JPH0352822A

JPH0352822A - 複合制癌剤

Info

Publication number: JPH0352822A
Application number: JP1187490A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Osawa; 利昭大沢; Tooru Mitsuno; 徹満野; Hiroyasu Suzuki; 弘康鈴木; Kozaburo Sato; 佐藤　孝三郎
Original assignee: Shionogi and Co Ltd; Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd; Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1989-07-21
Filing date: 1989-07-21
Publication date: 1991-03-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は他と区別されるアミノ酸配列を持つヒトリンホ
トキシンとインターフェロンーγを含有する抗腫瘍剤に
関するものである。この抗腫瘍剤はヒトを包含する補乳
類に投与することにより抗腫瘍療法において使用するこ
とができる。

〔従来の技術とその課題〕

ヒトリンホトキシン（以下Ｈｕ−ＬＴと略称することが
ある〉はリンパ球及びリンパ球系株化細胞から抗原刺激
またはマイトジェン刺激によって生産されるリンホカイ
ンの１種であり、種々の癌細胞に対して障害性を有する
ことから抗腫瘍剤〔［ＥｖａｎｓＣ，ｌ｛ら、Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅｓ．　３７，　８９８．　（１９７７）］と
しての応用が期待されている。しかし、マイトジエン刺
激による生産は、誘導される｝ｌｕ−ＬＴの量が少ない
ことから、その大量取得が困難であった。

最近、遺伝子組換え技術によりＨｕ−ＬＴ遺伝子のクロ
ーニング及びＨｕ−ＬＴの発現が報告されるに至り、Ｈ
ｕ−ＬＴを大量に入手することが可能になった（Ｇｒａ
ｙ　Ｐ，Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２，　　７２１−
７２４，　（１９８４））。

本出願人はヒ｝Ｔ細胞ハイブリドーマより新規Ｈｕ−Ｌ
Ｔ遺伝子を取得し（特開昭６２−１５１１８２）　、更
に本遺伝子を用い３種のＨｕ−ＬＴを取得した（特開昭
６３−８３９８、特開昭６３−８３９９、特開昭６４−
６２９８）　．これら３種のＨｕ−ＬＴはいずれもそれ
まで知られていたＨｕ−ＬＴとタンパク構造を異にする
。これらのＨｕ−ＬＴは、単独で用いても顕著な抗腫瘍
効果を示すものの、腫瘍の種類、投与方法によっては治
療効果をあげるために多量の投与が必要のため副作用が
ある等欠点も認められる。

インターフェロンーＴ　（以下ＩＦＮ−　ｒと略称する
ことがある）はＴリンパ球をマイトジエン処理すること
で誘発されるリンホカインの１種であり、抗ウイルス作
用及び細胞増殖抑制作用を有していることが明かにされ
ている（Ｇｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ，２９５，　５０３
．　（１９８２）　］。ヒトインターフェロンーγ（以
下Ｈｕ−ＩＦＮ−　ｒと略す）も遺伝子組換え技術によ
り遺伝子のクローニング及び発現が可能となり、高純度
Ｈｕ−［ＦＮ−　ｒを大量に入手できる（特開昭５９−
５１７９２）。ＩＦＮ−　ｒはその腫瘍細胞増殖抑制作
用に種特異性があるので効果確認に用いる動物種由来の
ＩＦＮ−γを用いなければならない。本明細書では効果
確認にマウスを用いた抗腫瘍薬効試験を実施したので、
マウス由来のＩＦＮ−ｒ（以下Ｍｕ−ＩＦＮ−Ｔと略〉
を用いた。このようにＩＦＮ−　ｒが種特異性を有する
故に試験にはＭｕ−ＩＦＮ−γを使用しているが、ヒト
に対してはＨｕ−ＩＦＮ−γが好ましいということはい
うまでもない。Ｍｕ−ＩＰＮ−γ遺伝子のクローニング
及びＭｕ−ＩＰＮ−　Ｔの発現、並びにその大量取得に
ついてはＮａｇａｔａ　Ｋ．らにより詳細に報告されて
いる（Ｎａｇａｔａ　Ｋ，　　ら、ＦＥＢＳ　ＬＢＴＴ
ＢＲＳ．　２０５，２００−２０４．　（１９８６）　
）。しかしＩＦＮ−γ単独で用いるには抗腫瘍スペクト
ラムが狭＜、ＩＦＮ−ｒにも副作用があることがわかっ
ている。そこでこれらのリンホカインの、より有効な利
用法が求められている。

ところで、ＬＴとＩＦＮ−　ｒの相乗作用がイン・ビト
ロの実験で確かめられている［：　Ｗｉｌｌｉａｍｓｏ
ｎ．Ｔ．Ｗ．らＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．．　　１３０．　
５１８　（１９８３）、特開昭６０−８９４３４、特開
昭６２−８７５２５）。しかしながら生体でのイン・ビ
ボ実験での効果は確認されていない。

また、副作用に対する知見も明らかにされていない。一
般に、２種類の薬物の組み合わせ使用により薬効に相乗
効果が見られる場合、副作用も相乗的に増強されると予
想されるところである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らはイン・ビボ試験において鋭意検討した結果
、安定性に優れたリンホトキシンを遺伝子組換法により
作製し〔特開昭６４−６２９８、特開昭６３−８３９８
、特開昭６３−８３９９、特開昭６２−１５１１８２　
３、これをインターフェロンーＴと併用することにより
、一層優れた抗腫瘍効果が認められ、さらに、全く驚く
べきことに、副作用も軽減することができるという新し
い知見を得、本発明を完或するに至った。

従って本発明は、次の一般式：Ｘ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−
Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａ　ｌａ−Ａｓｎ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａ　ｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇ
　Ｉｎ−Ａｓｐ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ
−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇ　ｌｙ−１　１
ｅ−ＴｙｒＰｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−
Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａ
　ｌａ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａ　Ｉａ−
Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−｝１ｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｙ
ｒ−｝１ｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｂｅ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ一Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−
Ｇｌｙ−Ｉ　ｌｅ−Ｐｒｏ−ｔｌｉｓ−Ｌｅｕ−Ｖａ１
−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａ　１
−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　ｌａ−Ｐｈｅ−Ａ　
ｌａ−Ｌｅｕ（但しＸは、Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ一Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈ＋
ｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ
−Ｈｉｓ，　　Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉ
ｓ　，またはＭｅｔ−Ｈ　ｉｓ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａを示
す。）で表されるＨｕ−ＬＴの１種以上とＩＦＮ−γを
含有する抗腫瘍剤を提供する。以下Ｘ＝Ｍｅｔ−Ａｓｐ
−Ｐｒｏ−Ａｌａ−・−−−−のＨｕ−ＬＴをＨｕ−Ｌ
Ｔ（　Ｉ型）、Ｘ＝Ｍｅｔ−Ｈ　ｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ
−｝１ｉｓのＨｕ−ＬＴをＨｕ−ＬＴ　（　Ｉ［型）、
Ｘ＝Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ＡｌａのＨｕ−ＬＴをＨ
ｕ−ＬＴ　（　ＩＩＩ型）と略称する。

〔具体的な記載〕

本発明に用いるＮｕ−ＬＴは遺伝子組換により作製され
た前記のいずれの型でも、何等差し支えない。

またＩＦＮ−　ｒにおいては遺伝子組換え型、天然型の
いずれでも使用することが可能であるが、Ｈｕ−ＩＦＮ
−　ｒについては（特開昭５９−５１７９２）、Ｍｕ−
ＩＦＮ−　ｒについてはＮａｇａｔａ　Ｋ．　ＣＦｔＥ
ＢＳ　Ｌ８ＴＴＥＲＳ，　２０５　．２００−２０４（
１９８６）　）らの方法によって作製されたものが好適
に用いられる。Ｈｕ−　ＩＦＮ−γが種を越えて有効で
ないことから一本件の実施例にＭｕ−ＩＦＮ−ｒを用い
て実験しているがヒトにはＨｕ−ＩＦＮ−γの方が好ま
しいことは言うまでもなく、そのことによってＩＦＮ−
Ｔの種が限定されることはない。

本発明におけるＨｕ−ＬＴとＩＦＮ−　ｒの配合比率は
１０，　０００／１から１／１０，　０００であり、そ
して好ましくは１００／１〜１／１０の範囲であるが、
これらの数値範囲内に制限されるものではない。

通常ＬＴ単独では効果発現のために（３〜５）ＸＩＱ６
ｕ／ｋｇの投与が必要であるが、高用量側では毒性が時
に問題となり、効果を保持しつつ毒性を軽減させる方法
が望まれていた。ＬＴとＩＰＮ−　ｒの併用では例えば
配合比が１：１の混合物では（０．３　〜１．３）　Ｘ
ＩＯ’　ｕ／ｋｇの投与量が望ましい。

しかしながら、この数値は参考であってこれらの値に限
定されるものではない。

本発明の制癌剤が適用可能な疾患は実施例において例示
する線維肉腫及び黒色腫に限らず、腎癌、乳癌、肺癌、
肝癌、白血病、ウイルス性疾患など種々なものがあげら
れる。

また本発明の制癌剤は実施例においては注射剤として静
注の形態をとっているが、これも制限されるものではな
く筋肉内注射、局所投与、経口投与、皮下投与、等種々
の投与形態が可能であり、それぞれに応じた剤型が可能
である。また併用療法として用いる際には、投与形態は
ＩＦＮ及びＬＴの両者の投与が同時且つ同一の投与経路
である必要はなく、静脈注射と皮下投与、経口剤と注射
剤の組合せなど、種々の方法が可能である。また、ＩＦ
ＮとＬＴとを異る時間に投与することもできる。その選
択、組み合せ、容量、投与タイミング等の選択は医師に
より最終的に決定されるべきものである。

〔発明の効果〕

Ｈｕ−ＬＴとＪＰＮ−γを含有する新規抗腫瘍剤及びＨ
ｕ−ＬＴとＩＦＮ−γを併用した新規抗腫瘍療法は優れ
た抗腫瘍効果を示し、かつ副作用も少ないことから優れ
た癌治療剤、治療法としての用途が期待できる。

実施例ＬＢａｌｂ／ｃマウス（７週令、雌）の右そけい部皮下に
線維肉腫Ｍｅｔｈ　Ａ細胞を２Ｘ１０５個／匹移植、７
日目よりＮａｇａｔａ　Ｋ，らの方法により作製したＭ
ｕ−ｉＦＮ−ｒ　（比活性４　ｘｌＯ６ｕ／ｍｇ蛋白、
ＬＰＳ濃度２ｎｇ／ｍｇ蛋白以下）及び特開昭６４−６
２９８記載のＨｕ−ＬＴ（ＩＩＩ型）（比活性２ｘｌ０
７ｕ／ｍｇ蛋白、ＬＰＳ　Ｂ度０．０２ｎｇ／■蛋白〉
を混合し複合剤（製剤例１）として連日５回尾静脈より
注射した。尚、以下の諸実施例には、すべてこのＮｕ−
ＬＴ（Ｉｎ型）及びＭｕ−ＩＦＮ−ｒを用いた。

経時的に腫瘍の大きさを測定し、３０日目に腫瘍体積を
求め無処理群との比較をし腫瘍増殖抑制率を求めた。ま
た副作用の指標としての体重変化は投与最終日（１１日
目）の無処理群に対する増減を割合で表した。実際、高
濃度のＬＴをマウスに投与すると投与量依存的に体重減
少を示し、より高濃度では致死毒性を示す（ＬＴの５日
間連日の静脈投与でのＬＤｓｏ＝　２．　８　ＸＩＯ’
　ｕ　／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ）。

結果を第■表に示す。

以下余白第１表上記の結果から明らかなように、ＬＴ２Ｘ１０’Ｕ又は
ＩＦＮ−ｒ　２　Ｘ１０’　ｕの単独投与ではほとんど
体重減少を示さないが効果もない。一方、ＬＴＩＸＩＯ
’　ｕの単独投与では著しい効果を示すが体重減少も大
きい。それに比べてＬＴと比較して毒性の低いＩＦＮ−
　ｒとＬＴを併用したものでは、体重減少を殆ど示さず
ＬＴＩＸ１０’ｕの単独投与とほぼ同様の効果を示して
いた。このことはＩＦＮ−γとＬＴの併用が単なる相加
効果ではないことを意味するものである。またここでは
示していないが、ＩＦＮ−　ｒとＬＴの配合比が異なっ
ているものでも、同様の結果が認められた。

尚、ｌ｛ｕ−ＬＴの活性はＬＴ感受性マウスＬＰ・３細
胞に対する、細胞障害作用を指標とし、単位はユニット
（ｕ）で表した。即ちＬＰ・３細胞にＬＴとアクチ７　
７　イシンＤ４０ｘ　／　ｍｊ！を添加、１０％ＦＣＳ
を含む培地で１８時間培養した後に、生存細胞の割合が
５０％になるＬＴの量をｌｕとして定義し、ＬＴ量を求
めた。

ＩＦＮ−　ｒの活性は、マウスＬＯ細胞を用いた抗ウイ
ルス活性を指標とし単位はユニッ｝　（Ｕ）で表した。

即ち、Ｌ○細胞にＩＦＮ−　ｒを添加、２４時間後にＶ
ＳＶウイルスを感染し１６〜２０時間培養してウ′イル
ス感染による細胞変性を５０％阻止するＩＦＮ−　ｒの
量を求め、ＮＩＨの標準ＩＦＮ−　ｒ　（Ｇ００２−９
０４−５１１）の換算力価をもって、そのユニットを求
めた。

蛋白定量は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準蛋白質と
してｌｏｗｒｙ法により求めた。エンドトキシン（ＬＰ
Ｓ）の定量はトキシカラーシステム（生化学工業）を用
い、標準ＬＰＳにはＥ．ｃｏｌｉ，　０１１１由来のも
のく生化学工業）を用いた。

実施例２．Ｃ５７ＢＬ／　６マウス（８週令、雌）にマウス黒色腫
Ｂ−１６　　１ＸＩＯ’個／匹を尾静脈より静脈投与し
３日目よりＩＦＮ−　ｒ及びＬＴを混合剤として５日間
連日投与した。２０日目に肺を摘出し肺への腫瘍の転移
結節数を数え、無処理群と比較して転移抑制率を求めた
。この結果を第２表に示す。

第２表実施例１と同様にＢ−１６を用いた腫瘍の肺転移抑制試
験においてもＬＴとＩＦＮ−　ｒの併用でより効果が増
大することが見い出された。

実施例３。

Ｂａｌｂ／ｃマウス（７週令、雌）の右そけい部皮下に
線維肉腫Ｍｅｔｈ　Ａ細胞を２　ＸＩＯ’個／匹移植、
２日目よりＭｕ−ＩＰＮ−　ｒを９日間、７日目よりＭ
ｕ一ＩＦＮ−　ｒ及びＨｕ−ＬＴ（ＩＩＩ型）を５日間
ｌ日１回尾静脈より投与した。

経時的に腫瘍の大きさを測定し３０日目に腫瘍体積を求
め、無処理群との比較し腫瘍増殖抑制率を求めた。結果
を第３表に示す。

第３表ＬＴ　２　ＸＩＱ’　ｕ　，又はＩＦＮ−ｒ　２　ＸＩ
Ｏ’　ｕのそれぞれ単独投与では殆ど効果がないが、両
者を併用して投与することで著しい効果が認められた。

またその際の体重減少もほとんどなく、実施例１中で示
したような高濃度投与時におけるＬＴの著しい副作用が
軽減されておりＬＴとＩＦＮ−γ併用の有用性を示唆す
るものであった。

以下実施例１〜３で記したように、ＩＦＮ−γとＬＴを
併用することによりそれぞれ単独投与で効果発現が期待
出来る投与量を減らすことができ、かつ副作用を軽減さ
せることが出来ることを見いだした。これは新たな癌治
療剤、治療法としての用途が期待出来るものである。

製剤例製剤例１．単位バイアルあたり、２ｒｎＩ！．の注射用水中に、下
記組戊を含む凍結乾燥製剤を製造した。

（組或：１バイアルあたり）Ｍｕ−ＩＦＮ一ｒ　　　　　　　　　　　　　５　ＸＩ
Ｏ５ｕＬＴ　（ＩＩＩ）　　　　　　　　　　　　　５
Ｘ１０’　ｕマウス血清アルブミン　　　　　　　　２
．０■マルトース　　　　　　　　　　　　　　５０■
リン酸２水素１ナトリウム・２水塩　　１５．６ｍｇリ
ン酸１水素２ナ｝　＋Ｊウム・１２水塩　　３５．８ｍ
ｇ製剤例２．製剤例ｌと同様に下記組或の凍結乾燥製剤を得た。

（組或：１バイアルあたりＭｕ−ＩＦＮ−　ｒＬＴ　（Ｉ）ヒト血清アルブミンマルトースリン酸２水素１ナトリウリン酸１水素２ナトリウ〉５Ｘ１０５ｕ５Ｘ１０’ｕ２．　Ｏ　ｍｇ５０ｍｇム・２水塩　　１５．６ｍｇム・１２水塩　　３５．８ｍｇ上記製剤を用時１−の注射用水に復元溶解して、所定量
を使用する。

Claims

【特許請求の範囲】１、次の一般式：【遺伝子配列があります】（但し、Ｘは、Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ、Ｍｅｔ−
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｈｉｓ）またはＭｅｔ−Ｈｉ
ｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａを示す。）で表されるヒトリンホト
キシンとインターフェロン−γを含有する抗腫瘍剤。