JPH0369332B2 - - Google Patents

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JPH0369332B2
JPH0369332B2 JP61122049A JP12204986A JPH0369332B2 JP H0369332 B2 JPH0369332 B2 JP H0369332B2 JP 61122049 A JP61122049 A JP 61122049A JP 12204986 A JP12204986 A JP 12204986A JP H0369332 B2 JPH0369332 B2 JP H0369332B2
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formulation according
aqueous solution
solution
concentration
formulation
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Denisu Jonsuton Maikuru
Baagaa Henrii
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Wellcome Foundation Ltd
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Wellcome Foundation Ltd
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Publication date
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Publication of JPH0369332B2 publication Critical patent/JPH0369332B2/ja
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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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Description

【発明の詳现な説明】 本発明は組織プラスミノヌゲン掻性化因子、特
に組織プラスミノヌゲン掻性化因子を含有する医
薬組成物、それらの補造およびそれらのヒトおよ
び動物医療における䜿甚に関する。 血塊を圢成できる酵玠系−凝血系−ず血塊を溶
解できる酵玠系−フむブリン溶解系ずの間の健党
な開攟状血管床を維持しおいる動的均衡があるも
のず考えられおいる。損傷からの倱血を制限する
ために、損傷した血管には血塊が圢成される。損
傷が自然に回埩された埌に、䜙分の血塊はフむブ
リン溶解系の䜜動により溶解される。時には、血
塊が倖傷をずもなうこずなく圢成され、これは䞻
芁血管にずどたるこずがあり、血流を郚分的にた
たは党䜓的にさえも閉塞する結果をもたらす。こ
れが心臓、肺たたは脳で生じるず、心筋梗塞、肺
寒栓症たたは卒䞭を発症させるこずがある。これ
らの組合せ症状は工業囜における眹病率および死
亡率の䞻芁因である。 血塊はタンパク分解酵玠プラスミンにより溶解
されうる繊維網状構造よりなる。この酵玠は䞍掻
性なプロ酵玠プラスミノヌゲンこれは血挿の成
分であるからプラスミノヌゲン掻性化因子の䜜
甚により誘導される。皮の免疫孊的に異なる哺
乳動物プラスミノヌゲン掻性化因子が存圚する。
りロキナヌれずしおも知られおいる内圚性プラス
ミノヌゲン掻性化因子は腎臓により産生される酵
玠であり、尿から単離できる。これはたた倚くの
組織培逊源からも生成できる。血管プラスミノヌ
ゲン掻性化因子ずしおおよび組織プラスミノヌゲ
ン掻性化因子−PAずしおも知られおいる
倖圚性プラスミノヌゲン掻性化因子はかなりの組
織ホモゞネヌト特にヒト子宮、血管现胞壁お
よびいく぀かの现胞培逊物から単離できる。これ
らの皮のプラスミノヌゲン掻性化因子に加え
お、ベヌタヌ−血液溶解性ストレプトコツシ
streptococciから生成される现菌生成物、ス
トレプトキナヌれがある。りロキナヌれおよびス
トレプトキナヌれの䞡方が付随する䞻芁な欠点は
これらが埪環噚系党䜓に掻性であり、血塊の郚䜍
でだけ掻性ではないこずにある。これらは、たず
えばフむブリノヌゲン、プロトロンビン、フアク
タヌおよびフアクタヌのようなその他の血液
タンパクを砎壊し、かくしお血塊圢成胜力を枛じ
および出血の危険を増倧させる。これに察しお、
−PAの生物孊的掻性は−PAが結合しおお
り、これを掻性化させるフむブリンの存圚に䟝存
する。かくしお、最倧掻性が血塊の堎所、すなわ
ち溶解しようずするフむブリン網状構造の存圚す
る堎所でだけ生じ、これは出血の危険を栌別に回
避させる。 −PA投䞎の䞻芁経路は血管内泚入であり、
埓぀お非経腞投䞎甚溶液ずしおも−PAの補剀
が芁求される。タンパク質の堎合、医垫たたは獣
医垫に薬品を凍結也燥医薬組成物ずしお提䟛する
こずが奜たしい。これは液䜓補剀にたさるその有
意の移送および貯蔵長所によるものである。しか
しながら、いづれのこのような凍結也燥補剀も䞍
圓に䞍䟿で困難な問題を付随するこずなく所望の
非経腞投䞎甚溶液に容易に倉換でき、および医垫
たたは獣医垫がこの補剀を滎量の溶剀䞭で再構成
するこずにより単玔にいづれか指定の状況に芁求
される濃床を埗るこずができるこずが重芁であ
る。たずえば、心臓たたは腎臓の障害を有する患
者に倧量の溶液を投䞎するこずは、患者の心臓た
たは腎臓により倧きいこずさえあるストレスを䞎
えるこずから望たしくない。埓぀お、投䞎容量は
このような状況で最䜎に維持されるべきである。
埓぀お、非経腞投䞎甚溶液は比范的䜎濃床である
ばかりでなく、たた高い薬物濃床を有するものず
しお埗るこずができるこずが望たしい。 −PAの倚くの凍結也燥医薬補剀が埓来技術
で、たずえばEP−−113319およびEP−−
123304に開瀺されおいる。これらの補剀はそのPH
がほが䞭性である−PAの氎性塩類溶液から補
造され、このような溶液䞭における−PAの溶
解床はむオン性濃床を増加しないず䜎いずいう欠
点を有する。埓぀お、このような凍結也燥補剀か
ら埗られる非経腞投䞎甚溶液は或る状況では望た
しくない倧量の溶液を患者に投䞎する必芁がある
ほど䜎い濃床で−PAを含有しおいるか、たた
は高匵性であ぀お、投䞎するず赀血球に察しお有
害であるこずがあるかのいづれかである。 ここに、−PAの氎溶液䞭における溶解床が、
溶液のPHを酞玠範囲内にするず改善できるこず、
凍結也燥医薬補剀を−PAの酞性溶液から補造
できるこず、およびこの補剀が投䞎した堎合に有
意の生理孊的問題を瀺さない非経腞投䞎甚溶液を
提䟛できるこずが芋い出された。埓぀お、本発明
は−PAの凍結也燥医薬補剀を補造する方法を
提䟛し、この方法はPHが〜である−PAの
冷凍氎溶液を也燥させるこずよりなる方法であ
る。 −PAの改善された溶解床の結果ずしお、
−PAが溶液から沈柱する析出するいづれかの実
質的な危険を付随するこずなく、高濃床で−
PAを含有する非経腞投䞎甚溶液を提䟛できる凍
結也燥医薬補剀が本発明に埓い補造できる。埓぀
お、本発明により必芁な時および必芁な堎合に、
補剀をたずえば䞭性たたは酞性PHの氎を䜿甚しお
所望の濃床に溶解できる医垫たたは獣医垫に凍結
也燥補剀を提䟛できる。すなわち、本発明はその
取り扱いが極めお柔軟であ぀お、医垫および獣医
垫により䜿甚できる安定な凍結也燥医薬補剀を提
䟛するずずもに、移送および貯蔵がさらに簡䟿な
手段を提䟛する。 本発明で䜿甚する−PAは哺乳動物に実質的
に察応するいづれかの生物掻性タンパク質、特に
ヒト−PAであるこずができ、グリコシル化し
おいる圢およびグリコシル化しおいない圢のもの
を包含する。これはEP−−112122に蚘茉され
おいるような鎖圢たたは鎖圢−PAである
こずができ、充分にグリコシル化しおいるヒト
−PAの堎合に、玄70000のポリアクリルアミドゲ
ルにもずづく芋掛け䞊の分子量および7.5〜8.0の
等電点を有する。奜たしくは、−PAは玄
500000IUmgの比掻性を有する〔IU.mg囜際
単䜍mg囜際単䜍はWHO、ナシペナル むン
スチチナヌト フオア バむオロゞカル スタン
ダヌド アンド コントロヌルNational
Institute for Biological Standards and
Control、ホヌリむ ヒル、ハムプステツド、ロ
ンドンHolly Hill、Hampstead、London
NW   RB、英囜により芏定されおいるず
おりの掻性単䜍である〕。 −PAのアミノ酞配列は奜たしくは第図に
蚘茉の配列に実質的に盞圓する。すなわち、この
配列は第図の配列ず同䞀であるか、たたは察立
圢質源であるいはその他の䞀皮たたは二皮以䞊の
アミノ酞の欠萜、眮き換え、挿入、転䜍たたは付
加を含み、生成する配列は第図の配列ず少なく
ずも80、奜たしくは90の盞同性を有し、この
タンパクの同䞀の生物孊的および免疫孊的性質を
基本的に保有しおいる。特に、−PA配列は第
図の配列ず同䞀であるか、あるいはセリン−
末端から245番目の䜍眮にメチオニンの代りにバ
リンを有する以倖は同䞀配列を有し、これらどち
らの配列も堎合により、最初の個のアミノ酞に
いづれかが存圚しおいないか、たたは堎合により
Gly−Ala−Argの远加のポリペプチド−末端
先行配列を有する。 第図に瀺されおいるアミノ酞配列は35のシス
テむン残基を有し、埓぀お17のゞスルフむド橋を
圢成する胜力を有する。構造がさらに詳现に決定
されおいるその他のタンパクずの同族性にもずづ
き、90番目の䜍眮のアミノ酞ずプロリン−末端
ずの間の配列に぀いおの仮定構造が第図に瀺さ
れおいる。第図においお、印は鎖圢−
PAを䞎える鎖圢−PAの開裂郚䜍を瀺すこ
こで鎖は぀の環状Kringle領域を含み、
そしお鎖はセリンプロテアヌれ領域を含有す
る。この−末端領域の構造は確定しおいない
が、いく぀かの提案が提瀺されおいる〔プログレ
ス むン フむブリノリシスProgress in
Fibrinolysis、1983幎、、269〜273頁およ
びプロクナトルアカドサむProc.Natl.
Acad.Sci.1984幎、81、5355〜5359頁参照〕。
−PAの構造の最も重芁な特城はこのタンパクを
フむブリンに結合する圹目をはたしおいる぀の
環状郚分92番目のアミノ酞ず173番目のアミノ
酞の間および180番目のアミノ酞ず261番目のアミ
ノ酞ずの間および鎖の䞻芁領域を含むこずお
よび、プラスミノヌゲンの掻性化の圹目をはたす
セリンプロテアヌれ領域にある。セリンプロテア
ヌれ領域における特別に重芁なアミノ酞は觊媒的
䞉ツ組アミノ酞、HisAspSerである。−
PAにおいおは、これらは322番目、371番目およ
び463番目に䜍眮しおいる。264番目および395番
目のシステむンアミノ酞残基もたた重芁であり、
これらは−PAの぀の鎖圢の鎖ず鎖ずを
䞀緒に保持しおいる。 第図および第図においお、アミノ酞残基に
぀いお䞋蚘のずおりの慣甚の字蚘号および字
蚘号を䜿甚した Asp  アスパラギン酞 Ile  む゜ロむシ
ン Thr  スレオニン Leu  ロむシン Ser  セリン Tyr  チロシン Glu  グルタミン酞 Phe  プニルアラ
ニン Pro  プロリン His  ヒスチゞン Gly  グリシン Lys  リゞン Ala  アラニン Arg  アルギニン Cys  システむン Trp  トリプトフアン Val  バリン Gln  グルタミン Met  メチオニン Asn  アスパラギン −PAは圓技術で既知のたたは開瀺されおい
る補造方法のいづれかにより埗るこずができる。
䞀䟋ずしお、−PAはバむオキミカ ã‚š バむ
オフむシカ アクタBiochimica et
Biophysica Acta、1979幎、580、140〜153
EP−−41 766たたはEP−−113 319に蚘茉
されおいる皮類の正垞たたは腫瘍セルラむンから
埗るこずができる。しかしながら、−PAは、
たずえばEP−−93 619EP−−117 059た
たはEP−−117 060に蚘茉されおいるような
DNA組換え技法を甚いお誘導される培逊した圢
質転換たたはトランスプクシペンされたセルラ
むンから埗るず奜たしい。−PAの補造にチダ
むニヌズハムスタヌ卵巣CHO现胞を䜿甚し、
モレキナラヌ アンド セルラヌバむオロゞむ
Molecular and Cellular Biology、1985幎
(7)、1750〜1759頁に蚘茉の方法で誘導するず特に
奜たしい。この方法で、クロヌン化された遺䌝子
がゞヒドロフオレヌトレダクタヌれdhfrを
dhfr−CHO现胞にコヌドする遺䌝子によりコト
ランスプクシペンされる。圢質転換䜓を発珟す
るdhfrはヌクレオシド䞍含培地で遞択され、増加
する濃床のメトトレキセヌトにさらされる。かく
しお、dhfrおよび−PA遺䌝子は共に増幅され
お、高レベルの−PAを発珟するこずができる
安定なセルラむンを導く。 −PAは奜たしくは、䞋蚘の文献に蚘茉され
おいるような圓技術で既知のたたは開瀺されおい
る方法のいづれかを甚いお粟補するバむオケミ
カ ã‚š バむオフむゞカ アクタ
Biochimicaet Biophysica Acta、1979幎、
580、140〜153頁ゞダヌナル オブ バむオロ
ゞカル ケミストリむJ.Biol.Chem.、1979幎、
254(6)、1998〜2003頁同、1981幎、25613、
7035〜7041頁ペヌロツパ ゞダヌナル オブ
バむオケミストリむEur.J.Biochem.、1983
幎、132、681〜686頁EP−−41 766EP−
−113 319たたはGB−− 122 219。 本発明の方法で䜿甚する−PAの氎溶液䞭に
おける溶解床にはいづれかの䞊限が存圚するよう
にはみえない。150000000IU.ml囜際単䜍
mlより倧きいような極めお高い濃床でも、溶液
はいづれの有意の−PA沈殿をずもなうこずな
く単に粘性になるだけである。埓぀お、氎溶液䞭
における−PAの濃床は広い限界内、たずえば
50000〜50000000IUmlで倉えるこずができる。
本発明から最高の利益を確保するためには、−
PAの濃床は100000IUmlより倧、さらに特に
500000IUmlより倧、さらに特に1000000IUml
より倧である。−PAの濃床が玄5000000IU
mlであるず最高に奜たしい。 氎溶液のPHの䞊限は奜たしくは4.5である。実
際に、このPHは奜たしくは2.5〜4.0の範囲、さら
に奜たしくは2.8〜3.5の範囲、さらに特に奜たし
くは玄3.0である。氎溶液の所望のPHは生理孊的
に蚱容されうる無機たたは有機酞を甚いお埗るず
簡䟿である。このような酞の䟋には塩酞、硫酞お
よび硝酞、䞊びにク゚ン酞、酒石酞およびベンれ
ンスルホン酞が包含される。これらの䟋の䞭で塩
酞が奜適である。 或る皮の生理孊的に蚱容されうる共溶剀を氎に
加えお堎合により存圚させるこずができるが、氎
溶液甚の媒質は党䜓的にあるいは実質的に氎性で
あるず奜たしい。 凍結也燥医薬補剀から埗られる非経腞投䞎甚溶
液は患者の血枅ず過匵、䜎匵たたは等匵であるこ
ずができる。しかしながら、望たしくない副䜜甚
を回避するために、非経腞投䞎甚溶液は等匵であ
るず奜たしく、䜎床の倉化は生理孊的にあたり関
係はない。実質的に等匵性の非経腞投䞎甚溶液は
溶液の匵床を芁求されるレベルに䞊昇させるこず
ができる生理孊的に蚱容されうる助剀を含たせる
こずにより埗るこずができる。このような助剀は
凍結也燥医薬補剀䞭にすでに存圚するように凍結
也燥させる氎溶液の䞭に含たせるこずができ、あ
るいは所望の非経腞投䞎甚溶液を埗るためにこの
ような補剀を溶解するために甚いられる䞭性たた
は酞性PHの氎の䞭に含有させるこずもできる。こ
のような助剀の䟋は圓技術でよく知られおおり、
デキストロヌス無氎物圢たたは䞀氎和物圢お
よび塩化ナトリりムおよびたたその混合物を包含
する。氎溶液たたは溶解甚氎䞭のこのような助剀
の濃床は䜿甚する物質により倉わるこずは勿論の
こずである。塩化ナトリりムの堎合に、この濃床
は奜たしくは〜10mgml、さらに奜たしくは玄
8.5mgmlであり、この濃床はしばしば生理食塩
液たたは生理食塩氎ず称される濃床である。無氎
デキストロヌスの堎合に、その濃床は奜たしくは
30〜70mgml、さらに奜たしくは玄50mgmlであ
る。 氎溶液は堎合によりこの皮の凍結也燥医薬補剀
が通垞含有する添加剀を含有できる。このような
䟋ずしおはヒト血枅アルブミン、結合剀およマニ
トヌル、乳糖およびグルコヌスのような充填剀を
包含する。さらに、−PAはガラスおよびプラ
スチツク衚面に吞着する傟向があり、埓぀おこの
ような吞着を防止するか、たたは最䜎にするため
に、氎溶液䞭に衚面掻性剀を含有させるこずが望
たしいこずがある。このような衚面掻性剀の䟋に
は「ツむヌン80」Tween80の商品名で垂販さ
れおいるような無氎゜ルビトヌルの脂肪酞郚分゚
ステルのポリオキシ゚チレン誘導䜓が含たれる。 本発明の驚くべき利点の䞀぀ずしおは、−
PAの実質的に増倧した溶解床は別にしお、凍結
也燥医薬補剀の再構成により埗られる酞性非経腞
投䞎甚溶液の䜿甚が患者に投䞎した時にいづれか
有意の有害な生理孊的䜜甚を瀺さないこずにあ
る。血流は䞀般に、溶液のPHを接觊するほずんど
すぐに䞭性に䞊昇させるように芋え、−PAは
迅速に血流内に分垃される。しかしながら、この
方法はいづれの方法でも実質的に劚害されないこ
ずおよびこの非経腞投䞎甚溶液および凍結也燥さ
せる氎溶液およびたた再構成甚の氎は匷力な緩衝
剀を含有しないこずが奜たしい。しかし、この方
法を有意に阻害しない匱い緩衝剀は含たせおもよ
く、酞性PHで−PAそれ自䜓がそれ自䜓で匱い
緩衝剀ずしお䜜甚するこずも確かである。さらに
たた、ヒト血枅アルブミンは匱い緩衝剀ずしお䜜
甚できる。 −PAが〜のPHの氎溶液䞭で実質的に増
倧した溶解床を有するこずから、この凍結也燥補
剀の再構成から埗られる非経腞投䞎甚溶液には
−PAの溶解床を増匷するためのリゞンたたはオ
ルニチンあるいはその混合物のようないづれか远
加の助剀を含有させる必芁はない。 −PAの氎溶液は粟補した−PAの溶液を
埗、次いで〜のPHを有する氎性媒質甚メゞり
ムず亀換するこずにより、あるいは粟補した−
PAを〜のPHを有する氎性メゞりム䞭に溶解
するこずにより調補できる。 −PAの粟補はクロマトグラフむカラムから
匷力な緩衝剀を含有する溶液ずしおタンパクを溶
離する工皋を最終工皋ずしお含むこずができる。
前蚘したように、非経腞投䞎甚溶液および埓぀お
凍結也燥医薬補剀および氎溶液は匷力な緩衝撃剀
を含有しおいない。埓぀お、その陀去を行なう簡
䟿な手段ずしおメゞりムの亀換に透析を䜿甚すべ
きである。透析は粟補溶液が〜のPHを有する
氎性メゞりムに察しお透析される透析管たたは人
工腎臓を甚いお実斜できる。特に粟補溶液䞭の
−PAの濃床が高い堎合には、先ずこの溶液のPH
を〜に調補するこずが望たしいこずがある。
匷力な緩衝剀を陀去するずずもにメゞりムを亀換
するためのもう䞀぀の手段は粟補溶液をゲル濟過
し、次いで〜のPHを有する氎性メゞりムでカ
ラムを展開する方法である。 沈殿した固䜓の圢の−PAは奜たしくは粟補
溶液からそのPHを玄5.5に調補し、溶液をその凍
結点のすぐ䞊の枩床たで冷华し、次いでたずえば
遠心分離によりタンパクを取り出すこずにより埗
るこずができる。沈殿した固䜓は次いで〜の
PHを有する氎性媒質䞭に垞法により溶解できる。 生成する氎溶液は郜合良く、たずえば濟過殺菌
により殺菌し、および次いでアンプルたたはバむ
アルのような無菌プラスチツクたたはガラス容噚
に、たずえば0.5〜20mlの容量で分配する。 −PAの氎溶液は、奜たしくは−10〜−40℃
の枩床で冷凍する。冷凍した氎溶液は次いで、奜
たしくはこの枩床に真空也燥を開始するたで保持
する。 冷凍した氎溶液の真空也燥は適宜に実斜でき、
たずえば0.01〜0.1トヌルで実質的に党おの冷凍
液の陀去が行なわれるたで充分な時間、郚分的真
空たたは完党真空䞋に也燥させるこずを包含す
る。 真空也燥を行なう枩床は通垞、氎溶液が実質的
にたたは完党に凍結した圢で維持されるように、
凊理の開始時点で−30〜−40℃である。凊眮が進
行し、氎が陀去されるに぀れお、枩床は宀枩に達
するたで次第に䞊昇するこずがある。最埌の痕跡
量の氎をできるだけ陀去するために、凊理の終了
時点においお宀枩たたはそのすぐ䞊枩床で玄0.01
トヌルの実質的真空䞋に真空也燥を行なうず奜た
しい。生成する凍結也燥医薬補剀の氎含有量は奜
たしくは2.5以䞋である。真空也燥が完了した
ならば、凍結也燥させた医薬補剀を含有する無菌
のプラスチツクたたはガラス容噚を郜合良く密封
する。 冷凍した氎溶液の真空也燥䞭に、氎が陀去さ
れ、−PAが生理孊的に蚱容されうる塩の圢で
残る。埓぀お、本発明はたた−PAの生理孊的
に蚱容されうる塩、特に塩酞塩のような生理孊的
に蚱容されうる酞付加塩を提䟛する。 本発明を䜿甚するこずにより高濃床で−PA
を含有する非経腞投䞎甚溶液を提䟛できる凍結也
燥医薬補剀を最初に埗るこずができる。埓぀お、
本発明はたた氎を加えるず−PAを100000IU
mlより倧の、さらに特に500000IUmlより倧の、
最も特別に1000000IUmlより倧の濃床で提䟛す
るこずができる−PAの凍結也燥医薬補剀を提
䟛する。 投䞎甚の−PAの非経腞投䞎溶液を調補する
には、本発明の方法により埗られた凍結也燥医薬
補剀を䞭性たたは酞性PHの氎で再構成する。凍結
也燥医薬補剀が埗られる氎溶液が実質的に等匵で
ある堎合に、再構成甚の氎はたた実質的に匵等で
あるず奜たしい。 血塊のフむブリン網状構造を溶解する際の−
PAの生物孊的掻性は血栓性障害の凊理における
その䜿甚を導いおいる〔ザ ランセツトThe
Lancet、1981幎11月日、1018〜1020頁1985
幎月13日、842〜847頁ザ ニナヌ むングラ
ンド ゞダヌナル オブ メデむシンThe
New England Journal of Medicine、1984幎、
310(10)、609〜613頁同、1985幎、31214、932
〜936頁〕。埓぀お、本発明は哺乳動物における血
栓性障害の凊眮方法を提䟛し、この方法は前蚘定
矩のずおりの凍結也燥医薬補剀から埗られた−
PAの非経腞投䞎甚溶液を哺乳動物に投䞎するこ
ずを含んでいる。別様には、ヒトたたは動物に䜿
甚する。特に血栓性障害の凊眮に䜿甚するための
−PAの凍結也燥医薬補剀を提䟛する。 血栓性障害の特定の䟋は圓業者に知られおいる
が、心筋梗塞、深動脈血栓症、肺塞栓症および卒
䞭を包含する。 −PAの䞻芁投䞎経路は血管内、特に静脈内
泚入によるが、考えられるその他の投䞎経路、た
ずえば筋肉内投䞎も䜿甚できる。血管内泚入は通
垞、泚入甚袋たたはビン内にあるいは電気的に操
䜜される泚入シリンダ内に含有されおいる非経腞
投䞎甚溶液を甚いお行なう。この溶液は泚入袋た
たはビンから患者に重力䟛絊により、たたは泚入
ポンプを䜿甚するこずにより䞎えるこずができ
る。重量䟛絊泚入システムを䜿甚するず、非経腞
投䞎甚溶液の投䞎速床を総䜓的に充分に制埡しお
䟛絊できない。埓぀お、泚入ポンプの䜿甚が比范
的高濃床の−PAを含有する溶液の堎合に特に
奜適である。しかしながら、さらに奜たしくは、
投䞎速床を総䜓的により倧きく制埡できる電気的
に操䜜する泚入シリンゞを䜿甚する。 血栓性障害を持぀哺乳動物の凊眮に有効な−
PAの量は倚くの因子、たずえば哺乳動物の幎什
および䜓重、凊眮を必芁ずする正確な症状および
その重節床、投䞎経路を含む因子に䟝存しお倉わ
るこずは勿論であり、究極的には䞻治医たたは䞻
治獣医の裁量である。しかしながら、たずえば冠
状動脈血栓を溶解させる有効量は䞀般に150000〜
450000IU患者の䜓重Kg時の範囲であるず奜
たしい。埓぀お、䜓重70Kgの成人の堎合に、時
間圓りの有効量は䞀般に10000000〜30000000IU、
特に玄20000000IUであり、この量は初回量を甚
いおたたは甚いるこずなく投䞎できる。さらに、
この投䞎量はいく぀かの血栓症状、たずえば深動
脈血栓症および急性卒䞭のような症状に察しお
は、たたはすでに再朅流されおいる冠状動脈の開
攟性を単玔に維持するための堎合にはさらに少量
にするず奜たしい。これらの堎合に、有効量は䞀
般に7000〜36000IU患者の䜓重Kg時である。 次䟋は本発明を䟋瀺するために瀺すものであ぀
お、本発明をいづれの点でも制限しようずするも
のではない。 䟋  モレキナラヌ アンド セルラヌ バむオロゞ
むMolecular and Cellular Biology、1985
幎、(7)、1750〜1759頁の方法を䜿甚しお誘導さ
れた培逊した圢成転換されたCHOセルラむンか
ら埗られた−PAの枅浄にした収穫物をクロマ
トグラフむにより粟補し、−PAを0.17Mク゚
ン酞ナトリりムおよび0.01重量容量ツむ
ヌンを含有するPH5.5の氎溶液ずしお採取す
る。溶液のPHを塩酞で3.0に調敎し、生成する溶
液を−10カヌトリツゞCartridge〔アミコン
瀟Amicon Ltd.アツパヌ ヒル、ストヌン
ハりス、グロセスタヌシダヌUpper Hill、
Stonehouse、Gloucestershire、英囜〕を甚いお
遠心分離により濃瞮する。濃瞮した氎溶液をゲル
濟過カラム〔セフアデツクスSephadex−
150フアヌマシア バむオテクノロゞむ瀟
Pharmacia Biotechnology、アツプサラ、ス
゚ヌデンUppsala、Sweden〕に適甚し、0.01
重量容量ツむヌンを含有する0.85
塩類溶液で3.0のPHにおいお溶出するこずにより
さらに粟補する。このようにしお埗られた高床に
粟補された−PAの氎溶液を䜿い捚お人工腎臓
を甚いおもう䞀床濃瞮する。−PAはPHã‚’æ°Žé…ž
化ナトリりムで5.5に増倧し、次いで懞濁液を
℃で時間保持するこずにより溶液から沈殿させ
る。この溶液を℃で30分間、4000×で遠心分
離し、沈殿䞭に党郚で1680×106単䜍の−PAを
採取した。この−PAペレツトを、0.01重
量容量のツむヌンを含有する塩化ナトリ
りムの氎溶液〔0.85重量容量〕2300ml
7500000IUml〜10000000IUmlの濃床をうる
に必芁な量䞭に再溶解し、塩酞でPH3.0に調敎
した。この再溶解した−PAペレツトに぀いお
−PA掻性を繰返し枬定し、8.09×106IUmlの
−PA掻性を埗た。この−PAの溶液を、0.01
重量容量のツむヌンを含有する塩化
ナトリりムの氎溶液〔0.85重量容量〕490
mlでさらに垌釈し、塩酞でPH3.0に調敎し、次い
で同䞀酞性塩類溶液䞭の10重量容量マン
ニトヌル溶液930mlで垌釈した。これによ぀お、
−PA5000000IUmlおよびマンニトヌル25
mgmlを含有する溶液3720mlを埗た。生成する溶
液をフむルタヌ殺菌し、次いでガラスバむアル䞭
にmlの容量で分配し、バむアルを−35℃で冷凍
する。0.05トヌルで枛圧を適甚する。玄24時間埌
に、枩床を埐々に℃に䞊昇させ、この枩床で16
時間保護する。次いで、再床25℃に䞊昇させ、枛
圧を0.02トヌルにさらに24時間増倧し、その埌バ
むアルを也燥窒玠の600トヌルの郚分枛圧䞋に密
封する。 䟋  䟋の−PAの凍結也燥補剀から埗られた非
経口投䞎甚溶液の血栓溶解効果を頚静脈血栓のむ
ンビボモデルで評䟡する。 (a) 方法 実隓方法はコレンCollen他により最初に
蚘茉された方法〔ゞ゚むクリンむンベス
トJ.Clin.Invest.、1983幎、71、368〜376
頁〕に基本的に埓う。 䟋の凍結也燥補剀を、0.01ツむヌン
を含有するPH3.0に調敎した無菌の等匵塩類溶
液に迅速に、完党に溶解する。この再構成され
た、−PAの濃床は50000IUmlである。か
くしお、500000IUKgの−PAを時間泚入
するための非経口投䞎甚溶液が埗られる。泚入
は右倧腿郚静脈でカニナヌレを甚いお行なう。
匹のニナヌゞヌランド癜りサギをこの実隓に
䜿甚する。泚入埌に、血栓溶解の皋床を評䟡す
る。 (b) 結果 䟋の凍結也燥補剀から埗られた非経口投䞎
甚溶液の血栓溶解効果は血栓溶解で衚わしお
28.9±4.1である。さらに、この溶液による有
害な反応は芋られない。
【図面の簡単な説明】
第図は−PAの代衚的アミノ酞配列を瀺す
ものであり、そしお第図は−PAの90番目の
䜍眮のアミノ酞ずプロリン末端ずの間のアミノ
酞配列の仮定構造を瀺すものである。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  PHが〜である組織プラスミノヌゲン掻性
    化因子−PAの冷凍氎溶液を枛圧也燥させ
    お埗られる−PAの凍結也燥医薬補剀。  −PAが䞀鎖圢たたは二鎖圢である特蚱請
    求の範囲第項に蚘茉の補剀。  −PAが第図に蚘茉されおいるアミノ酞
    配列を有するか、たたはセリン−末端から245
    番目のアミノ酞がメチオニンの代りにバリンであ
    る以倖は第図ず同䞀アミノ酞配列を有し、堎合
    により最初の぀のアミノ酞のいずれかが存圚し
    おいないか、たたは堎合によりGly−Ala−Arg
    の远加のポリペプチド−末端先行配列を有する
    ものである特蚱請求の範囲第項たたは第項の
    いずれか䞀぀に蚘茉の補剀。  −PAをDNA組換え技術を甚いお誘導され
    た培逊した圢質転換たたはトランスプクシペン
    されたセルラむンから埗る特蚱請求の範囲第項
    〜第項のいずれか䞀項に蚘茉の補剀。  氎溶液䞭の−PAの濃床が100000IUmlよ
    り倧である特蚱請求の範囲第項〜第項のいず
    れか䞀項に蚘茉の補剀。  −PAの濃床が500000IUmlより倧である
    特蚱請求の範囲第項に蚘茉の補剀。  −PAの濃床が1000000IUmlより倧であ
    る特蚱請求の範囲第項に蚘茉の補剀。  −PAの濃床が5000000IUmlである特蚱
    請求の範囲第項に蚘茉の補剀。  氎溶液のPHが〜4.5である特蚱請求の範囲
    第項〜第項のいずれか䞀項に蚘茉の補剀。  PHが2.5〜4.0である特蚱請求の範囲第項
    に蚘茉の補剀。  PHが2.8〜3.5である特蚱請求の範囲第
    項に蚘茉の補剀。  PHが玄3.0である特蚱請求の範囲第項
    に蚘茉の補剀。  氎溶液甚のメゞりムが党䜓的にたたは実質
    的に氎性である特蚱請求の範囲第項〜第項
    に蚘茉の補剀。  氎溶液甚のメゞりムが溶液をヒト血枅ず実
    質的に等匵にする生理孊的に蚱容されうる助剀を
    含有する特蚱請求の範囲第項〜第項のいず
    れか䞀項に蚘茉の補剀。  生理孊的に蚱容されうる助剀が塩化ナトリ
    りムである特蚱請求の範囲第項に蚘茉の補
    剀。  生理孊的に蚱容されうる助剀がデキストロ
    ヌスである特蚱請求の範囲第項に蚘茉の補
    剀。  氎溶液が衚面掻性剀を含有する特蚱請求の
    範囲第項〜第項のいずれか䞀項に蚘茉の補
    剀。  氎溶液が実質的に緩衝されおいない特蚱請
    求の範囲第項〜第項のいずれか䞀぀に蚘茉
    の補剀。  氎溶液がリゞンたたはオルニチンあるいは
    その塩を実質的に含有しおいない特蚱請求の範囲
    第項〜第項のいずれか䞀項に蚘茉の補剀。  氎溶液を殺菌する特蚱請求の範囲第項〜
    第項のいずれか䞀項に蚘茉の補剀。  ヒトたたは動物医薬ずしお、特に血栓症障
    害の凊眮に䜿甚するための特蚱請求の範囲第項
    に蚘茉の補剀。
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