JPH0380079A - 新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法 - Google Patents
新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[発明の目的]
(産業上の利用分野)
本発明は、新規なコンドロイチン硫酸分解酵素、コンド
ロイチナーゼA CIII 、コンドロイチナーゼC及
びコンドロイチナーゼB II、それらを産生する微生
物並びにそれらの製法に関する。
ロイチナーゼA CIII 、コンドロイチナーゼC及
びコンドロイチナーゼB II、それらを産生する微生
物並びにそれらの製法に関する。
(従来の技術及び発明が解決しようとする課題)フンド
ロイチン硫酸系グリコザミノグリカンは、細胞外マトリ
ックスを構成する成分として広く動物組織中に分布して
おり、加齢や疾病に伴ってその含量や糖鎖構造に変化の
生しることが知られている。これらの成分の組織内分布
を知るためには、酵素消化前後における組織染色像の変
化を調べることが有力な手法として用いられている。ま
た、グリコサミノグリカンを組織から抽出し、その糖鎖
構造を調べる際、構造のちがいを識別して分解できる特
異性の高い酵素が非常に重要な役割を果たしている。
ロイチン硫酸系グリコザミノグリカンは、細胞外マトリ
ックスを構成する成分として広く動物組織中に分布して
おり、加齢や疾病に伴ってその含量や糖鎖構造に変化の
生しることが知られている。これらの成分の組織内分布
を知るためには、酵素消化前後における組織染色像の変
化を調べることが有力な手法として用いられている。ま
た、グリコサミノグリカンを組織から抽出し、その糖鎖
構造を調べる際、構造のちがいを識別して分解できる特
異性の高い酵素が非常に重要な役割を果たしている。
従来、このような役割を果たす酵素としては、コンドロ
イチナーゼ(以下、Chaseと略す)ABC(Pro
teus vulgaris) 、 Chas e
AC(Flavobacterium l]epari
num) 、 Ch a s eA CT I (Ar
throbacter aurescens ) 、及
びCh a s e B (Flavol)acte
rium heparinum)などがある。これらの
酵素はそれぞれ異なる作用様式を示すが、コンドロイチ
ン硫酸糖鎖の作用部位についてはほとんど共通している
。
イチナーゼ(以下、Chaseと略す)ABC(Pro
teus vulgaris) 、 Chas e
AC(Flavobacterium l]epari
num) 、 Ch a s eA CT I (Ar
throbacter aurescens ) 、及
びCh a s e B (Flavol)acte
rium heparinum)などがある。これらの
酵素はそれぞれ異なる作用様式を示すが、コンドロイチ
ン硫酸糖鎖の作用部位についてはほとんど共通している
。
即ち、Chase ABC9Chase AC及び
Chase ACIIをコンドロイチン硫酸に作用さ
せると、いずれの酵素も類似の分解作用を示し、不飽和
2糖(△di)の△Di−O5△Di−6S.△D 1
−4S、△Di diS。
Chase ACIIをコンドロイチン硫酸に作用さ
せると、いずれの酵素も類似の分解作用を示し、不飽和
2糖(△di)の△Di−O5△Di−6S.△D 1
−4S、△Di diS。
(Chase ACを除く)及び△DidisEを生
成するため、これらの酵素類を組み合わせて用いても得
られる糖鎖骨格の情報は限られている。
成するため、これらの酵素類を組み合わせて用いても得
られる糖鎖骨格の情報は限られている。
近年、これらグリコサミノグリカンの構造と活性の関係
が重視されるようになり、糖鎖をより特異的に切断する
酵素の必要性が高まってきている。
が重視されるようになり、糖鎖をより特異的に切断する
酵素の必要性が高まってきている。
[発明の構成]
(課題を解決するための手段)
本発明者らは、かかる目的に役立つ酵素を得るため、C
hase産生菌を広く自然界より検索した結果、山梨県
下の土壌より分離したフラボバクテリウム属に属するH
p102株が、かかる性質を有する新規な酵素を産生ず
る能力をもつことを見いだした。
hase産生菌を広く自然界より検索した結果、山梨県
下の土壌より分離したフラボバクテリウム属に属するH
p102株が、かかる性質を有する新規な酵素を産生ず
る能力をもつことを見いだした。
この菌株をコンドロイチン硫酸を用いて誘導培養し、培
地及び菌体内に生成蓄積された酵素を分離採取した結果
、従来のChaSeとは特異性のことなるコンドロイチ
ン硫酸分解酵素、ChaseACIIl、Chase
C及びCh a s e B IIを採取した。こ
れらの酵素は従来のCh a s eに比べ、コンドロ
イチン硫酸糖鎖に対する作用がより限定されており、C
haseA CIIIは△Di−diSを生成しないこ
と、Chase Cは△Di−6S.△Didiso
を生成し、△Di−O3はわずかじか生成しないこと、
Ch a s e B IIはコンドロイチン硫酸B
(デルマタン硫酸と同し)に作用し、△D 1−4S及
び△DidiSBを生成することなどが確認され、目的
に適する性質を有することが分かり、本発明を完成する
に至った。
地及び菌体内に生成蓄積された酵素を分離採取した結果
、従来のChaSeとは特異性のことなるコンドロイチ
ン硫酸分解酵素、ChaseACIIl、Chase
C及びCh a s e B IIを採取した。こ
れらの酵素は従来のCh a s eに比べ、コンドロ
イチン硫酸糖鎖に対する作用がより限定されており、C
haseA CIIIは△Di−diSを生成しないこ
と、Chase Cは△Di−6S.△Didiso
を生成し、△Di−O3はわずかじか生成しないこと、
Ch a s e B IIはコンドロイチン硫酸B
(デルマタン硫酸と同し)に作用し、△D 1−4S及
び△DidiSBを生成することなどが確認され、目的
に適する性質を有することが分かり、本発明を完成する
に至った。
本発明のChase ACIIl、Chase C
及びCh a s e B IIは、次のような理化
学的性質を有する。
及びCh a s e B IIは、次のような理化
学的性質を有する。
■作 用
いずれの酵素もコンドロイチン硫酸の糖鎖のへキソザミ
ニド結合に作用するリアーゼであり、切断部の断端のウ
ロン酸の4位と5位の炭素の間に2重結合を形成する。
ニド結合に作用するリアーゼであり、切断部の断端のウ
ロン酸の4位と5位の炭素の間に2重結合を形成する。
■基質特異性(図1)
Chase ACIII: ヒアルロン酸に作用し
て不飽和2糖及び不飽和オリゴ糖を生成する。コンドロ
イチン硫酸に作用して△Di−OS、 △Di−65及
び△Di−4Sを生成するが、△Di−diSを生成し
ない。
て不飽和2糖及び不飽和オリゴ糖を生成する。コンドロ
イチン硫酸に作用して△Di−OS、 △Di−65及
び△Di−4Sを生成するが、△Di−diSを生成し
ない。
Chase C・ ヒアルロン酸に作用せず、コンド
ロイチン硫酸に作用して△Di−6S及び△DidiS
oを生成する。切断を受けるヘキソサミド結合につなが
る2糖のガラクトサミンの4位が硫酸化されている場合
は作用しない。
ロイチン硫酸に作用して△Di−6S及び△DidiS
oを生成する。切断を受けるヘキソサミド結合につなが
る2糖のガラクトサミンの4位が硫酸化されている場合
は作用しない。
Ch a s e B IT コンドロイチン硫酸
Bに作用して△Di−4S及び△Dt dtsnを生
成する。
Bに作用して△Di−4S及び△Dt dtsnを生
成する。
■至適pH(50mMトリス−酢酸、トリス−塩酸及び
グリシン緩衝液、37℃反応)(図2)Cbase
ACIII:6 0−70Chase C:8 0−
9、O C1〕ase BII : 8.0− 9.0■安
定pH範囲(100mMhリスー酢酸、トリス塩酸及び
グリシン緩衝液、37℃、30分処理)(図3) Chase ACIII:6.O−9,5Chase
C:5.5− 8.0 Chase BII : 6.5−11..0[5
]作用至適温度(50mM)−リス−酢酸緩衝液、pH
7,0) (図4) Ch a s e A CIII : 40℃Ch
ase C: 50℃ Chase Brr : 50℃■安定温度範囲
(50mMトリス−酢酸緩衝液、pH7,0,60分処
理) Ch a s e A CIll : 30℃以下
Chase C: 40℃以下 Chase Bll : 45℃以下■pH,温
度などによる失活の条件 100mM酢酸、トリス−酢酸、トリス−塩酸及びグリ
シン緩衝液中で37℃で30分間放置することにより、
次のpHで急激に失活する(図3)。
グリシン緩衝液、37℃反応)(図2)Cbase
ACIII:6 0−70Chase C:8 0−
9、O C1〕ase BII : 8.0− 9.0■安
定pH範囲(100mMhリスー酢酸、トリス塩酸及び
グリシン緩衝液、37℃、30分処理)(図3) Chase ACIII:6.O−9,5Chase
C:5.5− 8.0 Chase BII : 6.5−11..0[5
]作用至適温度(50mM)−リス−酢酸緩衝液、pH
7,0) (図4) Ch a s e A CIII : 40℃Ch
ase C: 50℃ Chase Brr : 50℃■安定温度範囲
(50mMトリス−酢酸緩衝液、pH7,0,60分処
理) Ch a s e A CIll : 30℃以下
Chase C: 40℃以下 Chase Bll : 45℃以下■pH,温
度などによる失活の条件 100mM酢酸、トリス−酢酸、トリス−塩酸及びグリ
シン緩衝液中で37℃で30分間放置することにより、
次のpHで急激に失活する(図3)。
Chase ACIII: pH5,5以下、pH
10,0以上 Chase C: pH5,0以下、pH8,5以
上 Chase BII : pH6,0以下50m
Mhリスー酢酸緩衝液、pH7,0中で各温度下に60
分間放置したとき、次の温度で急激に失活する(図5)
。
10,0以上 Chase C: pH5,0以下、pH8,5以
上 Chase BII : pH6,0以下50m
Mhリスー酢酸緩衝液、pH7,0中で各温度下に60
分間放置したとき、次の温度で急激に失活する(図5)
。
Ch a s e A CIII :Chase
C Ch a s e B II ■阻害及び活性化 35℃以上 45℃以上 50℃以上 本酵素類の活性は、表1に示すように各種イオンにより
賦活又は阻害される。
C Ch a s e B II ■阻害及び活性化 35℃以上 45℃以上 50℃以上 本酵素類の活性は、表1に示すように各種イオンにより
賦活又は阻害される。
Ch a s e A CIIIはBa+、Ca21
″で賦活され、Co 2” + Z n 2”で阻害さ
れる。
″で賦活され、Co 2” + Z n 2”で阻害さ
れる。
Chase CはBa”″で賦活され、CO+、 M
n +、Z n ”で阻害される。
n +、Z n ”で阻害される。
Ch a s e B IIはK+、Na+、Ca”
SO,”−、po43−で賦活され、E a”Co2+
0Mg2′″9M n 24. Z n2+で阻害され
る。
SO,”−、po43−で賦活され、E a”Co2+
0Mg2′″9M n 24. Z n2+で阻害され
る。
表
[5mM)
対照 100 too 100
K” 106 105 13
1Na’ 103 101
124Ba” 111 112
13Ca” 120 103
653Co” 89 42
38Mg2“ 108 97
75Mn” 106 89
30Zn” 26
1 1SQ4”−10098118 PO,”−9699127 EDTA 98 104 4
4本発明のCh a s e A CIII、Cha
se C及びCh a s e B IIは、フラ
ボバクテリウム属に属するChase ACIIl、
Chase C及びChase Bll産生能を有
する菌を培養し、その培養液又は菌体内にChaseA
CIIl、Chase C及びCh a s e
B IIを1 生成蓄積させ、これを採取することにより得られる。
1Na’ 103 101
124Ba” 111 112
13Ca” 120 103
653Co” 89 42
38Mg2“ 108 97
75Mn” 106 89
30Zn” 26
1 1SQ4”−10098118 PO,”−9699127 EDTA 98 104 4
4本発明のCh a s e A CIII、Cha
se C及びCh a s e B IIは、フラ
ボバクテリウム属に属するChase ACIIl、
Chase C及びChase Bll産生能を有
する菌を培養し、その培養液又は菌体内にChaseA
CIIl、Chase C及びCh a s e
B IIを1 生成蓄積させ、これを採取することにより得られる。
Chase A(、IIl、 Chase C及びC
h a s e B IIの生産能を有する菌として
は、新規なフラボバクテリウムspHp102株があげ
られ、次のような菌学的性質を示す。
h a s e B IIの生産能を有する菌として
は、新規なフラボバクテリウムspHp102株があげ
られ、次のような菌学的性質を示す。
A 形態
(1)肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は短い桿状であ
り、0.4〜05X0.6〜0.8uの大きさで、通常
2連であるが、まれに単独となる。
り、0.4〜05X0.6〜0.8uの大きさで、通常
2連であるが、まれに単独となる。
(2)細胞の多形成はない
〔3)運動性なし
く4)胞子形成なし
く5)ダラム染色性は陰性
B、生育状態
(1)肉汁寒天平板培養
半透明、ネーブルスイエロー色(J I 528102
”色名゛°準拠、工業用色名帳による判定)で光沢を有
する円形の丘状の均質なコロニを生ずる。表面は平滑か
つ湿潤で、周縁は金縁。
”色名゛°準拠、工業用色名帳による判定)で光沢を有
する円形の丘状の均質なコロニを生ずる。表面は平滑か
つ湿潤で、周縁は金縁。
拡散性色素を生成しない。
(2)肉汁寒天斜面培養
生育は良好で拡布状に生育する。生育部分はネーブルス
イエロー色を呈し、半透明である。
イエロー色を呈し、半透明である。
(3)肉汁液体培養
生育は良好で表面に膜を形成することなく、培地は濁る
。
。
(4)肉汁ゼラチン平板培養
生育は良好で黄土色を呈し半透明である。ゼラチンをわ
ずかに液化する。
ずかに液化する。
(5)リドマス・ミルク
リドマスの色が桃色に変化する(酸の生成)。
C1生理学的性質及びその他の性質
1 硝酸塩の還元、陰性
(2脱窒反応:陰性
(3)MRテスト:陰性
(4VPテスト、陽性
(5インドールの生成、陰性
(6硫化水素の生成・陰性
(7)デンプンの加水分解、陽性
(8)クエン酸の利用 陰性
(9)無機窒素源の利用、アンモニウム塩 陽性、硝酸
塩、陰性 (lO)色素の生成 キンプA培地、キングB培地で非水溶性のネーブルスイ
エロー色の色素を生成する (11)ウレアーゼ 陽性 (12)オキシダーゼ:陽性 (13)カタラーゼ 陽性 (14)酸素に対する態度:好気性 (15)生育pH+5〜9.5.特に7〜8が最適(1
6)生育温度ニア〜40℃1特に30〜37℃が最適 (17)0−Fテスト・グルコースを酸化的に利用する (18)炭素源の利用 無機塩培地を用いて糖類などの炭素源の利用を調べた。
塩、陰性 (lO)色素の生成 キンプA培地、キングB培地で非水溶性のネーブルスイ
エロー色の色素を生成する (11)ウレアーゼ 陽性 (12)オキシダーゼ:陽性 (13)カタラーゼ 陽性 (14)酸素に対する態度:好気性 (15)生育pH+5〜9.5.特に7〜8が最適(1
6)生育温度ニア〜40℃1特に30〜37℃が最適 (17)0−Fテスト・グルコースを酸化的に利用する (18)炭素源の利用 無機塩培地を用いて糖類などの炭素源の利用を調べた。
いずれの炭素源からもガスを発生せず酸の生成は以下の
通りである。
通りである。
(+、陽性、−4陰性)
L−アラビノース + セロビオース
L−ラムノース + ラフィノース
D−キシロース + D−ソルビトールD−グルコー
ス + D−マンニトールD−マンノース + イ
ノシトール D−フラクトース + ズルシトール D−ガラクトース + アドニトール 麦芽糖 + グリセリン ショ糖 + サリシン 乳糖 + エタノール トレハロース + (19)ガセインの分解・陰性 (20)エスクリンの分解・陽性 (21)β−ガラクトシダーゼ産生:陽性(22)マロ
ン酸の利用:陰性 (23)アルギニンの分解・陰性 (24)リジンの脱炭酸反応 陰性 (25)オルニチンの脱炭酸反応、陰性(26)デオキ
シリボヌクレアーゼ産生:陰性(27)ペニシリン感受
性:陰性 (28)黄色色素産生 陽性 (29)蛍光色素産生 陰性 (30)GC含量:37.7% 上記の菌学的性質を有する本閑の分類学上の位置をバー
ジエイのマニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー、第1版、第1巻(1984年)を参照して
検討すると、本菌はダラム陰性のグルコース非発酵性の
好気性短桿菌で、運動性を示さず、カタラーゼ、オキシ
ダーゼを産生じ、ペニシリン感受性が陰性でGC含量が
31%から42%の範囲にあることから、フラボバクテ
リウム属に属すると判定される。更に炭素源利用性の大
部分及び、カゼイン分解能、エクスリン分解能、インド
ール産生能、亜硝酸塩還元能、デンプン分解能、ウレア
ーゼ産生能、βガラクトシダーゼ産生能の性質が比較の
ため入手したフラボバクテリウム・マルチイボラム(F
lavobacterium multivorum
) A T CC33613株に類似していたが、マン
ニトール、アドニトール、イノシトール、ソルビトール
の利用性がフラボバクテリウム マルチイボラムと異な
るので、本菌はフラボバクテリウム属に属する新菌種と
同定される。
ス + D−マンニトールD−マンノース + イ
ノシトール D−フラクトース + ズルシトール D−ガラクトース + アドニトール 麦芽糖 + グリセリン ショ糖 + サリシン 乳糖 + エタノール トレハロース + (19)ガセインの分解・陰性 (20)エスクリンの分解・陽性 (21)β−ガラクトシダーゼ産生:陽性(22)マロ
ン酸の利用:陰性 (23)アルギニンの分解・陰性 (24)リジンの脱炭酸反応 陰性 (25)オルニチンの脱炭酸反応、陰性(26)デオキ
シリボヌクレアーゼ産生:陰性(27)ペニシリン感受
性:陰性 (28)黄色色素産生 陽性 (29)蛍光色素産生 陰性 (30)GC含量:37.7% 上記の菌学的性質を有する本閑の分類学上の位置をバー
ジエイのマニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー、第1版、第1巻(1984年)を参照して
検討すると、本菌はダラム陰性のグルコース非発酵性の
好気性短桿菌で、運動性を示さず、カタラーゼ、オキシ
ダーゼを産生じ、ペニシリン感受性が陰性でGC含量が
31%から42%の範囲にあることから、フラボバクテ
リウム属に属すると判定される。更に炭素源利用性の大
部分及び、カゼイン分解能、エクスリン分解能、インド
ール産生能、亜硝酸塩還元能、デンプン分解能、ウレア
ーゼ産生能、βガラクトシダーゼ産生能の性質が比較の
ため入手したフラボバクテリウム・マルチイボラム(F
lavobacterium multivorum
) A T CC33613株に類似していたが、マン
ニトール、アドニトール、イノシトール、ソルビトール
の利用性がフラボバクテリウム マルチイボラムと異な
るので、本菌はフラボバクテリウム属に属する新菌種と
同定される。
なお、本菌株Hp102は工業技術院微生物工業技術研
究所に微生物受託番号第10206号(以下、微工研菌
寄第10206号と略記する)として寄託されている。
究所に微生物受託番号第10206号(以下、微工研菌
寄第10206号と略記する)として寄託されている。
本発明の新規フラボバクテリウムspHp102菌株を
培養して、Chase ACIIl、ChaseC,
Chase BIIを培地又は菌体内に生成蓄積させ
るには、通常、微生物の培養に用いられる栄養培地、好
ましくは酵素産生能を高めるためにコンドロイチン硫酸
、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸或
はこれらを含む物質を添加した培地で培養することによ
り、培地中或は菌体中に生成蓄積されるので、公知の方
法で抽出、精製することによって精製酵素を得ることが
できる6 更に具体的に説明するとフラボバクテリウムspHp1
02菌株を適当な栄養培地、例えば適当な炭素源、窒素
源、無機塩類と酵素産生能を高めるために、コンドロイ
チン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリン、ヘパラ
ン硫酸或はこれらを含む物質などの誘導物質を含む培地
で菌を培養し、該酵素を培地中或は菌体中に生成M積さ
せるのであるが、炭素源としてはグルコース、ガラクト
ース、マンノース、フラクトース、キシロース、ラムノ
ース、アラビノース、シュクロース、ラクトース、マル
トース、トレハロース、セロビオース、ラフィノース、
ソルビトール、マンニトール、イノシトール、アドニト
ール、澱粉及びその加水分解物、糖蜜、グリセリンなど
が利用できる。窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、脱脂大豆粉、コーン
ステイープリカー、尿素、アンモニウム塩など有機、無
機の窒素化合物又はこれを含有するものが用いられる。
培養して、Chase ACIIl、ChaseC,
Chase BIIを培地又は菌体内に生成蓄積させ
るには、通常、微生物の培養に用いられる栄養培地、好
ましくは酵素産生能を高めるためにコンドロイチン硫酸
、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸或
はこれらを含む物質を添加した培地で培養することによ
り、培地中或は菌体中に生成蓄積されるので、公知の方
法で抽出、精製することによって精製酵素を得ることが
できる6 更に具体的に説明するとフラボバクテリウムspHp1
02菌株を適当な栄養培地、例えば適当な炭素源、窒素
源、無機塩類と酵素産生能を高めるために、コンドロイ
チン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリン、ヘパラ
ン硫酸或はこれらを含む物質などの誘導物質を含む培地
で菌を培養し、該酵素を培地中或は菌体中に生成M積さ
せるのであるが、炭素源としてはグルコース、ガラクト
ース、マンノース、フラクトース、キシロース、ラムノ
ース、アラビノース、シュクロース、ラクトース、マル
トース、トレハロース、セロビオース、ラフィノース、
ソルビトール、マンニトール、イノシトール、アドニト
ール、澱粉及びその加水分解物、糖蜜、グリセリンなど
が利用できる。窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、脱脂大豆粉、コーン
ステイープリカー、尿素、アンモニウム塩など有機、無
機の窒素化合物又はこれを含有するものが用いられる。
無機塩としては、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウ
ム、ナ1−リウム、カルシウムなどの塩類が使用される
。そして更に必要に応して菌の生育成は酵素産生に必要
な各種の無機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ油
、各種界面活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に添
加することができる。
ム、ナ1−リウム、カルシウムなどの塩類が使用される
。そして更に必要に応して菌の生育成は酵素産生に必要
な各種の無機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ油
、各種界面活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に添
加することができる。
本発明においては、好ましくは、酵素の誘導物質として
コンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリ
ンやヘパラン硫酸又はこれらを含有する物質を培地に添
加すれば大量の該酵素を生成させることができる。これ
らの添加物の添加は培養当初からでも、培養途中に行な
ってもよい。
コンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリ
ンやヘパラン硫酸又はこれらを含有する物質を培地に添
加すれば大量の該酵素を生成させることができる。これ
らの添加物の添加は培養当初からでも、培養途中に行な
ってもよい。
添加量としては上記誘導物質を通常02%〜2%添加す
れば良い結果が得られる。
れば良い結果が得られる。
培養の形態は液体培養でも固体培養でちよいが、通常は
液体培養が好適であり、工業的には深部通気撹拌培養を
行なうのが有利である。
液体培養が好適であり、工業的には深部通気撹拌培養を
行なうのが有利である。
本発明における培養条件は、使用する菌株、培地組成等
により多少異なるが、該酵素の生産に最ち有利な条件を
適当に選択、調節して行なう。培養温度は7〜40℃の
範囲内で適宜変更することができるが、特に好ましいの
は30〜37℃であ1 つ る。培養時間は条件によって異なるが、1〜2日程度で
あって、該酵素が最高蓄積量に達する時期に培養を終了
すればよい。培地のIIHは培地調整時に中性付近にあ
ればよく、通常の場合、特に調節の必要はない。
により多少異なるが、該酵素の生産に最ち有利な条件を
適当に選択、調節して行なう。培養温度は7〜40℃の
範囲内で適宜変更することができるが、特に好ましいの
は30〜37℃であ1 つ る。培養時間は条件によって異なるが、1〜2日程度で
あって、該酵素が最高蓄積量に達する時期に培養を終了
すればよい。培地のIIHは培地調整時に中性付近にあ
ればよく、通常の場合、特に調節の必要はない。
実施例
(力価測定法)
Chase ACJIl、 Chase C及びCh
a s e B IIの力価は、これら酵素がいずれ
もヘキソサミニド結合に作用するリアーゼであり、切断
部の断端のウロン酸の4位と5位の炭素に二重結合が形
成され、紫外吸収を持つことを利用してその増大を測定
することにより求められる。
a s e B IIの力価は、これら酵素がいずれ
もヘキソサミニド結合に作用するリアーゼであり、切断
部の断端のウロン酸の4位と5位の炭素に二重結合が形
成され、紫外吸収を持つことを利用してその増大を測定
することにより求められる。
酵素の基質には、Chase A CIII と
Chase Cについてはコンドロイチン硫酸C(サ
メ軟骨由来)を、Ch a s e B ITについ
てはコンドロイチン硫酸B(ブタ皮膚由来)を用いる。
Chase Cについてはコンドロイチン硫酸C(サ
メ軟骨由来)を、Ch a s e B ITについ
てはコンドロイチン硫酸B(ブタ皮膚由来)を用いる。
即ち、上記基質10 mg/ml水溶液25−に0
対し、酵素液iox、200mM酢酸緩衝液、p](7
,0,25d、20mM塩化カルシウム25パ及び水1
5−を加え、37℃で10分間反応させる。この液に対
して、0.06N塩酸溶液500−を加え、反応を停止
させ、232nmにおける紫外吸収Aを測る。対照液と
して同混液のゼロ時間における紫外吸収A。を測定する
。
,0,25d、20mM塩化カルシウム25パ及び水1
5−を加え、37℃で10分間反応させる。この液に対
して、0.06N塩酸溶液500−を加え、反応を停止
させ、232nmにおける紫外吸収Aを測る。対照液と
して同混液のゼロ時間における紫外吸収A。を測定する
。
酵素力価の表示は、上記反応で1分間にl PmoJの
分解量を生しさせる力価を1単位として、次の式から算
出する A−Ao600 (培養法) ペプトン(極東製)0 5 %、 酵母エキス (極東製)0.2%、コンドロイヂン硫酸ナトリウム(
生化学工業製)05%、K2HPO40、1%、M g
S O4・7H200,02%、NaCf20.1%
及び消泡剤アデカノールLG109(無電化製)0.0
05%(pH7,01)の組成からなる培地20℃を3
0℃容のジャファーメンタ−に仕込み、120℃で20
分間蒸気滅菌後、予め同組成(但し、酵母エキス濃度0
5%、消泡剤は無添加)の培地て30℃18時間振盪培
養しておいたフラボバクテリウムspHpl 02株(
微工研菌寄第10206号)400献(2%)を無菌的
に植菌し、30℃で16時間通気撹拌(200rpm)
培養した。
分解量を生しさせる力価を1単位として、次の式から算
出する A−Ao600 (培養法) ペプトン(極東製)0 5 %、 酵母エキス (極東製)0.2%、コンドロイヂン硫酸ナトリウム(
生化学工業製)05%、K2HPO40、1%、M g
S O4・7H200,02%、NaCf20.1%
及び消泡剤アデカノールLG109(無電化製)0.0
05%(pH7,01)の組成からなる培地20℃を3
0℃容のジャファーメンタ−に仕込み、120℃で20
分間蒸気滅菌後、予め同組成(但し、酵母エキス濃度0
5%、消泡剤は無添加)の培地て30℃18時間振盪培
養しておいたフラボバクテリウムspHpl 02株(
微工研菌寄第10206号)400献(2%)を無菌的
に植菌し、30℃で16時間通気撹拌(200rpm)
培養した。
培養液20℃を連続遠心分離機にて処理して菌体を集め
、この菌体(湿重量220g)を800−のO,1M燐
酸緩衝液(pH6,8)中に懸濁し、超音波破砕機を用
いて菌体を破砕した。破砕後、遠心分離により不溶物を
除去し、得られた上清液に0.5M酢酸ナトリウム溶液
500−を加えた後、プロクミン溶液(125n+g、
#) 750mlを4℃で撹拌しながら滴下した。この
液を30分間放置した後、遠心分離して上清を集め、予
め50mM燐酸緩衝液中で平衡化したハイドロキシアパ
クイトカラム(6x22cm)に負荷し、同緩衝液中で
食塩濃度をO−1,5Mまで直線的に上昇させることに
より溶出させた。コンドロイチン硫酸C及びBを基質と
して酵素活性を測定し、食塩濃度0.3−0.53Mで
溶出するChaseCとCh a s e B H画
分(1)及びo 55−0.8Mに溶出するChase
A C111画分(2)を分取し、それぞれの画分
を限外濾過膜を用いて濃縮塩脱し、次いでFf50mM
トリス−酢酸緩衝液に置換した。画情性画分はそれぞれ
同緩衝液で平衡化した硫酸化セルロファイン力ラム(2
,5x30cm)に負荷し、同緩衝液中で食塩濃度を0
→0.5Mまで直線的に上昇させて、画分(1)では0
.3−0.33MにChaseB IIを、0.4−0
.45MにChase Cを溶出、分取した。また、
両分(2)についても同条件下で溶出を行ない、0.3
−0.4M食塩濃度で溶出する活性画分を回収した。
、この菌体(湿重量220g)を800−のO,1M燐
酸緩衝液(pH6,8)中に懸濁し、超音波破砕機を用
いて菌体を破砕した。破砕後、遠心分離により不溶物を
除去し、得られた上清液に0.5M酢酸ナトリウム溶液
500−を加えた後、プロクミン溶液(125n+g、
#) 750mlを4℃で撹拌しながら滴下した。この
液を30分間放置した後、遠心分離して上清を集め、予
め50mM燐酸緩衝液中で平衡化したハイドロキシアパ
クイトカラム(6x22cm)に負荷し、同緩衝液中で
食塩濃度をO−1,5Mまで直線的に上昇させることに
より溶出させた。コンドロイチン硫酸C及びBを基質と
して酵素活性を測定し、食塩濃度0.3−0.53Mで
溶出するChaseCとCh a s e B H画
分(1)及びo 55−0.8Mに溶出するChase
A C111画分(2)を分取し、それぞれの画分
を限外濾過膜を用いて濃縮塩脱し、次いでFf50mM
トリス−酢酸緩衝液に置換した。画情性画分はそれぞれ
同緩衝液で平衡化した硫酸化セルロファイン力ラム(2
,5x30cm)に負荷し、同緩衝液中で食塩濃度を0
→0.5Mまで直線的に上昇させて、画分(1)では0
.3−0.33MにChaseB IIを、0.4−0
.45MにChase Cを溶出、分取した。また、
両分(2)についても同条件下で溶出を行ない、0.3
−0.4M食塩濃度で溶出する活性画分を回収した。
得られたそれぞれ3酵素の画分について、1゜−まで限
外済過膜濃縮を行なった後、それぞれをセ’77クリル
S−200カラム(3,8X100cm)に負荷し、0
.2M食塩を含む50mM1−リス−酢酸緩衝液でゲル
?濾過を行ない、それぞれの活性画分を集め、限外濾過
膜を用いて濃縮脱塩し、目的の酵素濃縮液を得た。
外済過膜濃縮を行なった後、それぞれをセ’77クリル
S−200カラム(3,8X100cm)に負荷し、0
.2M食塩を含む50mM1−リス−酢酸緩衝液でゲル
?濾過を行ない、それぞれの活性画分を集め、限外濾過
膜を用いて濃縮脱塩し、目的の酵素濃縮液を得た。
各酵素の収量
Ch a s e A CIII 960
UChaSe C55U Ch a s e B II 68 U
[発明の効果] 本発明によれば、新規コンドロイチン硫酸分解酵素、C
hase A(、IIl、Chase C及びCh
a s e B IIを提供することができる。
UChaSe C55U Ch a s e B II 68 U
[発明の効果] 本発明によれば、新規コンドロイチン硫酸分解酵素、C
hase A(、IIl、Chase C及びCh
a s e B IIを提供することができる。
図1は本発明の酵素類の基質特異性を示す図である。Δ
はCh a s e A CIllによるコンドロイ
チン硫酸C(サメ軟骨)消化物のHP L C4 分析における紫外吸収図、BはChase Cによ
るコンドロイチン硫酸D(サメヒレ)消化物のHPLC
分析における紫外吸収図、CはCh a s e B
IIによるコンドロイチン硫酸B(ブタ皮)消化物の
HPLC分析における紫外吸収図を示す。 1、△Di−0S、2:△Di−6S 3:ΔDi−4S、4 △DidiS。 5:△Di−diSa、 6:△4糖以上のオリゴ糖 図2は本発明の酵素類の至適pHを示す図であり、図3
は本発明の酵素類の安定pH範囲を示す図である。図2
及び図3のAはCh a s eA CIII、BはC
hase C,CはChaseB II (実 線) 酢酸緩衝液 (鎖 線) −−−−−−−−−−トリス−酢酸緩衝
液(点 線)・・・・・・・・・ トリス−塩酸緩衝
液(−点鎖線) −−−−一一一一 グリシン緩衝液図
4は本発明の作用至適温度を示す図であり、図5は本発
明の酵素類の温度による失活の条件を示す図である。図
4及び図5のAはChaseACIIl、BはChas
e C,CはChase II 7
はCh a s e A CIllによるコンドロイ
チン硫酸C(サメ軟骨)消化物のHP L C4 分析における紫外吸収図、BはChase Cによ
るコンドロイチン硫酸D(サメヒレ)消化物のHPLC
分析における紫外吸収図、CはCh a s e B
IIによるコンドロイチン硫酸B(ブタ皮)消化物の
HPLC分析における紫外吸収図を示す。 1、△Di−0S、2:△Di−6S 3:ΔDi−4S、4 △DidiS。 5:△Di−diSa、 6:△4糖以上のオリゴ糖 図2は本発明の酵素類の至適pHを示す図であり、図3
は本発明の酵素類の安定pH範囲を示す図である。図2
及び図3のAはCh a s eA CIII、BはC
hase C,CはChaseB II (実 線) 酢酸緩衝液 (鎖 線) −−−−−−−−−−トリス−酢酸緩衝
液(点 線)・・・・・・・・・ トリス−塩酸緩衝
液(−点鎖線) −−−−一一一一 グリシン緩衝液図
4は本発明の作用至適温度を示す図であり、図5は本発
明の酵素類の温度による失活の条件を示す図である。図
4及び図5のAはChaseACIIl、BはChas
e C,CはChase II 7
Claims (3)
- (1)下記の理化学的性質を有するコンドロイチン硫酸
分解酵素、コンドロイチナーゼACIII、コンドロイチ
ナーゼC及びコンドロイチナーゼBII。 [1]作用 いずれの酵素もコンドロイチン硫酸の糖鎖のヘキソサミ
ニド結合に作用するリアーゼであり、切断部の断端のウ
ロン酸の4位と5位の炭素の間に2重結合を形成する。 [2]基質特異性 コンドロイチナーゼACIII:ヒアルロン酸に作用して
不飽和2糖及び不飽和オリゴ糖を 生成する。コンドロイチン硫酸に作用して △Di−0S、△Di−6S及び△Di−4Sを生成す
るが、△Di−diSを生成しない。 コンドロイチナーゼC:ヒアルロン酸に作用せず、コン
ドロイチン硫酸に作用して△Di−6S及び△Di−d
iS_Dを生成する。切断を受けるヘキソサミド結合に
つながる2糖のガラクトサミンの4位が硫酸化されてい
る場合は作用しない。 コンドロイチナーゼBII:コンドロイチン硫酸Bに作用
して△Di−4S及び△Di−diS_Bを生成する。 [3]至適pH(50mMトリス−酢酸、トリス−塩酸
及びグリシン緩衝液、37℃反応) コンドロイチナーゼACIII:6.0−7.0コンドロ
イチナーゼC:8.0−9.0 コンドロイチナーゼBII:8.0−9.0 [4]安定pH範囲(100mMトリス−酢酸、トリス
−塩酸及びグリシン緩衝液、37℃、30分処理) コンドロイチナーゼACIII:6.0−9.5コンドロ
イチナーゼC:5.5−8.0 コンドロイチナーゼBII:6.5−11.0[5]作用
至適温度(50mMトリス−酢酸緩衝液、pH7.0) コンドロイチナーゼACIII:40℃ コンドロイチナーゼC:50℃ コンドロイチナーゼBII:50℃ [6]安定温度範囲(50mMトリス−酢酸緩衝液、p
H7.0、60分処理) コンドロイチナーゼACIII:30℃以下 コンドロイチナーゼC:40℃以下 コンドロイチナーゼBII:45℃以下 [7]阻害及び活性化 コンドロイチナーゼACIII:Ba^2^+、Ca^2
^+で賦活され、Co^2^+、Zn^2^+で阻害さ
れる。 コンドロイチナーゼC:Ba^2^+で賦活され、Co
^2^+、Mn^2^+、Zn^2^+で阻害される。 コンドロイチナーゼBII:K^+、Na^+、Ca^2
^+、SO_4^2^−、PO_4^3^−で賦活され
、Ba^2^+、Co^2^+、Mg^2^+、Zn^
2^+で阻害される。 - (2)請求項(1)記載のコンドロイチナーゼACIII
、コンドロイチナーゼC及びコンドロイチナーゼBII産
生能を有するフラボバクテリウムspHp102株。 - (3)フラボバクテリウム属に属するコンドロイチナー
ゼACIII、コンドロイチナーゼC及びコンドロイチナ
ーゼBII産生菌を培養し、その培養液又は菌体内にコン
ドロイチナーゼACIII、コンドロイチナーゼC及び/
又はコンドロイチナーゼBIIを生成蓄積させ、これを採
取することを特徴とする請求項(1)記載のコンドロイ
チナーゼACIII、コンドロイチナーゼC及び/又はコ
ンドロイチナーゼBIIの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21601789A JP2919496B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | 新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
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---|---|---|---|
JP21601789A JP2919496B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | 新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0380079A true JPH0380079A (ja) | 1991-04-04 |
JP2919496B2 JP2919496B2 (ja) | 1999-07-12 |
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ID=16681998
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP21601789A Expired - Fee Related JP2919496B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | 新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2919496B2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0576294A2 (en) * | 1992-06-26 | 1993-12-29 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Chondroitinase, process for preparing the same, and pharmaceutical composition comprising the same |
US5773277A (en) * | 1992-06-26 | 1998-06-30 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Crystalline chondroitinase isolated from Proteus vulgaris ATCC 6896 |
US6001630A (en) * | 1992-06-26 | 1999-12-14 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Pharmaceutical compositions of chondroitinase ABC isolated from Proteus vulgaris ATCC 6896 |
US6596303B1 (en) | 1999-03-22 | 2003-07-22 | Mars Incorporated | Pet food for maintenance of joint health and alleviation of arthritic symptoms in companion animals |
-
1989
- 1989-08-24 JP JP21601789A patent/JP2919496B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0576294A2 (en) * | 1992-06-26 | 1993-12-29 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Chondroitinase, process for preparing the same, and pharmaceutical composition comprising the same |
EP0576294A3 (en) * | 1992-06-26 | 1994-08-17 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | Chondroitinase, process for preparing the same, and pharmaceutical composition comprising the same |
US5496718A (en) * | 1992-06-26 | 1996-03-05 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Chondroitinase ABC isolated from proteus vulgaris ATCC 6896 |
US5763205A (en) * | 1992-06-26 | 1998-06-09 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Producing pure chondroitinase ABC from Proteus vulgaris ATCC 6896 |
US5773277A (en) * | 1992-06-26 | 1998-06-30 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Crystalline chondroitinase isolated from Proteus vulgaris ATCC 6896 |
US6001630A (en) * | 1992-06-26 | 1999-12-14 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Pharmaceutical compositions of chondroitinase ABC isolated from Proteus vulgaris ATCC 6896 |
US6596303B1 (en) | 1999-03-22 | 2003-07-22 | Mars Incorporated | Pet food for maintenance of joint health and alleviation of arthritic symptoms in companion animals |
US6977084B2 (en) | 1999-03-22 | 2005-12-20 | Bui Linh M | Pet food containing Perna canaliculus for maintenance of joint health and alleviation of arthritic symptoms |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2919496B2 (ja) | 1999-07-12 |
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