JPH04117346A

JPH04117346A - ホスホリパーゼａ↓２阻害物質

Info

Publication number: JPH04117346A
Application number: JP2234955A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Yoshida; 正吉田; Keizo Inoue; 圭三井上; Hitoshi Arita; 有田　斉; Shigeru Matsutani; 茂松谷; Yoshimi Kawamura; 川村　義巳
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1990-09-04
Filing date: 1990-09-04
Publication date: 1992-04-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、新規なホスホリパーゼＡ、阻害物質に関し、
さらに詳しくは、チェラビア属に属する菌株、例えばチ
ェラビア・テリフーラ（Ｔ　ｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒ
ｒｉｃｏｌａ）ＲＦ　−１４３株またはその変異体を液
中好気性条件下に培養することにより産生されるホスホ
リパーゼＡ、阻害作用を有する生理活性物質に関するも
のである。また、本発明は、該化合物を産生ずるチェラ
ビア属に属する菌株、例えばチェラビア・テリコーラＲ
Ｆ−１４３株またはその変異体を培養し、培養液から該
化合物を採取することを特徴とする該化合物の製造方法
に関するものである。

［従来技術および発明が解決しようとする課題］ホスホ
リパーゼＡ、は多くの生物の細胞や分泌液に含有されて
おり、リン脂質に特異的に作用するエステラーゼであっ
て、ｌ、２−ジアシルグリセロールリン脂質のＣ−２位
の脂肪酸エステルを特異的に加水分解し、リゾグリセロ
リン脂質と脂肪酸とを生成することが知られている。そ
の酵素活性に関連して、神経、筋肉、心臓への毒性昨月
抗凝固作用を有し、痙彎、低血圧、溶血、出血、浮腫な
どを誘発し得ることが指摘されており、その他の疾患に
も直接または間接的に関与している可能性がある。した
がって、ホスホリパーゼＡ。

の酵素活性に対する阻害物質が得られれば、該勢素の作
用に起因または関連する様々な病態を制防し、治療する
ことができると考えられる。従来知られているホスホリ
パーゼＡ、阻害物質には、メルクリン、ｐ−ブロモフェ
ナシルプロミドなどがあるが、新たな有効物質が待たれ
ている。

［課題を解決するための手段］本発明者らは、先に、チェラビア・テリコーラＲＦ−１
４３株が産生ずるチエロジンαおよびβが優れたホスホ
リパーゼＡ、阻害活性を有することを見い出し、これを
特許出願したが（特願平１−１０９９３９）、更に研究
を続けた結果、上記菌株がチエロジンとは構造を異にす
る新規なホスホリパーゼＡ、阻害物質を生産しているこ
とを見い出し、かつ、その構造を決定することにより、
本発明を完成したものである。

即ち、本発明は、チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３
株を培養することにより産生され得る、ホスホリパーゼ
Ａ、阻害作用を有する生理活性物質である化合物および
その製造方法を提供するものである。

本発明の化合物の構造式および物理化学的性状を以下に
列挙する。

！１呂ｌｌｌ物理化学的性状（１）分子式：　Ｃ３ｆｆＨ，，０（２）融点：１７５〜１８２℃ （３）外１ｔｌ：無色粉末（４）Ｓ　ＩＭＳ（１１＋／ｚ）：　９６７（ＭＨ”）
（５）　ＨＲＭＳ　（＋ｎ／ｚ）実測値：９６７．３７５４計算値：　９６７．３７４９（ＭＨ”）（６）ｒＲ（Ｋ
Ｂｒ）：３４２４，２９００〜２３２０．１７４２，１
８５９，１６１０゜１５４７．１４６１．１３１８．１
２７８゜１１５２．１０９６，１０７７．９８Ｂ。

７９０ＣＩ−’ （７）　ＵＶ（ｎ＊（ε））　：　２７５（２４１５Ｑ
）、　　３２３（５１２０Ｘ希Ｈ（Ｊ！　　ＭｅＯＨお
よびＭｅＯＨ）２４８（肩、２１２５０）、３３１（３
２６５０）（希ＮａＯＨ−ＭｅＯＨ）（８）溶解性ニジメチルスルホキシド、メタノール、り
ｏＯホルムおよび酢酸エチルに可溶、ｎ−へ牛サン、石
油エーテルおよび水に不溶（９）呈色反応ＦｅＣＱｓ：陽性ニンヒドリン：陰性坂口；陰性エールリッヒ：陰性（ｌＯ）薄層クロマトグラフィーＲｒ値（ンリヵゲルＦ
　＊−（メルク））：り凹本ルム：　　ＭｅＯＨ（２：　Ｌ）溶媒系　：　　
　０．０８りａα本ルム：　　ＥｔＯｌ（：　　１４％
　ＮＨ４０Ｈ（４ニア：２）溶媒系　：　　　０．２６
りＯｏネルＡ　：　ＥｔＯＨ：　１０％酢酸（４ニア：
２）溶媒系：　　０．７２（１１）ガスクロマトグラフ
ィー（Ｒｔ（分乃［カラム：ヌクレオシル５Ｃ＋＊４．
６φＸ１５０移動相：０．１％リン酸を含有する６３〜
９０％水性ｌ、ＣＮ／リニアーグラジェント。

流速：１．８村／分コニ９．５１（１２）比旋光度：［αコＤ　ｏ、ｏｏ（ｃ＝　０．５８２．　　メタノー
ル）本発明化合物の塩としては、Ｎａ、になどアルカリ
金属、Ｍｇ、Ｃａなどアルカリ土類金属、アンモニアな
どの有機塩基など本発明化合物のカルボキシ基と塩を形
成し得るすべての塩基との塩が例示され、製薬上許容し
得る塩が好ましい。

ホスホリパーゼＡ、阻害物質である本発明化合物を産生
ずるチェラビア・テリコーラＲＦ−１４３株は、通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所に、受託番号微工
研条寄第２１９６号の下で寄託されている（寄託日：昭
和６３年１２月１９日）。

本発明で使用されるチェラビア・テリコーラＲＦ−１４
３の菌学的性状は以下の通りである。

ＲＦ−１４３株の栄養菌糸はコーンミール寒天上で肉眼
的に白色を呈する。子のう果（ａｓｃｏｃａｒｐ）は寒
天培地の表面に形成され、その形は球形で茶黒色を呈す
る。その大きさは直径１００〜３００μｌで、外壁の表
面組織（ｔｅｘｕｔｒａ　ｅｐｉｄｅｒａ＋ｏｉｄｅａ
）は茶色である。子のうは３０〜３５Ｘ　１５〜１７μ
ｌの大きさで、洋ナシ形を示し、その中に８個の子のう
胞子を有する。子のうは成熟時には溶解する。子のう胞
子は幅の広い紡錘形をしており、オリーブ色から茶灰色
を呈し、その一端に１個の発芽孔を有する。子のう胞子
の大きさは１２〜１８Ｘ６〜８μｌである。本菌の不完
全世代は認められない。

以上の性状からＲＦ−１４３株はチェラビア・テリコー
ラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒｒｉｃｏｌａ””）と
同定された。

参考文献１）　シー・ダブりニー・エモンズ（Ｃ，Ｗ、　Ｅｍｍ
。

ｎｓ）、Ｂｕｔｌ、　Ｔｏｒｒｅｙ　Ｂｏｔ、　Ｃ１ｕ
ｂ　５７．１２４２）　ジー・ドゲット（Ｇ、　　Ｄｏ
ｇｕｅｔ）、Ｒｅｖ、　　Ｍｙｃｏｌ。

２１、５ｕｐ９１．　Ｃｏ１ｏｎｉａｌ　１．２（１９
５６）３）　シー・ブース（Ｃ，Ｂｏｏｔｈ）、Ｍｙｃ
ｏｌ、Ｐａｐ。

８３、７（１９６１）４）ニスｅウダガワ（Ｓ、　Ｕｄａｇａｖａ）、Ｔｒａ
ｎｓ。

Ｍｙｃｏｌ、　Ｓｏｃ、　Ｊａｐ、　４．９９（１９６
３）５）　ジェイ・ニー・ボン・アークス（Ｊ、　Ａ、
　ｖａｎＡｒｘ）、５ｔｕｄ、　Ｍｙｃｏｌ、　８．　
ｌ１ｌ（１９７５）チェラビア・テリコーラも菌類の特
徴として、突然変異を起こす可能性がある。そのような
突然変異体は、自然発生的にも出現するが、当業者周知
の物理的または化学的な方法で容易に誘導することかで
きる。従って、充分量の本発明化合物を産生ずる能力を
保持しているチェラビア・テリコーラＲＦ−１４３の変
異体もまた本発明の範囲に包含されるということが当業
者には理解されるであろう。

チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３の培養には、通常
の培養法を利用することができる。適当な炭素源、窒素
源、無機塩、および微量金属等の存在下、好気性条件下
で液中培養することが好ましい。通常、チェラビア・テ
リコーラＲＦ−１４３を温度約２０〜４０℃、好ましく
は２８°Ｃで通気しながら振盪フラスコ培養すると、約
１〜１０日間培養すればよい。次いで、培養物からの生
成物の分離における当業者既知の方法で本発明化合物を
分離すればよい。即ち、培養物を濾過して濾液および沈
殿（ｌＩ１成分）をそれぞれ適当な溶媒で抽出し、得ら
れた抽出液を濃縮して溶媒抽出、クロマトグラフィー処
理等によって活性物質を単離−ｊ−ス本発明に係る化合物のホスホリパーゼＡ、５０％阻害濃
度（ホスホリパーゼＡ、活性を５０％阻害する濃度）１
王、ブタ膵臓由来のホスホリパーゼＡ。

に対しては１２μ９７酎、ラット血小板由来のホスホリ
パーゼＡ２に対しては０．００７５μ９／ｚＱである。

従って、本発明の化合物は、ホスホリパーゼＡ、の酵素
活性に起因する様々な疾患の予防および治療に有用と考
えられる。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

実施例１１）発酵チェラビア・テリコーラＲＦ−１４３株（１１工研条寄
第２１９６号）をバレイシ目ブドウ糖寒天斜面で７〜１
０日間、２８℃で培養し、−斜面の全菌体および胞子を
２１２容量のエルシンマイヤーフラスコ中の培地ａｏｏ
ｚ１２（培地組成；ブドウ糖２．０％、ポリペプトン１
．０％、肉エキス０．３％、酵母エキス０．２％、食塩
０．１％、ｐＨ７，０）に植菌した。植菌されたフラス
コを２８℃で２日間振盪培養した。上記培養液（８００
ｍのを２０Ｃの上記組成の培地を含む３０Ｒのジャー・
ファーメンタ−に加え、２８℃で１日間、通気撹拌培養
を行った（通気量２０ｇ／分、撹拌１５０　ｒｐｍ）。

次に上記の培養液６ｅをバレイショ浸出液（２００ｐ／
Ｉ２）およびシ：ｌ　ｍ！（２０９／　１２）組成の培
地（ｐＨ無修正）１５０ｆ２を含む２５０Ｑ発酵タンク
に移した。

発酵は、２８℃で、開始時から１６時間までは２０　ｒ
ｐｍ、その後は３７０　ｒｐｍで撹拌し、通気量は１５
０ｅ／分（１，ＯＶＶＭ）で７日間通気撹拌培養を行っ
た。

２）単離上記１）で得た発酵液３５６ｅを希塩酸でｐＨ２，５に
調整し、ろ過した。菌体部分をアセトン１０８ｅで抽出
、抽出液（ｐＨ３，８）を減圧下で濃縮した。水相（３
０ｆｆ）をｐＨ２，５に調整し、酢酸エチル（２ＥＭ）
で抽出した。抽出液を減圧下で濃縮し、石油エーテル（
２Ｑ）を加えて沈澱を生じさせた。

得られた粗抽出物４４８９をアセトン（３，６１２）に
溶解し、２００ｔｘＭ　　リン酸バッファー（ＰＢＸｐ
Ｈ７，５，８，４（２）を加え、これをＣＨＰ−２０Ｐ
カラム（２Ｏｆ２）にかけた。アセトン　３％ＮａＣＱ
−２０１ＩＭ　ＰＢ（ｐＨ７，５）＝３　：　７の混液
（１０Ｑ）で洗浄し、次いでアセトン゛３％ＮａＣＱ−
２０ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７，５）＝３　：　７のｆｉ液（
３０ｊ）とアセトン：　２０ｎＭ　ＰＢ（ｐＨ７，５）
＝７　：　３の混液（３０のとのリニアーグラジェント
により溶出した。

この溶出により下表のごと（Ａ分画（２２，０９）、Ｂ
分画（２４，６９）、Ｃ分画（１０８９）およびＤ分画
（１７，６９）を得、Ｂ分画を更に次の様に処理した。

分画　　　Ｆｒ、Ｎｏ、　　　　容量（１２）１〜７　
　　３．２Ａ　　　　　８〜１８　　　　８．１８　　　　１９〜２６　　　　３．６Ｃ３０〜３３　　　　４．８Ｄ　　　　　３４〜３５　　　　９．０Ｄ分画（２４，
６９）をセファデックスＬＨ−２０カラムにかけ、メタ
ノールで溶出した（２回）。得られた活性分画（１，０
８９）を調製用高速液体クロマトグラフィーにか１す［
カラムニヌクレオシル１０Ｃ，，（２φＸ　２５　ｃｍ
）、溶離液；０．１％Ｈ，ＰＯ４を含有する６８〜７０
％ＣＨ，ＣＮ（０〜１８分りニア−グラジェント）、流
速：１１１２／分、検出：　ＵＶ（２５０ｎａ）］、目
的とする化合物１６１履９を得た。この化合物は、先に
示した物理化学的性状を示した。

以下の実験例に示す方法で本発明化合物のホスホリパー
ゼＡ、阻害活性を調べた。

実験Ｍｌ互凄基質には、Ｌ−３−ホスファチジルエタ／−ルアミン、
１−バルミトイル−２−［１−”Ｃ］リルオイル（Ａａ
ｅｒｓｈａ１社＋　　５９　ｍｃ　ｉ／ｇａｏｌ）を、
Ｌ−ａ−ホスファチジルエタノールアミン（Ｓｉｕａａ
。

卵白由来）により希釈（２、ＯＯＯｄｐ＋＊／　ｎ５ｏ
ｌ）　Ｌ、これをソニケートしたものを用いた。ＰＬＡ
Ｉには、豚膵臓由来（Ｓ　１ｇ５ａ社）およびラット血
小板由来のものを使用した。反応は、トリスバッファー
（０，１Ｍ、ｐＨ７，４）、ＣａＣｅｔ（３ＤＭ）の溶
液中にＰＬＡ、および基質調整液を加え、３７℃で２０
分間反応後にドールズ試薬１．２５Ｒ＋２を入れ直ちに
撹拌し反応を止めた。これに蒸留水０．５ｍ１２とｎ−
へブタン０．８ｘ（ｌを加え撹拌後遠心し、上層を別に
分取した。さらにｎ−ヘプタンＯ，ＢｘＩ２とシリカゲ
ルを加え撹拌後、遠心し上清をバイアル瓶に分取し、こ
れにトルエンカクテルを加え、液体シンチレーシコンカ
ウンターによりＰＬＡ、によって遊離されてくる脂肪酸
量を測定した。

阻害活性値（％）は、（（阻害剤添加時のＤＰＭ値−Ｐ
ＬＡ、無添加時のＤＰＭ値）／（ＰＬＡ、単独作用時の
ＤＰＭ値−ＰＬＡ、無添加時のＤＰＭ値））×１００に
より算出した。

結果ホスホリパーゼＡ、の活性を５０％阻害する濃度は、ブ
タ膵臓由来のホスホリパーゼＡ！に対しては１２μｇ／
友ｅ１ラット血小板市来のホスホリパーゼＡ、に対して
はＯ，ＯＯ７５μ９／＊Ｑであった。

【図面の簡単な説明】第１図は本発明化合物の赤外吸収スペクトルを示すグラ
フである。

Claims

【特許請求の範囲】１、以下の構造式で示される化合物またはその塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、チエラビア属に属する請求項１に記載の化合物を産
生する菌株を液中好気性条件下で培養し、培養液から該
化合物を採取することを特徴とする該化合物の製造方法
。