【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学工業、特に医療用材料（医用材料）分野において有用なβ−ポリリンゴ酸の微生物を用いた製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医用材料用の生分解性ポリマーとしては、従来、ポリグリコール酸やポリ乳酸等のポリ（α−ヒドロキシ酸）が開発されてきた。これらポリ（α−ヒドロキシ酸）は、加水分解によって生成するグリコール酸、乳酸などが生体内における代謝中間物であるため生体毒性がなくて代謝され易く、また、疎水的であるにも係らず加水分解速度が適当である点が、医用材料用ポリマーとしての長所であるとされている。
【０００３】
一方、ポリリンゴ酸は、生分解性に優れた直鎖状の水溶性ポリエステルであり、加水分解によって生成するリンゴ酸は生体内における代謝中間物でもある。さらに、側鎖に化学修飾が可能なカルボキシル基を有することから、ポリ（α−ヒドロキシ酸）に代わる新しい生体内分解吸収性高分子としての用途が期待されている。より具体的には、生体吸収性縫合糸、骨接合用材料、人工腱、人工血管及びドラッグデリバリーの高分子キャリアー等の医用材料としての用途が考えられている。
【０００４】
ポリリンゴ酸は、その構造上の違いから、αβ−ポリリンゴ酸、α−ポリリンゴ酸、β−ポリリンゴ酸の３つのタイプに分類されている。このうち、β−ポリリンゴ酸については、リンゴ酸を保護化して得られるβ−ベンジルマロラクナートを経由し開環重合と脱保護を行う化学合成法と共に、微生物による製造法が報告されている。
【０００５】
微生物を用いたポリリンゴ酸の製造では、ペニシリウム・サイクロピウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．３３， ｐｐ４５９， １９６９）やフィサルム・ポリセファラム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ．１９３， ｐｐ６９， ２０００）、オウレオバセディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属の微生物を用いた製造法（特開平４−２１１３８５号、特開平４−３４１１８９号）が知られている。
【０００６】
Ｓ． Ｌｉｕら（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｖｏｌ．４６， ｐｐ２７３−２７８， １９９６）は、化学合成法並びに微生物より得られた各種β−ポリリンゴ酸の１３Ｃ−ＮＭＲデータの比較を行っている。これによると、［化１］において▲１▼〜▲４▼の記号で示した各炭素原子のケミカルシフト（ｐｐｍ）として、以下のような範囲の値が示されている。
【０００７】
【化１】
【０００８】
▲１▼の炭素原子；６８．８０ｐｐｍ〜７１．９５ｐｐｍ
▲２▼の炭素原子；３３．４０ｐｐｍ〜３８．４０ｐｐｍ
▲３▼の炭素原子；１６８．９０ｐｐｍ〜１７３．１０ｐｐｍ
▲４▼の炭素原子；１７０．００ｐｐｍ〜１７５．７９ｐｐｍ
【０００９】
【特許文献１】特開平４−２１１３８５号公報
【特許文献２】特開平４−３４１１８９号公報
【非特許文献１】Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．３３ （４）， ｐｐ４５９， １９６９．
【非特許文献２】ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｖｏｌ．１９３， ｐｐ６９−７４， ２０００．
【非特許文献３】Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｖｏｌ．４６， ｐｐ２７３−２７８， １９９６．
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
化学合成法によるβ−ポリリンゴ酸の製造技術は、保護化・開環重合・脱保護化と続く多数の工程を必要とするため収率が低いという欠点を有している。また、ペニシリウム・サイクロピウムやフィサルム・ポリセファラムを用いた製造法は、収率や蓄積量が低く、実際的な方法とは言い難い。
【００１１】
一方、オウレオバセディウム属の微生物を利用する製造法は、グルコース等の安価な糖質原料から効率良く製造する方法として提案されており、ペニシリウム・サイクロピウムやフィサルム・ポリセファラムを用いた製造法よりは高い生産性を示している。
【００１２】
しかしながら、オウレオバセディウム属に属する微生物は、天然多糖の一種であるプルランを著量生成することがよく知られている。また、同属微生物群は、黒色酵母（ｂｌａｃｋ ｙｅａｓｔ） と総称される数属中の一群であることもよく知られていて、黒色色素であるメラニンを生成する。
よって、オウレオバセディウム属の微生物を用いるβ−ポリリンゴ酸の製造においては、培養物からβ−ポリリンゴ酸を分離するに際して、プルランやメラニンを除去する必要がある。
【００１３】
事実、特開平４−２１１３８５号公報で示されているオウレオバセディウム属に属する微生物を用いた発酵法によるβ−ポリリンゴ酸の製造においては、プルランの副成が認められ、プルランの副成を低減するために酵素法の検討がなされているが、本方法においても、プルランの生成量が検討前の発酵法と比べて６〜７割程度低減しているに過ぎない（特開平４−３４１１８９号公報）。
【００１４】
また、本発明者の一人は、プルランを副生しないオウレオバセディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属に属する微生物として、オウレオバセディウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）ＩＦＯ６３５３株を選択し、これを培養してβ−ポリリンゴ酸を産生させることを試みているが、この菌においても著量のメラニンが副生することが知られている（２０００年度日本農芸化学大会講演要旨集：ｐ３８３， 平成１２年度日本生物工学会大会講演要旨集 ： ｐ３７）。
【００１５】
以上のように、微生物を用いたβ−ポリリンゴ酸の製造については、それぞれの微生物について欠点や改善すべき点があり、より効率的、かつ、低コストでβ−ポリリンゴ酸を製造するための新しい微生物の獲得が望まれていた。
【００１６】
すなわち、本発明は、微生物を用いたβ−ポリリンゴ酸の新規な製造法を提供することを目的とし、より詳しくは、微生物の培養中に生成する副生物の生成量の少ないβ−ポリリンゴ酸の製造法を提供することを目的としている。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
一般的に、多くの菌類は、生活環の中で無性胞子と有性胞子を生じ、無性生殖と有性生殖の両方で繁殖が可能である。有性胞子を生じる時期は完全世代（その形態をテレオモルフという）、無性胞子を生じる時期は不完全世代（その形態をアナモルフという）と呼ばれ、菌類は、それぞれの生活環における形態によって分類がなされている。また、菌類の中には完全世代がない、もしくは、知られていないものも数多く存在している。
【００１８】
本発明者らは、アナモルフがオウレオバセディウム属と近縁な微生物についてβ−ポリリンゴ酸産生能の有無を調べた結果、アナモルフがホルモネマ（Ｈｏｒｍｏｎｅｍａ）属に属する微生物がβ−ポリリンゴ酸を著量産生することを見出し、さらには、これらの属に属する微生物は、オウレオバセディウム属に属する微生物を用いたβ−ポリリンゴ酸の製造において問題となったプルラン等の多糖やメラニン等の色素の副生が認められない、もしくは、相対的に低いことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１９】
即ち、本発明は、β−ポリリンゴ酸を産生する微生物を液体培地中で培養して、得られた培養液よりβ−ポリリンゴ酸を採取するに際して、β−ポリリンゴ酸を産生する微生物としてアナモルフがホルモネマ属に属する微生物によるβ−ポリリンゴ酸の製造法である。
【００２０】
さらに、本発明は、上記製造法において、アナモルフがホルモネマ属に属し、テレオモルフがシドウィア（Ｓｙｄｏｗｉａ）属、プリングスヘイミア（Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍｉａ）属、又はドチオラ（Ｄｏｔｈｉｏｒａ）属に属する微生物を用いることを特徴とするβ−ポリリンゴ酸の製造法である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいうアナモルフがホルモネマ属に属する微生物とは、同じくアナモルフがオウレオバセディウム属の微生物と分類学上明確に区別される。
【００２２】
すなわち、Ｅ． Ｊ． Ｈｅｒｍａｎｉｄｅｓ−Ｎｉｊｈｏｆ （Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ， Ｎｏ．１５， ｐ１４１−１８１， １９７７）は、オウレオバセディウム属に属する微生物は、同調的（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ）な分生子形成を行うのに対して、ホルモネマ属に属する微生物は、求基的（ｂａｓｉｐｅｔａｌ）な分生子形成を行う点において、両属の形態上の明確な差異が見出されると述べている。
【００２３】
さらに、Ｎ． Ａ． Ｙｕｒｌｏｖａら （Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ， Ｖｏｌ．６９， ｐ３２３−３２９， １９９６）は、５．８Ｓ−Ｒプライマー（５’−ＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣ−３’）並びにＬＲ−７プライマー（５’−ＴＡＣＴＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＴＣＴ−３’）により増幅される１．９ｋＢのＰＣＲ増幅断片（５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ＩＴＳ２遺伝子、２６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の５末端側の半領域が含まれる）について、５つの制限酵素（ＡｌｕＩ， ＨｈａＩ， ＭｓｐＩ， ＤｄｅＩ， ＲｓａＩ）による制限酵素切断パターンの差異を比較（ｐ３２７のＴａｂｌｅ．２）しており、これにより、オウレオバセディウム属とホルモネマ属が分子系統学的に識別されると記載している。
【００２４】
また、Ｇ． Ｓ． ｄｅ Ｈｏｏｇ ら （Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ， Ｖｏｌ．６５， ｐ４１−５４， １９９４）は、アナモルフがホルモネマ属に属する微生物について、そのテレオモルフとの関連性を示している。すなわち、テレオモルフがシドヴィア属、プリングスヘイミア属、ドチオラ属である微生物のアナモルフは、ホルモネマ属菌であると記載している。特に、シドヴィア・ポリスポラ（Ｓｙｄｏｗｉａ ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）については、そのアナモルフが、ホルモネマ・デマチオイデス（Ｈｏｒｍｏｎｅｍａ ｄｅｍａｔｉｏｉｄｅｓ）であることが記載されている。
【００２５】
本発明でいうアナモルフがホルモネマ属に属する微生物としては、より具体的には、シドヴィア・ポリスポラ（Ｓｙｄｏｗｉａ ｐｏｌｙｓｐｏｒａ）ＣＢＳ １１６．２９株、同ＣＢＳ １２８．６４株、同ＣＢＳ７１９．７６株、同ＣＢＳ ７５０．７１株、プリングスヘイミア・セピンコラ（Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍｉａ ｓｅｐｉｎｃｏｌａ）ＣＢＳ ７４８．７１株、プリングスヘイミア・スミラシス（Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍｉａ ｓｍｉｌａｃｉｓ）ＣＢＳ ８７３．７１株、プリングスヘイミア・ユーフォビアエ（Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍｉａ ｅｕｐｈｏｒｂｉａｅ）ＣＢＳ ７４７．７１株、ドチオラ・カナビナエ（Ｄｏｔｈｉｏｒａ ｃａｎａｂｉｎａｅ）ＣＢＳ ７３７．７１株、ホルモネマ・プルノルム（Ｈｏｒｍｏｎｅｍａ ｐｒｕｎｏｒｕｍ）ＣＢＳ ７６５．８４株等が挙げられる。
【００２６】
尚、シドヴィア属、および、プリングスヘイミア属、ドチオラ属に属する微生物は、いずれも子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）・真正子嚢菌亜門（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ）・小房子嚢菌綱（Ｌｏｃｕｌｏａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）・ドチデアレス目（Ｄｏｔｈｉｄｅａｌｅｓ）・クロイボタケ科（Ｄｏｔｈｉｄｅａｃｅａｅ）に分類される。一方、アナモルフがホルモネマ・プルノルムである微生物については、完全世代の形態であるテレオモルフが不明なホルモネマ属微生物であり、糸状不完全菌綱（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）に分類される。
【００２７】
上記に挙げたアナモルフがホルモネマ属に属する微生物は、例えば表１に記載された菌株が例示できこれら菌株はオランダ王立芸術科学アカデミー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｒｔｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）傘下のセントラルビューローフォーシュメルカルチャーズ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ ；略称ＣＢＳ）から有償により万人に分譲される。また、これらの微生物は、その代表例に過ぎず、他の微生物であっても、アナモルフがホルモネマ属に属する限りは、本発明の範囲に含まれる。また、アナモルフがホルモネマ属に属する微生物より得られる変異株もしくは遺伝学的手法により誘導される組換え株であって、β−ポリリンゴの生産性が向上した株、メラニン等の副生物の産生量がさらに低減化した株等の産業上有用な形質を獲得した株についても、本発明の範囲に含まれる。
【００２８】
以下、本発明のβ−ポリリンゴ酸産生菌を産生する微生物を培養して、該培養液よりβ−ポリリンゴ酸を採取する方法について述べる。
【００２９】
アナモルフがホルモネマ属に属する微生物を培養する場合、微生物分野における常法に従い、炭素源、窒素源、無機塩等の栄養分を含む培地を用いて行うことができる。
【００３０】
本発明に使用される培地はいわゆる液体培地であって、炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類、核酸成分、微量金属塩類等を必要により取捨選択し、組み合わせて適当量添加した水溶液が好適に使用可能である。
【００３１】
培地の炭素源としては、糖質原料、とくにグルコースおよびフルクトースを好適に用いることができる。その添加濃度は１〜３０重量％、好ましくは５〜２０重量％が適当である。窒素源としては、微生物の培養に際して通常使用される窒素原子を含有する無機化合物又は有機化合物、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、コハク酸アンモニウムなどの有機酸アンモニウム塩、尿素等を単独もしくは混合して用いることができる。さらに、無機塩としては、例えば、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等を用いることができる。この他に菌の生育やβ−ポリリンゴ酸に効果的な栄養成分として、酵母エキス、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、カザミノ酸、大豆油、モラセス、各種ビタミン等を培地に適宜添加し用いてもよい。
【００３２】
培養は振盪、通気撹拌等の好気的条件下で行われ、培養温度は一般に２０〜４０℃、好ましくは２２〜３５℃である。培養ｐＨは２〜１０、好ましくは、３〜９、さらに好ましくは、４〜８である。培養期間は、特に制限されるものではないが、通常１日〜３０日間、より好ましくは、５日間〜２０日間で行われる。
【００３３】
さらに、本発明の方法を実施する場合、上記のように培養して得られた培養物から菌体を集め（或いは菌体を濃縮し）、水や適当な緩衝液に再懸濁後、再度、グルコース等の糖質原料やＬ−リンゴ酸と接触させて、β−ポリリンゴ酸を産生させてもよい（酵素反応）。この際、集菌体を一旦水や適当な緩衝液で洗浄した後、使用することもでき、このような場合も本発明においてはβ−ポリリンゴ酸を産生する微生物の培養に含まれる。
【００３４】
さらに、上記のように培養して得られた菌体を、アクリルアミド等の重合性モノマーやアルギン酸塩、カラギーナン等の適当な単体を用いて固定化し、該固定化物（菌体処理物）と原料とを接触させてもよい。微生物菌体又はその処理物の濃度は特に制限されるものではないが、一般には１〜５０重量％、好ましくは２〜２０重量％の範囲内が好適である。本発明においては上記の様な菌体処理物もβ−ポリリンゴ酸を産生する微生物に含まれる。
【００３５】
以上述べた方法により培養液中又は酵素反応液中に産生したβ−ポリリンゴ酸を培養液又は酵素反応液から採取するに際しては、それ自体既知の方法に従いβ−ポリリンゴ酸を分離・精製すればよい。
例えば、イオン交換樹脂処理法、沈澱法（例えば、アセトン、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、メチルエチルケトン等の有機溶媒沈澱法等）を適宜組み合わせて行うことができる。
【００３６】
以上に述べた方法により製造されるβ−ポリリンゴ酸の物理化学的性質は、以下のとおりである。
（１）１Ｎ塩酸水溶液あるいは１Ｎ硫酸水溶液等の酸性溶液中での加水分解処理により、Ｌ−リンゴ酸のみが生成する。
（２）分子構造上区別される４種類の炭素原子の各ケミカルシフト（ｐｐｍ）が、以下の▲１▼〜▲４▼に示す範囲の値を示す。
【００３７】
▲１▼の炭素原子；６８．８０ｐｐｍ〜７１．９５ｐｐｍ
▲２▼の炭素原子；３３．４０ｐｐｍ〜３８．４０ｐｐｍ
▲３▼の炭素原子；１６８．９０ｐｐｍ〜１７３．１０ｐｐｍ
▲４▼の炭素原子；１７０．００ｐｐｍ〜１７５．７９ｐｐｍ
（３）ＧＰＣ法により測定した平均分子量が、約１，０００〜５０，０００の範囲内である。
【００３８】
【実施例】
次に、本発明について、以下の実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００３９】
［実施例１］
以下に示す組成の培地を調製した後、この培地１００ｍＬを５００ｍＬエーレンマイヤーフラスコに分注し、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）により滅菌した。
【００４０】
グルコース ８．０％
コハク酸アンモニウム塩 ０．３％
コハク酸 ０．０２％
重炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３） ０．０４％
リン酸二水素一カリウム ０．０１％
硫酸マグネシウム・７水和物 ０．０１％
硫酸亜鉛・７水和物 ０．００５％
コーンスティープリカー ０．０５％
ｐＨ ６．０（ｐＨ調整剤；１ＮＮａＯＨ水溶液）
【００４１】
以下の［表１］に示す菌株を各フラスコに植菌した後、１２０ｒｐｍ３０℃で１０日〜１５日間振盪培養を行った。培養終了後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を除去し、各培養液の培養上清液を調製した。
【００４２】
続いて、ＨＰＬＣ分析法により、培養により得られた培養液中の遊離のリンゴ酸濃度を測定した。次に、この培養上清液に対して、等量の２Ｎ濃塩酸を混合し、９０℃にて２４時間加水分解処理を行い、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、ＨＰＬＣ分析によってリンゴ酸量を定量した。
その結果、各培養上清液では、加水分解処理前と比べて、加水分解処理後のリンゴ酸濃度が著量増加していた。これは、培養上清中に分泌されたポリリンゴ酸が加水分解処理によりリンゴ酸に分解された結果であると推測された。よって、加水分解前後のリンゴ酸濃度の差分より、各培養上清中に蓄積したポリリンゴ酸量を算出し、以下の［表１］にまとめた。
【００４３】
また、株式会社ジェイ・ケイ・インターナショナルが販売を行っているＬ−リンゴ酸分析キット（製造元；ロシュ・ダイアグノスティックス社）を使用した結果、加水分解されたリンゴ酸は、すべてＬ体であった。尚、上記のリンゴ酸濃度のＨＰＬＣ分析は、以下の条件にて実施した。
【００４４】
カラム；ＳｈｉｍｐａｋＳＣＲ−１０２Ｈ（島津製作所製）
（２本直列連結）
移動相；２ｍＭ過塩素酸水溶液
流速；１．５ｍＬ／分間
カラム温度；５０℃
検出器；紫外吸収計（ＳＰＤ−１０Ａ，島津製作所製）
検出波長；２１０ｎｍ
検出時間：１２．３分間
標準物質；Ｌ−リンゴ酸（和光純薬製）
【００４５】
【表１】
【００４６】
［実施例２］
実施例１と同じ培地を調製し、各々１００ｍＬを５００ｍＬエーレンマイヤーフラスコ中に分注し、オートクレーブ（１２１℃、１５分間）により滅菌した。
以下の［表２］に示した菌株を各フラスコに植菌後、実施例１と同じ培地を用いて同じ条件で１５日間振盪培養を行い、実施例１と同様の方法にて、培養上清液を調製した。培養上清液とその３倍量（容積換算）のメタノールを混合し、一晩４℃にて冷やしながら放置した。一晩放置後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間）を行ったところ、沈殿物を得たので、これを凍結乾燥処理に供し、その重量を測定した。
【００４７】
凍結乾燥させた沈殿物について、実施例１と同様に、１Ｎの塩酸溶液中で加水分解処理に供した後、ＨＰＬＣ分析を行ったところ、リンゴ酸以外のピークは見出されず、本沈殿物がポリリンゴ酸であると推測された。尚、メタノール沈殿物として得られるポリリンゴ酸は、重合度の高い高分子量体であることが知られている。
以下の［表２］に凍結乾燥物から計算した高分子量のポリリンゴ酸の蓄積量を示す。
【００４８】
【表２】
【００４９】
［実施例３］
２Ｌのサクラ精機製通気攪拌型バイオリアクター（ＴＢＲ−２）中に実施例１と同じ成分と濃度からなる培地１Ｌを仕込み、常法により滅菌処理を行った。
培養開始時のｐＨを４．０〜８．０まで１．０ずつ変化させた各試験区毎にシドヴィア・ポリスポラＣＢＳ１２８．６４株、もしくは、同ＣＢＳ７１９．７６株、同ＣＢＳ７５０．７１株を別々に植菌後、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液にて培養開始時のｐＨでコントロールしながら通気攪拌培養（２５０ｒｐｍ、３０℃、１．１ｖｖｍ、１０日間）を行った。
培養終了後、実施例１と同様の方法にて、培養上清液中のポリリンゴ酸蓄積量を分析した。以下の［表３］に各ｐＨにおける各菌株のポリリンゴ酸の蓄積量を示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】
［実施例４］
実施例３と同様に、２Ｌのサクラ精機製通気攪拌型バイオリアクター（ＴＢＲ−２）中に実施例１と同じ成分と濃度からなる培地１Ｌを仕込み、常法により滅菌処理を行った。
各試験毎区にシドヴィア・ポリスポラＣＢＳ１２８．６４株、もしくは、同ＣＢＳ７１９．７６株、同ＣＢＳ７５０．７１株を別々に植菌後、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液にて培養中のｐＨを６．０にコントロールしながら通気攪拌培養（２５０ｒｐｍ、３０℃、１．１ｖｖｍ、１０日間）を行った。
【００５２】
培養終了後、実施例１と同様の方法にて、ポリリンゴ酸の蓄積量を分析すると共に、ＨＰＬＣによる他の有機酸の濃度、並びに、培養上清の吸光度（５８０ｎｍ）について分析を行った。
その結果、培養上清中にはリンゴ酸のみならず、コハク酸、フマル酸等の副生成物は確認できなかった。また、いずれの菌においても、培養終了上清は透明であり、植菌前の培地の吸光度と比べても、その吸光度に大きな変化は見出されなかった。すなわち、培養上清中への各種有機酸やメラニン等の色素の産生は認められなかった。以下の［表４］に各菌株のポリリンゴ酸の蓄積量と吸光度を示す。
【００５３】
【表４】
【００５４】
［比較例１］
実施例３と同様に、２Ｌのサクラ精機製通気攪拌型バイオリアクター（ＴＢＲ−２）中に実施例１と同じ成分と濃度からなる培地１Ｌを仕込み、常法により滅菌処理を行った。
オウレオバセディウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ） ＩＦＯ６３５３株を植菌後、２Ｎ水酸化ナトリウム溶液にて培養中のｐＨを７．０にコントロールしながら通気攪拌培養（２５０ｒｐｍ、３０℃、１．１ｖｖｍ、１０日間）を行い、実施例４と同様の方法にて、ＨＰＬＣによる他の有機酸の濃度、並びに、培養上清の吸光度（５８０ｎｍ）について分析を行った。
【００５５】
培養終了時のポリリンゴ酸蓄積量は、１２．５ｇ／Ｌであった。また、培養上清液中には、リンゴ酸は確認されなかったが、コハク酸が０．２ｇ／Ｌ、フマル酸０．１ｇ／Ｌが認められた。さらに、培養終了時における培養上清の色はメラニン色素の産生のため黒く着色し、その吸光度（５８０ｎｍ）は、２．６であった。
【００５６】
［実施例５］
実施例４で得られたシドヴィア・ポリスポラＣＢＳ１２８．６４株、および、同ＣＢＳ７１９．７６株、同ＣＢＳ７５０．７１株の各培養上清液より、実施例２と同様の方法にて、ポリリンゴ酸をメタノール共沈殿法により分離精製した。
得られたポリリンゴ酸について、島津製作所製のＨＰＬＣ−１０ＶＰ装置並びにＧＰＣ分析用ソフトを使用して、以下の条件にて各株のポリリンゴ酸の分子量を測定した。
以下の［表５］に各菌株のポリリンゴ酸の分子量分析結果を示す。
【００５７】
カラム；ＴＳＫ−ｇｅｌ α−２０００
ＴＳＫ−ｇｅｌ α−５０００
ＴＳＫ−ｇｅｌ α−７０００
（３本直列連結）
移動相；水
流速；１．０ｍＬ／分間
カラム温度；３０℃
検出器；フォトダイヤモンドアレー検出器ＳＰＤ−Ｍ１０ＡＶＰ
検出波長；２１０ｎｍ
標準物質；ＰＥＧ、Ｄｅｘｔｒａｎ
【００５８】
【表５】
【００５９】
［実施例６］
実施例５で得られたシドヴィア・ポリスポラＣＢＳ１２８．６４株のポリリンゴ酸について、ＪＥＯＬ（日本電子データム株式会社）製のＪＮＭ−α４００ＦＴ型ＮＭＲにより、１３Ｃ−ＮＭＲデータを取得した。
その結果、メタノール由来のケミカルシフト（４６．０ｐｐｍ）に加えて、６９．６６ｐｐｍ、および、３５．８５ｐｐｍ、１７１．５０ｐｐｍ、１７５．４１ｐｐｍの４つのケミカルシフトが観察された。
すなわち、得られたポリリンゴ酸は、β型であることが確認された。
【００６０】
【発明の効果】
本発明によれば、アナモルフがホルモネマ属に属するβ−ポリリンゴ酸産生微生物を培養することで、副生物産成の少ないβ−ポリリンゴ酸の製造法が提供される。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing β-polymalic acid using microorganisms, which is useful in the chemical industry, particularly in the field of medical materials (medical materials).
[0002]
[Prior art]
As a biodegradable polymer for medical materials, poly (α-hydroxy acids) such as polyglycolic acid and polylactic acid have been conventionally developed. These poly (α-hydroxy acids) are easily metabolized without biotoxicity because glycolic acid, lactic acid, and the like generated by hydrolysis are metabolic intermediates in the living body. It is said that an appropriate decomposition rate is an advantage of a polymer for medical materials.
[0003]
On the other hand, polymalic acid is a linear water-soluble polyester excellent in biodegradability, and malic acid generated by hydrolysis is also a metabolic intermediate in a living body. Furthermore, since it has a carboxyl group that can be chemically modified in the side chain, it is expected to be used as a new biodegradable and absorbable polymer replacing poly (α-hydroxy acid). More specifically, applications as medical materials such as bioabsorbable sutures, osteosynthesis materials, artificial tendons, artificial blood vessels, and polymer carriers for drug delivery are considered.
[0004]
Polymalic acid is classified into three types, αβ-polymalic acid, α-polymalic acid, and β-polymalic acid, based on structural differences. Among them, β-polymalic acid has been reported to be produced by a microorganism as well as a chemical synthesis method in which ring-opening polymerization and deprotection are carried out via β-benzylmalolactate obtained by protecting malic acid.
[0005]
In the production of polymalic acid using microorganisms, Penicillium cyclopium (Agricultural Biological Chemistry Vol. 33, pp459, 1969), and Fishalum PhysipoMol PhysipoMol PhysipoMol PhysipoMol PhysipoMol (Physarumpoyl PhysipoMol PhysipoMol PhysipoMol) are available. Production methods using microorganisms of the genus Aureobasidium (JP-A-4-21385, JP-A-4-341189) are known.
[0006]
S. Liu et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol. 46, pp 273-278, 1996) compare 13 C-NMR data of various β-polymalic acids obtained from chemical synthesis methods and microorganisms. According to this, the following chemical shift values (ppm) of carbon atoms indicated by the symbols (1) to (4) in [Chemical Formula 1] are shown.
[0007]
Embedded image
[0008]
(1) carbon atom: 68.80 ppm to 71.95 ppm
(2) carbon atom: 33.40 ppm to 38.40 ppm
(3) carbon atom; 168.90 ppm to 173.10 ppm
(4) carbon atom: 170.00 ppm to 175.79 ppm
[0009]
[Patent Document 1] Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 4-21385 [Patent Document 2] Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 4-341189 [Non-Patent Document 1] Agricultural Biological Chemistry Vol. 33 (4), pp459, 1969.
[Non-Patent Document 2] FEMS Microbiology Letters Vol. 193, pp 69-74, 2000.
[Non-Patent Document 3] Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol. 46, pp 273-278, 1996.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
The technology for producing β-polymalic acid by a chemical synthesis method has a drawback that the yield is low due to the necessity of a number of steps following protection, ring-opening polymerization and deprotection. Further, the production method using penicillium cyclopium or fisalum polycephalam has low yield and accumulation amount, and is hardly a practical method.
[0011]
On the other hand, a production method using a microorganism of the genus Aureobasedium has been proposed as a method for efficiently producing from an inexpensive saccharide raw material such as glucose, and is more effective than a production method using penicillium cyclopium or fisalum polycephalam. Indicates high productivity.
[0012]
However, it is well known that microorganisms belonging to the genus Aureobasedium produce a significant amount of pullulan, a kind of natural polysaccharide. It is also well known that the congener microorganisms are a group of several genera generally called black yeast, and produce melanin which is a black pigment.
Therefore, in the production of β-polymalic acid using a microorganism of the genus Aureobasedium, it is necessary to remove pullulan and melanin when separating β-polymalic acid from a culture.
[0013]
In fact, in the production of β-polymalic acid by a fermentation method using a microorganism belonging to the genus Aureobasedium disclosed in JP-A-4-21385, by-products of pullulan were recognized, and by-products of pullulan were observed. The enzymatic method has been studied in order to reduce the amount of fermentation, but in this method as well, the amount of pullulan produced is reduced by only about 60 to 70% as compared with the fermentation method before the study (Japanese Patent Laid-Open No. Hei. 341189).
[0014]
In addition, one of the present inventors has selected Aureobasidium pullulans IFO6353 strain as a microorganism belonging to the genus Aureobasidium that does not produce pullulan, and cultured it. Attempts have been made to produce β-polymalic acid, but it is known that a remarkable amount of melanin is also produced as a by-product in this bacterium. Abstracts of the Lectures of the Japan Society of Engineering Engineers: p37).
[0015]
As described above, regarding the production of β-polymalic acid using microorganisms, there are disadvantages and points to be improved for each microorganism, and more efficient and new methods for producing β-polymalic acid at low cost. The acquisition of microorganisms was desired.
[0016]
That is, an object of the present invention is to provide a novel method for producing β-polymalic acid using a microorganism, and more specifically, to produce β-polymalic acid with a small amount of by-products produced during culture of the microorganism. It aims to provide a manufacturing method.
[0017]
[Means for Solving the Problems]
In general, many fungi produce asexual and sexual spores in the life cycle and are capable of reproduction in both asexual and sexual reproduction. The time when sexual spores occur is called the complete generation (the form is called teleomorph), and the time when asexual spores are generated is called the incomplete generation (the form is called anamorph). Fungi are classified according to the form in their life cycle. Has been done. There are also many fungi that have no complete generation or are unknown.
[0018]
The present inventors have examined the presence or absence of β-polymalic acid-producing ability of microorganisms whose anamorph is closely related to the genus Aureobasedium. As a result, the microorganisms whose anamorph belongs to the genus Hormonema produce β-polymalic acid. Microorganisms belonging to these genera are further found to be polysaccharides such as pullulan and pigments such as melanin, which are problematic in the production of β-polymalic acid using microorganisms belonging to the genus Aureobasedium. Was found to be not found or relatively low, thereby completing the present invention.
[0019]
That is, the present invention provides a method for culturing β-polymalic acid-producing microorganisms in a liquid medium and collecting β-polymalic acid from the obtained culture solution. This is a method for producing β-polymalic acid by a microorganism belonging to the genus.
[0020]
Further, the present invention is characterized in that in the above-mentioned production method, the anamorph belongs to the genus Formonema and the teleomorph uses a microorganism belonging to the genus Sidowia, the genus Pringsheimia, or the genus Dothiora. This is a method for producing β-polymalic acid.
[0021]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Anamorphs referred to in the present invention are clearly distinguished from microorganisms belonging to the genus Hormonema in the same taxonomic manner as microorganisms belonging to the genus Aureobasedium.
[0022]
That is, E.I. J. Hermanides-Nijof (Studies in Mycology, No. 15, p141-181, 1977) states that microorganisms belonging to the genus Aureobasedium form synchronous conidia, whereas microorganisms belonging to the genus Hormones belong to the genus Hormones. It is stated that the microorganisms belonging to them show distinct morphological differences between the two genera in that they carry out basopetal conidia formation.
[0023]
Further, N.I. A. Yurova et al. (Antonie van Leeuwenhoek, Vol. 69, p323-329, 1996) amplified with the 5.8S-R primer (5'-TCGATGAAGAACGCAGGC-3 ') and the LR-7 primer (5'-TACTACCACCACAAGATCT-3'). 5 restriction enzymes (AluI, HhaI, MspI, DdeI, RsaI) for the 1.9 kB PCR amplified fragment (including the 5.8S rRNA gene, the ITS2 gene, and the 5-terminal half region of the 26S rRNA gene) to be obtained (Table 327 of p327), which states that the genus Aureobasedium and the genus Hormonema are molecularly phylogenetically distinguished.
[0024]
Also, G. S. de Hoog et al. (Antonie van Leeuwenhoek, Vol. 65, p41-54, 1994) show the relationship of anamorphs to microorganisms belonging to the genus Hormonema with teleomorphs. That is, it describes that the anamorph of the microorganism whose teleomorph belongs to the genus Sidovia, the genus Pringsheimia, or the genus Dothiola is a genus Formonema. In particular, it is described that the anamorph of Sydvia polyspora is Hormonema dematioides.
[0025]
More specifically, examples of the microorganism in which the anamorph belongs to the genus Formonema in the present invention include Sidvia polyspora CBS 116.29, CBS 128.64, CBS 719.76, and CBS 750. 71 strains, Pringsheimia sepincola CBS 748.71 strains, Pringsheimia smilasis CBS 873.71 strains, Plingsheimia euphobiae (Pringsahe bie sr. Dothiora canabinae CBS 737.71 strain, Hormonema pruno rum) CBS 765.84 strain and the like.
[0026]
Microorganisms belonging to the genus Sidvia, the genus Plingsheimia, and the genus Dothiola are all Ascomycota, Ascomycotina, Euascomycotina, Loculoascomycetes, and Dochideales. -It is classified into the black mushroom family (Dothideaceae). On the other hand, a microorganism whose anamorph is Formonema prunorm is a microorganism of the genus Formonema of which the form of the complete generation, teleomorph, is unknown, and is classified into Hyphomycetes.
[0027]
Examples of the microorganisms whose anamorph belongs to the genus Formonema include, for example, the strains listed in Table 1. These strains are the central bureau under the Royal Institute of Arts and Sciences of the Netherlands (Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences). It is distributed by Cultures (Centralalureau voor Schimmelcultures; abbreviated as CBS) to everyone for a fee. In addition, these microorganisms are merely representative examples, and other microorganisms are included in the scope of the present invention as long as the anamorph belongs to the genus Formonema. Further, the anamorph is a mutant strain obtained from a microorganism belonging to the genus Formonema or a recombinant strain derived by a genetic technique, a strain with improved productivity of β-polyapple, the production of by-products such as melanin is increased. Strains that have acquired industrially useful traits such as strains that have been further reduced are also included in the scope of the present invention.
[0028]
Hereinafter, a method for culturing a microorganism producing the β-polymalic acid-producing bacterium of the present invention and collecting β-polymalic acid from the culture solution will be described.
[0029]
When the anamorph cultures a microorganism belonging to the genus Formonema, the anamorph can be cultured using a medium containing nutrients such as a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts according to a conventional method in the field of microorganisms.
[0030]
The medium used in the present invention is a so-called liquid medium, and an aqueous solution in which a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, vitamins, nucleic acid components, trace metal salts, and the like are selected as necessary and added in an appropriate amount in combination is preferable. It can be used for
[0031]
As the carbon source of the medium, saccharide raw materials, particularly glucose and fructose, can be suitably used. The addition concentration is suitably 1 to 30% by weight, preferably 5 to 20% by weight. As the nitrogen source, an inorganic compound or an organic compound containing a nitrogen atom usually used in culturing a microorganism, for example, ammonia, an ammonium salt of an organic acid such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium succinate, urea or the like alone or They can be used in combination. Further, as the inorganic salt, for example, potassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate and the like can be used. In addition to this, as a nutrient effective for the growth of bacteria and β-polymalic acid, yeast extract, corn steep liquor, peptone, meat extract, casamino acid, soybean oil, molasses, various vitamins, etc. are appropriately added to the medium and used. Is also good.
[0032]
The culture is performed under aerobic conditions such as shaking and aeration and stirring, and the culture temperature is generally 20 to 40 ° C, preferably 22 to 35 ° C. The culture pH is 2 to 10, preferably 3 to 9, and more preferably 4 to 8. The culture period is not particularly limited, but is usually 1 day to 30 days, more preferably 5 days to 20 days.
[0033]
Furthermore, when performing the method of the present invention, cells are collected (or concentrated) from the culture obtained by culturing as described above, resuspended in water or a suitable buffer, and then re-suspended. Alternatively, β-polymalic acid may be produced by contact with a saccharide raw material such as glucose or L-malic acid (enzymatic reaction). At this time, the collected cells can be used once after being washed with water or a suitable buffer, and such a case is also included in the cultivation of a microorganism producing β-polymalic acid in the present invention.
[0034]
Further, the cells obtained by culturing as described above are immobilized using a polymerizable monomer such as acrylamide or an appropriate simple substance such as alginate or carrageenan. May be contacted. The concentration of the microbial cells or a processed product thereof is not particularly limited, but is generally in the range of 1 to 50% by weight, preferably 2 to 20% by weight. In the present invention, the treated microorganisms as described above are also included in the microorganisms producing β-polymalic acid.
[0035]
When the β-polymalic acid produced in the culture solution or the enzyme reaction solution by the method described above is collected from the culture solution or the enzyme reaction solution, the β-polymalic acid may be separated and purified according to a method known per se. .
For example, an ion exchange resin treatment method and a precipitation method (for example, an organic solvent precipitation method such as acetone, methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, and methyl ethyl ketone) can be appropriately combined.
[0036]
The physicochemical properties of β-polymalic acid produced by the method described above are as follows.
(1) Only L-malic acid is produced by a hydrolysis treatment in an acidic solution such as a 1N aqueous hydrochloric acid solution or a 1N aqueous sulfuric acid solution.
(2) The chemical shifts (ppm) of the four types of carbon atoms that are distinguished from each other in the molecular structure show values in the following ranges (1) to (4).
[0037]
(1) carbon atom: 68.80 ppm to 71.95 ppm
(2) carbon atom: 33.40 ppm to 38.40 ppm
(3) carbon atom; 168.90 ppm to 173.10 ppm
(4) carbon atom: 170.00 ppm to 175.79 ppm
(3) The average molecular weight measured by the GPC method is in the range of about 1,000 to 50,000.
[0038]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
[0039]
[Example 1]
After preparing a medium having the following composition, 100 mL of this medium was dispensed into a 500 mL Erlenmeyer flask and sterilized by an autoclave (121 ° C., 15 minutes).
[0040]
Glucose 8.0%
Ammonium succinate 0.3%
Succinic acid 0.02%
Potassium bicarbonate (K 2 CO 3 ) 0.04%
Monopotassium dihydrogen phosphate 0.01%
Magnesium sulfate heptahydrate 0.01%
Zinc sulfate heptahydrate 0.005%
Corn steep liquor 0.05%
pH 6.0 (pH adjuster; 1N NaOH aqueous solution)
[0041]
After inoculating strains shown in the following [Table 1] into each flask, shaking culture was performed at 30 rpm at 120 rpm for 10 to 15 days. After completion of the culture, the cells were removed by centrifugation (12000 rpm, 10 minutes), and a culture supernatant of each culture was prepared.
[0042]
Subsequently, the concentration of free malic acid in the culture solution obtained by the culture was measured by HPLC analysis. Next, the culture supernatant was mixed with an equal volume of 2N concentrated hydrochloric acid, hydrolyzed at 90 ° C. for 24 hours, neutralized with a 1N aqueous solution of sodium hydroxide, and then analyzed by HPLC analysis. The amount of acid was quantified.
As a result, in each culture supernatant, the concentration of malic acid after the hydrolysis treatment was significantly increased as compared with that before the hydrolysis treatment. This was presumed to be the result of polymalic acid secreted into the culture supernatant being decomposed into malic acid by hydrolysis. Therefore, the amount of polymalic acid accumulated in each culture supernatant was calculated from the difference between the concentrations of malic acid before and after hydrolysis, and the results are summarized in [Table 1] below.
[0043]
Also, as a result of using an L-malic acid analysis kit (manufactured by Roche Diagnostics, Inc.) sold by JK International Co., Ltd., all of the hydrolyzed malic acid was in the L form. Was. The HPLC analysis of the malic acid concentration was performed under the following conditions.
[0044]
Column: Shimpak SCR-102H (manufactured by Shimadzu Corporation)
(Two connected in series)
Mobile phase; 2 mM perchloric acid aqueous solution flow rate; 1.5 mL / min Column temperature;
Detector; UV absorption meter (SPD-10A, manufactured by Shimadzu Corporation)
Detection wavelength: 210 nm
Detection time: 12.3 minutes Standard substance; L-malic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries)
[0045]
[Table 1]
[0046]
[Example 2]
The same medium as in Example 1 was prepared, 100 mL of each was dispensed into a 500 mL Erlenmeyer flask, and sterilized by an autoclave (121 ° C., 15 minutes).
After inoculating each flask with the strains shown in [Table 2] below, shaking culture was performed for 15 days under the same conditions using the same medium as in Example 1, and the culture supernatant was obtained in the same manner as in Example 1. A liquid was prepared. The culture supernatant was mixed with three times the volume (in terms of volume) of methanol, and allowed to stand overnight at 4 ° C. while cooling. After standing overnight, centrifugation (12000 rpm, 10 minutes) was performed, and a precipitate was obtained. The precipitate was subjected to freeze-drying treatment, and the weight was measured.
[0047]
The freeze-dried precipitate was subjected to a hydrolysis treatment in a 1N hydrochloric acid solution as in Example 1, and then subjected to HPLC analysis. As a result, no peak other than malic acid was found, and the precipitate was found to be polymalate. Presumed to be acid. It is known that polymalic acid obtained as a methanol precipitate is a high molecular weight polymer having a high degree of polymerization.
The following Table 2 shows the accumulated amount of high molecular weight polymalic acid calculated from the lyophilized product.
[0048]
[Table 2]
[0049]
[Example 3]
1 L of a medium having the same components and concentration as in Example 1 was charged into a 2 L Sakura Seiki aeration-stirred bioreactor (TBR-2), and sterilized by a conventional method.
Sidvia polyspora CBS 128.64 strain, or CBS 719.76 strain and CBS 750.71 strain were separately prepared for each test plot in which the pH at the start of culture was changed by 1.0 from 4.0 to 8.0. After the inoculation, aeration and agitation culture (250 rpm, 30 ° C., 1.1 vvm, 10 days) was performed while controlling the pH at the start of the culture with a 2N sodium hydroxide solution.
After completion of the culture, the amount of polymalic acid accumulated in the culture supernatant was analyzed in the same manner as in Example 1. Table 3 below shows the amount of polymalic acid accumulated by each strain at each pH.
[0050]
[Table 3]
[0051]
[Example 4]
As in Example 3, 1 L of a medium having the same components and concentration as in Example 1 was charged into a 2 L Sakura Seiki aeration-stirred bioreactor (TBR-2), and sterilized by a conventional method.
Separately, Sidvia polyspora CBS 128.64 strain, or CBS 719.76 strain or CBS 750.71 strain were separately inoculated in each test section, and the pH during culturing was adjusted to 6.0 with a 2N sodium hydroxide solution. Aeration and agitation culture (250 rpm, 30 ° C., 1.1 vvm, 10 days) was performed while doing so.
[0052]
After completion of the culture, the accumulated amount of polymalic acid was analyzed in the same manner as in Example 1, and the concentrations of other organic acids by HPLC and the absorbance (580 nm) of the culture supernatant were analyzed.
As a result, not only malic acid but also by-products such as succinic acid and fumaric acid could not be confirmed in the culture supernatant. In addition, in any of the bacteria, the culture supernatant was transparent, and no significant change was found in the absorbance of the medium before inoculation, as compared with the absorbance of the medium before inoculation. That is, production of pigments such as various organic acids and melanin in the culture supernatant was not recognized. The following Table 4 shows the amount of polymalic acid accumulated and the absorbance of each strain.
[0053]
[Table 4]
[0054]
[Comparative Example 1]
As in Example 3, 1 L of a medium having the same components and concentration as in Example 1 was charged into a 2 L Sakura Seiki aeration-stirred bioreactor (TBR-2), and sterilized by a conventional method.
After inoculating Aureobasidium pullulans IFO6353 strain, aeration and stirring culture (250 rpm, 30 ° C., 1.1 vvm, 250 rpm, 30 ° C., 1.1 Vvm, 2N sodium hydroxide solution) was performed while controlling the pH during the culture to 7.0. 10 days), and in the same manner as in Example 4, the concentration of other organic acids by HPLC and the absorbance (580 nm) of the culture supernatant were analyzed.
[0055]
The amount of polymalic acid accumulated at the end of the culture was 12.5 g / L. Malic acid was not found in the culture supernatant, but 0.2 g / L of succinic acid and 0.1 g / L of fumaric acid were found. Further, at the end of the culture, the color of the culture supernatant was colored black due to the production of melanin pigment, and its absorbance (580 nm) was 2.6.
[0056]
[Example 5]
From the culture supernatants of Sidvia polyspora CBS128.64, CBS719.76 and CBS750.71 obtained in Example 4, polymalic acid was converted to methanol in the same manner as in Example 2. Separated and purified by coprecipitation method.
With respect to the obtained polymalic acid, the molecular weight of the polymalic acid of each strain was measured under the following conditions using an HPLC-10VP apparatus manufactured by Shimadzu Corporation and software for GPC analysis.
[Table 5] below shows the results of the molecular weight analysis of polymalic acid of each strain.
[0057]
Column: TSK-gel α-2000
TSK-gel α-5000
TSK-gel α-7000
(Three connected in series)
Mobile phase; water flow rate; 1.0 mL / min column temperature;
Detector: Photo diamond array detector SPD-M10AVP
Detection wavelength: 210 nm
Standard substance: PEG, Dextran
[0058]
[Table 5]
[0059]
[Example 6]
For polymalate of Shidovia-Porisupora CBS128.64 strain obtained in Example 5, by JEOL (JEOL Datum Ltd.) manufactured by JNM-α400FT type NMR, we acquire the 13 C-NMR data.
As a result, in addition to the chemical shift derived from methanol (46.0 ppm), four chemical shifts of 69.66 ppm and 35.85 ppm, 171.50 ppm, and 175.41 ppm were observed.
That is, it was confirmed that the obtained polymalic acid was of the β type.
[0060]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the manufacturing method of (beta) -polymalic acid with little by-product production is provided by culture | cultivating (beta) -polymalic acid-producing microorganism whose anamorph belongs to the genus Formonema.
