JPH0380079A - 新規コンドロイチン硫酸分解酵素、それらを産生する微生物並びにそれらの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、新規なコンドロイチン硫酸分解酵素、コンド
ロイチナーゼＡ　ＣＩＩＩ　、コンドロイチナーゼＣ及
びコンドロイチナーゼＢ　ＩＩ、それらを産生する微生
物並びにそれらの製法に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）フンド
ロイチン硫酸系グリコザミノグリカンは、細胞外マトリ
ックスを構成する成分として広く動物組織中に分布して
おり、加齢や疾病に伴ってその含量や糖鎖構造に変化の
生しることが知られている。これらの成分の組織内分布
を知るためには、酵素消化前後における組織染色像の変
化を調べることが有力な手法として用いられている。ま
た、グリコサミノグリカンを組織から抽出し、その糖鎖
構造を調べる際、構造のちがいを識別して分解できる特
異性の高い酵素が非常に重要な役割を果たしている。

従来、このような役割を果たす酵素としては、コンドロ
イチナーゼ（以下、Ｃｈａｓｅと略す）ＡＢＣ（Ｐｒｏ
ｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）　、　Ｃｈａｓ　ｅ　　
ＡＣ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌ］ｅｐａｒｉ
ｎｕｍ）　、　Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅＡ　ＣＴ　Ｉ　（Ａｒ
ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｕｒｅｓｃｅｎｓ　）　、及
びＣｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　（Ｆｌａｖｏｌ）ａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ）などがある。これらの
酵素はそれぞれ異なる作用様式を示すが、コンドロイチ
ン硫酸糖鎖の作用部位についてはほとんど共通している
。

即ち、Ｃｈａｓｅ　　ＡＢＣ９Ｃｈａｓｅ　　ＡＣ及び
Ｃｈａｓｅ　　ＡＣＩＩをコンドロイチン硫酸に作用さ
せると、いずれの酵素も類似の分解作用を示し、不飽和
２糖（△ｄｉ）の△Ｄｉ−Ｏ５△Ｄｉ−６Ｓ．△Ｄ　１
−４Ｓ、△Ｄｉ　　ｄｉＳ。

（Ｃｈａｓｅ　　ＡＣを除く）及び△ＤｉｄｉｓＥを生
成するため、これらの酵素類を組み合わせて用いても得
られる糖鎖骨格の情報は限られている。

近年、これらグリコサミノグリカンの構造と活性の関係
が重視されるようになり、糖鎖をより特異的に切断する
酵素の必要性が高まってきている。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段） 本発明者らは、かかる目的に役立つ酵素を得るため、Ｃ
ｈａｓｅ産生菌を広く自然界より検索した結果、山梨県
下の土壌より分離したフラボバクテリウム属に属するＨ
ｐ１０２株が、かかる性質を有する新規な酵素を産生ず
る能力をもつことを見いだした。

この菌株をコンドロイチン硫酸を用いて誘導培養し、培
地及び菌体内に生成蓄積された酵素を分離採取した結果
、従来のＣｈａＳｅとは特異性のことなるコンドロイチ
ン硫酸分解酵素、ＣｈａｓｅＡＣＩＩｌ、Ｃｈａｓｅ　
　Ｃ及びＣｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　ＩＩを採取した。こ
れらの酵素は従来のＣｈ　ａ　ｓ　ｅに比べ、コンドロ
イチン硫酸糖鎖に対する作用がより限定されており、Ｃ
ｈａｓｅＡ　ＣＩＩＩは△Ｄｉ−ｄｉＳを生成しないこ
と、Ｃｈａｓｅ　　Ｃは△Ｄｉ−６Ｓ．△Ｄｉｄｉｓｏ
を生成し、△Ｄｉ−Ｏ３はわずかじか生成しないこと、
Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　ＩＩはコンドロイチン硫酸Ｂ
（デルマタン硫酸と同し）に作用し、△Ｄ　１−４Ｓ及
び△ＤｉｄｉＳＢを生成することなどが確認され、目的
に適する性質を有することが分かり、本発明を完成する
に至った。

本発明のＣｈａｓｅ　　ＡＣＩＩｌ、Ｃｈａｓｅ　　Ｃ
及びＣｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　ＩＩは、次のような理化
学的性質を有する。

■作　用 いずれの酵素もコンドロイチン硫酸の糖鎖のへキソザミ
ニド結合に作用するリアーゼであり、切断部の断端のウ
ロン酸の４位と５位の炭素の間に２重結合を形成する。

■基質特異性（図１） Ｃｈａｓｅ　　ＡＣＩＩＩ：　　ヒアルロン酸に作用し
て不飽和２糖及び不飽和オリゴ糖を生成する。コンドロ
イチン硫酸に作用して△Ｄｉ−ＯＳ、　△Ｄｉ−６５及
び△Ｄｉ−４Ｓを生成するが、△Ｄｉ−ｄｉＳを生成し
ない。

Ｃｈａｓｅ　　Ｃ・　ヒアルロン酸に作用せず、コンド
ロイチン硫酸に作用して△Ｄｉ−６Ｓ及び△ＤｉｄｉＳ
ｏを生成する。切断を受けるヘキソサミド結合につなが
る２糖のガラクトサミンの４位が硫酸化されている場合
は作用しない。

Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　Ｂ　ＩＴ　　　コンドロイチン硫酸
Ｂに作用して△Ｄｉ−４Ｓ及び△Ｄｔ　　ｄｔｓｎを生
成する。

■至適ｐＨ（５０ｍＭトリス−酢酸、トリス−塩酸及び
グリシン緩衝液、３７℃反応）（図２）Ｃｂａｓｅ　　
ＡＣＩＩＩ：６　０−７０Ｃｈａｓｅ　　Ｃ：８　０−
９、Ｏ Ｃ１〕ａｓｅ　　ＢＩＩ　　：　８．０−　９．０■安
定ｐＨ範囲（１００ｍＭｈリスー酢酸、トリス塩酸及び
グリシン緩衝液、３７℃、３０分処理）（図３） Ｃｈａｓｅ　　ＡＣＩＩＩ：６．Ｏ−９，５Ｃｈａｓｅ
　　Ｃ：５．５−　８．０ Ｃｈａｓｅ　　ＢＩＩ　　：　６．５−１１．．０［５
］作用至適温度（５０ｍＭ）−リス−酢酸緩衝液、ｐＨ
７，０）　　（図４） Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ａ　ＣＩＩＩ　：　　４０℃Ｃｈ
ａｓｅ　　Ｃ：　　５０℃ Ｃｈａｓｅ　　Ｂｒｒ　　：　　５０℃■安定温度範囲
（５０ｍＭトリス−酢酸緩衝液、ｐＨ７，０，６０分処
理） Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ａ　ＣＩｌｌ　：　　３０℃以下
Ｃｈａｓｅ　　Ｃ：　　４０℃以下 Ｃｈａｓｅ　　Ｂｌｌ　　：　　４５℃以下■ｐＨ，温
度などによる失活の条件 １００ｍＭ酢酸、トリス−酢酸、トリス−塩酸及びグリ
シン緩衝液中で３７℃で３０分間放置することにより、
次のｐＨで急激に失活する（図３）。

Ｃｈａｓｅ　　ＡＣＩＩＩ：　　ｐＨ５，５以下、ｐＨ
１０，０以上 Ｃｈａｓｅ　　Ｃ：　　ｐＨ５，０以下、ｐＨ８，５以
上 Ｃｈａｓｅ　　ＢＩＩ　　：　　ｐＨ６，０以下５０ｍ
Ｍｈリスー酢酸緩衝液、ｐＨ７，０中で各温度下に６０
分間放置したとき、次の温度で急激に失活する（図５）
。

Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ａ　ＣＩＩＩ　：Ｃｈａｓｅ　　
Ｃ Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　ＩＩ ■阻害及び活性化 ３５℃以上 ４５℃以上 ５０℃以上 本酵素類の活性は、表１に示すように各種イオンにより
賦活又は阻害される。

Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ａ　ＣＩＩＩはＢａ＋、Ｃａ２１
″で賦活され、Ｃｏ　２”　＋　Ｚ　ｎ　２”で阻害さ
れる。

Ｃｈａｓｅ　　ＣはＢａ”″で賦活され、ＣＯ＋、　Ｍ
　ｎ　＋、Ｚ　ｎ　”で阻害される。

Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　ＩＩはＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ”
ＳＯ，”−、ｐｏ４３−で賦活され、Ｅ　ａ”Ｃｏ２＋
０Ｍｇ２′″９Ｍ　ｎ　２４．　Ｚ　ｎ２＋で阻害され
る。

表 ［５ｍＭ） 対照　１００　　ｔｏｏ　　１００ Ｋ”　　　　　１０６　　　　　１０５　　　　　１３
１Ｎａ’　　　　　１０３　　　　　１０１　　　　　
１２４Ｂａ”　　　　１１１　　　　　１１２　　　　
　　１３Ｃａ”　　　　１２０　　　　　１０３　　　
　　６５３Ｃｏ”　　　　　８９　　　　　　４２　　
　　　　３８Ｍｇ２“　　　１０８　　　　　　９７　
　　　　　７５Ｍｎ”　　　　１０６　　　　　　８９
　　　　　　３０Ｚｎ”　　　　　２６　　　　　　　
　１　　　　　　　　１ＳＱ４”−１００９８１１８ ＰＯ，”−９６９９１２７ ＥＤＴＡ　　　　９８　　　　　１０４　　　　　　４
４本発明のＣｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ａ　ＣＩＩＩ、Ｃｈａ
ｓｅ　　Ｃ及びＣｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　ＩＩは、フラ
ボバクテリウム属に属するＣｈａｓｅ　　ＡＣＩＩｌ、
Ｃｈａｓｅ　　Ｃ及びＣｈａｓｅ　　Ｂｌｌ産生能を有
する菌を培養し、その培養液又は菌体内にＣｈａｓｅＡ
ＣＩＩｌ、Ｃｈａｓｅ　　Ｃ及びＣｈ　ａ　ｓ　ｅ　　
Ｂ　ＩＩを１ 生成蓄積させ、これを採取することにより得られる。

Ｃｈａｓｅ　Ａ（、ＩＩｌ、　　Ｃｈａｓｅ　Ｃ及びＣ
ｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　ＩＩの生産能を有する菌として
は、新規なフラボバクテリウムｓｐＨｐ１０２株があげ
られ、次のような菌学的性質を示す。

Ａ　形態 （１）肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は短い桿状であ
り、０．４〜０５Ｘ０．６〜０．８ｕの大きさで、通常
２連であるが、まれに単独となる。

（２）細胞の多形成はない 〔３）運動性なし く４）胞子形成なし く５）ダラム染色性は陰性 Ｂ、生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 半透明、ネーブルスイエロー色（Ｊ　Ｉ　５２８１０２
”色名゛°準拠、工業用色名帳による判定）で光沢を有
する円形の丘状の均質なコロニを生ずる。表面は平滑か
つ湿潤で、周縁は金縁。

拡散性色素を生成しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 生育は良好で拡布状に生育する。生育部分はネーブルス
イエロー色を呈し、半透明である。

（３）肉汁液体培養 生育は良好で表面に膜を形成することなく、培地は濁る
。

（４）肉汁ゼラチン平板培養 生育は良好で黄土色を呈し半透明である。ゼラチンをわ
ずかに液化する。

（５）リドマス・ミルク リドマスの色が桃色に変化する（酸の生成）。

Ｃ１生理学的性質及びその他の性質 １　硝酸塩の還元、陰性 （２脱窒反応：陰性 （３）ＭＲテスト：陰性 （４ＶＰテスト、陽性 （５インドールの生成、陰性 （６硫化水素の生成・陰性 （７）デンプンの加水分解、陽性 （８）クエン酸の利用　陰性 （９）無機窒素源の利用、アンモニウム塩　陽性、硝酸
塩、陰性 （ｌＯ）色素の生成 キンプＡ培地、キングＢ培地で非水溶性のネーブルスイ
エロー色の色素を生成する （１１）ウレアーゼ　陽性 （１２）オキシダーゼ：陽性 （１３）カタラーゼ　陽性 （１４）酸素に対する態度：好気性 （１５）生育ｐＨ＋５〜９．５．特に７〜８が最適（１
６）生育温度ニア〜４０℃１特に３０〜３７℃が最適 （１７）０−Ｆテスト・グルコースを酸化的に利用する （１８）炭素源の利用 無機塩培地を用いて糖類などの炭素源の利用を調べた。

いずれの炭素源からもガスを発生せず酸の生成は以下の
通りである。

（＋、陽性、−４陰性） Ｌ−アラビノース　＋　セロビオース Ｌ−ラムノース　　＋　ラフィノース Ｄ−キシロース　　＋　Ｄ−ソルビトールＤ−グルコー
ス　　＋　Ｄ−マンニトールＤ−マンノース　　＋　イ
ノシトール Ｄ−フラクトース　＋　ズルシトール Ｄ−ガラクトース　＋　アドニトール 麦芽糖　　　　　　＋　グリセリン ショ糖　　　　　　＋　サリシン 乳糖　　　　　　　＋　エタノール トレハロース　　　＋ （１９）ガセインの分解・陰性 （２０）エスクリンの分解・陽性 （２１）β−ガラクトシダーゼ産生：陽性（２２）マロ
ン酸の利用：陰性 （２３）アルギニンの分解・陰性 （２４）リジンの脱炭酸反応　陰性 （２５）オルニチンの脱炭酸反応、陰性（２６）デオキ
シリボヌクレアーゼ産生：陰性（２７）ペニシリン感受
性：陰性 （２８）黄色色素産生　陽性 （２９）蛍光色素産生　陰性 （３０）ＧＣ含量：３７．７％ 上記の菌学的性質を有する本閑の分類学上の位置をバー
ジエイのマニュアル・オブ・システマティック・バクテ
リオロジー、第１版、第１巻（１９８４年）を参照して
検討すると、本菌はダラム陰性のグルコース非発酵性の
好気性短桿菌で、運動性を示さず、カタラーゼ、オキシ
ダーゼを産生じ、ペニシリン感受性が陰性でＧＣ含量が
３１％から４２％の範囲にあることから、フラボバクテ
リウム属に属すると判定される。更に炭素源利用性の大
部分及び、カゼイン分解能、エクスリン分解能、インド
ール産生能、亜硝酸塩還元能、デンプン分解能、ウレア
ーゼ産生能、βガラクトシダーゼ産生能の性質が比較の
ため入手したフラボバクテリウム・マルチイボラム（Ｆ
ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ　
）　Ａ　Ｔ　ＣＣ３３６１３株に類似していたが、マン
ニトール、アドニトール、イノシトール、ソルビトール
の利用性がフラボバクテリウム　マルチイボラムと異な
るので、本菌はフラボバクテリウム属に属する新菌種と
同定される。

なお、本菌株Ｈｐ１０２は工業技術院微生物工業技術研
究所に微生物受託番号第１０２０６号（以下、微工研菌
寄第１０２０６号と略記する）として寄託されている。

本発明の新規フラボバクテリウムｓｐＨｐ１０２菌株を
培養して、Ｃｈａｓｅ　　ＡＣＩＩｌ、ＣｈａｓｅＣ，
Ｃｈａｓｅ　　ＢＩＩを培地又は菌体内に生成蓄積させ
るには、通常、微生物の培養に用いられる栄養培地、好
ましくは酵素産生能を高めるためにコンドロイチン硫酸
、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸或
はこれらを含む物質を添加した培地で培養することによ
り、培地中或は菌体中に生成蓄積されるので、公知の方
法で抽出、精製することによって精製酵素を得ることが
できる６ 更に具体的に説明するとフラボバクテリウムｓｐＨｐ１
０２菌株を適当な栄養培地、例えば適当な炭素源、窒素
源、無機塩類と酵素産生能を高めるために、コンドロイ
チン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリン、ヘパラ
ン硫酸或はこれらを含む物質などの誘導物質を含む培地
で菌を培養し、該酵素を培地中或は菌体中に生成Ｍ積さ
せるのであるが、炭素源としてはグルコース、ガラクト
ース、マンノース、フラクトース、キシロース、ラムノ
ース、アラビノース、シュクロース、ラクトース、マル
トース、トレハロース、セロビオース、ラフィノース、
ソルビトール、マンニトール、イノシトール、アドニト
ール、澱粉及びその加水分解物、糖蜜、グリセリンなど
が利用できる。窒素源としては、酵母エキス、麦芽エキ
ス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、脱脂大豆粉、コーン
ステイープリカー、尿素、アンモニウム塩など有機、無
機の窒素化合物又はこれを含有するものが用いられる。

無機塩としては、各種リン酸塩、マグネシウム、カリウ
ム、ナ１−リウム、カルシウムなどの塩類が使用される
。そして更に必要に応して菌の生育成は酵素産生に必要
な各種の無機物や有機物、例えばシリコーン油、ゴマ油
、各種界面活性剤などの消泡剤やビタミン類を培地に添
加することができる。

本発明においては、好ましくは、酵素の誘導物質として
コンドロイチン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸、ヘパリ
ンやヘパラン硫酸又はこれらを含有する物質を培地に添
加すれば大量の該酵素を生成させることができる。これ
らの添加物の添加は培養当初からでも、培養途中に行な
ってもよい。

添加量としては上記誘導物質を通常０２％〜２％添加す
れば良い結果が得られる。

培養の形態は液体培養でも固体培養でちよいが、通常は
液体培養が好適であり、工業的には深部通気撹拌培養を
行なうのが有利である。

本発明における培養条件は、使用する菌株、培地組成等
により多少異なるが、該酵素の生産に最ち有利な条件を
適当に選択、調節して行なう。培養温度は７〜４０℃の
範囲内で適宜変更することができるが、特に好ましいの
は３０〜３７℃であ１　つ る。培養時間は条件によって異なるが、１〜２日程度で
あって、該酵素が最高蓄積量に達する時期に培養を終了
すればよい。培地のＩＩＨは培地調整時に中性付近にあ
ればよく、通常の場合、特に調節の必要はない。

実施例 （力価測定法） Ｃｈａｓｅ　ＡＣＪＩｌ、　Ｃｈａｓｅ　Ｃ及びＣｈ　
ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　ＩＩの力価は、これら酵素がいずれ
もヘキソサミニド結合に作用するリアーゼであり、切断
部の断端のウロン酸の４位と５位の炭素に二重結合が形
成され、紫外吸収を持つことを利用してその増大を測定
することにより求められる。

酵素の基質には、Ｃｈａｓｅ　　Ａ　　ＣＩＩＩ　　と
Ｃｈａｓｅ　　Ｃについてはコンドロイチン硫酸Ｃ（サ
メ軟骨由来）を、Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　ＩＴについ
てはコンドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮膚由来）を用いる。

即ち、上記基質１０　ｍｇ／ｍｌ水溶液２５−に０ 対し、酵素液ｉｏｘ、２００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐ］（７
，０，２５ｄ、２０ｍＭ塩化カルシウム２５パ及び水１
５−を加え、３７℃で１０分間反応させる。この液に対
して、０．０６Ｎ塩酸溶液５００−を加え、反応を停止
させ、２３２ｎｍにおける紫外吸収Ａを測る。対照液と
して同混液のゼロ時間における紫外吸収Ａ。を測定する
。

酵素力価の表示は、上記反応で１分間にｌ　ＰｍｏＪの
分解量を生しさせる力価を１単位として、次の式から算
出する Ａ−Ａｏ６００ （培養法） ペプトン（極東製）０ ５　％、 酵母エキス （極東製）０．２％、コンドロイヂン硫酸ナトリウム（
生化学工業製）０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０、１％、Ｍ　ｇ
　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，０２％、ＮａＣｆ２０．１％
及び消泡剤アデカノールＬＧ１０９（無電化製）０．０
０５％（ｐＨ７，０１）の組成からなる培地２０℃を３
０℃容のジャファーメンタ−に仕込み、１２０℃で２０
分間蒸気滅菌後、予め同組成（但し、酵母エキス濃度０
５％、消泡剤は無添加）の培地て３０℃１８時間振盪培
養しておいたフラボバクテリウムｓｐＨｐｌ　０２株（
微工研菌寄第１０２０６号）４００献（２％）を無菌的
に植菌し、３０℃で１６時間通気撹拌（２００ｒｐｍ）
培養した。

培養液２０℃を連続遠心分離機にて処理して菌体を集め
、この菌体（湿重量２２０ｇ）を８００−のＯ，１Ｍ燐
酸緩衝液（ｐＨ６，８）中に懸濁し、超音波破砕機を用
いて菌体を破砕した。破砕後、遠心分離により不溶物を
除去し、得られた上清液に０．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液
５００−を加えた後、プロクミン溶液（１２５ｎ＋ｇ、
＃）　７５０ｍｌを４℃で撹拌しながら滴下した。この
液を３０分間放置した後、遠心分離して上清を集め、予
め５０ｍＭ燐酸緩衝液中で平衡化したハイドロキシアパ
クイトカラム（６ｘ２２ｃｍ）に負荷し、同緩衝液中で
食塩濃度をＯ−１，５Ｍまで直線的に上昇させることに
より溶出させた。コンドロイチン硫酸Ｃ及びＢを基質と
して酵素活性を測定し、食塩濃度０．３−０．５３Ｍで
溶出するＣｈａｓｅＣとＣｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　Ｈ画
分（１）及びｏ　５５−０．８Ｍに溶出するＣｈａｓｅ
　　Ａ　Ｃ１１１画分（２）を分取し、それぞれの画分
を限外濾過膜を用いて濃縮塩脱し、次いでＦｆ５０ｍＭ
トリス−酢酸緩衝液に置換した。画情性画分はそれぞれ
同緩衝液で平衡化した硫酸化セルロファイン力ラム（２
，５ｘ３０ｃｍ）に負荷し、同緩衝液中で食塩濃度を０
→０．５Ｍまで直線的に上昇させて、画分（１）では０
．３−０．３３ＭにＣｈａｓｅＢ　ＩＩを、０．４−０
．４５ＭにＣｈａｓｅ　　Ｃを溶出、分取した。また、
両分（２）についても同条件下で溶出を行ない、０．３
−０．４Ｍ食塩濃度で溶出する活性画分を回収した。

得られたそれぞれ３酵素の画分について、１゜−まで限
外済過膜濃縮を行なった後、それぞれをセ’７７クリル
Ｓ−２００カラム（３，８Ｘ１００ｃｍ）に負荷し、０
．２Ｍ食塩を含む５０ｍＭ１−リス−酢酸緩衝液でゲル
？濾過を行ない、それぞれの活性画分を集め、限外濾過
膜を用いて濃縮脱塩し、目的の酵素濃縮液を得た。

各酵素の収量 Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ａ　ＣＩＩＩ　　　　　９６０　
ＵＣｈａＳｅ　Ｃ５５Ｕ Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　ＩＩ　　　　　　　６８　Ｕ
［発明の効果］ 本発明によれば、新規コンドロイチン硫酸分解酵素、Ｃ
ｈａｓｅ　　Ａ（、ＩＩｌ、Ｃｈａｓｅ　　Ｃ及びＣｈ
　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ　ＩＩを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の酵素類の基質特異性を示す図である。Δ
はＣｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ａ　ＣＩｌｌによるコンドロイ
チン硫酸Ｃ（サメ軟骨）消化物のＨＰ　Ｌ　Ｃ４ 分析における紫外吸収図、ＢはＣｈａｓｅ　　　Ｃによ
るコンドロイチン硫酸Ｄ（サメヒレ）消化物のＨＰＬＣ
分析における紫外吸収図、ＣはＣｈ　ａ　ｓ　ｅ　　Ｂ
　ＩＩによるコンドロイチン硫酸Ｂ（ブタ皮）消化物の
ＨＰＬＣ分析における紫外吸収図を示す。 １、△Ｄｉ−０Ｓ、２：△Ｄｉ−６Ｓ ３：ΔＤｉ−４Ｓ、４　　△ＤｉｄｉＳ。 ５：△Ｄｉ−ｄｉＳａ、　　６：△４糖以上のオリゴ糖 図２は本発明の酵素類の至適ｐＨを示す図であり、図３
は本発明の酵素類の安定ｐＨ範囲を示す図である。図２
及び図３のＡはＣｈ　ａ　ｓ　ｅＡ　ＣＩＩＩ、ＢはＣ
ｈａｓｅ　　Ｃ，ＣはＣｈａｓｅＢ　ＩＩ （実　　線）　　　　　酢酸緩衝液 （鎖　　線）　−−−−−−−−−−トリス−酢酸緩衝
液（点　　線）・・・・・・・・・　トリス−塩酸緩衝
液（−点鎖線）　−−−−一一一一　グリシン緩衝液図
４は本発明の作用至適温度を示す図であり、図５は本発
明の酵素類の温度による失活の条件を示す図である。図
４及び図５のＡはＣｈａｓｅＡＣＩＩｌ、ＢはＣｈａｓ
ｅ　　Ｃ，ＣはＣｈａｓｅ　ＩＩ 　７

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有するコンドロイチン硫酸
   分解酵素、コンドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチ
   ナーゼＣ及びコンドロイチナーゼＢII。 ［１］作用 いずれの酵素もコンドロイチン硫酸の糖鎖のヘキソサミ
   ニド結合に作用するリアーゼであり、切断部の断端のウ
   ロン酸の４位と５位の炭素の間に２重結合を形成する。 ［２］基質特異性 コンドロイチナーゼＡＣIII：ヒアルロン酸に作用して
   不飽和２糖及び不飽和オリゴ糖を 生成する。コンドロイチン硫酸に作用して △Ｄｉ−０Ｓ、△Ｄｉ−６Ｓ及び△Ｄｉ−４Ｓを生成す
   るが、△Ｄｉ−ｄｉＳを生成しない。 コンドロイチナーゼＣ：ヒアルロン酸に作用せず、コン
   ドロイチン硫酸に作用して△Ｄｉ−６Ｓ及び△Ｄｉ−ｄ
   ｉＳ＿Ｄを生成する。切断を受けるヘキソサミド結合に
   つながる２糖のガラクトサミンの４位が硫酸化されてい
   る場合は作用しない。 コンドロイチナーゼＢII：コンドロイチン硫酸Ｂに作用
   して△Ｄｉ−４Ｓ及び△Ｄｉ−ｄｉＳ＿Ｂを生成する。 ［３］至適ｐＨ（５０ｍＭトリス−酢酸、トリス−塩酸
   及びグリシン緩衝液、３７℃反応） コンドロイチナーゼＡＣIII：６．０−７．０コンドロ
   イチナーゼＣ：８．０−９．０ コンドロイチナーゼＢII：８．０−９．０ ［４］安定ｐＨ範囲（１００ｍＭトリス−酢酸、トリス
   −塩酸及びグリシン緩衝液、３７℃、３０分処理） コンドロイチナーゼＡＣIII：６．０−９．５コンドロ
   イチナーゼＣ：５．５−８．０ コンドロイチナーゼＢII：６．５−１１．０［５］作用
   至適温度（５０ｍＭトリス−酢酸緩衝液、ｐＨ７．０） コンドロイチナーゼＡＣIII：４０℃ コンドロイチナーゼＣ：５０℃ コンドロイチナーゼＢII：５０℃ ［６］安定温度範囲（５０ｍＭトリス−酢酸緩衝液、ｐ
   Ｈ７．０、６０分処理） コンドロイチナーゼＡＣIII：３０℃以下 コンドロイチナーゼＣ：４０℃以下 コンドロイチナーゼＢII：４５℃以下 ［７］阻害及び活性化 コンドロイチナーゼＡＣIII：Ｂａ＾２＾＋、Ｃａ＾２
   ＾＋で賦活され、Ｃｏ＾２＾＋、Ｚｎ＾２＾＋で阻害さ
   れる。 コンドロイチナーゼＣ：Ｂａ＾２＾＋で賦活され、Ｃｏ
   ＾２＾＋、Ｍｎ＾２＾＋、Ｚｎ＾２＾＋で阻害される。 コンドロイチナーゼＢII：Ｋ＾＋、Ｎａ＾＋、Ｃａ＾２
   ＾＋、ＳＯ＿４＾２＾−、ＰＯ＿４＾３＾−で賦活され
   、Ｂａ＾２＾＋、Ｃｏ＾２＾＋、Ｍｇ＾２＾＋、Ｚｎ＾
   ２＾＋で阻害される。
2. （２）請求項（１）記載のコンドロイチナーゼＡＣIII
   、コンドロイチナーゼＣ及びコンドロイチナーゼＢII産
   生能を有するフラボバクテリウムｓｐＨｐ１０２株。
3. （３）フラボバクテリウム属に属するコンドロイチナー
   ゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＣ及びコンドロイチナ
   ーゼＢII産生菌を培養し、その培養液又は菌体内にコン
   ドロイチナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＣ及び／
   又はコンドロイチナーゼＢIIを生成蓄積させ、これを採
   取することを特徴とする請求項（１）記載のコンドロイ
   チナーゼＡＣIII、コンドロイチナーゼＣ及び／又はコ
   ンドロイチナーゼＢIIの製造法。