JPH0381229A - 抗ａｔｌウイルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗ＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血球：　ａｄｕｌｔＴ
　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ）ウィルス抗体陽性静注
用免疫グロブリン製剤の製法に関する。

〔従来の技術〕

特定のウィルスに対する抗体を主成分とする静注用免疫
グロブリン製剤としては、各種ウィルス、例えばＢ型肝
炎ウィルス（ＨＢＶ）、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（ＮＡ
ＮＢＶ）、サイトメガロウィルス、水１Ｍ帯状ヘルペス
ウィルス、インフルエンザウィルスなどに対するものが
知られており、各々のウィルスによる感染の予防治療の
ために用いられる。

（発明が解決しようとする課題〕 本発明の目的は、臨床上適用できる製剤、すなわち、安
全性と有効性の高い抗ＡＴＬウィルス抗体陽性静注用免
疫グロブリン製剤の製造方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、この目的に沿って抗ＡＴＬウィルス抗体
陽性静注用免疫グロブリン製剤の工業的な製法について
検討した結果、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ
という）分画処理、加熱処理等を組み合わせ、各工程の
処理条件を設定することによって安全性と有効性の高い
抗ＡＴＬウィルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤が
得られることを見出しこと、さらに本製剤がＡＴＬウィ
ルス感受性の動物を用いた実験において感染防止効果の
あることを、初めて確認したことに基づいて本発明を完
成した。

（１）　　出発原料 本発明の出発原料としては、抗ＡＴＬウィルス抗体陽性
免疫グロブリンを含む画分が使用され、これはヒト血漿
由来であって、抗ＡＴＬウィルス抗体陽性免疫グロブリ
ン画分を含むものであれば特に限定されない。具体的に
は、抗ＡＴＬウィルス抗体陽性血漿からコーンのエタノ
ール分画により得られる百分■＋■、画分■、または抗
ＡＴＬウィルス抗体陽性免疫グロブリンを含むこれらと
同等の画分のペースト等が挙げられる。また、この出発
原料は、ヒト血液型抗体、カリクレイン、プレカリクレ
イン、ＩｇＭｉｇＧ重合体などを含んでいてもよい。陽
性の確認は、例えばＡＴＬ粒子またはウィルス由来の蛋
白質を既知の免疫学的手法〔ＲＩ法、ＰＨＡ法、ＥＩＡ
法、ラテックス凝集反応法又はゼラチン粒子凝集反応（
ＰＡ）法〕によって試薬化し、この試薬との反応性を検
知することによって行う。また、市販のＡＴＬ抗体測定
用試薬、例えばセロディアＡＴＬを使用することもでき
る。この陽性画分を出発原料とする。

（２）製法 本発明による製造方法は、好ましくは以下の処理よりな
る。

■低濃度ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）処理工程 本工程は出発原料を低濃度ＰＥＧで処理し、上清を回収
する工程である。

出発原料を適当な水性溶媒に懸濁する。水性溶媒の溶質
として、たとえば塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、
リン酸カリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、クエン酸、ク
エン酸ナトリウム等を含ませてもよい。

この懸濁液を分子量１　、０００〜１０，０００　（好
適には約２，０００〜６，０００　＞のＰＥＧで処理す
る（たとえば、両者を混合する）、処理条件としては、
ＰＥＧ１度４〜１０　ｗ　／　ｖ％（特に４〜８Ｗ／ｖ
％）、ｐＨ４〜６（特に４．５〜５．５　）　、イオン
強度０．０００１〜０．１　Ｍ　（特に、０．０００１
〜０．０１　Ｍ　）であることが好ましい。

この際、蛋白濃度１〜２０ｗ／ｖ％（特に、５〜Ｉ　５
　ｗ　／　ｖ％）であることが好ましい。

当該処理は、０〜４℃程度で通常３０分〜６時間程度撹
拌することによって行われる。

その後、たとえば遠心骨Ｍ　（６０００〜８０００　ｒ
　ｐ　ｍ、１０〜３０分間）して上清を回収する。

■高濃度ＰＥＧ処理工程 本工程は■の工程で得られた上清を高濃度ＰＥＧで処理
し、沈澱を回収する工程である。

上記上清を分子量１　、０００〜１０，０００　（好適
には２．０００〜６．０００）のＰＥＧにてさらに処理
する（例えば、両者を混合する）。処理条件としては、
ＰＥＧ濃度１０〜１５ｗ／ｖ％（特に、約１１−１３ｗ
　／　ｖ％）、ｐＨ６〜９（特に７．５〜８．５）、イ
オン強度０．０００１−０．１　Ｍ　（特に、０．００
０１〜０．ＯＩＭ）であることが好ましい。

この際、蛋白濃度１〜２０ｗ／ｖ％（特に、５〜１５ｗ
／ｖ％）であることが好ましい。

当該処理は、０〜４℃程度で通常３０分〜６時間程度撹
拌することによって行われる。

その後、たとえば遠心分離（６（１００〜８０００　ｒ
　ｐ　ｍ、１０〜３０分間）して沈澱を回収する。

■陰イオン交換体処理工程 本工程は■の工程で得られた沈澱画分を水性溶媒に溶解
後、または後記■の工程の処理後陰イオン交換体で接触
処理して非吸着画分を回収する工程である。

本工程は、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧ重合体を除くた
めに行われる。

（ｉ）陰イオン交換体の調製 陰イオン交換体は陰イオン交換基を不溶性担体に結合し
たものであるが、陰イオン交換基としてはジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）基、四級アミノエチル（ＱＡＥ）
基等を、不溶性担体としてはアガロース、セルロース、
デキストラン、ポリアクリルアミド等を用いることがで
きる。

その結合は公知の方法で行われる。

（ｉｉ）処理方法 ■の工程で得られた沈澱画分を適当な水性溶媒に溶解す
る。水性溶媒はｐＨ５〜８（好ましくはｐＨ５，５〜７
．５　＞　、低イオン強度（好ましくは０．０１〜０．
２Ｍ）の水溶液であることが好ましい、■の工程と同様
の溶質を含んでいてもよい、蛋白濃度としては１〜１５
ｗ／ｖ％（特に、３〜１０ｗ／ｖ％）が好ましい。

さらに、上記水性溶媒で平衡化した陰イオン交換体と接
触処理する。その処理に際してはバッチ法、カラム法の
どちらを用いてもよい。

たとえば、バッチ法では、陰イオン交換体１ｍ１に対し
て処理対象溶液１０〜１０ｏｍ１程度と混合させ、０〜
４℃で３０分〜２時間程度撹拌した後、遠心分Ｎ　（６
，０００〜８．０００　ｒ　ｐ　ｍ、　　１０〜３０分
間）又は濾過して上清を回収する。

カラム法でも、陰イオン交換体１−に対して処理対象溶
液１Ｏ−１ｏｏ■１程度を接触させ、非吸着画分を回収
する。

なお、本■の工程は所望により省略することもできる。

また、液状加熱処理を行う場合には■の固定化ヒト血液
型物質処理後に当該陰イオン交換体処理を実施すること
が好ましい。

■固定化ヒト血液型物質処理工程 本工程は■の工程の沈澱画分または■の非吸着画分を固
定化ヒト血液型物質で接触処理して、非吸着画分を回収
する工程である。

本工程はヒト血液型抗体を除くために行われる。

（１）固定化ヒト血液型物質の調製 固定化ヒト血液型物質はヒト血液型物質を不溶性担体に
固定化したものである。

ヒト血液型物質は、合成のものでもよく、また公知の方
法を用いて以下の様にして調整したものであってもよい
。例えば、ヒトＡ、Ｂ、ＡＢまたはＯ型の赤血球を低張
溶液中で溶血、または超音波処理した後、硫安分画法ま
たはＰＥＧ分画法により精製すること等により得られる
。

さらにこのヒト血液型物質は生理的食塩液に溶解後、夾
雑するウィルスの不活化に有効とされている、たとえば
、約５０〜７０℃、好ましくは約６０℃で、７〜１３時
間、好ましくは約１０時間、又は約８０〜１３０℃１好
ましくは９５℃−１２１℃で約１〜４０分、好ましくは
約２〜３０分間加熱処理する。その後、遠心分離して不
溶物を除去し、蒸留水に対して透析して、各ヒト血液型
物質を得る。

一方、不溶性担体としてはアガロース、セルロース、デ
キストラン、シリカゲル、ガラス等が用いられる。

固定化は公知の方法に準しればよい。例えば、アガロー
ス、セルロース等はＣＮＢｒ活性化法により、シリカゲ
ル、ガラス等はオキシラン法によりヒト血液型物質を固
定化できる。

（ｉｉ）処理方法 処理対象物、たとえば■の工程の沈澱画分を水性溶媒に
溶解したもの、あるいは■の工程の非吸着画分をｐＨ５
〜８（特にｐＨ６〜７）、イオン濃度０．０１〜０．２
Ｍ（特に０．０５〜０．１５Ｍ）の条件下で、上記水性
溶媒で平衡化した固定化ヒト血液型物質と接触処理する
。その際、蛋白濃度１−１５ｗ　／　ｖ％（特に、３〜
１０　ｗ　／　ｖ％）であルコトが好ましく、またバッ
チ法、カラム法のどちらを用いてもよい。

たとえばバッチ法では、固定化ヒト血液型物質１　ｒｕ
ｎに対して処理対象溶液１０〜１００−程度と混合させ
、０〜１０℃１好ましくは０〜４　”Ｃで、３０分〜４
時間、好ましくは３０分〜２時間程度撹拌した後、遠心
分離（６，０００〜８．００Ｏｒ　ｐ　ｍ、１０〜３０
分間）して上清を回収する。

カラム法でも、固定化ヒト血液型物質ｌ■ｌに対して処
理対象溶液１０〜１００ｍ１程度を接触させ、非吸着画
分を回収する。

この■の工程は所望により省略することもできる。

■加熱処理工程 本工程は、所望の段階で安定化剤の存在下に当該免疫グ
ロブリンのＡＴＬウィルスに対する抗体活性の減少は最
小限にとどめるが、夾雑するウィルス、例えばＡＴＬ、
ＨＢ、ＮＡＮＢなどのウィルスは実質的に不活化する条
件下で加熱処理する工程である。加熱処理は、含湿度３
％以下の乾燥状態（即ち、乾熱処理）、または溶液状態
、即ち免疫グロブリンの水溶液状ＪＱ（即ち、液状加熱
処理）で行う、より好ましくは液状加熱処理が推奨され
る。

安定化剤としては、いずれの処理の場合も、糖［（例、
サッカロース、マルトース）、糖アルコール（例、ソル
ビトール、マンニトール）が好適に例示される。より好
ましくはソルビトールである。

安定化剤の添加量は、乾熱処理法では、三糖類、糖アル
コール等を０．５〜５　ｗ　／　ｖ％（好ましくは、ｌ
〜３　ｗ　／　ｖ％）液状加熱処理法では二Ｉ！類、糖
アルコール等を１０ｗ／ｖ％以上（好ましくは２０〜４
５　ｗ　／　ｖ％または１０〜３５ｗ／ｗ％）を用いる
ことが好適に例示される。

加熱の対象となる免疫グロブリンの量は、乾熱処理では
、蛋白量としてｌ〜ＩＯＷ／Ｖ％（好ましくは３〜７　
ｗ　／　ｖ％）となるように調整することが好適である
。液状加熱処理では、蛋白量として０．１〜３　Ｑ　ｗ
　／　ｖ％（好ましくは５〜２０ｗ／Ｖ％）に調整する
ことが好ましい。

加熱処理は、乾熱処理の場合は、安定化剤を添加後、要
すれば除菌濾過し、たとえば凍結乾燥などによって含水
率３％以下、好ましくは１％以下とする。凍結乾燥の条
件としては０．５　ｗｔｌｇの真空下、２０〜４０℃で
２４〜９６時間程度が例示される０次いで、たとえば５
０〜７０″Ｃ（好ましくは６０゛Ｃ程度）、１０〜２０
０時間（好ましくは５０〜１００時間程度）で処理する
。

また、本加熱処理工程は不活性ガス雰囲気下で行うこと
により、加熱時の安定性をより高めることができる。不
活性ガスとしては例えば、窒素ガス、アルゴン、ヘリウ
ムなどが挙げられる。

液状加熱処理の場合は水溶液のｐＨを４．５〜６．５、
好ましくはｐＨ５〜６に調整し、液状加熱処理法ではた
とえば５０〜７０℃（好ましくは６０℃程度）で■０分
〜２０時間（好ましくは１０時間程度）処理される。

加熱処理の工程は、乾熱処理の場合は最終工程で行うこ
とが好ましい。

液状加熱処理の場合は、出発原料に対して、または■の
工程の前に行うのが好適である。

なお、■の工程のあとに行うこともできるが、その場合
は、■および■の処理を再度行うことが夾雑物除去の点
でより好ましい。

全工程終了後、公知の方法、すなわち透析、除菌濾過、
分注などの操作により液状製剤とすることができる。さ
らに、凍結乾燥などの操作により乾燥製剤とすることも
できる。

液状製剤の場合、グロブリン濃度としては１〜１５　ｗ
／ｖ％（好ましくは５〜１０　Ｗ　／　Ｖ％）程度であ
る。また、安定化剤を添加しておくことが好ましい、安
定化剤としては、糖、糖アルコールなどが例示される。

その具体的な例については■の加熱処理において既に開
示したものと同様である。

安定化剤の添加量としては、グロブリン１〜１５ｗ　／
　ｖ％当たり、１−Ｌｏｗ／ｖ％程度、好ましくは５　
ｗ　／　ｖ％程度が挙げられる。

また、液状製剤のｐｌ＋は５．３〜５．７程度、好まし
くは５．５程度としておくことが例示される。

乾燥製剤の場合も安定化剤を添加しておくことが好まし
い。安定化剤としては、糖、糖アルコール、アルブミン
、無機塩などが例示される。その具体的な例としては、
糖、糖アルコールについては■の加熱処理において既に
開示したものと同様であり、無機塩としては塩化ナトリ
ウムが例示される。

安定化剤の添加量としては、グロブリン１−１５重量部
当たり、糖またはキ唐アルコールで１〜１０重量部（好
ましくは２重量部）程度、アルブミンで０．５〜５重量
部（好ましくは１重量部）程度、無機塩で０．１−１重
量部（好ましくは０．５重量部）程度が挙げられる。

〔作用・効果〕

本発明により得られた製剤は免疫グロブリンが殆ど不活
化されておらず、しかも、加熱処理を施しているので夾
雑ウィルスは不活化され、抗補体活性も充分に低い等の
性質を有し、日本国生物学的製剤基準（以下、生基準）
に適合できる安全な製剤である。

また、乾燥製剤の場合は溶解性もよい。

本発明により得られた製剤は、用時、液状製剤の場合は
そのまま、あるいは適当な溶媒（例えば、注射用蒸留水
、生理食塩液、ブドウ糖液など）で希釈して、また、乾
燥製剤の場合は適当な溶媒（例えば、注射用蒸留水）に
溶解して、静脈内投与、点滴などにより、ＡＴＬウィル
ス由来の白血病の予防または治療に用いられる。

〔実施例・実験例〕

本発明をより詳細に説明するために実施例および実験例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。

実施例１ ＰＡ法にてスクリーニングした抗ＡＴＬウィルス抗体陽
性血漿を冷エタノール法により得られたコーン画分Ｕ十
１１ｋｇに冷水１０ｍ２を加え、ｐＨを５．５に調整し
た後、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＃４０００を終濃度が８％になるよ
うに添加し、２℃で遠心分離を行った。

得られた上清を１Ｎ−水酸化ナトリウムを用いてｐＨ，
ｏとした後、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＃４０００を終濃度が１２％
になるように加え、２℃で遠心分離を行い、ＩｇＧ画分
を集めた。

このＩｇＧ画分を０．６％塩化ナトリウム溶液を用いＩ
ｇＧｆｉ度が７％になるように溶解せしめ、ｐｉ＋を６
．５に調整した。

このＩｇＧ溶液１００ｍ１を別途調整したヒト血液型物
質フォルミルセルロファイン力ラム３ｍｌを通過させヒ
ト血液型抗体を吸着除去した。この工程での吸着により
血液型抗体は（１：３２）から（１：２）に低下した。

この未吸着画分にＩｇＧ５Ｗ／Ｖ％溶液当たりヒト溶液
−フ゛ξンを１ｗ／ｖ％、サンカロースを２ｗ／ｖ％添
加し、除菌濾過後、凍結乾燥した。

凍結乾燥後、６０゛Ｃで７２時間加熱処理を行い、静注
用免疫グロブリン製剤を得た。

本製剤は、実質的にＩｇＧ単量体のみを含み、ヒト血液
型抗体量も充分少な（、抗補体価も１０〜１５ｃＨ，。

程度であった。

また、溶解性も高く、静注用免疫グロブリンとしての生
基準にも合格した。

また、この免疫グロブリンはウサギを使った試験でＡＴ
Ｌウィルスの感染を阻止した。

実施例２ ＰＡ法にてスクリーニングした抗ＡＴＬウィルス抗体陽
性血漿から冷エタノール法により得られたコーン画分Ｕ
＋ｌｌｌ１ｋｇに水１０ｆを加え、さらに１００ｍ１当
たりソルビトールを５０ｇ添加し、ｐＨを５．５に調整
した後、６０℃で１０時間加熱処理を行った。

加熱処理後、ｐＨを５．５に調整した後、冷蒸留水にて
３倍希釈し、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＃４０００を終濃度が６％に
なるように添加し、２℃３時間抽出を行った後、２　’
Ｃ７′遠心分離を行った。

得られた上清をＩＮ−水酸化ナトリウムを用いｐＨ８，
８とした後、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＃４０００を終濃度が１２％
になるように加え、２℃で遠心分離を行い、沈澱画分に
ＩｇＧ画分を得た。この沈澱を蒸溜水に溶解し、この溶
解液に０．４％食塩水で平衡化したＤＥＡＥ−セファデ
ックスを添加（５０ｎ＋１？容液当り２ｍ１）　シ、０
〜４℃の条件下、約１時間接触処理し、処理後濾過にて
ＤＥＡＥ−セファデックスを除き濾過液（Ｉ　ｇＧ温溶
液を回収した。

１ｇＧ画分に２％ソルビトール、０．５％ＮａＣｊ！お
よび１％アルブミンを添加溶解し、ρ１１６．８とした
後、除菌濾過し、凍結乾燥して静注用免疫グロブリン製
剤を得た。

本製剤は、実質的にＩｇＧ単量体のみを含み、ヒト血液
型抗体量も充分中なく、抗補体価も１０〜１５ＣＨ，。

程度であった。

また、溶解性も高く、静注用免疫グロブリンとしての生
基準にも合格した。

実施例３ 実施例２において、ＤＥＡＥ−セファデックスによる処
理後遠心分離（７０００ｒｐｍ、約２０分間）して上清
（ＩｇＧ溶液）を回収した。

このＩｇＧｔｇ液を蒸留水で５％ＩｇＧ？Ｂ液に調整し
、酢酸ナトリウムで溶液のｐｏを約５．５にし、さらに
ソルビトールを終濃度５％まで添加した。

この水溶液（電導度約１　ｍｍｈｏ）を除菌濾過し静注
用免疫グロブリン液状製剤を得た。

本製剤は、実質的に１ｇＧ１１量体のみを含み、抗補体
価も１Ｏ−１５ｃＨ，。程度であり、静注用免疫グロブ
リンとしての生基準にも合格した。

またウサギを使った試験で、ＡＴＬウィルスの感染を阻
止した。

実施例４ ＰＡ法にてスクリーニングした抗ＡＴ＋、ウィルス抗体
陽性血漿を５６℃で３０分間加温後以下のような冷エタ
ノール法によりコーン画分ｎを回収した。

■エタノール濃度８％、ｐＨ１，２、−３℃１１６時間
で処理して上清を採取 ■エタノール濃度２１％、ＰＨ６，８、−５’Ｃ，２４
時間で処理して沈ｔＲ（コーン画分１１＋Ｉ［［）を採
取 ■沈澱を溶解し、エタノール濃度２０％、ｐＨ６，６、
＝５℃１１６時間で処理して沈澱を採取■沈澱を溶解し
、エタノール濃度１７％、ｐＨ５，２，６℃１８時間で
処理して上清を採取 ■エタノール濃度２５％、ＰＨ７，４、−５℃２１６時
間で処理して沈澱（コーン画分■）を採取このコーン画
分■ペーストＩｋｇを蒸留水１０Ｉ！。

にて懸濁し、ｐＨを５．５に調整した後、遠心分離を行
い、上清を回収して、上清１００ｍ１当たりソルビトー
ルを５０ｇ添加し、６０℃で１０時間加熱処理した。

加熱処理後、蒸留水で３倍希釈し、ρ１１を５．５に調
整した後、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＃４０００を８！濃度が６％に
なるように添加し、２℃で遠心分離を行った。

得られた上清をＩＮ＝水酸化ナトリウムを用いｐＨ８，
０とした後、Ｐ　Ｅ　Ｇ　＃４０００を終濃度が１２％
なるように加え、２　”Ｃで遠心分離を行い、沈澱水に
ＩｇＧ画分を得た。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ＡＴＬウィルス抗体陽性免疫グロブリンを含む
   画分を出発原料とする、以下の処理からなる抗ＡＴＬウ
   ィルス抗体陽性静注用免疫グロブリン製剤の製造方法： （ａ）ｐＨ４〜６、イオン強度０．０００１〜０．１Ｍ
   、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０００〜１０，０
   ００のポリエチレングリコール４〜１０ｗ／ｖ％で処理
   して上清を回収する。 （ｂ）（ａ）の上清をｐＨ６〜９、イオン強度０．００
   ０１〜０．１Ｍ、温度０〜４℃の条件下、分子量１，０
   ００〜１０，０００のポリエチレングリコール１０〜１
   ５ｗ／ｖ％で処理して沈澱を回収する。 （ｃ）所望の工程で夾雑するウィルスが不活化するのに
   充分な条件下、安定化剤の存在下で加熱処理する。
2. （２）（ｂ）の工程の後に、ｐＨ５〜８、イオン強度０
   ．０１〜０．２Ｍの条件下、固定化ヒト血液型物質で処
   理して非吸着画分を回収する工程を含むことを特徴とす
   る請求項（１）記載の製造方法。
3. （３）（ｂ）の沈澱を水性溶媒に溶解し、ｐＨ５〜８、
   イオン強度０．０１〜０．２Ｍの条件下、陰イオン交換
   体で処理して非吸着画分を回収する工程を含んでなる請
   求項（１）記載の製造方法。