JPH037585A - 光活性オリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の選択的阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、光活性化可能な治療化合物および組成物、前
記化合物および組成物を使用して標的ＤＮＡの機能およ
び／または発現を阻害する方法に関する。さらに詳しく
は、ここに開示する本発明は、前以て決定した配列を有
するヌクレオチド塩基（オリゴヌクレオチド）のＵＶＡ
　（紫外線Ａ光）照射産生物からなる、光活性化可能な
治療組成物の治療学的使用に関し、そして化合物は２つ
の光活性化可能な官能基を有し、そしてＵＶＡ照射条件
下にオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの塩基と反応
することができる。

ソラレン誘導体は、本発明の実施において三機能性化合
物としてとくに有用である。この組成物は生存しうる細
胞に、好ましくは生体内において、投与する。その後、
細胞をＵＶＡ照射に暴露する。

これにより、細胞中でオリゴヌクレオチドの前以て決定
した配列により標的された、不活性化または「ターンオ
フ（ｔｕｒｎ−ｏｆｆ）　Ｊ遺伝子が細胞中に生ずる。

光活性化可能な治療材料の調製に使用するオリゴヌクレ
オチドは、「センス（ｓｅｎｓ）」ＳＲのセグメントま
たは標的された遺伝子の「アンチセンス（ａｎｔｉｓｅ
ｎｓｅ）　」ＤＮＡ鎖の塩基配列セグメントに対して相
補的である、塩基配列セグメントを含有する。光活性化
可能な治療材料の調製において、オリゴヌクレオチドは
ＵＶＡ照射のとき二官能性化合物の光活性化可能な成分
と反応してモノアダクト（ｍｏｎｏａｄｄｕｃｔ）を形
成し、そして細胞を投与しそしてさらにＵＶＡ照射する
と、光活性化可能な治療組成物は標的された遺伝子中で
ＤＮＡの相補的セグメントとその場で架橋する。

ここにおいて、光活性化可能な部分およびオリゴヌクレ
オチド成分、例えば、オリゴヌクレオチドの光活性化可
能なソラレンモノアダクトを有するキメラ分子であると
信じられる、光活性化可能な治療薬物、ＤＮＡ機能を選
択的に阻害する方法、例えばＵＶＡで生存可能な細胞中
でソラレンーオリゴヌクレオチドモノアダクトを照射す
る方法；および標的された組織、例えば、皮膚に本発明
の光活性化可能な治療材料を投与し、次いで前記部位の
局在化ＵＶＡ照射からなる方法を開示する。

光治療技術は大昔から知られている。エジプト人は、ナ
イル河に成長する雑草（ａｍｍｉ　ａ＋ａｊｕｓ）の葉
を摂取し、次いで彼ら自身太陽に暴露して皮膚の脱色し
た判〔白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）　）を処置した。ａｍ
ｍｉｍａｊｕｓ植物の活性成分は、１９４７年において
分離および特性決定され、ソラレン、８−メトキシプソ
ラレン（８−ＭＯＰ）の誘導体である。ラーナー（Ｌｅ
ｒ−ｎｅｔ）および共同研究者は、１９５３年において
、精製した８−ＭｏＰはヒトに安全に投与することがで
きこと、そして増感した８−ＭｏＰは白斑の管理におい
て低い投与量で有効であることを確立した。ラーナーお
よび共同研究者による研究は、大きい興味をつくり、そ
して、とくに皮膚科学の分野において、治療の光製剤学
の現代の領域を開始した。

引き続く研究は、ＵＶＡで照射したソラレン誘導体（フ
ロクマリン類）、例えば、８−ＭｏＰはＤＮＡと反応す
ることを立証した。光活性化したソラレンの治療効果は
、ＤＮＡの２つの相補的鎖中の塩基との光反応から生じ
た。

こうしてさらにソラレンの誘導体、例えば、８−ＭｏＰ
を開発した光治療は、ソラレン誘導体の局所的適用また
は経口的摂取後、皮膚のＵＶＡ光照射を含みそして、最
近、病気をもった血液の体外照射を含んだ。

最も早い光治療の２つは、ソラレンおよびＵＶＡで白斑
および乾唐を処置することであった。より最近の発展は
、皮膚のＴ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の白血球相をソラ
レンおよびＵＶＡで処置することであった。８−ＭｏＰ
の経口的投与後、患者の血液を白血球泳動により３つの
分画に分離する：赤血球、白血球および血漿、白血球お
よび血漿を一緒にし、そしてプラスチックカセットに通
過させ、ここでそれらを薄い（１ｍｍ）層として照射す
る。

「体外の光化学治療により皮膚細胞リンパ腫の治療（Ｔ
ｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ　Ｔ−Ｃ
ｅｌｌ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ　ｂｙＥｘｔｒａｃｏｐｏｒ
ｅａｌ　Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）　Ｊ　
、Ｖｏｌ、３１６、Ｎｏ、６、Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｊｏｕｒ、Ｍｅｄ、、ｐｐ、２９７−３０３
、Ｆｅｂｒｕａｒｙ　５．１９８７゜ ソラレン誘導体、８−ＭＯＰ（１）は、天然に産出する
３環の芳香族化合物であり、その平らな構造はＤＮＡ中
の核酸塩基対間のインターカレーシコン（ｉ　ｎ　Ｌｅ
ｒｃａ　ｌａ　ｔ　ｔｏｎ）を促進する。

ラレンとチミンとの４’、５７−（フラン側）シクロブ
チルアダクト（上のチミンについて示されている、■）
である。

ＵＶＡ光（３２０〜４００ｎｍ）で活性化するとき、ソ
ラレンは細胞のＤＮＡ中でピリミジン塩基と、優先的に
チミンと反応する。他のヌクレオチド塩基を越えたチミ
ンに対する優先は約２０：１である。ソラレンは多官能
性試薬である、ＤＮＡと３つの明確なタイプのアダクト
＝２つのモノ付加生成物および１つの架橋した生成物、
を形成する。モノアダクトは、ソラレンとチミンの５．
６炭素との３゜４−「ピロン側Ｊシクロブチルアダクト
（例えば、上のチミンについて示されている、■）また
はソ３．４−モノアダクト（ｎ）は３００ｎｆｆｌ（＝
ｊ近に弱い吸収のみを有し、したがってＵＶＡ光を弱く
吸収するのみである。ソラレンの４’、５’−モノアダ
クトは３３０ｒ＋ｍ付近に強い吸収を有し、こうして第
２ＵＶＡ光子をより容易に吸収することができる。第２
光子は３．４−ピロン環を光活性化して、反対のＤＮＡ
Ｎ玉鎖上のチミン塩基（例えば、上のチミンについて示
した、■）との第２反応に導き、これにより架橋したＤ
ＮＡ鎖を生成する。

換言すると、ソラレンはＤＮＡ鎖中でチミン塩基との反
応により作用してＤＮＡ鎖を架橋する。

４’、５’−モノアダクトは他のＵＶＡ光子を吸収する
。こうして、ＤＮＡの架橋の形成は２つの光子プロセス
であり、ここで第１光子の吸収はＤＮＡへのソラレンの
４’、５’　−モノアダクトの形成に導き、そしてＵＶ
Ａの第２光子の吸収はソラレンの３．４−ピラン環を光
活性化し、これは引き続いて反対のＤＮＡｔｌ上の他の
チミンに付加して架橋したＤＮＡを与える。

相補的核酸鎖間の塩基対形成は、罪極性ソラレン分子に
より占有のために見事に位置する疎水性部位を提供する
。結合しかつ配向したソラレン部分の光活性化は、ＤＮ
Ａ中のピリミジン塩基（主としてチミン）とのプソラレ
ン光アダクトの形成を促進する。前述のように、可能な
反応生成物はモノ付加のアダクト（モノアダクト）およ
び１つのシアダクトまたは架橋物を包含する。

いくつかの因子は光縮合プロセスに影響を及ぼす、特定
のソラレンがＤＮＡと相互作用する能力は、コアソラレ
ン分子上の置喚基の性質に関係する、その固有の熱力学
的性質に依存する。ソラレンは、それ自体、ＤＮＡを取
り囲む水性環境および塩基対間の疎水性部位の間で分割
する。分布は、ａ）温度の低下、ｂ）反応緩衝液の塩濃
度の増加、およびＣ）ソラレンコア上の置換基の変更（
例えば、８−ＭｏＰの代わりに４′−アミノメチル−４
゜５’、８−１−リメチルソラレン（ＡＭＴ）により、
より多い塩基対の相互作用に向かってシフトすることが
できる。

塩基対の不存在下に、ソラレン光アダクトの収量は減少
し、そして８−ＭｏＰの場合において、収量は少なくと
も２桁だけ減少する。したがって、ＤＮＡの塩基対の鎖
は、本発明のモノアダクトを生成する好ましい方法にお
いて使用する。

モノアダクトの形成を制御するために、２つの方法を使
用した。第１に、３９０ｎｍより大きい紫外線の波長で
ソラレンー二本鎖ＤＮＡ溶液を照射することによって、
モノアダクトは事実上形成する光アダクトのみである。

第２に、標的鎖に対して相補的である鎖中のオリゴヌク
レオチドのＡ　７９ｉ域中に不一致の塩基を組み込むこ
とによって、モノアダクト単独は照射のために使用する
ＵＶＡの波長に無関係に生成する。例えば、構造（Ｖ）
は−敗した塩基対を表し、そして構造（Ｖｌ）は不一致
の塩基対を表し、ここで不一致の相補的鎖は相補的塩基
Ｔの代わりにＡを有し、これにより不一致の鎖中のＴ塩
基間の架橋からソラレンを阻害する。

相補的鎖中に不一致塩基を意図的に組み込むことによっ
て、架橋の形成は遮断される。照射後、モノアダクトの
オリゴヌクレオチドを含有する混合物を変性して、未反
応の相補的ＤＮＡ鎖をオリゴヌクレオチドーソラレンモ
ノアダクト鎖から分離する。主な結果により、モノアダ
クトは８−Ｍ０Ｐ十ｄｓ　−ＤＮＡ　（完全に一致して
いるか、あるいは単一の不一致塩基を含有する）を４０
０ｎｍの光で照射するとき、同様な効能をもってモノア
ダクトが形成することが示される。

先行技術の光治療は、ソラレンの誘導体、例えば、８−
ＭｏＰを投与し、次いでＵＶＡで照射して８−ＭｏＰを
含有する照射した細胞中のＤＮＡの相補的鎖中にモノア
ダクトおよび架橋を生成することを包含する。しかしな
がら、ソラレンそれ自体の投与は、細胞中に含有される
ＤＮＡの特定の位置に対して特異的でなく、そして引き
続＜ＵＶＡの照射はモノアダクトの形成および細胞のＤ
ＮＡの全体を通じて不規則な架橋を引き起こす。

本発明の１つの目的は、オリゴヌクレオチドの前取て決
定した配列および少なくとも２つの光活性化可能な官能
基を有する化合物のモノアダクトとの光架橋のために細
胞遺伝子中の特定の遺伝子を標的することであり、前記
化合物はＵＶＡ照射条件下にオリゴヌクレオチドの少な
くとも１つの塩基と反応することができる。このような
架橋反応の結果は、反応生成物を含有する遺伝子はター
ンオフされる、すなわち、架橋したＤＮＡが複製および
それがコードするポリペプチドを発現することを阻害さ
れることである。こうして、全体のゲノムのＤＮＡの少
なくとも１つの標的されたセグメントはその遺伝子、ま
たはある他のＤＮＡセグメント中で架橋により選択的変
更される。したがって、他のゲノム位置は光活性化化合
物、例えば、ソラレンの作用により節約される。標的さ
れた遺伝子中のＤＮＡの１つの鎖に対して相補的なオリ
ゴマー（標的されたセグメントを位置決定し、そしてそ
れとハイブリダイゼーションすることができる）を、光
活性化可能な化合物、例えば、ソラレンーオリゴヌクレ
オチドアダクトを、ＵＶＡ照射および架橋の形成の前に
、細胞遺伝子中の特異的ヌクレオチド配列へ供給する手
段として設計した。

標的された遺伝子の活性化が起こる特定の理論に拘束さ
れたくないが、光活性化された反応は生体内で起こり、
不活性化または「ターンオフ」された１または２以上の
遺伝子を生ずると信じられる。こうして、本発明の治療
材料は、それらの治療作用がＵＶＡ照射によりので、光
活性化可能であると呼ぶ。最初の反応において、生体外
で、メチレン分子はオリゴヌクレオチドに接合して、メ
チレンおよびオリゴヌクレオチドの４’、５’モノアダ
クトを形成する。

本発明のメチレン−オリゴヌクレオチドモノアダクトは
、生存可能な細胞または組織に、例えば、注射、または
動物の皮膚の局所的または病変内の適用により投与し、
そして移送または他の方法で細胞中に入る。細胞におい
て、メチレン−オリゴヌクレオチドアダクトは標的され
たＤＮＡ配列中のＤＮＡの特異的または相補的セグメン
トとハイブリダイゼーションすると、われわれは理論化
する。ハイブリダイゼーションした光活性化可能なメチ
レン−オリゴヌクレオチド物質の引き続くその場のＵＶ
Ａ照射は、メチレン−オリゴヌクレオチド物質をそれが
ハイブリダイゼーションする相補的鎖と反応または架橋
させ、これにより標的されたＤＮＡ配列と相互作用させ
る。

いったん遺伝子のＤＮＡ配列が知られるか、あるいはい
ったん遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列
が知られると、特異的オリゴヌクレオチド配列は既知の
方法により構成することができる。構成する特異的オリ
ゴヌクレオチド配列は、少なくともターンオフすべき遺
伝子のＤＮＡのセグメントに対して相補的であるべきで
ある。

したがって、ＴＡ配列またはＡＴ配列を含有する既知の
遺伝子位置は、本発明の光治療物質のための潜在的標的
であろう。なぜなら、モノアダクトのメチレン部分は、
オリゴヌクレオチドおよび細胞のＤＮＡの両者中で、チ
ミン塩基と優先的に反応するからである。

本発明の組成物は、光活性化可能なオリゴヌクレオチド
、例えば、少なくともＴＡまたはＡＴ配列および望まし
くはＴＡＴまたはＡＴＡ配列を含有する、特定の前以て
決定したオリゴヌクレオチドとメチレン化合物との４’
、５’−モノアダクトからなる。これらのキメラ４’、
５’　−モノアダクト化合物は、メチレンおよび前以て
決定した配列のオリゴヌクレオチドの混合物のＵＶＡ照
射後、形成すると信じられる。メチレンの４’、５’−
モノアダクトは、この第１照射により生成した他の光生
成物ならびに未反応物質を含有しうる反応混合物から分
離することができる。

オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの塩基とＵＶＡ照
射条件下に反応することができ、したがってここに記載
する治療学的処置において使用である、少なくとも２つ
の光活性化可能な官能基を含有する他の化合物は、次の
ものを包含する：ＮＮ′−ＮＮキーン（Ｃ−１〜Ｃ−５
）−ビス−マレイミド（例えば、Ｎ、Ｎ’　−テトラメ
チレン−ビス−マレイミド）、Ｎ−ＨまたはＮ−アルキ
ル（Ｃ−１〜Ｃ−８）−フラノカルボスチリル（例えば
、７Ｈ−フラノ（３，２−ｇ）グイノロンー２）；フラ
ノクロモン（例えば、７Ｈ−フラノ（３，２−ｇ）（１
）ベンゾピラン−５−オン）；およびアルケニル（Ｃ−
〜Ｃ−１０）オキシクマリン（例えば、７−アルキルオ
キシクマリン）。

モノアダクトのオリゴヌクレオチド部分は、ＤＮＡの相
補的配列内にチミン塩基を含有する、標的された遺伝子
のＤＮＡのセグメントに対してハイブリダイゼーション
ように設計する。こうして、有用な照射した生成物は、
オリゴヌクレオチドの前以て決定した配列中のチミン部
位にメチレン４’、５’−モノアダクトを含有する。４
′５′−モノアダクトは、標的された遺伝子において相
補的ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションし、次いでそ
れと光反応することができる。

さらに、標的された遺伝子中の選択した配列に対して相
補的であるオリゴデオキシリボヌクレオチド−およびオ
リゴデオキシリボヌクレオシド−アルキルホスホネート
は、ここに記載する本発明の実施のために使用するオリ
ゴヌクレオチドまたはオリゴマーの意味の範囲内に入る
。オリゴデオキシリボヌクレオシド−低級（Ｃ−１〜Ｃ
−３）アルキルホスホネートは非イオン性核酸の類似体
であり、通常核酸中に存在する負に帯電したホスホジエ
ステルインターヌクレオチド結合を置換する、自然のア
ルキルホスホネート結合を含有する。

ホスホネート結合はヌクレアーゼによる加水分解に対し
て抵抗性であり、したがって非イオン性オリボヌクレオ
チドは細胞壁中に浸入することができる。本発明は、イ
ンターヌクレオチドホスフェートのすべてまたはあるも
のがアルキルホスホネートと置換できることを包含する
。「雑種」分子を形成する、アルキル（例えば、メチル
）ホスホネートとのインターヌクレオチドとの選択的置
換は、これらの変更されたオリゴヌクレオチドへの皮膚
中に位置するヌクレオチック（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ
）酵素の活性を抑制するとき、とくに有利であることが
発見された。完全に置換されたオリゴヌクレオチドと比
較して、同一の細胞効果を達成するために、雑種インタ
ーヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの濃度を有
意に低下させることが必要であることがある。

本発明において使用するオリゴヌクレオチドは、約８塩
基から約３０塩基までの大きさの範囲のＤＮＡ配列の前
以て決定した配列からなる。最も好ましくは、配列は約
１２〜約２０塩基の長さである。配列中の８より小さい
塩基は前以て決定した配列として使用することができる
が、独特性の程度は長さの減少とともに急速に減少し、
これにより標的された遺伝子に対するソラレンーオリゴ
ヌクレオチドモノアダクトの潜在的特異性を大きく減少
する。換言すると、ソラレンーオリゴヌクレオチドモノ
アダクトは他の遺伝子（標的された遺伝子として意図し
ない遺伝子）と相互作用し、そしてこのような他の遺伝
子の望ましくない相互作用を引き起こすことがある。他
方において、約３０塩基より大きい前以て決定したオリ
ゴヌクレオチド配列は、本発明の実際の適用を妨害しう
る程度に高い、標的すべき遺伝子中のその相補的セグメ
ントの認識およびハイブリダイゼーションのための相同
性を要求しうる。換言すると、標的された遺伝子の相補
的ＤＮＡセグメントへのより長い前以て決定したオリゴ
ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションのために必
要な時間は、この方法を実際に無効とすることがある。

そのうえ、長い前以て決定した配列を有するを有する４
’、５’−ソラレンーオリゴヌクレオチドモノアダクト
の細胞壁を横切る移送は、遅延されるか、あるいは妨害
されることさえある。

前以て決定した前以て決定した配列に関すると、配列は
オリゴヌクレオチド内に少なくともチミン−アデニンま
たはアデニン−チミン（ＴＡまたはＡＴ）を含有しなく
てはならない。換言すると、前以て決定した配列は、Ａ
ＴまたはＴＡジヌクレオチド配列を含有する標的すべき
遺伝子のＤＮＡの相補的配列から選択される。好ましく
は、選択すべき前以て決定したオリゴヌクレオチド配列
は、前以て決定した配列内に多数のＴＡまたはＡＴ配列
を含有すべきである０例えば、ＴＡＴまたはＡＴＡ、お
よびＴＡＴＡまたはＡＴＡＴは好ましい、また、シトシ
ンをオリゴヌクレオチドまたは標的された遺伝子中でチ
ミンと置換することができるが、望ましさに劣る。

したがって、選択しかつ、例えば、１０塩基を有する前
以て決定した配列は、ＴＡＴ＾配列および６つの追加の
塩基を含有することができる０例えば、Ｔ３　（Ｔ細胞
受容体）のための遺伝子において、配列５　’　−ＧＧ
ＡＡＴＡＴＡＧＧ　−３’が存在し、そして選択した配
列は所望のＡＴＡＴＡ配列を含有する。その１０塩基の
配列は、本発明における使用のための前以て決定した相
補的オリゴヌクレオチド配列として選択することができ
る。この例において、相補的オリゴヌクレオチド配列は
通常５’　−ＣＣＴＡＴＡＴＴＣＣ−３′である。

オリゴヌクレオチド配列は、この分野においてよく知ら
れている技術により調製することができる０例えば、オ
リゴヌクレオチド配列は、ＤＮＡ合成装置において固相
合成により調製することができるか、あるいは好ましさ
に劣るが、逆転写の複雑な技術を使用することができる
。

ソラレンーオリゴヌクレオチドモノアダクトを調製する
ために、緩衝された（ｐＨ７，４＞ソラレンの水溶液（
０，０５〜０．２■／ｌｌ１１）を調製する。ソラレン
溶液のｌｌｌ１１につき、約１０〜５０■の前以て決定
したオリゴヌクレオチドを約０．０１〜０．０５ミリモ
ルの濃度で添加する。したがって、この溶液をソラレン
ーオリゴヌクレオチド溶液の１−につき約１〜５時間の
間、モノクロメータ−から長い波長のＵＶＡ光（３９０
〜４１０ｎｍ）で照射する。より長い時間にわたって照
射する場合、より大きい溶液を使用することができる。

紫外線ランプの代わりに、増熱または特別の蛍光ランプ
を使用することができる。紫外線ランプは、架橋反応を
引き起こすＵＶＡ波長、すなわち、３２０〜３７０ｎｍ
の排除するガラスフィルターとともに使用することがで
きる。

本発明の方法は、生存可能な細胞に、治療学的に有効量
の光活性化可能なオリゴヌクレオチド、例えば、４’、
５’−ソラレンーオリゴヌクレオチドモノアダクトを投
与することからなる。オリゴヌクレオチド部分の細胞中
のその相補的ＤＮＡ遺伝子位置へのハイブリダイゼーシ
ョンは、起こると信じられ、次いで細胞をＵＶＡ光で照
射する。

ハイブリダイゼーションした４’、５’　−ソラレンー
オリゴヌクレオチドモノアダクトは、標的された遺伝子
内の相補的ＤＮＡ配列へハイブリダイゼーションする。

ソラレンーオリゴヌクレオチドモノアダクトのソラレン
部分の３，４−ピラン環の光活性化、およびモノアダク
トのオリゴヌクレオチド部分をハイブリダイゼーション
させる標的されたＤＮＡ上のチミンへの引き続く付加は
、シアダクトの架橋を提供し、これにより標的された遺
伝子中の遺伝情報の複製および発現を阻害する。

多分皮膚の１　、０００の病気および疾患が存在する。

皮膚は体の大きい器官であり、全体の体重の１５％に及
ぶ、１ｅＩＩ１以内で、約１００の汗腺、４ｍの神経、
接触、温度、圧力および痛みに応答する３、０００より
多い神経細胞が存在する。それは、また、体の免疫系の
重要な部分である；体の防御機構において含まれるリン
パ球の最高の濃度は皮膚中に位置する。さらに、表皮細
胞は有意な量のインターロイキン−１、インターロイキ
ン−３、サイモポイエチン、インターフェロン、顆粒球
／単球コロニー刺激因子、リンパ球機能関連抗原（例え
ば、ＬＦＡ−１）および細胞間付着分子（例えば、ＩＣ
ＡＭ−１）を産生ずることが知られている。これらの遺
伝子またはタンパク質またはペプチドをコードする他の
遺伝子、例えば、ＣＤ１ａ　（免疫反応に参加する）を
阻害して、このようなポリペプチド産生物を発現させな
いようにすると、種々の重大なまたは面倒な免疫系の疾
患を効果的に処置することができる。

前述のポリペプチドの産生に原因となる遺伝子、または
他の標的された遺伝子のヌクレオチド配列を検査するこ
とによって、標的された遺伝子内に８〜３０塩基配塩基
台有する特定のＡＴまたはＴＡに対して相補的なオリゴ
ヌクレオチドを選択および調製することができる。相補
的配列を使用して、本発明の組成物を調製する。例えば
、次の配列は、細胞間付着分子ＩＣＡＭ−１をエンコー
ドする遺伝子中の配列に対して相補的である： （１）　ＴＴＴ　ＡＧＧ　ＣＡＡ　ＣＧＧ　ＧＧＴ　Ｃ
ＴＣＴＡＴ　ＧＣＣＣＡＡ　ＣＡＡＣＴＴ　ＧＧＧ　Ｃ
ＴＧ。

（２）　ＣＴＣＧＣＴ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＣＣＣＣＡＧ
　ＴＡＴ　ＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＧＴ　ＣＡＧ　ＣＣＧ
　。

（３）　ＣＣＧ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＣＴＴ　Ｃ
ＴＧ　ＴＡＴ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣ
ＴＣ及び （４）　ＧＡＧ　ＧＣＣＴＧＣＡＧＴ　ＧＣＣＣＡＴ　
ＴＡＴ　ＧＡＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＣ。

最も好ましくは、本発明による組成物中に使用するオリ
ゴヌクレオチドは、ＡＴＡまたはＴＡ、Ｔを含有し、そ
して１２〜２０ヌクレオチド配列の長さであるので、上
の配列の各々中に含まれるいくつかの配列は、ＩＣＡＭ
−１の発現を阻害する組成物の生成にとくに適当である
ことがある。

同様に、次の配列はＣＤ１ａ（Ｔ−６）をコードする遺
伝子中の配列に対して相補的である：（１）　ＴＧＴ　
ＣＡＣＣＡＡ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＡＣＴ　ＴＡＴ　ＴＣ
Ａ　ＣＣＴ　ＴＣＣＣＣＴ　ＡＡＴ　ＴＣ。

（２）　　ＣＡ　　ＴＡＴ　　ＣＡＴＴ　　ＴＧＣＡＧ
Ａ　　ＴＧＴ　　ＴＡＴ　　ＴＴＣＣＴＴ　　ＣＴＣＴ
ＣＡ　　ＧＡＡ　　ＡＡＡ （３）　ＧＡＡ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　Ｇ
ＣＡ　ＴＡＴ　ＣＡＴ　ＴＴＧ　ＣＡＧ＾ＴＧ　ＴＴＡ
　ＴＴＴ。

（４）　ＴＧＧ　ＡＡＴ　ＴＧＣＴＧＴ　ＣＣＣＡＧＧ
　ＴＡＴ　ＧＡＧ　ＴＣＴ　ＧＣＡ＾ＡＴ　ＣＡＣＴＣ
Ａ。

（５）　ＡＡＡ　ＴＧＡ　ＣＣＧ　ＡＡＴ　ＧＧＴ　Ｇ
ＣＧ　ＴＡＴ　ＡＣＧ　ＧＡＡ　ＴＡＡＴＧＴ　ＴＴＣ
ＣＡＧ。

（６）　ＡＣＡ　ＧＣＣＴＣＣＴＧＴ　ＣＡＣＣＴＧ　
ＴＡＴ　ＣＴＣＡＡＡ　ＡＧＧＡＴＣＴＧＧ　ＣＣＴ。

（７）＾ＴＡ　ＴＴＣＣＣＡ　ＧＣＣＡＣＴ　ＧＧＡ　
ＴＡＴ　ＧＧＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＣ。

（８）　　ＴＧＣＡＧＡ　　ＡＡＴ　　ＧＣＴ　　ＴＧ
Ｇ　　ＣＣＡ　　ＴＡＴ　　ＴＣＣＣＡＧ　　ＣＣ八へ
ＴＧ　　ＧＡＴ　　ＡＴＧ。

（９）ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＴＡＡ　ＸＸＸ　ＡＧＧ　ＣＡ
ＣＴＡＴ　ＣＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＴ　　ＧＡＴ　　Ｇ
ＡＡ。

（１０）ＡＡＣＴＧＣＡＡＴ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＧＣＧ
　ＴＡＴ　ＣＴＡ　ＣＧＡ　ＡＴＴＣＣＣＴＣＡ　　Ａ
ＡＴ。

（１１）ＡＣＣＴＧＴ　ＡＴＣＴＣＡ　ＡＡＡ　ＧＧＡ
　ＴＡＴ　ＴＣＡ　ＡＡＣＴＧＣＡＡＴ　ＴＣＡ　　Ｔ
ＧＧ。

（１２）ＡＣＡ　ＧＣＣＴＣＣＴＧＴ　ＣＡＣＣＴＧ　
ＴＡＴ　ＣＴＣＡＡＡ　ＡＧＧＡＴＡ　　ＴＴＣＡＡＡ
。

（１３）ＡＴＡ　ＴＴＣＣＣＡ　ＧＣＣＡＣＴ　ＧＧＡ
　ＴＡＴ　ＧＧＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＣ
，および （１４）ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＧＴＧ　Ｔ
ＧＴ　ＴＡＴ　ＧＴＣＡＴＴ　ＴＴＣＡＴＧ　　ＣＴＧ
　　ＡＴＴ。

ここでＸ＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ０ これらの配列内にＡＴまたはＴＡ、Ｊｉも好ましくはＴ
ＡＴまたはＡＴＡ配列を含有する１２〜２０塩基の配列
が含まれ、これらの配列はＣＤ１ａの産生を遮断するた
めに使用できる本発明による組成物の調製においてとく
に有用である。

ＩＬ−６受容体をコードする遺伝子における領域に対し
て相補的であるいくつかの配列は、タンパク質の発現の
遮断において通常であろう。これらは次ののもの含む： （１）　ＧＧＣＧＡＣＧＣＡ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＣＡＣ
ＴＡＴ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＡＧＡＧ、ＣＴ　ＧＴＣＴＣ
Ｃ。

（２）　ＴＴＴ　ＧＡＣＣＧＴ　ＴＣＡ　ＧＣＣＣＧＡ
　ＴＡＴ　ＣＴＧ　ＡＧＣＴＣＡＡＡＧ　ＣＧＴ　ＡＧ
Ｔ。

（３）　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＴＡＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　Ｃ
ＴＴ　ＴＡＴ　ＴＡＧ　ＴＡＧ　ＴＡＡＧＴＧ　ＣＣＴ
　ＧＣＡ。

（４）　ＡＡＴ　ＣＴＣＴＧＡ　ＡＧＡ　ＧＡＡ　ＴＡ
Ｔ　ＴＡＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＣＴＴＴＡＴ　ＴＡＧ　
ＴＡＧ。

（５）　ＴＧＧ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＡＧＴ　ＡＧＴ　Ｃ
ＴＧ　ＴＡＴ　ＴＧＣＴＧＡ　ＴＧＴＣＡＴ　ＡＡＧ　
ＧＧＣおよび （６）　ＴＧＧ　ＴＧＣＣＡＣＣＣＡ　ＧＣＣＡＧＣＴ
ＡＴ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＡＧＡＡＣＴＡＧ　ＴＣＴ。

これらの配列内に包含される、ＴＡおよびＡＴを含有す
るか、あるいは最も好ましくはＴＡＴを含有する１２〜
２０塩基配列を使用して、ＩＬ−６受容体タンパク質の
発現を阻害するための本発明による組成物を生成するこ
とができる。

ＧＭ　−Ｃ３Ｆをコードする遺伝子中の領域に対して相
補的であるオリゴヌクレオチドは、次の配列を有するも
のを包含する： （１）　ＧＡＡ　ＡＧＣＣＴＴ　ＧＣＡ　ＡＧＡ　ＧＧ
ＣＴＡＴ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＣＣＣＴＧＣＡＧＧ　ＧＣ
Ａ。

（２）　ＣＴＧ　ＣＴＡ　ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＡＡＴ　Ｇ
ＧＡ　ＴＡＴ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＴＧＡＣＴＡＣＣ
ＣＡ。

（３）　ＡＴＡ　ＣＣＣＴＣＴ　ＧＴＧ　ＣＣＣＣＴＧ
　ＴＡＴ　ＡＡＴ　ＣＡＡ　ＴＡＣＣＴＴ　ＣＴＣＴＣ
Ｃ。

（４）　ＴＴＣＴＧＴ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＣＡ
ＣＴＡＴ　ＴＴＣＡＡＡ　ＡＧＣＣＣＣＴＣＴ　ＧＴＧ
。

（５）　　ＣＣＧ　　ＴＡＧ　　ＡＣＣＣＴＧ　　ＣＴ
ＣＧＡＡ　　ＴＡＴ　　ＣＴＴ　　ＣＡＧ　　ＧＣＧＧ
ＧＴ　ＣＴＧ　ＣＡＣ。

（６）　ＡＣＣＧＧＡ　ＧＴＴ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＣＡ
Ｇ　ＴＡＴ　ＧＴＣＴＧＧ　ＴＡＧＴＡＧ　ＣＴＧ　Ｇ
ＣＴ。

（７）　ＣＴＡ　ＧＧＧ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＡＧＧ　Ａ
ＧＣＴＡＴ　ＧＧＣＣＴＧ　ＴＴＣＴＴＧ　ＧＧＧ　Ｇ
ＧＣ，および （８）　　ＣＧＴ　ＧＧ（、ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＡＣＴ　
ＧＴＧ　ＴＡＴ　ＴＴＣＴＣＴ　ＣＴＣＧＣＴ　　ＧＣ
Ｔ　　ＧＡＧ。

これらの配列内に含有される配列を有する、１２〜２０
塩基のＴＡまたはＡＴを含有する、最も好ましくはＡＴ
ＡまたはＴＡＴを含有するオリゴヌクレオチドを使用す
る、光活性化可能な組成物は、ＧＭ　−Ｃ３Ｆの発現を
阻害する。

次の配列は、ＩＬ−１αをコードする遺伝子中の領域に
対して相補的である： （１）　ＡＴＧ　ＡＴＣＣＴＣＡＴＡ　ＡＡＧ　ＴＴＧ
　ＴＡＴ　′Ｔｒｃ　ＡＣＡ　ＴＴＧＣＴＣＡＧＧ　Ａ
ＡＧ （２）　ＣＴＧ　ＡＴＣＡＴＴ　ＧＧＣＴＣＧ　ＡＡＴ
　ＴＡＴ　ＡＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＴＧＡＧ　ＧＧＧ　Ｇ
ＴＣ （３）　ＡＣＣＴＧＴ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　ＴＴＴ　ＧＧ
Ｇ　ＴＡＴ　ＣＴＣＡＧＧ　ＣＡＴＣＴＣＣＴＴ　ＣＡ
Ｇ （４）　ＣＴＡ　ＣＧＣＣＴＧ　ＧＴＴ　ＴＴＣＣＡＧ
　ＴＡＴ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＴＣ＾ＧＴ　ＧＡＴ　Ａ
ＧＡ　。

これらの配列内に含有される配列を有する、１２〜２０
塩基のＴＡまたはＡＴを含有する、最も好ましくはＡＴ
ＡまたはＴＡＴを含有するオリゴヌクレオチドは、ＩＬ
−１αの発現の阻害のための本発明による組成物の調製
において有用である。

本発明の組成物および方法は、光活性化可能な治療組成
物を使用する、局所的適用、例えば、皮膚への局所的適
用または処置すべき組織中への注射による、皮膚の疾患
の処置にとくに適当である。

なぜなら、表皮細胞をＵＶＡ照射に暴露することが容易
であるからである。光活性化可能な治療組成物は、皮膚
の外側層に浸透する。表皮のより低い層中の生存可能な
細胞は、光活性化可能な物質を細胞核中に吸収し、ここ
で前述のハイブリダイゼーションおよび引き続＜ＵＶＡ
照射を行う。

本発明による組成物により処置すべき病気の例は、次の
とおりである：炎症の病気（例えば、アトピー性皮膚炎
またはエリテマトーデス）、角質層の病気（例えば、角
鱗瑠または乾廚）、ウィルスの病気（例えば、いぼおよ
び単純ヘルペス）、および新生物の病気（例えば、黒色
腫および皮膚のＴ細胞リンパ腫）。

さらに、本発明の光活性化可能なオリゴヌクレオチド組
成物および方法は、内因性遺伝子ばかりでなく、かつま
た外因性の遺伝子、例えば、皮膚細胞またはＵＶＡ照射
することができる他の標的された細胞中に存在するウィ
ルスのゲノムから誘導されるものの選択的阻害において
有効であることがある。

ここに記載するモノアダクトのオリゴヌクレオチドは、
皮膚の疾患、例えば、乾府の処置のための局所的または
病変内の投与のための適当な製剤学的賦形剤中で調製す
ることができる。本発明の組成物は、局所的にまたは処
置部位中の注射、例えば、皮下に注射により適用するこ
とができる。

局所的のために使用するとき、アダクトは通常製剤学的
に許容されうるキャリヤーと配合する。

キャリヤー材料は医薬製剤においてよく知られており、
そして希釈剤または賦形剤と呼ばれる物質を包含する。

キャリヤーは無機または有機の物質を包含することがで
き、そして十分な粘度を付与して組成物の広がりを可能
とし、そして局所的に適用する組織へのすぐれた付着を
提供する。このようなキャリヤーの例は次のものを包含
するが、これらに限定されない：ポリオール、例えば、
グリセロール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレ
ングリコール、適当なそれらの混合物、植物油、および
当業者によく知られている他の物質。

製剤の粘度は、この分野においてよく知られている方法
により、例えば、高分子量のポリエチレングリコールの
使用により調節することができる。

アダクトおよびキャリヤーに加えて、製剤は薬理学的に
許容されうる添加剤またはアジュバント、例えば、抗微
生物剤、例えば、バラ−ヒドロキシ安息香酸のメチル、
エチル、プロピル、およびブチルエステル、ならびにク
ロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸などを含
有するすることができる。製剤は、また、増粘剤または
ゲル化剤、乳化剤、湿潤剤、着色剤、緩衝剤、安定剤お
よび防腐剤、例えば、酸化防止剤、例えば、ブチルヒド
ロキシアニソールをこの分野の実施に従って含有するこ
とができる。製剤は、また、浸透増強剤、例えば、ジメ
チルスルホキシド、長鎖アルコール、例えば、ノンオキ
シツール、長鎖カルボン酸、プロピレングリコール、Ｎ
−（２−ヒドロキシエチル）ピロリドン、１−ドデシル
−アザシクロへブタン−２−オンなどを含有することが
できる。適用の方法および特定の治療の要件に依存して
、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム
およびゼラチンを使用することが望ましい。

製剤の組成は、製剤技術においてよく知られている成分
を使用して調節して、ゲル、クリーム、軟膏、固体、液
体、半固体などである医薬製剤を提供することができる
。製剤の特定の物理学的形態は、処置の所望する方法お
よび処置されるべき患者に依存する。

本発明の医薬組成物の典型的な処方を、次に記載する： ｍ瞥 アスコルビン酸 ベンジルアルコール プロピレングリコール 水 ステアリルアルコール セチルアルコール 白色ペトロラタム ポリオキシ−４０ステアレート 水 グリセリン 塩化ナトリウム アスコルビン酸ナトリウム ポリプロピレングリコール 注射による適用のため、本発明による組成物は、注射す
るために十分に低い粘度を有する溶液または懸濁液とし
て配合される。注射の使用に適する組成物は、無菌であ
るかつ容易な注射を可能とする程度に流動性である。そ
れは、また、製造および貯蔵の条件下に安定であり、そ
して微生物による汚染に対して保存されるべきである。

防腐剤は、アルコール、安息香酸、ソルビン酸、プロピ
レングリコールを含みおよび含まないメチルパラベンお
よびプロピルパラベンを包含する。さらに、組成物のｐ
Ｈは、組織の損傷を生じないか、あるいはアダクトの化
学的不安定性に導かない範囲、すなわち、約４〜７内で
なくてはならない。

特定の効果を提供するために要求される特定の製剤中の
活性成分の濃度は、医薬製剤の分野においてよく知られ
ているように、キャリヤーの性質および製剤中に導入す
べき特定のアダクトに基づいて決定することができる。

使用するキャリヤーおよびアダクトに依存して有意に高
い濃度のアダクトを有する製剤を、調製することができ
る。キャリヤーが実質的にアダクトを保持するか、ある
いはそれを遅い速度で放出する場合、製剤中のアダクト
の濃度は、実質的に上昇することができそして、事実、
実質的に上昇させて有効な処置を行うことができる。実
際に、製剤は所望する回数の適用で状態を効果的に処置
する最低濃度のアダクトを含有すること、すなわち、よ
り低い有効投与割合が、多数の適用を使用する場合、許
容され得ることが好ましい。この低い濃度の限界は、キ
ャリヤーまたは賦形剤の供給有効性に依存する。好まし
くは、アダクトは製剤の約０．０１〜約１０重量％を構
成する。

本発明の好ましい態様は、アダクト、すなわちオリゴヌ
クレオチド８　ＭＯＰモノアダクトを含む製剤を含んで
成る。この製剤は、乾瘤を治療することにおいて特に効
果的である。その治療に投じられるアダクトの有効な濃
度は、中でも、その製剤に含まれるキャリヤー及び他の
アダクトに依存するけれども、通常、その製剤における
アダクトの濃度は、約０．０１〜１０重量％の間である
。これらの範囲は、例示的であって、制限するものでは
ない。

なぜならば、その濃度は、上記のように、キャリヤー材
料、使用される多くの用途、等に依存して広範囲にわた
って調節され得るからである。

製剤のｐＨは、アダクトの安定性を確保し、そしてその
製剤が患者に生理学的に受は入れられることを確保する
ことにおいて重要である。製剤のｐＨは、毒物学的に許
容できる緩衝液の使用により維持され得る。そのような
緩衝液は、医薬製剤業界において良（知られており、そ
して塩酸緩衝液、無水フタル酸緩衝液、リン酸緩衝液及
びクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液を包含する。

局部的適用においては、本発明の組成物は、患者の冒さ
れた部分又は苦痛の位置に適用される。

用語°“局所的”とは、上皮組織、特に皮膚の表面及び
変性され、そしてプラークが皮膚上から除かれている皮
膚上の乾磨病の表面を言及する。

局所的起用のために適切な製剤の調製においては、アダ
クトは通常、適切な溶媒と共に混合される。この目的の
ために効果的である溶媒の例として、エタノール、アセ
トン、酢酸、アルカリ水溶液、ジメチルスルホキシド、
グリセリン、グリセロール、プロピレングリコール、非
オキシツール、エチルエーテル、ポリエチレングリコー
ル、等ヲ挙げることができる。

注射による適用は、乾廖の治療のために使用さ得る。こ
の方法においては、本発明の組成物が、乾宥皮膚中に直
接注射される。

次の例は、本発明の原理及び実施を例示し、そして制限
するものではない。すべての％は、特にことわらないか
ぎり、重量によってである。

■上： ８−メトキシソラレンの４’、５’モノアダクトを含む
光活性オリゴヌクレオチドの調製。

８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）の４’、５’−モ
ノアダクトを含むオリゴヌクレオチドの光活性モノアダ
クトを、次の通りにして調製した。配列ＧＡＧＴＡＴＧ
ＡＧ　（遺伝子の“センス′”鎖の部分に相補的である
）及びその相補的配列、ＣＡＴＡＣを、８−ＭｏＰ及び
Ｕ　Ｖ　Ａ　（３２０〜４００ｎｍ）により５°Ｃで処
理した。緩衝液（０，ＯＩＭのトリス、０．００１Ｍの
ＥＤＴＡ及び０．５ＭのＮａＣ１、ｐＨ７，４）中、８
−ＭＯＰ（０，２１１１ｇ／戚、０．９３ｍＭ）及び上
記９−マー及び５−マーの等モル量から成る二本鎖らせ
ん状オリゴマーを、格子モノクロメータ−を用いて４０
０ｎｍの光により照射した。この場合、調製された主要
光アダクトは、９−マーの４’、５’　−モノアダクト
であった。その４’、５’　モノアダクトされたオリゴ
ヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２
０％アクリルアミド及び８．３Ｍの尿素）を用いて変性
することにより他のオリゴヌクレオチド種から分離した
。ゲルバンドを切り出し、モノアダクトを含むオリゴヌ
クレオチドを溶離するために蒸留水に浸軟し、そして次
に、カートリッジクロマトグラフィーにより精製した。

その精製された４’　、５’−８−Ｍ０Ｐオリゴヌクレ
オチドを用いて、特定の細胞ＤＮＡ配列に８−ＭｏＰを
向けた。

Ａ、光化学ニドリス−ＥＤＴＡ緩衝液中、８−ＭｏＰ（
０，２■／戚）及び（ｚｐ）−オリゴヌクレオチド（０
，０３ｍＭ　）を、４００ｎｍの光により照射した。最
初の実験において、光化学的動力学を、オリゴヌクレオ
チドへの８−ＭｏＰの４’、５’モノアダクトの生成の
ための最適時間を決定するために、０゜０．５．１．２
及び３時間で、その溶液をアッセイすることにより決定
した。

Ｂ、ポリアクリルアミド電気泳動：　８−ＭＯＰ　−オ
リゴヌクレオチド反応混合物のアリコートを、スクロー
ス−染料混合物と共に混合し、そしてポリアクリルアミ
ドゲルに適用した。電流は、１０〜１５ｍアンペア（約
１５００〜２０００ボルト）で約５時間適用された。電
気泳動の間、ゲルの作業温度は、約５°Ｃであった。

Ｃ，４’　　５’８−Ｍ０Ｐオリゴマーの精製：ポリア
クリルアミドゲル上の（３！ｐ）−オリゴヌクレオチド
バンドを、オートラジオグラフ法により可視化した。そ
のオートラジオダラムを、鋳型として使用し、ゲルから
オリゴヌクレオチドバンドを切り出した。その切り出さ
れたゲルバンドを、蒸留水中に４〜８時間、浸軟し、８
−ＭｏＰ−モノアダクトオリゴヌクレオチドを溶離した
。次に、そのオリゴヌクレオチド溶液（オリゴヌクレオ
チド２０〜４０ｎを含む溶液１０成まで）を、Ｎｅｎ５
ｏｒｂカートリツジに適用した。保持されなかった種を
除くために洗浄した後、その精製された８−ＭｏＰ−オ
リゴヌクレオチドを、水：メタノール溶液（６０％）に
より、約１ｄ／分の流速で溶離した。次に、その８−Ｍ
ｏＰ−オリゴヌクレオチドを凍結乾燥せしめ、そして少
量の蒸留水に溶解し、そしてその濃度をＵＶ分光分析法
により決定した。短い波長のＵＶＡ光（３２０〜３７０
ｎｍ）により、相補的配列を含むオリゴヌクレオチドの
存在下で８−１’ｌＯＰオリゴヌクレオチドを含む溶液
を照射することにより、架橋を形成するモノアダクトオ
リゴヌクレオチドの能力を確認した。元のオリゴヌクレ
オチドよりも一層ゆっくり移動する架橋されたオリゴヌ
クレオチドの収量を、オートラジオダラムの検査により
評価した。

劃」− ８−ＭｏＰ−オリゴヌクレオチドによるＥ、コリにおけ
る耐アンピシリンの抑制。

アンピシリン耐性Ｅ、コリを、例１に記載されるように
８−ＭｏＰにより、耐アンピシリン（ａｍｐ）遺伝子の
一部のアンチセンスオリゴマーをアダクトすることによ
って構成された８−？ｌ０Ｐ−オリゴヌクレオチドによ
り細菌を処理することによって、アンピシリンに対して
敏感にする。

Ａ、細菌及び培地ニブル−スクリプトプラスミドにより
形質転換された、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＥ−ユニ
株ＸＬ−１ブルーは、アンピシリン及びテトラサイクリ
ンに対して耐性である。細菌は、テトラサイクリンを含
み、そしてアンピシリンを含むか又は含まないＬＢ培地
中で増殖される。

Ｂ、８−ＭｏＰ−オリゴヌクレオチド：配列５′−ＣＴ
ＣＡＴＡＣＴＣ−３’は、耐ａｍｐ配列（塩基番号２８
２３〜２８３２　）の開始近くで及び全プラスミドにお
いてこの部位においてのみ生じる。相補的配列、５　’
　−ＧＡＧＴＡＴＧＡＧ−３’　、９−単位オリゴマ−
（又は“９−マーｆｌ）を、８−ＭｏＰと組合し、そし
て次に、例１に記載のようにして精製する。

Ｅ、コリプラスミドにその相補的配列を認識することに
よって、その９−マーは、架橋可能部位で８−Ｍ０Ｐモ
ノアダクトの“位置を定める°°　（又はハイブリダイ
ズする）。ＵＶＡ光（十分なスペクトル）による続く照
射によるこの部位での架橋は、“アンピシリナーゼ゛の
生成を阻害し、そして従って、８−ＭｏＰ−オリゴマー
により処理された細菌は標準培地中で生存するが、アン
ピシリン含有培地中では生存しない。この効果の特異性
を、テトラサイクリン耐性がこの手段により影響されな
いことを示すことによって例示する。

上記のようにして変性されたアンピシリン配列（２８２
３〜２８３２　）に対して相補的な９−マーを、細菌培
養物に添加し、そして続いてＵＶＡ光により照射する（
１〜２ジユール／　ｃｉ　）。対照は、未処理細菌及び
ＵＶＡのみ又は８−ＭｏＰ−オリゴマーのみのいづれか
により処理された細菌を含む。

Ｃ０手段： １、初期培養物ニブラスミドを含む定常期細菌５０ｍを
、アンピシリン（２５ｇ／ｄ）及び０〜１１０００ｎ／
ｌｌ１１（対照の場合、Ｏｎｇ／ｍの濃度）の濃度範囲
での８−ＭｏＰ−オリゴマーを含むＬＢ培地５ｄ中に接
種し、そして３７℃で定常期に増殖する。

２、　８−ＭｏＰ−オリゴマー効力の評価：集密的培養
物のアリコートを、抗生物質（含まない）、アンピシリ
ン、テトラサイクリン又はアンピシリン士テトラサイタ
リンのいづれかを含む培地に添加する（１０種のグルー
プ）。５種のアリコートを、ＵＶＡ光（２，５ミ’Ｊ　
”７７　）／ｃ１ａ（７）照射）ニヨ／’）１５分間処
理する（１〜２　Ｊ／ｃｓｆｉ）。個々のグループにお
ける他の５種のアリコートを、暗やみに保持する。その
培養物を、いづれの抗生物質も不在下で増殖されるグル
ープが定常期になるまで、３７°Ｃで連続的に振盪（２
２０ｒｐｍ）　Ｌながら増殖する。生存率を、アンピシ
リン及びテトラサイクリンを含む標準寒天プレート上に
培養物をプレートすることによって決定する０次に確立
されたコロニーを、７日以内で、及び１〜２日後できる
だけ早く計数する。

３、標的特異性の決定：初期培養物の他のアリコートを
、上記のようにして照射する。プラスミドＤＮＡを単離
し、そして制限酵素ＦｎｕＨ１及びＮ１ａｌＶにより消
化し、約５０個の塩基対を含む１つの標的配列を含む複
数のフラグメントを得る。消化生成物を変性し、そして
次に電気泳動する。

ａａ＋ｐ遺伝子の（ｚｚｐ）−ラベルされたフラグメン
ト（標的配列を含む）を、電気泳動により単離されたＤ
ＮＡのサザントランスファー分析においてプローブとし
て使用する。

Ｄ、結果 １、　８−ＭｏＰ−オリゴマー及びＵＶＡにより処理さ
れ、そしてアンピシリンの存在下で増殖された培養物は
、他のグループよりもより少ないコロニーを有する。

２、　ザザントランスファーからのフィルターのプロブ
は、処理された細菌から単離されたプラスミドの５０塩
基対のフラグメントが、未処理の細菌からのＤＮＡと比
較して、前者における８−ＭｏＰ−オリゴマーの架橋の
ために異なった速度で移動することを示す。

！１Ｌ３Ｌ＝ケラチン細胞サイトキン遺伝子発現の光不
活性化。

ＰＡＭ　２１２は、新生Ｂａ１ｂ／Ｃマウスの皮膚に由
来する自発的に形質転換されたネズミケラチン細胞系で
ある。この同種細胞系は、ＩＬ−１α及び顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）ヲ組織的に
産生ずる。この基準は次のものにより決定された：ネズ
ミマクロファージＩＬ−１α及びネズミＴ細胞ＧＭ　−
ＣＳＰのためのｃＤＮＡを用いてのノザンプロット分析
ｉ　２　）　ＧＭ−ＣＳＦのためのＨＴ−２細胞増殖及
びＩＬ−１のためのＤｌｏ、Ｇ４．１細胞間時刺激を用
いての生物学的活性インビトロアッセイ；及び３）組換
え体由来のネズミＩＬ−１α及び叶−ＣＳＦに生ぜしめ
られる抗体を有するＰＡＭ　１２２培養物からの精製さ
れたならし培地の特徴化。

ＰＡＭ　２１２細胞は、組織培養プラスチック中におい
て付着性単層として、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）に
より補足されたダルベコの最少必須培地（ＤＭＥＭ）に
おいて増殖される。その単層が集密的になる場合、細胞
は接触阻止により増殖を止める。ＰＡＭ　２１２細胞の
集密的単層は、週２度、培地を変えることにより、２力
月までの間、静止増殖期において活性のまま存続するこ
とができる。そのような培養物からのサイドキン生成は
、組織的に存続する。下記に概略される手段は、８−Ｍ
ｏＰ−変性アンチセンスオリゴマーを用いてのＧＭ　−
ＣＳＦ遺伝子の光不活性化によりＧＭ　−Ｃ３Ｆ遺伝子
発現を阻止することを企画する。ＧＭ　−ＣＳＦのため
のネズミ遺伝子は、ＲＮＡ合成においてＧＭ　−ＣＳＦ
のための主要開始部位を含む配列５　’　−ＣＣＣＡＧ
ＴＡＣＴＣ−３’を含む。相補的オリゴヌクレオチド鎖
におけるソラレン標的部位は、相補的ＡＴ配列である。

この方法の特異性のための対照は、この同じシステムに
おけるＩＬ−１遺伝子発現である。

Ａ、細胞の処理：　　ＰＡＭ　２１２細胞を、集密約培
養物が得られるまで、７５ｃｆｆｌの培養フラスコ中で
増殖する。集密的での１週間後、培地を３日ごとに変え
、８−ＭｏＰ−オリゴマー（例１に従って産生される）
を、組織培養培地（濃度範囲：　Ｏ””１１００ｎ／蔵
）に添加する。ＰＡＭ　２１２細胞の３０分間のインキ
ュベーションの後、その培養物をＵＶＡ光により処理す
る（１〜Ｊ／ｃｆｆｌ　）。培地をデカントし、そして
培養物をＰＢＳにより３回洗浄し、その後、１０％ＦＣ
３を含む新しいＤＭＥＭを再び添加する。上記操作のた
めの対照は、未処理細胞、並びに、ＵＶＡ光又は８−Ｍ
ｏＰ−オリゴマーのみのいづれかにより処理された細胞
を包含する。

Ｂ、ＲＮＡ単離：上記処理後、１　、２　、４　、８゜
１２　、１６　、２４　、３６　、４８及び７２時間で
、培地を細胞から収穫し、そして１ｒｎ１のアリコート
に凍結する。

細胞を集め、そして全細胞ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｉｖｉ
ｎ−な−炙、のグアニジンイソチオシネート方法により
単離する。全細胞ＲＮＡ又はポリＡ−選沢ＲＮＡ〔メツ
センジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）のために富化された）
のいづれかを、アガロースゲル上で電気泳動し、そして
そのゲルをナイロンフィルター膜（ｚｅｔａｂｉｎｄ）
上にプロットする。その膜を、ＧＭ　−ＣＳＦのために
（”　Ｐ　）−ｃＤＮＡによりハイブリダイズし、そし
て７０°Ｃでフィルムに暴露する。同じ実験を、ＩＬ１
αのために（”Ｐ）　−ｃＤＮＡにより行なう。デンシ
トメーター法を用いて、ｍＲＮＡの定量差異を評価する
。

Ｃ１ＧＭ−ＣＳＦ活性：培地を、ＨＴ−２細胞と共に４
８時間のインキュベーション、続く、（”Ｈ）−チミジ
ンと共に４時間のインキュベージ、コンにより、ＧＭ　
−ＣＳＦ活性についてアッセイする。ＤＮＡ中へのチミ
ジンの組込みを、シンチレーション分光測定により測定
する。ＨＴ−２刺激因子の同定を、ＧＭ　−ＣＳＦに対
する中和化抗体が、ＨＴ−２細胞に対するその効果を阻
止するために添加される類似する実験により確証する。

抗−ＧＭ　−Ｃ５Ｆ抗体と反応性であるタンパク質の分
析を、ＥＬＩＳＡにより達成する。最後に、培養された
細胞の凍結乾燥分解物を、同一の態様でＧＭ　−Ｃ３Ｆ
生物学的活性及びタンパク質について試験する。ＧＭ　
−ＳＣＦについて試験されるサンプルをまた、Ｄｌｏ、
Ｇ４．１クローン化Ｔヘルパー細胞及びコンカナバリン
Ａを用いてＩＬ−１について試験する。サンプルを、Ｃ
ｏｎＡの存在下でＤＩＯ細胞と混合し、そして７２時間
培養し、続いて再び４時間、〔３Ｈ〕−チミジンにより
パルスする。増殖を、シンチレーション分光測定により
測定する。

Ｄ、結果 ＧＭ　−〇ＳＦ遺伝子発現の効果的且つ特異的阻止は、
次の結果を生む： １．４時間後、叶−Ｃ３Ｆ　ｍＲＮＡは、ノザンプロッ
ト分析により検出できず又は著しく減じられるが、しか
しＩＬ−１αｍＲＮＡレベルは、変化しないように思え
る。他方、質的に（大きさ）異なるＧＭ　−Ｃ５ＦｍＲ
ＮＡは、変性されたＧＭ　−Ｃ３Ｆ遺伝子の異常且つ非
生産性転写の結果として蓄積する。

２、　　ＨＴ−２刺激活性は、処理されたＲＡＭ　２１
２細胞のならし培地又は細胞溶解物のいずれにも存在せ
ず；この不在は、研究の期間を通して持続する。

対照的に、ＣｏｎＡの存在下でＤＩＯ細胞の増殖を強化
するためのならし培地及び細胞溶解物の能力は、影響を
受けず；すなわち、ＩＬ−１活性は影響を受けない。

３、　　ｆ！ＬＩＳＡは、ＰＡ？１２１２細胞のならし
培地又は細胞溶解物のいづれにおいても免疫反応性ＧＭ
　−Ｃ５Ｆを示さず；対照的に、ＩＬ−１α免疫反応性
は影響を受けない、他方、切断された非機能的ＧＭ　−
ＣＳＦペプチドは、ならし培地及び細胞溶解物において
明白である。

五土：接触皮膚炎の治療のための光治療クリーム組成物
。

対象患者の接触皮膚炎を治療するために局所適用のため
の光治療クリーム組成物は、光活性薬物成分及びオリゴ
ヌクレオチド成分を有するキメラ分子である光治療化合
物０．０１〜１０重量部（キャリヤー１００重量部に基
づ＜）、及びそのための医薬キャリヤーを含んで成る。

好ましくは、前記キャリヤーは、ＵＶＡ光を吸収すべき
でない。

光活性治療化合物は、例１に記載のようにして合成され
、そして精製された、８−メトキシソラレン（８−ＭＯ
Ｐ）の光活性４’、５’−モノアダクト及びＣＤＩ遺伝
子のＤＮＡ“センス°゛又は“アンチセンス”鎖のセグ
メントに相補的なオリゴヌクレオチドである。８−　Ｍ
ＯＰが光反応されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは
、配列５　’　−ＴＴＣＣＴＡＴＡＡＧＴＴ−３′を有
する。このアンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるソ
ラレンは、それがＵＶＡ光に暴露される場合、標的遺伝
子配列におけるチミンと反応することができる。

キャリヤー製剤は、皮膚への適用のために適合され、そ
して皮膚細胞膜を通して光反応性治療化合物の輸送を促
進することができる。適切なキャリヤー製剤の例は、本
明細書の始めで記載された。

上記表に記載されるクリーム製剤における、治療的に有
効な量の光治療組成物、すなわち約０．５重量部のモノ
アダクトが、対象患者の皮膚に適用され、そして有効時
間（約３０分）の後、その皮膚はＵＶＡ光（１〜５Ｊ／
ｃｌｉ）により５〜３０分間照射される。ＣＤＩ遺伝子
のＤＮＡが、それにより機能を阻止され、そして患者は
、疾病、すなわち接触皮膚炎が治おる。

側Ｊノアンチセンス配列５　’　−ＧＡＧＴＡＴＧＡＧ
−３’のために′ハイブリッドヌクレオチド間連鎖を含
むオリゴヌクレオチドの調製。

異なったメチルホスフェート位置を有するハイブリッド
ヌクレオチド開基を含む３種のオリゴヌクレオチドを、
ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）で市販の試薬を用いて調製した。次に、これらのハイ
ブリッドを、相補的な５−塩基オリゴヌクレオチドと複
合体化し、４′アミノメチル−４゜５’　　８−）リメ
チルソラレン（ＡＭＴ）　、すなわちソラレン誘導体と
共にインキュベートし、そして次にＵＶＡにより照射し
た。次に、そのオリゴヌクレオチドを、例２に従って精
製した。下記第１表は、調製された３種のハイブリッド
オリゴヌクレオチド及びそれらのそれらのそれぞれのメ
チルホスフェート基の位置を示す。

個々のこれらのハイブリッド分子の特異的光変性の程度
を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定し
た。個々のこれらのハイブリッドアンチセンスオリゴヌ
クレオチドのための光化学的収量は、非置換性非変性対
照のオリゴヌクレオチドに観察される収量に類似した。

草−」−一表 メーじＬ−表 ９−マー（ａｌｔ−ｍｐ） 位置２での交互の開始 ９マー ９マー（ａｌｔ−ｍｐ） ９マー（ＴＡＴ−ｍｐ） ９マー（ＡＧ−ｍｐ） ０ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋　　　　　　＋＋＋＋ ＋＋＋＋　　　　　　　＋＋ 炎旦：ヒト皮膚に存在することが知られているタイプの
酵素によるハイブリッドオリゴヌクレオチドの試験。

オリゴヌクレオチド（９マー）、オルト−ホスフェート
（モノアダクト）オリゴヌクレオチド（９マー−ＭＡ）
及び例５で調製された３種のハイブリッドオリゴヌクレ
オチドを、既知の上皮タイプの酵素二Ｔ４ポリマラーゼ
（Ｔ４　Ｐｏ１）　、酸性ホスファターゼ（ＡＰ）及び
酸性ホスファターゼ／ホスフォジェステラーゼ（ＡＰ／
ＰＤＥ）に適切な緩衝溶液中において暴露した。種々の
オリゴヌクレオチドの感度を、下記第２表に示す。

（尺度：＋＋＋十最っとも耐性、０耐性が存在しない）
ｉｔ：アンピシリンへの通常の耐性細菌の感作。

例２に関して、アンピシリン耐性遺伝子β−ラクタマー
ゼを有するプラスミドを含むＥ、コリを、２種の濃度の
モノアダクトオリゴヌクレオチド（９マー−ＭＡ）によ
り処理した。オリゴマーを、標準の熱シ目ツク方法によ
り細胞中に導入した。

次に、その細胞を３７°Ｃで６０分間インキュベートし
、オリゴマー（９マー）をアニーリングし、そして次に
、氷上で３０分間Ｕ　Ｖ　Ａ　（２，３ｍＷ／ｃｆｆｌ
）により照射した。新しい培地を、ＵＶＡ処理後、その
細胞に添加し、そしてその細胞をさらに１時間インキュ
ベートした。細胞（処理されていない対照及びモノアダ
クト９マー〔９７一−ＭＡ）により処理された細胞〕を
、アンピシリンを含む寒天プレート及びアンピシリンを
含まない寒天プレート上にプレートした。３７°Ｃで一
晩インキユベートした後、コロニー計数を行なった。ア
ンピシリンを含まないプレートに比べてのアンピシリン
を含むプレート上でのコロニーの割合を用いて、Ｅ、コ
リのアンピシリン耐性の抑制の測定としてコロニー増殖
に対する９マー−ＭＡ及びＵＶＡの効果を計算した。

５６ｎｇの９マー−ＭＡにより処理された細菌は、２９
％の増殖阻止を示したが、しかし１１２ｎｇの９マー−
ＭＡにより処理された細菌は４２％の増殖阻止を示した
。アンピシリンを含まないが、しかしテトラサイクリン
を含むプレート上にプレートされた細胞は、アンピシリ
ン耐性を担当するβ−ラクタマーゼ酵素配列に向けられ
るアンチセンスオリゴヌクレオチドにより影響を受けな
かった。

■工：アンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理され
たプラスミド株５Ｌ−１ブルーに対するＳ１ヌクレアー
ゼ活性。

プラスミドをＥ、コリ（ＸＬ−１ブル一株）から得、そ
してアンチセンスオリゴヌクレオチド（９マー−ＭＡ）
を、ＤＮＡ合成機で既知の試薬を用いて合成した。その
プラスミドを、２ＭのＮａＯＨ−２１ＭのＥＤＴＡを用
いて変性し、そして次に、モノアダクトオリゴヌクレオ
チドと共に３７°Ｃで６０分間インキュベートした。こ
の溶液をＵ　Ｖ　Ａ　（３２０〜４００ｎｍ。

２．８ｍＷ／ｃ＋ｆｌ）に３０分間暴露した。次に、そ
のサンプルを２つの両分に分けた：１つはＮａ叶及びＥ
ＤＴＡにより変性された。次のそれぞれの画分を、Ｓ１
ヌクレアーゼ（３３ｎＭのＮａ０Ａｃ、　５０ｍＭのＮ
ａＣｊ！及び０．０３ｎＭのＺｎＳＯ４において４０単
位）と共に３７°Ｃで３０分間インキュベートし、そし
て次にすぐに、変性条件下で作用する２０％ポリアクリ
ルアミドゲルに適用した。

保護された領域の存在を、二本鎖オリゴヌクレオチドの
保護された領域に対応するバンドを示す変性ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により決定した。これは、バンド
が他の方法で８１ヌクレア−ゼに対する暴露を残存する
ことができなかったので、二本鎖形態の存在を確認した
。

開示される本発明の多くの変法が、当業者に浮かぶであ
ろう。しかしながら、これは、本発明の範囲を限定する
ものではない。

特許出願人 イエール　ユニバーシティ 特許出願代理人 弁理士　青　木　　　朗 弁理士　石　１）　　敬 弁理士山口昭之 弁理士　西　山　雅　也 第１頁の続き ＠Ｉｎｔ、Ｃ１，’ 識別記号 庁内整理番号 Ｃ０７Ｈ２１１０４ Ｇ　１２　Ｎ　　１５／１１ ＮＡ 手 続 補 正 書（方式） ５、補正の対象 （１）願書の「出願人の代表者」の欄 平成２年５月 ３０日 （２）委 任 状 特許庁長官 士 田 文 毅 殿 （３）明 細 ｔ １゜ 事件の表示 ６、補正の内容 平成２年特許願第１１９５８号 （１）（２）別紙の通 り ２゜ 発明の名称 （３）明細書の浄書（内容に変更なし）光活性オリゴヌ
クレオチドによる遺伝子発現の選択的阻害 ３゜ 補正をする者 ７゜ 添附書類の目録 事件との関係 特許出願人 （１）訂 正 願 圭 通 （２）委任状及び訳文 各 通 名称 イエール ユニバーシティ （３）浄書明細書 通 ４゜ 代 理 人 住所 〒１０５ 東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号 ５゜ 補正命令の日付

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生存細胞における標的ＤＮＡの機能を阻害するため
   の光活性治療組成物であって、２種の光活性官能基を有
   する化合物のＵＶＡ照射生成物、及び塩基配列が、（ａ
   ）少なくとも１つのＴＡ又はＡＴ配列を含み、そして（
   ｂ）インターロイキン−１、インターロイキン−３、イ
   ンターロイキン−６、サイモポエチン、インターフェロ
   ン、顆粒球／単球コロニー刺激因子、リンパ球機能関連
   抗原、細胞内付着分子及びＣＤｌａをコードする遺伝子
   から成る群から選択された遺伝子に存在する細胞ＤＮＡ
   のセグメントに実質的に相補的である、ＤＮＡのオリゴ
   ヌクレオチド（ここで、前記ＵＶＡ照射生成物が前記細
   胞の機能を阻害するために光活性条件下で前記細胞にお
   ける標的ＤＮＡと反応することができる）、並びに前記
   生成物１００重量部に対してキャリヤー０．０１〜２０
   重量部の割合での、前記ＵＶＡ照射生成物のための医薬
   的に許容できるキャリヤーを含んで成る組成物。 ２、２種の光活性官能基を有する前記化合物がソラレン
   化合物である請求項１記載の組成物。 ３、前記１２〜２０個の塩基の配列が、次の配列：（１
   ）ＴＴＴＡＧＧＣＡＡＣＧＧＧＧＴＣＴＣＴＡＴＧＣＣ
   ＣＡＡＣＡＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧ、 （２）ＣＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＴＡＴＴ
   ＧＣＴＧＣＡＣＡＣＧＴＣＡＧＣＣＧ、 （３）ＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＴＡＴＡ
   ＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＴＣ、及び （４）ＣＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＴＧ
   ＡＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＣ の１つ内に含まれる配列である請求項１記載の組成物。 ４、前記１２〜２０個の塩基の配列が、次の配列：（１
   ）ＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＣＴＴＡＴＴＣＡ
   ＣＣＴＴＣＣＣＣＴＡＡＴＴＣ、 （２）ＣＡＴＡＴＣＡＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＡＴＴ
   ＴＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡ、 （３）ＧＡＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＴＣ
   ＡＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＡＴＴＴ、 （４）ＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＡＴＧ
   ＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡ、 （５）ＡＡＡＴＧＡＣＣＧＡＡＴＧＧＴＧＣＧＴＡＴＡ
   ＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧ、 （６）ＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＴＡＴＣ
   ＴＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＣＴ、 （７）ＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴＧ
   ＧＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＣ、 （８）ＴＧＣＡＧＡＡＡＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＴＡＴＴ
   ＣＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴＧ、 （９）ＡＡＧＡＡＧＴＡＡＸＸＸＡＧＧＣＡＣＴＡＴＣ
   ＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡ、 （１０）ＡＡＣＴＧＣＡＡＴＴＣＡＴＣＧＧＣＧＴＡＴ
   ＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＣＴＣＡＡＡＴ、 （１１）ＡＣＣＴＧＴＡＴＣＴＣＡＡＡＡＧＧＡＴＡＴ
   ＴＣＡＡＡＣＴＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＧ、 （１２）ＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＴＡＴ
   ＣＴＣＡＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡ、 （１３）ＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴ
   ＧＧＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＣ、及び （１４）ＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＴＧＴＴＡＴ
   ＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴ の１つ内に含まれる配列である請求項１記載の組成物。 ５、前記１２〜２０個の塩基の配列が、次の配列：（１
   ）ＧＧＣＧＡＣＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＴＧＴＡ
   ＧＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣ、 （２）ＴＴＴＧＡＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＴＡＴＣ
   ＴＧＡＧＣＴＣＡＡＡＧＣＧＴＡＧＴ、 （３）ＧＡＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＡＴＴ
   ＡＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＣＴＧＣＡ、 （４）ＡＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＡＡＴＡＴＴＡＴＣ
   ＡＴＣＧＴＣＴＴＴＡＴＴＡＧＴＡＧ、 （５）ＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＴＣＴＧＴＡＴＴ
   ＧＣＴＧＡＴＧＴＣＡＴＡＡＧＧＧＣ、及び （６）ＴＧＧＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＴＣ
   ＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴ の１つ内に含まれる配列である請求項１記載の組成物。 ６、前記１２〜２０個の塩基の配列が、次の配列：（１
   ）ＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＴＡＴＡＡＧ
   ＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡ、 （２）ＣＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＴＡＴＡ
   ＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＡＣＣＣＡ、 （３）ＡＴＡＣＣＣＴＣＴＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＡＴＡ
   ＡＴＣＡＡＴＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＣ、 （４）ＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴ
   ＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧ、 （５）ＣＣＧＴＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＣＧＡＡＴＡＴＣ
   ＴＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣ、 （６）ＡＣＣＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＣＡＧＴＡＴＧ
   ＴＣＴＧＧＴＡＧＴＡＧＣＴＧＧＣＴ、 （７）ＣＴＡＧＧＧＣＴＧＡＡＴＡＧＧＡＧＣＴＡＴＧ
   ＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＧＧＧＣ、及び （８）ＣＧＴＧＧＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＴＡＴＴ
   ＴＣＴＣＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＡＧ の１つ内に含まれる配列である請求項１記載の組成物。 ７、前記１２〜２０個の塩基の配列が、次の配列：（１
   ）ＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＡＡＧＴＴＧＴＡＴＴＴＣ
   ＡＣＡＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧ、 （２）ＣＴＧＡＴＣＡＴＴＧＧＣＴＣＧＡＡＴＴＡＴＡ
   ＣＴＴＴＧＡＴＴＧＡＧＧＧＧＧＴＣ、 （３）ＡＣＣＴＧＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＴＡＴＣ
   ＴＣＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧ、及び （４）ＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＡＴＣ
   ＴＧＡＡＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡ の１つ内に含まれる配列である請求項１記載の組成物。 ８、次の配列： （１）ＹＴＴＡＧＧＣＡＡＣＧＧＧＧＴＣＴＣＴＡＴＧ
   ＣＣＣＡＡＣＡＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧ、 （２）ＣＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＴＡＴＴ
   ＧＣＴＧＣＡＣＡＣＧＴＣＡＧＣＣＧ、 （３）ＣＣＧＧＧＴＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＴＡＴＡ
   ＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＴＣ、及び （４）ＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＣＡＴＴＡＴＧ
   ＡＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＡＣＣＡＣ の１つ内に含まれる配列を有する１２〜２０個の塩基の
   ＡＴ又はＴＡ−含有オリゴヌクレオチド。 ９、次の配列： （１）ＴＧＴＣＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＣＴＴＡＴＴ
   ＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＴＡＡＴＣＴ、 （２）ＣＡＴＡＴＣＡＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＡＴＴ
   ＴＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＡ、 （３）ＧＡＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＴＣ
   ＡＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＡＴＴＴ、 （４）ＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＴＡＴＧ
   ＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＡ、 （５）ＡＡＡＴＧＡＣＣＧＡＡＴＧＧＴＧＣＧＴＡＴＡ
   ＣＧＧＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧ、 （６）ＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＴＡＴＣ
   ＴＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＣＴ、 （７）ＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴＧ
   ＧＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＣ、 （８）ＴＧＣＡＧＡＡＡＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＴＡＴＴ
   ＣＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴＧ。 （９）ＡＡＧＡＡＧＴＡＡＸＸＸＡＧＧＣＡＣＴＡＴＣ
   ＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡ、 （１０）ＡＡＣＴＧＣＡＡＴＴＣＡＴＣＧＧＣＧＴＡＴ
   ＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＣＣＴＣＡＡＡＴ、 （１１）ＡＣＣＴＧＴＡＴＣＴＣＡＡＡＡＧＧＡＴＡＴ
   ＴＣＡＡＡＣＴＧＣＡＡＴＴＣＡＴＧＧ、 （１２）ＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＧＴＡＴ
   ＣＴＣＡＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡ、 （１３）ＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴ
   ＧＧＣＡＡＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＣ、及び （１４）ＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＴＧＴＴＡＴ
   ＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴ の１つ内に含まれる配列を有する１２〜２０個の塩基の
   ＡＴ又はＴＡ−含有オリゴヌクレオチド。 １０、次の配列： （１）ＧＧＣＧＡＣＧＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＴＧ
   ＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＣ、 （２）ＴＴＴＧＡＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＴＡＴＣ
   ＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＣＧＴＡＧＴ、 （３）ＧＡＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＡＴＴ
   ＡＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＣＴＧＣＡ、 （４）ＡＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＡＡＴＡＴＴＡＴＣ
   ＡＴＣＧＴＣＴＴＴＡＴＴＡＧＴＡＧ、 （５）ＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＴＣＴＧＴＡＴＴ
   ＧＣＴＧＡＴＧＴＣＡＴＡＡＧＧＧＣ、及び （６）ＴＧＧＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＴＣ
   ＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴ の１つ内に含まれる配列を有する１２〜２０個の塩基の
   ＡＴ又はＴＡ−含有オリゴヌクレオチド。 １１、次の配列： （１）ＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＴＡＴＡ
   ＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡ、 （２）ＣＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＴＡＴＡ
   ＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＡＣＣＣＡ、 （３）ＡＴＡＣＣＣＴＣＴＧＴＧＣＣＣＣＴＧＴＡＴＡ
   ＡＴＣＡＡＴＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＣ、 （４）ＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴ
   ＴＣＡＡＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＧＴＧ、 （５）ＣＣＧＴＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＣＧＡＡＴＡＴＣ
   ＴＴＣＡＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣ、 （６）ＡＣＣＧＧＡＧＴＴＧＧＧＧＧＧＣＡＧＴＡＴＧ
   ＴＣＴＧＧＴＡＧＴＡＧＣＴＧＧＣＴ、 （７）ＣＴＡＧＧＧＣＴＧＡＡＴＡＧＧＡＧＣＴＡＴＧ
   ＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＧＧＧＣ、及び （８）ＣＧＴＧＧＧＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＴＡＴＴ
   ＴＣＴＣＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＡＧ の１つ内に含まれる配列を有する１２〜２０個の塩基の
   ＡＴ又はＴＡ−含有オリゴヌクレオチド。 １２、次の配列： （１）ＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＡＡＧＴＴＧＴＡＴＴ
   ＴＣＡＣＡＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧ、 （２）ＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＧＡＡＴＴＡＴＡ
   ＣＴＴＴＧＡＴＴＧＡＧＧＧＧＧＴＣ、 （３）ＡＣＣＴＧＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＴＡＴＣ
   ＴＣＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＧ、及び （４）ＣＴＡＣＧＣＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＴＡＴＣ
   ＴＧＡＡＡＧＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡ の１つ内に含まれる配列を有する１２〜２０個の塩基の
   ＡＴ又はＴＡ−含有オリゴヌクレオチド。