synthetic medium) glucose, sucrose, maltose, arabinose, xylose, mannose, fructose, trehalose, glycerose, mannitol, starch,
Ethanol, citric acid, isocitric acid, succinic acid, DL
-malic acid, fumaric acid. The taxonomic position of this strain having the above-mentioned mycological properties is referred to as "The Genera of Fungi".
Sporulating in pure culture
re” (3rd edition) edited by J.A. Von Arx Lu
As a result of an examination published by Brecht & Cramer (1981), it was found that it was a new strain belonging to the genus Aureobasedium, and it was classified as Aureobasedium.
Sp. It was named strain A-91. [0012] This strain was given to the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology as follows: Microorganism accession number P-11966
It has been deposited as "No." [0013] The method for producing L-malic acid polymer of the present invention will be described below. [0014] The above-mentioned bacteria of the genus Aureobasedium can be cultured according to a conventional method using a medium containing nutrients such as a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts. [0015] As a carbon source for the medium, for example, carbohydrate raw materials, particularly glucose, are suitably used, and the concentration thereof is 1 to 1.
30% by weight, preferably 1-20% by weight is suitable. As a nitrogen source, nitrogen-containing organic or inorganic substances commonly used in culturing microorganisms, such as ammonia, ammonium salts of organic acids such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, and ammonium succinate;
Urea etc. can be used alone or in combination, and as the inorganic salt, for example, potassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, etc. can be used. In addition, nutrients such as yeast extract, corn steep liquor, peptone, meat extract, casamino acids, and various vitamins can be added to the medium if necessary for the growth of the bacteria. [0016] The culture is carried out under aerobic conditions such as shaking and aeration, and the culture temperature is generally 20 to 40°C, preferably 20°C.
A temperature of 2 to 35°C is suitable. The culture pH is 2-10, preferably 3-9, more preferably 3-7. [0017] The culture period is not particularly limited, but it is usually carried out for 1 to 10 days. PMLA produced in the culture solution by the above-mentioned culture method can be separated and purified from the culture solution by methods known per se, such as ion exchange resin treatment, precipitation, etc., such as acetone, methanol, ethanol, , n-propanol, isopropanol, methyl ethyl ketone, etc. can be carried out in an appropriate combination. The physicochemical properties of PMLA produced by the method described above are as follows. (1) The molecular weight measured by GPC method is approximately 2,000
~50,000. (2) Only L-malic acid is produced by hydrolysis treatment with a 1N sulfuric acid solution. Effects of the Invention According to the present invention, a PMLA-producing bacterium belonging to the genus Aureobasedium is cultured, and P is produced in a high amount.
MLA can be obtained. [Example] Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples. However, the following examples are given only to help gain a concrete understanding of the present invention, and the present invention is not limited thereby. Example 1 Medium (glucose 12%, KH2 PO4 0.05%
, MgSO4 ・7H2 O0.05%, yeast extract 0
．． After dispensing 50 ml of 02% (no pH adjustment) into a 500 ml Erlenmeyer flask and sterilizing it (121°C, 15 minutes),
1 ml of a separately sterilized 6% ammonium nitrate solution was added. For culturing, 1 g of calcium carbonate was added to the prepared medium, and the microorganisms shown in Table 1 were inoculated, cultured with shaking at 25°C for 3 days, and this was used as a preculture. For the main culture, 2,000 ml of the above medium was dispensed into a 5,000 ml Erlenmeyer flask, sterilized (121°C, 15 minutes), and 40 ml of separately sterilized 6% ammonium nitrate and 60 g of dry heat sterilized calcium carbonate were added. 2 (v/v) of preculture
% and cultured with shaking at 25°C for 8 days. After completion of the culture, 200 ml of the culture was centrifuged (8,000 rpm, 15 minutes, room temperature), and 200 ml of methanol was gradually added to 100 ml of the resulting supernatant, resulting in precipitation of the product. The precipitate was separated by centrifugation (8,000 rpm, 10 minutes, 4°C),
After washing with a mixture of methanol and water (2:1), it was dried in a desiccator under reduced pressure and weighed. The results are shown in Table 1. [0024]
Table 1 ────────
────────────────────────

*

○
Strain name
Production amount (mg
) ─────────
──────────────────────
Aureobasidiu
m pullulans

IFO
4464 50

IFO 7757
4200
IFO 4
875 500
──────────
──────────────────────
Aureobasidium
mansonii

IFO 6
421 150
IF
O9233
3800
ATCC 14249
50
──────────────
────────────────────
Aureobasidium
microstictum

IFO 32066
920
IFO
32068
450
IFO 32069
1200
────────────────────
──────────────
Aureobasidium SP. A-
91 8300
──────────────────
────────────────
○

*Product weighed as calcium salt
002
5] Example 2 Regarding the recovered product of Example 1, the molecular weight was measured by G.
PC method (column: TSK gel G3000 PW
XL, mobile phase: 0.05M phosphate buffer (pH 7.
0), 25°C, detector: UV (210 nm) and RI
), the molecular weight varied depending on the strain and culture conditions, and was 2,000 to 50,000. 50 mg of the product was dissolved in 1N H2SO4.
After dissolving in 10ml of solution, the solution was boiled in 100℃ boiling water for 3 hours.
A time hydrolysis treatment was performed. The treated solution was subjected to paper chromatography (developing solvent, ethyl acetate:acetic acid:water=50
:12:10), the Rf of malic acid was
A single spot corresponding to the value was observed. Furthermore, as a result of analyzing organic acids by high performance liquid chromatography (LC-5A model manufactured by Shimadzu), a single peak indicating the retention time of malic acid was obtained. For example, Aureobasidium mansoni
i) High performance liquid chromatography of the acid hydrolyzate of the product recovered from the culture of IFO 9233 [Column: HPX-87H (BIO-RAD), Column temperature: 60°C, Solvent: 0.01M H2SO4, Flow rate:
0.7 ml/min, detector: UV (210 nm)] Analysis results showed the same retention time as the standard substance L-malic acid. The obtained hydrolyzate was analyzed using an L-malic acid measurement kit (manufactured by Boehringer Mannheim) and was found to be L-malic acid. [0028] From the above results, it was found that this product was a product obtained by polymerizing L-malic acid.

Claims

【特許請求の範囲】[Claims]

【請求項１】　　オウレオバセディウム属に属するＬ−
リンゴ酸重合物産生菌を培養して、培養物よりＬ−リン
ゴ酸重合物を採取することを特徴とするＬ−リンゴ酸重
合物の製造法。Claim 1: L- belonging to the genus Aureobasedium
A method for producing an L-malic acid polymer, which comprises culturing malic acid polymer-producing bacteria and collecting the L-malic acid polymer from the culture.

【請求項２】　　オウレオバセデイウム属に属するＬ−
リンゴ酸重合物産生菌が、オウレオバセデイウム・Ｓｐ
．Ａ−９１株である請求項１記載の方法。Claim 2: L- belonging to the genus Aureobaseium
The malic acid polymer producing bacteria is Aureobaseium Sp.
．． The method according to claim 1, wherein the strain is A-91.

【請求項３】　　Ｌ−リンゴ酸重合物産生能を有するオ
ウレオバセディウム・Ｓｐ．Ａ−９１株。3. Aureobasedium Sp. having the ability to produce an L-malic acid polymer. A-91 strain.