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Conjugue d'immunogLobuLine contenant de l'idarubicine, médicament Le contenant et procédé de déplétion in vitro d'un sous-groupe de Lymphocytes T d'une population ceLLuLaire utiLisant ce conjugue
Le concept général de L'utilisation d'anticorps monoclonaux (MoAb) pour diriger des agents antinéopLasiques contre des tumeurs est connu et son importance therapeutique est actueLLement en cours d'evaLuation. De façon générale, cette approche comprend La production de conjugues d'un anticorps et d'un agent toxique capabLes sélectivement de LocaLiser et d'endommager Les cellules tumorales.
On s'est principalement efforcé de construire des immunotoxines à partir des chatnes A de toxines et d'anticorps d'origine végétale et bactérienne, de façon à ce que leur liaison à l'antigène et leur internalisation provoquent La mort des cellules. En pratique, de nombreux MoAb semblant etre specifiques des tumeurs réagissent également avec des sous-populations de cellules normaLes et, par conséquent, il est peut-être irréaliste
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d'utiliser de teLLes toxines puissantes en raison des Lésions potentieLLes qu'elles sont susceptibLes de creer aux tissus normaux.
Une alternative moins dangereuse de L'empLoi des toxines végétales consiste des anticorps des médicaments anticancéreux classiques, tels que La doxorubicine, La vindesine, Le chlorambuciL, a coupLerLe meLphaLan et Le methotrexate-Par suite des effets toxiques non spécifiques des agents antinéoplasiques couramment utiLisés, on a tenté d'accrottre leur index thérapeutique en les couplant à des MoAb dirigés contre des antigènes tumoraux.
Les tentatives de suppression du rejet des greffes provoque par Les cellules T dérivées du thymus sont souvent centrées sur La diminution de L'activite des ceLLuLes T par utilisation d'une globuline antithymocy-
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taire. Plus récemment, la mise au point des anticorps monoclonaux a permis de définir des sous-groupes de cellules T selon leur fonction in vitro et la présence d'antigènes de surface spécifiques définis par des MoAb. cela a stimulé les recherches d'un mechanisme par lequel les ceLLuLes T commandent Le rejet des greffons, centrees sur La division majeure en les sous-groupes auxiLiaires/inducteurs et cytotoxiques/suppresseurs définis par les antigènes murins L3T4 et LY-2.
Bien que Le MoAb OKT3, un réactif anti-ceLLuLes T totales, se soit révélé actif in vitro, une etude recente a révélé que 20 MoAb dirigés contre 20 antigènes lymphocytaires murins différents étaient sans effet in vivo chez la souris et sont donc inutiles pour Les études in vivo. IL est donc approprié d'examiner les moyens par lesquels ces MoAb tres spécifiques peuvent etre rendus plus puissants afin
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d'éliminer complètement Les ceLLuLes leur servant de cibLe. L'utiLisation de médicaments à des MoAb constitue une teLle approche.
Le potentiel clinique des conjugues medicamentMoAb englobe L'unmunochimiotherapie anticancereuse et La reduction de divers troubles immunoreguLateurs et Le rejet des allogreffes. De nombreuses etudes ont démontré La cytotoxicite spécifique de toxines et de medicaments vis-à-vis des ceLLuLes tumorales lorsque ces toxines et médicaments sont couplés à un MoAb dirigé contre des antigenes associés aux tumeurs. Cependant, on s'est moins intéressé ä l'utilisation in vivo de conjugués médicament-MoAb pour éradiquer les cellules T et etudier l'immunoréguLation par Les ceLLuLes T dans Le rejet des greffons, bien que des conjugués toxine-anticorps aient été abondamment utilisés in vitro pour eradiquer les ceLLuLes T avant une greffe de moëlle osseuse.
Les anthracyclines constituent un groupe important d'agents antineopLasiques utilises dans La chimio-
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thérapie anticancéreuse, parmi LesqueLLes La doxorubicine et La daunorubicine se sont révélées efficaces contre les tumeurs solides. Le couplage de La daunorubicine et de La doxorubicine a des anticorps entratne cependant une perte considérabLe de l'activité médicamenteuse lorsque Le coupLage est effectue par L'intermé- diaire du groupe amino. Récemment, La daunorubicine a ete couplée ä des MoAb par l'intermédiaire de l'atome de carbone 14 par utilisation de La bromodaunorubicine. Ces conjugués se sont révélés actifs in vitro. Cependant, aucune etude in vivo n'a été mentionnee (GaLLego et
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coLL., Int. J.
Cancer, 1984, 33 737-744). De plus, on a établi que Les conjugués daunorubicine-MoAb présentaient une toxicite non spécifique aux concentrations MO tg/mL.
La demanderesse a découvert que L'idarubicine (4-déméthoxydaunorubicine, Ida), peut etre coupLee ä des MoAb et que Les conjugués ont une activité antitumorale selective et puissante in vitro et in vivo. La toxicité non spécifique des conjugués Ida-MoAb ne s'est pas révé- Lee in vivo ä des doses inférieures à 8,0 mg/kg. Les conjugués Ida-MoAb présentent une efficacité in vitro et in vivo supérieure ä celle des conjugués daunorubicineMoAb.
De plus, La demanderesse a évalué la capacité des conjugués Ida-MoAb à eradiquer spécifiquement des populations ceLLuLaires par couplage d'Ida à des MoAb connus pour reagir avec des sous-populations differenties de Lymphocytes (L3T4+, Ly-2+ et Thy-1+). La demanderesse a également établi que cela constitue un procédé étonnamment efficace de déplétion ceLLuLaire. Par exemple, Le MoAb anti-Ly-2. 1, qui n'a pas d'effet mesurable in vivo sur les ceLLuLes ly-2.1+, peut etre transforme en un agent cytotoxique efficace par couplage avec L'agent cytotoxique Ida.
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En utilisant des antigènes MoAb dinges contre
Ly-2 et LT3T4, nous avons maintenant démontre qu'un
Ida-MoAb peut éliminer des ceLLuLes cibles in vitro et in vivo. On peut obtenir des conjugués Ida-MoAb ayant un potentiel de depletion spécifique de sous-groupes de cellules T responsables du rejet des greffons supérieur à celui des globulines antilymphocytaires ou des reac- tifs anti-cellules T totales, tels que Le MoAb OKT3.
La presente invention fournit donc des conjugués d'immunoglobulines comprenant de l'Ida conjuguée à un anticorps monoclonal ou un fragment de celui-ci com- prenant au moins un des sites de liaison d'antigene de
L'anticorps.
L'Ida est décrit dans L'US-A-4077988. De pree- rence, on Lie 2 ä 8, et mieux 2 ä 6 molécules d'Ida par covalence à chaque molecule d'anticorps ou de fragment d'anticorps. Les moLecuLes d'Ida sont généralement, mais non necessairement, conjuguees par la position 14 à L'anticorps monoclonal ou au fragment d'anticorps. De préférence, elles sont liées directement, bien qu'il soit possibLe d'interposer un support ou un fragment de liaison inerte. L'Ida peut cependant etre liée à L'anticorps ou au fragment d'anticorps par L'intermediaire du groupe amino. On peut pour cela utiliser un peptide espaceur dégradable, un support de dextran, un espaceur sensibleauxacidesouunacidepolyglutamique.
(ofp.35)
Typiquement, chaque anticorps ou fragment d'anticorps est spécifique d'un antigene sur La surface des cellules contre LesqueLLes on désire diriger L'Ida.
Par exemple, l'anticorps ou Le fragment d'anticorps peut etre spécifique d'un tissu cible désiré, tel qu'un neoplasme humain. Des exemples des néoplasmes humains contre lesquels on peut souhaiter diriger L'Ida sont les cancers du sein, du colon, du poumon, de La prostate, de L'ovaire, du thymus et d'autres cancers, sarcomes et
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leucémies.
L'anticorps ou Le fragment d'anticorps peut sinon être spécifique d'un néoplasme d'animal. Un anticorps ou fragment d'anticorps specifique du récepteur à la transférine humaine (TFR) qui est présent sur Les ceLLuLes en division, Les cellules érythroblastiques et Les ceLLuLes de diverses tumeurs peut etre utilise Un anticorps monoclonal anti-TFR approprie peut etre pro-
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duit contre Le récepteur à La transferine sur Les ceLLu- lesLyCR-LON-HMy-2 (HMy-2).
Lorsque Les conjugues d'immunoglobuline sont destines à l'utilisation dans La déplétion d'une population spécifique de Lymphocytes T, L'anticorps ou Le fragment d'anticorps est specifique d'un antigène de surface cellulaire qui est Lui-meme spécifique de ces lymohocytes T. L'anticorps ou Le fragment d'anticorps peut donc être spécifique d'une population de Lympho- cytes T auxiliaires, suppresseurs ou cytotoxiques.
De préférence, L'anticorps monoctonal ou te fragment d'anticorps appartient à La même espèce que celle ä laouelle Le conjugue d'immunoglobuline doit etre administré. On empLoie donc typiquement un anticorps monocLonaL ou fragment d'anticorps humain ou de souris Lorsqu'on désire administrer Le conjugué à des etres humains. Egalement, de préférence, l'anticorps ou Le fragment d'anticorps appartient à la cLasse IgG. Le fragment d'anticorps peut etre Le fragment Fab, Fab'ou F(ab')2- Une IgM monomere, qui peut dériver d'un anticorps IgM par digestion avec une enzyme proteolytique,
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peut également etre utilisee.
Les conjugués d'immunoglobuline sont préparés selon l'invention par un procédé comprenant La conjugaison d'Ida à l'anticorps monoclonal ou au fragment de celui-ci. De preference, on fait réagir une 14-halo- géno-Ida avec L'anticorps monoclonal ou son fragment. Le substituant de La position 14 peut etre Le fluor, le
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chLore, Le brome ou L'iode, ais c'est de préférence Le brome.
La 14-bromo-Ida est décrite dans l'US-A-4125607 La conjugaison peut donc etre effectuee selon un procédé comprenant : (a) Le meLange de L'anticoros monoclonal ou de son fragment avec un exces molaire de 14-halogéno-Ida, (b) La réaction du melange entre 18 et 37 C, (c) l'élimination de tout précipité, (d) l'élimination des matieres de départ n'ayant pas reagi par filtration sur geL, et adsorbE (e) L'élimination du medicament (Ida) /par chromatographie d'adsorption ou chromatographie d'échange d'ions.
Typiquement, le stade (a) est effectué dans un solvant organique miscible à L'eau, tel que Le N, N-di-
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methyLformamide. De preference, L'exces molaire de La 14-halogéno-Ida dans le stade (a) est de 0 Åa 50 fois.
Dans Le stade (b), on effectue de preference La réaction pendant une periode de 1 Åa 8 heures. Typiquement, La reaction est effectuée à La temperature ambiante.
Cependant, d'autres procedes de conjugaison peuvent etre utilises. Lorsqu'on desire un conjugué ayant un support ou fragment de Liaison inerte interposé entre l'Ida et L'anticorps monoclonal ou te fragment d'anticorps, on fixe tout d'abord typiquement Le support ou Le fragment de Liaison à L'atome de carbone C-14 de L'Ida puis on Le Lie à L'anticorps ou au fragment d'anticorps.
Egatement, comme mentionné ci-dessus, L'anticorps ou Le
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fragment d'anticorps peut Atre lié à L'Ida par L'intermédiaire du groupe amino par utilisation d'un peptide espaceur dégradable, d'un support de dextran, d'un espaceur sensible aux acides ou d'acide potyglutamique.
Les conjugués d'immunoglobuline de L'invention peuvent etre utilises pour traiter un etre humain ou un autre mammifère atteint d'un cancer. On peut administrer
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une quantité thérapeutique efficace du conjugue. Le cancer peut etre une tumeur solide, une tumeur ascitique ou une leucémie. Des néoplasmes humains que L'on peut traiter ont été mentionnés ci-dessus. On peut administrer deux ou plusieurs conjugues, L'anticorps monocLonaL ou le fragment d'anticorps de chaque conjugué ayant une spécificité differente.
On peut administrer un conjugué par injection.
On peut l'administrer par voie parenterale, par exemple intraveineuse. On peut L'administrer par voie locale ou directement dans la tumeur. La quantité d'un conjugué administre à un patient depend de divers facteurs, tels que La tumeur à traiter et L'etat du patient. Cependant, de façon typique, on peut administrer une dose de 10 à
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p 200 mg de conjugue par de SUrfacecorporelle. peut etre administre avec d'autres agents chimiothérapeutiques ou avec des agents qui accroissent L'activite des conjugués, comme des agents vasodilatateurs ou Le facteur de nécrose tumorale.
Les conjugués d'immunogLobuLine peuvent également étre utiLises pour La depLetion specifique d'un sous-groupe de Lymphocytes T d'une population de cellu- Les. Une quantité thérapeutique efficace d'un conjugué
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comprenant un anticorps ou un fragment d'anticorps contre un antigene de surface ceLLu- monoclonalLaire présent sur les Lymphocytes à réduire peut etre administre à un etre humain ou à un animaL. Sinon, une population cellulaire peut etre incubée in vitro avec un teL conjugue.
On peut utiLiser une combinaison de conjugues dinges contre deux ou plusieurs antigènes de surface cellulaire. Les Lymphocytes dont on desire effectuer La déplétion peuvent etre des Lymphocytes T auxiliaires, suppresseurs ou cytotoxiques.
Cet aspect de L'invention peut astre utilisé pour
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eviter Le rejet d'un tissu greffe chez un receveur de greffon. Les conjugués peuvent etre utilisés comme agents immunosuppresseurs. On administre au receveur du greffon une quantité de conjugue efficace pour éviter Le rejet du greffon. De préférence, dans ce cas, on realise une déplétion des ceLLuLes T cytotoxiques. Un etre humain ou un animal atteint d'un cancer peut etre traité par dépLétion des Lymphocytes T suppresseurs par admi- nistration d'un conjugue approprié. Des maladies auto- immunes peuvent être traitées par L'administration d'un conjugue afin d'effectuer une depLetion des Lymohocytes
T auxiliaires. Dans chaque cas, La voie d'administration et La dose du conjugué sont comme mentionne ci-dessus.
Les conjugues d'immunogLobuLine sont presentes sous forme de compositions pharmaceutiques avec un support ou diluant convenant en pharmacie. On peut utiliser un support ou diLuant approprie quelconque. Des supports et diluants appropries comprennent la soLution saLee physiologique et la soLution glucosée de Ringer.
Les exemples suivants iLLustrent L'invention Sur Les dessins, Les figures 1 à 12 concernent l'exemple 1 et les figures 13 à 14 concernent L'exempLe 2. PLus particulièrement : la figure 1 represente la structure de derives de L'anthracycLine ;
La figure 2 represente Le coupLage de L'idarubicine (Ida) à L'anti-Ly-2. 1 (0, 5 mg). Les moles d'Ida incorporees par moles d'anti-Ly-2.
1 (") (ordonnées de gauche) et la recuperation des protéines (e) (ordonnées de droite) sont représentées en fonction du nombre de nmoL d'Ida dans Le meLange réactionnel (abscisses)
La figure 3 represente Le titre d'anticorps mesuré par Le pourcentage de ceLLuLes formant des rosettes (ordonnees) en fonction de La dilution de L'anticorps (x 10-1) (abscisses) de conjugués d'anti-Ly-2. 1
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sur des cellules cible ITT (1) 75NS E3.
Des dilutions en série ont été effectuees ä partir d'une solution Åa
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0, 1 avec
2 (o) ou 8 (u) moles d'Ida/moLe d'anticorps ; la figure 4 représente L'effet inhibiteur de L'Ida (m) ou de l'Ida-anti-ly-2,1 (#), 5 moles d'Ida/moLe d'anticorps, sur les ceLLuLes E3 dans un essai en 24 heures dans LequeL Le pourcentage d'inhibi- tion de L'incorporation de La ('H]-thymidine Cordonnées) est représente en fonction de La concentration de L'Ida (M) (abscisses) ;
la figure 5 représente L'effet inhibiteur de l'Ida (#), de L'Ida-anti-Ly-2. 1 cl), 5 moles d'Ida/moLe d'anticorps, ou d'Ida-anti-TFR (o), 5 moles d'Ida/moLe d'anticorps sur des ceLLuLes (Ly-2+) E3 dans un essai d'inhibition en 30 minutes où Le pourcentage d'inhibition de L'incorporation de [3H]-thymidine (ordonnées) est représenté en fonction de La concentration de L'Ida (M) (abscisses) ;
La figure 6 représente l'effet inhibiteur de L'Ida-anti-Ly-2. 1 (o), 5 moles d'Ida/mole d'anticorps, et du conjugué plus l'anti-Ly-2. 1 Ce) sur des cellules cibles E3 dans un essai de spécificité en 30 minutes où Le pourcentage d'inhibition de L'incorporation de [3H]thymidine (ordonnées) est représenté en fonction de La concentration de L'Ida (M) (abscisses) ;
La figure 7 represente La croissance du thymome E3 chez des souris CBF, auxquelles on a injecté par voie sous-cutanée 2 x 106 ceLLuLes. Des groupes de 10 souris ont reçu des traitements intraveineux, indiques par une flèche ; PBS (o), Ida (m), anti-Ly-2, 1 (A), Ida-anti-TFR (o) ou Ida-anti-Ly-2. 1 Ce). La tailLe moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnees) est représentée en fonction des jours suivant L'inocuLation de La tumeur (abscisses). Les barres d'erreur représentent ¯ L'erreur type
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de la moyenne ;
La figure 8 représente des courbes de croissance tumorale individueLLes de souris CBF1 auxquelles on a injecté par voie sous-cutanee 2, 0 x 106 cellules tumora- les E3 traitees par voie intraveineuse Les jours 4 et 5 avec le conjugué Ida-anti-Ly-2, 1.
La taille des tumeurs (cm2) (ordonnées) est representee en fonction des jours suivant L'inocuLation de La tumeur (abscisses) ; la figure 9 represente La croissance du thymome E3 chez des souris CBF1 auxquelles on a injecté par voie sous-cutanée 3, 0 x 106 cellules Des groupes de 10 souris ont reçu Les traitements intraveineux indiques par une flèche ; PBS Cu), anti-Ly-2. 1 CA), Ida (m) ou conjugue Ida-anti-Ly-2. 1 (*). La tailLe moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnées) est représentée en fonction du nombre de jours suivant l'inoculation de La tumeur (abs- cisses). Les barres d'erreur représentent ¯ l'erreur type de La moyenne ;
La figure 10 représente La croisance du thymome E3 chez des souris CBF1 auxquelles on a injecté par voie sous-cutanee 3, 0 x 106 cellules.
Des groupes de 10 souris ont reçu Les traitements ant ; tumoraux indiqués par une flèche ; PBS (o), anti-Ly-2.1 (A), Ida (n) ou conjugué Ida-anti-Ly-2. 1 (#). La taille moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnées) est représentée en fonction du nombre de jours suivant l'inoculation de la tumeur (abscisses) Les barres d'erreur representent ¯ L'erreur type de la moyenne ;
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La figure 11 represente La croissance greffon de tumeur humaine CoLo 205 chez des souris "nude"auxqueLLes on a injecté par voie sous-cutanée 2 x 106 cellules Des groupes de 10 souris ont reçu Les traitements intraveineux suivants indiqués par une flèche ;
PBS (#), Ida Libre (#), conjugué Ida-250-30.6 (.), méLange d'Ida et de 250-30. 6 (Q) et 250-30. 6 (A).
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7 La taiLLe moyenne des tumeurs (cm) est (ordonnees)représentée en fonction du nombre de jours suivant l'inoculation de La tumeur (abscisses). Les barres d'erreur représentent + l'erreur type de La taille moyenne des tumeurs ;
La figure 12 représente les courbes de croissance individueLLes des tumeurs de souris "nude" ayant reçu un xénogreffon qui ont été traitées par voie intraveineuse (flèche) avec Le conjugué Ida-250-30. 6. Le trait discontinu represente la taiLLe moyenne des tumeurs des souris traitees par Le PBS. La taille des
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0 tumeurs (ordonnees) est représentée en fonction du nombre de jours suivant l'inoculation de la tumeur (abscisses) ; la figure 13 illustre le couplage de L'idarubi-
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cine (Ida) à l'anti-L3T4 (0, 5 mg).
Les moles d'Idaincorporées par mole d'anti-L3T4 (#) (ordonnées de gauche) et La recuperation protéinique (#) (ordonnees de droite) sont représentées en fonction du nombre de nmoL d'Ida dans Le méLange reactionneL (abscisses) ;
La figure 14 montre te titre des anticorps mesure en pourcentage de cellules formant des rosettes Cordonnées) en fonction de La dilution d'anticorps (x 10-1) (abscisses) de conjugués d'anti-Thy-1 sur
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d. ITT (1) 75NS E3.
Des dilutions en '-J serie ont été effectuées à partir d'une solution à 1, de conjugué avec 1 (o), 4 (s) ou 7 (e) moles d'Ida/moLe d'anti-Thy-1 ; La figure 15 montre L'effet du traitement par un Ida-MoAb et un MoAb sur Le nombre des ceLLuLes L3T4+ et es ceLLuLes cibLesLy-2+ dans La rate de souris traitées par L'Ida-antiL3T4 (*-*), traitées par l'anti-L3T4 (A- ) traitees par l'Ida-anti-Ly-2.1 (#--#), traitées par L'anti-Ly-2. 1
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(A--A) ou non traitees (a--o) ou Le pourcentage de cellutes formant des rosettes (ordonnées) est représenté en
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fonction du temps en jours (abscisses) ;
La figure 16 montre L'effet d'un traiteient avec une association de conjugues d'Ida-MoAb sur La survie chez des souris CBA d'un greffon de tumeur P38801 (à travers des barrières H-2 ou non-H-2). Des grouses de 10 ä 15 souris ont reçu une injection sous-cutanée de 8,0 x
106 cellules tumorales T388D1 et ont reçu un des Traitements intraveineux (fteche) suivants :
Ci) PBS (#), (ii) anti-L3T4 et anti-Ly-2. 1 (o), (iii) Ida-anti-L3T4 (#), (iv) Ida-anti-Ly-2. 1 ( < ) et (v) Ida-anti-L3T4 et Ida- anti-Ly-2. 1 (AL La taille moyenne des tumeurs (c#2) (ordonnees) est représentée en fonction du nompre ce jours suivant l'inoculation de La tumeur (abscisses) Les barres d'erreur représentent ¯ l'erreur type de La moyenne ; et
La figure 17 montre l'effet du conjugue. Idaanti-Thy-1 sur La survie chez des souris CBA d'un greffon de tumeur P388D1.
Des groupes de 10 souris ont reçu une injection sous-cutanee de 1, 0 x 107 ceLLuLes de tumeur P388D1 et ont reçu car voie intraveineuse (flèche) un des traitements suivants : (i) PBS (o), toi) ant ; -Thy-1 (.) et (iii) Ida-anti-Thy-1 (#). La taille moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnees) est représentée en fonction du nombre de jours suivant l'inoculation de La tumeur (abscisses).
Les barres d'erreur representent ¯ l'erreur type de La moyenne ;
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La figure 18 montre La croissance fon de Colo 205 (30. 6+, 17. 1+) chez des souris d'un xenogref-auxquelles on a injecte 8 x 106 ceLLuLes/souns. Des groupes de 10 souris ont été traites par voie intrapéritonéale comme indique par une flèche avec du PBS (o); du 17. 1-Ida (o) ; du 30. 6-1da C) Ou un meLange de 30. 6-Ida et de 17.1-Ida t) La taiLLe moyenne des
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0 tumeurs ) est représentée en fonction nombre de jours suivant L'inocuLation de La tumeur
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(cm(abscisses). Les barres d'erreur représentent + L'erreur type de La moyenne.
La dose totale d'Ida était de 200 p. g ;
La figure 19 montre La croissance d'un xenogreffon de tumeur humaine du colon LIM2210 chez des souris "nude" auxquelles un fragment de tumeur (1-5 mg) a ete implante. Des groupes de 10 souris ont été traites par voie intraveineuse, comme indique par une flèche, avec du PBS (cri) ; du 17. 1-Ida (+) ; du JGT-13-Ida (A) ; du 17.1-Ida (#) ou du 30. 6-Ida (o). La taiLLe moyenne des tumeurs (cm2) (ordonnées) est représentée en fonction des jours suivant L'inocuLation de la tumeur (abscisses). Les barres d'erreur representent ¯ L'erreur type
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de La moyenne. La dose totale d de 80 09.
EXEMPLE 1 MatérieLs et méthodes CeLLuLes tumorales
Les Lignées ceLLuLaires examinées dans cette étude comprenaient La variante ITT (I) 75NS E3 (E3) de
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thymome murin et coLL., J. NatL. Cancer (Ly-2+) (SmythInst. 1986, 76, 503-510), Le lymphome EL4 (ly-2-, TFR-) (Horowitz et coLL., Science, 1968 160 533-535), La Lignee de ceLLuLes humaines CEM (TFR+) (FoLey et coLL., Cancer 1965, 18, 522-529) et La lignée de ceLLuLes humaines colo 205 (250-30. 6+). Les cellules étaient entretenues in vitro dans du milieu de Eagle modifie par Dulbecco (DME) ou du milieu RPMI 1640 (Flow Laboratories, Sydney, Australe), avec addition de 10 % de serum de veau nouveau-ne inactive par chauffage (Flow), 2 mM de glutamine (commonwealth Serum Laboratories, Sydney, Australie) ;
100 g/ml de streptomycine (GLaxo, Melbourne, Austratie) et 100 UI/mL de pénicilline (Commonwealth Seru Laboratories). La tumeur E3 était entretenue in vivo par des passages successifs sur des souris (C57BL/6 x BALB/C) F1 (souris CBF1)- Les cellules
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du Liquide d'ascite étaient lavées et centrifugées (400 g x 5 min) deux fois dans du tamoon salé phosphaté(PBS) à pH 7,3, remises en suspension dans du PBS et injectees par voie sous-cutanee (s. c.) dans la paroi abdominale des souris ; ces derniers presentaient des tumeurs paloabtes avant Le traitement.
Les souris ont été soumises à des series de traitements intraveineux (i. v.) ou intratumoraux (i. t. ) puis Les tailles des tumeurs ont été mesurées chaque jour avec un pied a coulisse, la mesure étant effectuee selon Les axes perpendiculaires des tumeurs. Les données ont été enregistrees comme taille moyenne des tumeurs (produit des deux diamètres L'erreur type).
Souris
Les souris CBA et (C56BL/6 x BAL3/c (souris
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CBF1) et Les souris (nu/nu) ont été produites au Service de Pathologie de l'Université de Melbourne Des groupes expérimentaux de 8 à 10 souris de meme sexe et de meme age ont été utilises dans chaque expérience.
Anticorps monoclonaux
Les MoAb utilisés ont été : (i) L'anti-Ly-2. 1 (IgG1) réagissant avec une specificite pour Ly-2. 1 murin (Hogarth et coll. ImmunoLogy 1982 46 135-144) et (ii) L'A3C6 (anti-TFR) (IgG1) réagissant avec Le récepteur Åa La transférine humaine (TFR) (Panaccio et coll., Immuno-
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Logy and tell ; et (iii) un anticorps 250-30. contre un antigene présent sur Les celLuLes
Les MoAb ont été isolés du liquide d'ascite par précipitation avec du suLfate d'ammonium a 40 %, disso- Lution dans du PBS et dialyse avec Le meine tampon.
Ces preparations brutes ont été soit absorbées sur du Protéine-A-Sépharose (Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey), lavées abondamment avec du PBS (pH 7, 3) et éluées avec de La glycine 0,2 M/HCl (pH 2,8) soit
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passées à travers une colonne d'AffigeL blue (Bio-Rad
Laboratories, Pty. Ltd., Sydney). Apres neutraLisation,
Les MoAb ont ensuite été diatysés contre du PBS, divises et conservés à -70oC. L'A3C6 a été obtenu par immunisa- tion intrapentoneaLe de souris CBA à des intervalles d'une semaine pendant 3 semaines avec 2 x 106 cellules
LicR-LON-HMy-2 (HMy-2) OKT9+ve), prélévement des rates trois semaines apres La dernière injection et fusionnement avec des ceLLuLes P3-NSI-AG4-1 (NS-1).
Preparation et détermination quantitative des conjugues
On a mélange des formes intactes des MoAb anti-Ly-2. 1, anti-TFR ou 250-30. 6 (1-2 mg/mt dans du tampon borate Åa pH 8, 0) avec un excés molaire (1-50) de 14-bromo-4-déméthoxydaunorubicine (Br-Ida) dissoute dans du N, N-dimethylformamide (DMF) à 10 mg/mt. La reaction a été maintenue à la température ambiante pendant 4 heures avant centrifugation (400 9 x 5 minutes) pour eliminer tout précipité.
La Br-Ida libre et les autres matières de depart n'ayant pas réagi ont été éliminées Dar chromatographie par filtration sur gel avec une colonne de Sephadex G-25 (PD-10 ; Pharmacia) et on a fait ensuite passer les conjugués à travers une colonne de Porapak Q (MiLLipore) pour éliminer tout médicament adsorbe (Niederwieser et coLL., J. Chromatog. 1971 54, 215-223).
La quantité d'Ida incorporée aux conjugues médicamentMoAb a été déterminée par spectrophotométrie d'absor-
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11 bance à 483 nm (E498 = x et par estima- 498 2 tion des protéines (Bradford, Ans L. Biochem. 1976 72, 248-253).
Activité d'anticorps
Une détermination par formation de rosettes utilisant une immunoglobuline de mouton anti-souris a été utilisée pour determiner l'activité d'anticorps des conjugués Ida-MoAb par comparaison avec Le MoAb Libre ayant subi les memes opérations que ceLLes du orocede de
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couplage (Parish et McKensie, J. Immunol Methods 1978 20, 173-183).
Activité médicamenteuse (a) essai d'inhibition en 24 heures : 100 l de cellules (2-5 x 106/mt) ont été introduits dans une plaque de microtitrage à fond plat et incubés pendant 1 heure Åa 37 C, De L'idarubicine (Ida) Libre (dissoute dans Le PBS) et des conjugués Ida-MoAb ont été filtrés aseptiquement et des dilutions ont été effectuées dans du PBS stérite ; 50 L d'Ida Libre ou de conjugué ont été ajoutés aux cellules en utilisant 2 cupules pour chaque echantiLLon ; les cupules temoins recevaient 50 l de PBS et Les ceLLuLes ont été cultivées ä 37 C avec 7 % de COS pendant 24 heures.
(b) essai d'inhibition en 30 minutes : 200 pu de cellules (2-5 x 106/mL) ont été recueillis dans des tubes Eppendorf stériles, remis en suspension dans Le medicament ou Le conjugue stérile et mélangés pendant 30 minutes à 37 C. Les celLules ont ensuite été centrifugées (400 g x 5 min), remises en suspension dans le milieu de culture et des portions de 100 l ont été distribuées dans une pLaque de microtitrage avec des cupules en double pour chaque échantillon avant une periode d'incubation de 16-24 heures.
Après la période d'incubation dans les deux essais, 50 t du milieu de culture contenant 1 Ci de [3H]-thymidine (activite spécifique : 5 Ci/mmol ; Amersham) ont été ajoutés et les plaques ont ete incubees pendant 2-4 heures. Les ceLLuLes ont ensuite été
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recueiLLies et séchées et Les échantilLons individuels ont été separes et comptes avec un compteur à scintiLLation de La [Hj-thymidine a éte ss. L'incorporationexprimée en pourcentage d'inhibition de L'incorporation des témoins. L'erreur standard pour tout point a été caLcuLee à partir des determinations en double et ne
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depassait pas 5 % pour tout point expérimentaL.
Toxicité
Des groupes de 10 à 20 souris CBA ont reçu une injection i. v. unique de diverses doses d'Ida ou d'Ida-anti-Ly-2. 1 et Les souris survivantes ont ete notees en fonction de la dose de médicament administrée en mg/kg. Les organes de ces souris ont été prélevés et pesés avant fixation dans la formaline et coloration par
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l'hématoxyline et L'eosine.
Resultants Préparation et caractérisation des conjuques
La Br-Ida (figure 1) a été couplée par covalence à plusieurs MoAb : contre Le TFR humain, contre un antigène present sur Les cellules humaines de cancer du coLon (anticorps 250-30. 6) et contre l'alloantigène Ly-2 murin. Les conditions de la reaction de conjugaison ont été etablies par variation de l'excès moLaire de Br-Ida
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ajoute aux MoAb et etablissement entre une incorporation et des récupérations moindres des protéines L'Ida-anti-Ly-2. 1 (figure L'Ida-anti-TFR et L'Ida-250-30. 6 (valeurs non présen- d'un compromistees) ont incorporé 3 à 5 molécuLes d'Ida avec des recuperations des protéines superieures à 50 %. La reaction de La Br-Ida avec les MoAb pourrait produire deux types de liaisons (figure 1C et D).
Pour établir La Liaison
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presente, Les conjugués ont été portés à pH 4, ou ä pH 9, 0 pendant 48 heures, Le medicament non conjugue libéré a été absorbé dans du Porapak Q et les échantilLons ont été soumis à une nouvelle détermination quantitative par spectrophotometrie. Cinquante % du médicament lié ont été libérés lors de L'exposition ä l'action d'une base (pH 9, 0) tandis qu'aucune perte n'a été observee à pH 4,5. Cela suggère qu'au moins 50 % du médicament sont unis par une Liaison ester (figure 1D), car la Liaison ester est sensible aux conditions basi-
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ques tandis que La liaison amine est stable.
Activite
Les titres des anticorps avant et apres conju- gaison ont été mesurés selon la methode de formation des rosettes et exprimes comme La dilution à Laquelle 50 % des ceLLuLes cibles ont présenté des rosettes. Les conjugues Ida-anti-ly-2. 1 contenant 2 et 8 moLecuLes d'Ida avaient des titres des anticorps contre Les ceLLu- les E3 respectivement de 1/56 000 et 1/33 000, tandis que Le titre de L'anticorps non conjugue était de
1/80 000 (figure 3). Les conjugués Ida-250-30. 6 conte- nant 2 et 6 moLecuLes d'Ida avaient des titres des anti- corps contre Les ceLLuLes Cola 205 respectivement de
1/16 000 et 1/11 000, tandis que Le titre de L'anticorps non conjugué etait de 1/33 000.
IL y a donc une certaine perte de L'activite d'anticorps due à L'opération de conjugaison ; Les conjugués avec moins de 6 molécules d'Ida par molécule de MoAb ont été utilises pour Les études in vitro et in vivo. IL faut noter que la solubi- lité et L'activite d'anticorps des conjugues Ida-antiLy-2. 1 ont diminué notablement au-delà de ces taux d'incorporation d'Ida (valeurs non presentees) Le nombre maximal des molécules d'Ida que L'on peut utilement incorporer varie selon L'anticorps individuel.
Activité in vitro de L'idarubicine et de conjuguésidarubicine-MoAb
La cytotoxicite in vitro de l'Ida et de deux conjugues Ida-MoAb sur la lignée de cellules murines ITT (1) 75NS E3 (Ly-2+, TFR-) et La Lignee de cellules humaines CEM (Ly-2-, TFR+) a été mesurée dans un essai d'inhibition en 24 heures et les valeurs de La DI50 (inhibition à 50 % de L'incorporation de La [3H]-thymi- dine des témoins) ont été déterminées, les résultats sont iLLustres par la figure 4 et Le tableau 1. La DI50 de L'Ida était dans La gamme de 1, 0 à 2, 5 x 10-7 M pour
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les deux lignées ceLLuLaires étudiées (figure 4, tabLeau 1).
La 0150 pour L'Ida-anti-Ly-2. 1 relativement à E3 etait quatre fois supérieure (figure 4) et pour l'Ida-anti-TFR relativement à CEM, les Dieu étaient une à deux fois supérieures à celle de L'Ida Libre
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(tabteau 1). Donc, L'Ida Libre est plus cytotoxioue pour E3 et CME que respectivement L'Ida-anti-Ly-2. 1 et l'Ida-anti-TFR. Cependant, ces conjugués Ida-MoAb presentent une cytotoxicité 10 fois inférieure vis-a-vis des lignées ceLLuLaires non réactives (tabLeau 1), ce qui indique que leur action cytotoxique est specifique et résulte du maintien de t'activité d'anticorps (figure 3).
TABLEAU 1
Effet de conjugué idarubicine-anticorps monocLonaL
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i sur des ceLLuLes tumorales1Lignée de Valeurs moyennes de La Dick) déterminées pour cellules Ida Ida-anti-Ly-2. 1 Ida-anti-TFR tumorales
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<tb>
<tb> E3 <SEP> 1,2#10-7 <SEP> 4,3#10-7 <SEP> 2,3#10-6
<tb> (5)2 <SEP> (3) <SEP> (2)
<tb> CEM <SEP> 2,2#10-7 <SEP> 2,0#10-6 <SEP> 3,0#10-7
<tb> (5) <SEP> (2) <SEP> (3)
<tb>
1 DI50=inhibityion à 50 % de L'incorporation de La [3H]-thymidine des témoins.
= nombre des preparations étudiées.
Les conjugues Ida-250-30. 6 ont été Légèrement moins actifs que L'Ida libre. L'Ida Libre avait une DIcQ de 6 x 10-8 M, tandis que Le conjugué avait une DI50 de 3, 5 x 10-7 M sur La Lignée de ceLLuLes cibles Colo 205.
Pour déterminer si Les conjugues presentaient sélectivement leur action cytotoxique vis-à-vis des ceLLuLes cibles, L'Ida-anti-Ly-2. 1 et l'Ida-anti-TFR ont
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été incubés pendant 30 minutes avec des ceLLuLes E3 (Ly-2+) avant élimination par lavage du conjugué non lié et mesure de La cytotoxicite. Le conjugué Ida-antiLy-2. 1 avait une DI50 de 6,2 # 10-7 M tandis que la DI50 de l'Ida libre était de 5,2 x 10 7 M (fig. ure 5). En revanche, le conjugué Ida-anti-TFR non réactif avait une Dien de 5, 0 x 10-6 M, c'est-à-dire 10 fois supérieure à celle de L'Ida Libre, ce qui démontre que l'activité de liaison d'anticorps du conjugué Ida-Ly-2. 1 résultait de sa cytotoxicite sélective.
De façon semblable, Le conjugué Ida-250-30. 6 et Le medicament Libre ont été incubés pendant 30 minutes avec Les Lignees ceLLuLaires Colo 205
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(250-30. + ve) et E3 (250-30. 6-ve) avant Lavage et essai de La cytotoxicité. Les deux (ignées ceLLuLaires ont présenté une reaction sembLabLe ä La dose de medicament Libre, c'est-à-dire 9, x 10-7 M pour CoLo 205 et 9, x Cependant, Le conjugué Ida-250- 30. quatre fois pLus toxique pour Coto 205 que pour La lignée de celluLes E3 ne reagissant pas avec L'anticorps.
Les memes résultats ont été obtenus avec La lignée ceLLuLaire CEM et L'Ida-anti-Ly-2. 1 en tant que témoin non réactif (vaLeurs non présentées) Pour confirmer que La cytotoxicité des conjugués Ida-MoAb pour les cellules cibles était spécifique et se produisait aux sites de liaison d'anticorps, on a étudié L'inhibition de La cytotoxicité du conjugué par empLoi de MoAb Libre. A une concentration en Ida de 4, 0 x 10-6 M (2 g d'anti-Ly-2. 1), La cytotoxicite du conjugué
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anti-Ly-2. sur Les ceLLuLes E3 a été reduite de 70 par addition de 50 g (250 g/L) d'anti-Ly-2.
(figure 6) indiquant que La cytotoxicité du conjugué 1Ida-anti-Ly-2. 1 est Liee directement à sa capacite de Liaison d'anticorps. Des résultats témoins semblables ont été obtenus avec Le 250-30.6. It faut noter que dans tous les essais, L'anti-Ly-2. 1, L'anti-TFR et Le
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250-30.6 libres étaient non cytotoxiques (vaLeurs non prèsentées).
TraitementinvivoduthymomemurinITT (1)75NSE3
Pour evaluer t'inhibition de La croissance des tumeurs solides, des groupes de souris CBF1 (10 par groupe) ont été inoculés par voie sous-cutanee avec 2, 0 x 10-6cellules E3 dans ta region abdominale et traites avec des injections i. v. d'un des composes suivants : (i) PBS ; (ii) anti-Ly-2. 1 ; (i i i) I da (iv) Ida-anti-TFR; ou (v) Ida-anti-Ly-2.1. Les souris recevaient 20 g d'Ida et/ou 1 200 g d'anti-Ly-2. 1, respectivement les jours 4 et 5 (taiLLe des tumeurs = 0,1 cm2) après l'inoculation de La tumeur.
Au cours des 24 heures du oremier traitement, les souris traitees par l'Ida-anti-Ly-2. 1 avaient une taiLLe moyenne des tumeurs égale à 20 # de celle des souris traitées par Le PBS (c'est-ä-dire une diminution de 80 % de ta-masse tumorale (figure 7) ; il s'est révélé évident que l'anti-Ly-2.1 seul et L'Ida Liee par covaLence au MoAb anti-TFR non spécifique n'influaient pas sur La croissance de la tumeur E3. Les tumeurs des souris recevant L'Ida seule ont été reduites jusau'à 50 % ; cependant, trois de ces souris sont mortes et Les autres presentaient une diminution de 25 % du poids cor-
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porel.
Les courbes individueLLes de croissance tumorale des souris recevant L'Ida-anti-Ly-2. ont demontre une régression de neuf des dix tumeurs au cours du traitement (figure 8) ; en fait, cinq des dix tumeurs ont totalement regresse et ne sont pas reapparues ( > 200 jours) et Les tumeurs qui continuaient à se déve-
1Lopper ä la fin du traitement (cinq sur dix) se développaient plus Lentement que les tumeurs des souris traitees par Le PBS et L'Ida-anti-TFR. Une autre expérience a été effectuée pour évaluer Le traitement i. v. de tumeurs pLus grosses en utilisant L'Ida,-anti-Ly-2. 1.
Des
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groupes de souris CBF1 (10 par groupe) ont été inocutés avec 3, 0 x 106 cellules E3 et les souris ont ensuite reçu respectivement 15 g et 900 g d'Ida et d'antiLy-2. 1 Les jours 6 (taille des tumeurs = 0, 2 cm2) et 7 apres L'inocuLation des tumeurs (figure 9). Les souris traitées par l'Ida-anti-Ly-2. 1 avaient une taiLLe moyenne des tumeurs de 50 % de celle des souris traitées par Le PBS et de 66 % de celle des souris traitées par l'Ida au jour 7, et cette tendance s'est maintenue jus-
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qu'a La fin de L'etude (jour 18).
Les courbes indivi- dueLLes de croissance des tumeurs des 10 souris CBF1 recevant L'Ida-anti-Ly-2. 1 ont démontré L'existence de quatre régressions et de quatre disparitions complètes de la masse tumorale ( > 200 jours ; valeurs non présen-
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tees). Donc, l'Ida-ant 1 a été efficace contre des tumeurs plus grosses et, dans tes deux experiences, L'activité antitumorale de L'Ida a été considérablement améliorée par couplage avec Le MoAb anti-Ly-2. 1.
Traitementinvivodelatumeurducolonhumain CoLo 205
L'effet du conjugué Ida-anti-250-30. 6 a été evaLue chez des souris l'nude" (nu/nu) portant des xénogreffons de CoLo 205.
L'injection sous-cutanee de 2 x 106 ceLLuLes
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dans La paroi abdominale a provoqué une masse paLpabLe o en quatre jours (environ Des groupes de dix souris ont ensuite été traités par des injections i. v. d'un des composés suivants : (i) PBS ; (ii) 250-30.6; (iii) Ida plus 250-30. 6 (non conjugué) ; (iv) Ida ; (v) conjugué Ida-250-30. 6. Au total, 275 g d'Ida ont été administres dans une serie de 5 injections intraveineuses Les jours 4,5, 6, 10 et 12 après L'inocuLa- tion de La tumeur.
Aucun effet therapeutique n'est apparu dans les groupes de souris traités par Le PBS ou te 250-30. 6 non
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conjugué Avec l'Ida seule, deux souris sur dix ont sur- vécu tandis que toutes les souris du groupe recevant l'Ida non conjuguée plus Le 250-30. 6 étaient mortes au jour 7 après avoir présente des symptomes de toxicité teLs qu'une perte de poids. Les souris recevant Le conjugué Ida-250-30. 6 ont presente une diminution consi- dérable de la taille des tumeurs. Ces resultats sont illustrés par la figure 11. Par contre, les courbes de croissance tumorale des souris individuelles (figure 12) ont montré aue cinq des dix souris présentaient des tumeurs ayant régresse au jour 7 ; ces tumeurs croissant ensuite en ne laissant que deux souris sur dix sans tumeur.
Ces souris n'ont pas présenté d'effet dO a La toxicité Traitement intratumoral
Le traitement intratumoral s'est révélé etre une technique utile pour l'immunothérapie des tumeurs des animaux et de L'homme. Par consequent, des études ont été effectuées pour caractériser l'activité antitumorale des conjugués Ida-anti-Ly-2. 1 Lorsqu'iLs sont administrés directement dans une tumeur E3 solide. Des groupes de 10 souris CBF1 ayant subi une implantation souscutanee de 3, 0 x 106 ceLLuLes E3 ont développé des tumeurs (0, 1-0, 2 cm2) 5 jours après L'inoculation de La tumeur.
Les traitements consistaient en deux injections aux jours 5 et 6 apres l'implantation de la tumeur, les souris recevant un des traitements suivants : (1) PBS ; (2) Ida ; (3) anti-Ly-2. 1 ; ou (4) Ida-anti-Ly-2. 1 (Ida totale = 30 g). L'Ida-anti-Ly-2. 1 a presente l'activité antitumorale maximale, L'Ida libre et L'anti-Ly-2. 1 seul n'ayant pas d'effet sur la croissance tumorale Lors de L'administration directe dans la tumeur. Les souris traitées par L'Ida-anti-Ly-2. 1 avaient une taiLLe moyenne des tumeurs de 60 % de ceLLe des souris traitées par Le PBS au jour 8 et de 30 % de ceLLe des souris
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traitées par Le PBS au jour 13 (figure 10).
Les courbes individueLLes de croissance des tumeurs (valeurs non présentées) des souris traitees par L'Ida-anti-Ly-2. 1 ont indiqué 1 régression complète tandis que les souris restantes présentaient un ralentissement retardé de La croissance tumorale 3 jours après l'achèvement du traitement.
Toxicité
Pour les experiences de toxicité aigue, des groupes de 10 souris CBA (Ly-2. 1+) ont reçu une injection unique de diverses doses d'Ida, d'Ida-anti-Ly-2. 1 ou d'Ida-anti-TFR. Toutes Les souris injectées avec L'Ida ont présenté une perte initiale de poids atteignant 25 % du poids d'origine ; cependant, aucune perte
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de poids n'a été observée chez Les souris traitées avec L'un ou l'autre conjugué Ida-MoAb. Le tableau 2 presente La toxicite de L'Ida et des conjugués Ida-MoAb exprimée par les valeurs de La DLrQ et de La DL10. comme on Le voit, La DL10 de L'Ida-anti-Ly-2. 1 était de 10, 0 mg/kg
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d'Ida par rapport à 0, pour L'Ida
75 mg/kg seuLementLibre.
De plus, Le conjugué Ida-anti-TFR avait une DL10 de 8, 0 mg/kg. Les conjugues Ida-MoAb n'ont pas été étudies à une dose correspondant à la DLcQ. Ces résultats demontrent L'index thérapeutique superieur des conjugues Ida-MoAb par rapport ä l'Ida libre.
TABLEAU 2 Effet des conjugues idarubicine-anticorps monocLonaL chez les souris CBA
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<tb>
<tb> Ida <SEP> (mg/kg)
<tb> DL10 <SEP> DL50
<tb> Ida <SEP> 0,75 <SEP> 3,00
<tb> Ida-anti-Ly-2,0 <SEP> 10,00 <SEP> NE
<tb> Ida-anti-TFR <SEP> 18,00 <SEP> NE
<tb>
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Résultats histopathologiQues
Effet aigu :
L'administration intraveineuse d'Ida Libre (1, 0 mg/kg) a provoque une atrophie de La pulpe blanche de La rate 15 jours après Le traitement et une certaine hypertrophie des fibres du muscle cardiaque (valeurs non présentées) En revanche, une dose unique d'Ida-antiLy-2. 1 (2, 4 mg/kg) n'a provoque aucune toxicite tissulaire non spécifique après 15 et 30 jours, bien qu'un certain gonflement des hépatocytes ait été observé au jour 15.
EXEMPLE 2
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Matériels et methodes
Souris
Des souris (DBA/2 x BALB/c) F1 et CBA ont été produites au Service de Pathologie, Université de
Melbourne. Des groupes expérimentaux de 10 à 20 souris, toutes de meme sexe et de meme sage, ont été utilisés dans chaque expérience.
Cellules tumorales
Les Lignees ceLLuLaires examinees dans cette etude comprenaient la variante ITT (1) 75NS E3 (E3) de thymome murin (Ly-2+), Le lymphome EL4 (L3T4+) Horowitz et coll., science 1968 160 533-535), Le carcinome du colon humain CoLo 205 (Semple et coll., Cancer Res. 1978 38 1345-1355) et Les cellules T de Leucemie humaine CEM (Ly-2-, L3T4-) (FoLey et coLL., Cancer, 1965 18 522-529). Les cellules ont été entretenues in vitro comme décrit dans L'exempLe 1. La Lignee de cellules macrophages P388D1 etait entretenue in vivo par des passages successifs sur souris (DBA/2 x BALB/c) F1.
Les ceLLuLes du liquide d'ascite étaient lavées et centrifugees (400 9 x 5 min) deux fois dans du tampon salé phosphaté (PBS, pH 7, 3), remises en suspension dans du PBS et injectées par voie sous-cutanée dans la paroi abdomi-
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nale des souris qui deveLoppaient ensuite des greffons tumoraux palpables. Les souris étaient ensuite soumises à une série de traitements intraveineux et Les tailles des tumeurs étaient mesurées chaque jour avec un pied a coulisse, La mesure etant effectuée selon les axes perpendiculaires des tumeurs. Les vaLeurs étaient enregistrées comme la taiLLe moyenne des tumeurs (produit des deux diamètres + erreur type).
Anticorps monoclonaux
Les anticorps monoclonaux contre les antigenes de surface des cellules murines L3T4, Ly-2 et Ty-1, qui caractérisent des sous-populations distinctes de Lympho- cytes, ont été utilisés comme système modèle.
Les MoAb utilises étaient : (i) anti-Ly-2. 1 (IgG2a murine) réagissant avec une spécificité pour Ly-2. 1 murin (Horgarth et colt. ImmunoLogy, 1982, 46, 135-144), (ii) H129. 19 (anti-L3T4) (IgG2b de rat) reagissant avec une spécificité pour L3T4 murin (Pierres et coLL. J. Immunology 1984 152 2775-2782) et (iii) l'anti-Thy-1 (IgG2b de rat) réagissant avec les cellules T murines (Marshak-Rothstein et coll., J. Immunology, 1979 122 2491-2497). Les anticorps ont été isolés, purifies et conservés comme décrit dans l'exemple 1.
L'activité des anticorps a été déterminée par formation des rosettes avec une immunogLobuLine de mouton antisouris, comme décrit dans l'exemple 1.
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Preparation ES e de conjugues idarubicine-anticorpsmonoclonal
Un MoAb (1-2 mg/mL) a été meLange avec un exces molaire de 5 à 20 fois de 14-bromo-4-déméthoxydaunorubicine (Br-Ida) dissoute à 10 mg/mt dans te N,N-dimé- thylformamide pendant 4 heures à pH 8, 0 (tampon borate 0, 05 M) et à la température ambiante. Après réaction et purification, La quantite d'Ida incorporee au conjugue obtenu a été déterminée comme décrit dans l'exemple 1.
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Activité médicamenteuse
On a effectué deux essais (24 heures et
30 minutes) Dour evaLuer l'activité médicamenteuse comme décrit dans l'exemple 1 en utilisant une concentration des cellules de 1 à 5 x 106/ml.
Sérologie
Une méthode par formation de rosettes a été uti-
Lisee dans ces experiences pour déterminer Le titre des anticorps et Le nombre des cellules L3T4+ et Ly-2 Ce procédé comprenait la liaison d'immunoglobuline de mou- ton anti-souris qui détecte également L'immunogLobuLine de rat (Ig) couplée à des gLobuLes rouges de mouton pour detecter Les anticorps sur La surface des ceLLuLes Lym- phoides. L'Ig de surface de ceLLuLes spléniques Ig a été éliminée par coiffage avec de l'immunoglobuline de mouton anti-souris (25 cl et 2 ml de ceLLuLes à 107/ l) ; Les cellules ont ensuite été maintenues sur de
La glace dans un milieu contenant 0,01 % d'azide de sodium pour éviter La resynthèse de L'immunogLobuLine.
Résultats
L'étude a été effectuée en phases separées : (a) une caractérisation in vitro de trois conjugués Ida-MoAb différents, puis (b) La démonstration de leur utilité dans La déplétion active de sous-groupes de cellules T avant ou pendant Le rejet d'un aLLogreffon de ceLLuLes tumorales.
Préparation et caractérisation des conjugues
De La Br-Ida a été couplée par covalence à un MoAb dirigé contre les antigènes murins L3T4, Ly-2 et Thy-1. Les conditions de La reaction de conjugaison ont été établies par variation de l'excès molaire de Br-Ida ajouté au MoAb et etabLissement d'un compromis entre une incorporation accrue d'Ida et des récupérations moindres des protéines. L'Ida-anti-L3T4 (figure 13), t'Ida-antiLy-2. 1 et L'Ida-anti-Thy-1 (valeurs non présentées)
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incorporaient 3 à 6 molécules d'Ida, avec des récupérations des proteines supérieures à 50 %.
Activitéd'anticorps
Les titres des anticorps avant et après conjugaison ont été mesurés selon La methode de formation des rosettes et exprimés par La dilution à LaqueLLe 50 % des cellules cibles E3 présentaient des rosettes. Les conjugués Ida-anti-Thy-1 contenant 1, 4 et 7 moLecuLes d'Ida avaient des titres des anticorps respectivement de
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1/425 000, 1/170 000 et 1/130 000, tandis que Le titre de L'anticorps non modifie était de 1/550 000 (figure 14). IL y a donc une certaine perte de L'acti- vite d'anticorps lors de La conjugaison à l'Ida ; cependant, les conjugues avec moins de 4 moLecuLes d'Ida au MoAb ont été utiLises pour Les etudes in vitro et in vivo.
De même, L'activite d'anticorps des deux conjugues Ida-anti-Ly-2. 1 et Ida-anti-L3T4 (valeurs non présentees) a notablement diminue par incorporation de plus de 6 moLecuLes d'Ida par moLecuLe de MoAb.
Activité médicamenteuse in vitro
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La cytotoxicite des conjugues Ida-MoAb a ete étudiée sur diverses ceLLuLes cibLes reactives seLon un essai en 24 heures et comparée à celle de t'Ida libre. L'activité de L'Ida Libre était 4 à 10 fois supérieure à celle des conjugués Ida-MoAb, avec une DI 50(inhibition à 50 % de L'incorporation de [3H]- thymidine des témoins) de L'Ida Libre se situant Åa 6, 6-9, 0 x 10-8 M vis-à-vis des Lignées de cellules tumorales étudiées. IL est evident que Le conjugué Ida-anti-Ly-2.1 était le conjugué Le plus cytotoxique (DI50 = 4,3 x 10-7) lorsqu'il a été étudié contre La lignée celLula ; re ITT (1) 75NS E3, qui est une variante de la lignée cellulaire native enrichie en antigène Ly-2.
Pour examiner la sélectivité de l'action du conjugué vis-a-vis des ceLLuLes cibles, des conjugues Ida-MoAb ont été incubes pen-
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dant 3 minutes avec Les cellules cibles avant elimination par lavage du conjugué non Lié et mesure de La cytotoxicite. Selon cet essai en 30 minutes, Les conjugués Ida-MoAb non réactifs avaient une DISO 10 à 50 fois supérieure à celle de L'Ida libre, ce qui demontre que la liaison a l'anticorps est essentielle à la cytotoxicité du conjugué Ida-MoAb. IL faut noter qu'aucun des MoAb utiLises dans cet essai n'avait in vitro une action cytotoxique sur les cellules cibles en l'absence de comolément. Les résultats sont regroupés dans le tableau 3.
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TABLEAU 3 Effet de conjugues idarubicine-anticorps monoclonal.
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1 DIcQ moyenne sur Les cellules tumorales
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<tb> 1.cellules <SEP> Essai <SEP> valeurs <SEP> moyennes <SEP> de <SEP> la <SEP> DI50 <SEP> (Ida <SEP> (M)) <SEP> déterminés <SEP> pour
<tb> tumorales <SEP> Ida <SEP> Ida-anti-Ly-2.1 <SEP> Ida-anti-L3T4 <SEP> Ida-anti-Thy-1
<tb> E3 <SEP> 24h2 <SEP> 7,8#10-8 <SEP> 4,3#10-7 <SEP> NE <SEP> 9,0#10-7
<tb> 30min3 <SEP> 1,8#10-7 <SEP> 4,3#10-7 <SEP> NE <SEP> 1,2#10-6
<tb> EL4 <SEP> 24h <SEP> 6,6#10-8 <SEP> NE <SEP> 6,0#10-7 <SEP> NE
<tb> 30min <SEP> 1,6#10-7 <SEP> NE <SEP> 6,2#10-7 <SEP> NE
<tb> CEM <SEP> 24h <SEP> 9,0#10-8 <SEP> NE <SEP> NE <SEP> NE
<tb> 30min <SEP> 2,2#10-7 <SEP> 6,0#10-6 <SEP> NE <SEP> NE
<tb> Colo <SEP> 205 <SEP> 24h <SEP> 8,0#10-8 <SEP> NE <SEP> NE <SEP> NE
<tb> 30min <SEP> 1,2#10-7 <SEP> NE <SEP> 4,0#10-6 <SEP> 5,
8#10-6
<tb>
DI50 = Inhibition à SO % de L'incorporation de [3H]-thymidine des témoins selon un essai de cytotoxicite en 24 heures selon un essai en 30 minutes NE = non étudié
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Activité in vivo de conjugués idarubicine-anticorps monoctonal
L'activite immunosuppressive in vivo des conjugues Ida-MoAb a été comparee à celle du MoAb seul par détermination de La capacité des conjugués à réaliser une déplétion sélective des ceLLuLes L3T4+ ou Ly-2+ de
La rate. Des souris CBA ont reçu quatre injections i. v. de conjugué anti-Ly-2. 1 ou anti-L3T4 (30 g d'Ida/1, 5 mg de MoAb) les jours 0, 2, 5 et 10 et Le nombre des ceLLu- les Ly-Z+ ou L3T4+ dans La rate a été suivi par détermination de La formation de rosettes.
Pour chaque traitement, Les cellules spléniques de deux souris traitées ont été examinées chaque jour et La moyenne des résultats a ete établie (figure 15). Il s'est produit une baisse rapide du nombre des ceLLuLes L3T4+ d'environ 30 % des ceLLuLes spLéniques totales chez La souris normale le jour 0 à environ 4 % chez les sour ; s traitées par l'Ida-anti-L3T4 au jour 20. Cette depLetion des ceLLuLes L3T4+ a persiste pendant pLus de 60 jours avant qu'un accroissement graduel soit observe. La déplétion après Le traitement in vivo avec l'anti-L3T4 seul a égaLement provoqué une baisse nette du nombre des ceLlules
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L3T4+ (30 % à 5 %).
Le conjugué Ida-anti-Ly-2. 1 a réduit Le nombre des cellules Ly-2+ de la rate de 25 % à 5 % au jour 10 ; cependant, Le nombre des cellules Ly-2+ a commencé à augmenter au jour 15 et est revenu à La normate aux jours 40-50. Il est interessant de noter que Le MoAb anti-Ly-2.1 seul a été incapable de provoquer une déplie- tion notable des cellules Ly-2+ ; il semble que La variation du nombre des cellules Ly-2+ et L3T4+ des souris témoins non traitées soit due ä La variation naturelle d'une souris Åa L'autre.
IL a donc été evident que L'Ida-anti-L3T4 et L'Ida-anti-Ly-2. 1 pourraient respectivement provoquer une déplétion des cellules L3T4+
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ou Ly-2+ dans les rates des souris traitees, plus efficacement que Le MoAb seuL. L'effet du conjugué Ida- anti-Ly-2. 1 est important car Le MoAb anti-Ly-2. 1 est
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totalement dépourvu d'effet Lorsqu'on L'utilise seul, mais peut etre transforme en un agent immunosuppresseur pulssant La depLetion entretenue par Les conjugués médicament-MoAb a donc ete appropriée à l'examen du rOLe des ceLLuLes Ly-2+ et L3T4+ in vivo dans la reaction de rejet du greffon.
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Effet de L'Ida-anti-L 'Ida-anti-Thy-1 tumoraux
Dans ces expériences, Les conjugues Ida-antiL3T4, Ida-anti-Ly-2.
1 et Ida-anti-Thy-1 ont été utilisés pour accrottre La durée de survie de greffons tumoraux P388D1 chez des souris CSA, Les a L Logreff es etant effectués à travers Les barrieres H-2 (classes I et II) et non-H-2.
(a) Traitement avec une association de conjugués
Des groupes de 10 à 15 souris CBA ont reçu des injections sous-cutanées de 8, 0 x 106 cellules tumorales P388D1 et ont reçu une injection intraveineuse Les jours - 1, 0 (= jour de l'inocutation de La tumeur), 3,5 et 10 d'un des composants suivants : (i) PBS, (ii) anti-L3T4 et anti-Ly-2. 1, (iii) Ida-anti-L3T4, (iv) Ida-antiLy-2. 1 et (v) Ida-anti-L3T4 et Ida-anti-Ly-2. 1. La quantité totale d'Ida et de MoAb reçue était respectivement de 125 g et 5, 75 mg.
Les greffons tumoraux des souris traitées par Le PBS et par Les MoAb ont survécu 14 à 17 jours avec une taille maximaLe moyenne des tumeurs de 0, 31 cm2, ce qui demontre que les deux MoAb non conjugués associes sont incapables de réaliser une déplétion efficace des ceLLuLes L3T4+ et Ly-2+ telle que Le greffon tumoral puisse survivre (figure 16).
De plus, L'Ida-anti-Ly-2. 1 et l'Ida-ant ; -L3T4 seuls n'ont pu que prolonger La survie du greffon (20-28 jours) avec des
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y taiLLes maximales moyennes des tumeurs de est probable que L'Ida-anti-Ly-2. l'Ida-anti-L3T4 seuls n'ont pas pu éliminer toutes Les 0, 40 cm2 àceLLuLes T et qu'une provocation antigénique puissante (comme on L'observe avec Les différences compLetes du complexe majeur d'histocompatibilité) a été capable de stimuler Les ceLLuLes Ly-2 et L3T4+ restantes pour qu'elles prolifèrent et provoquent une réaction de rejet.
En revanche, une association des deux conjugues Ida-anti-Ly-2. 1 et Ida-anti-L3T4 a permis à 14/15 des greffons tumoraux P388D1 d'échapper au rejet et d'augmenter de taille jusqu'à ce que les souris soient sacrifiées (jour 50-2,00 cm2). On a noté qu'un petit nombre de ces tumeurs P388D1 traitées avec un conjugué ont presente une certaine regression de La taiLLe des jours 8 ä 16 ; cependant, une depLetion continue des ceLLuLes L3T4+ et Ly-2+ (jour 10) a permis au greffon de tumeur P388D1 de présenter une croissance tumorale régutière.
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(b) Conjugue Ida-anti-Thy-1
On a injecté à des groupes de 10 souris CBA par voie sous-cutanee 107 ceLLuLes de tumeur P388D1 et, par voie intraveineuse, L'un des composés suivants aux jours
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- 5 et 6 ; (i) PBS, (ii) anti-Thy-1 et (iii) Ida-
1, 0,anti-Thy-1. La quantité totale d'Ida et d'anti-Thy-1 reçue a été respectivement de 130 p. g et 5, 4 mg et Les greffons tumoraux des souris traitées par Le PBS ont survécu pendant 15 jours. Le MoAb anti-Thy-1 seul a assuré La survie du greffon tumoral pendant 28 à 32 jours avec une taiLLe maximale moyenne de La tumeur de 0, 58 cm2 (jour 6) (figure 17).
Chez Les souris traitees par l'Ida-anti-Thy-1, 30 % des greffons tumoraux ont été complètement rejetes au jour 40 tandis que Les 70 % restants ont continue à crottre pour finalement permettre (jour 32) L'augmentation de La taille moyenne
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des tumeurs du groupe. Done, l'Ida-anti-Thy-1, comme
L'association Ida-anti-Ly-2. 1 et l'Ida-anti-L3T4, a ete capable de provoquer une déplétion des cellules Ly-2+ et L3T4+ teLle qu'une majorité des greffons de tumeur P388D1 ont survécu chez Les souris CBA en l'absence de la reaction normale de rejet rapide.
EXEMPLE 3
On a prepare des conjugues selon Le mode opéra- toire décrit dans l'exemple 1 entre l'Ida et l'anticorps monocLonaL 17. 1 et entre l'Ida et L'anticorps monoclonal 30. 6. Des cellules du carcinome humain du colon CoLo 205 (30. 6+, 17. 1+) ont été inoculées par voie sous-cutanée à des souris "nude" à raison de 8 x 106 cellutes/souris comme décrit dans L'exempLe 2. Les souris inoculees ont ensuite'été soumises à une série de traitements intrapéritonéaux. La taiLLe des tumeurs a été mesuree avec un pied à coulisse en effectuant La mesure selon les axes perpendiculaires des tumeurs. Les valeurs ont été enregistrées sous forme de La taille moyenne des tumeurs (produit des deux diamètres + L'erreur type). Les résultats sont iLLustres par La figure 18.
EXEMPLE 4
On a préparé des conjugués selon Le mode operatoire décrit dans L'exemple 1 entre L'Ida et L'anticorps monoclonal 17. 1, entre l'Ida et l'anticorps monoclonal JGT-13, entre l'Ida et L'anticorps monocLonaL 27. 1*)et entre L'Ida et L'anticorps monocLonaL 30. 6. Un xénogreffon de tumeur humaine du colon LIM2210 (1-5 mg) a été implante à des souris "nude". Les souris, après implantation, ont été soumises à une série de traitements intraveineux. La taille des tumeurs a été mesurée avec un pied à coulisse en effectuant La mesure selon les axes perpendiculaires des tumeurs. Les valeurs ont été enregistrées sous forme de la taille moyenne des tumeurs (produit des deux diamètres ¯ l'erreur type). Les résuL-
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tats sont illustrés par la figure 19.
Bien entendu, diverses modifications peuvent etre apportées par l'homme de l'art aux dispositifs ou procédés qui viennent d'entre décrits uniquement à titre d'exemples non Limitatifs sans sortir du cadre de l'invention.
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*) (Thompson et coll., Proc. National Cancer Institute 1983 12 409-419 IGG2A murin) anticorps monoclonal 30. 6 (Thompson et coll., Brit. Journ. Cancer 1983 Z 595-605 ; IGG2B murin) anticorps monoclonal JGT-13 (IGG1 de souris, réagit avec l'antigene carcino-embryonique dans le carcinome du colon, mais pas avec les tissus normaux) anticorps monoclonal 27. 1 (IGG1 de souris, réagit avec l'antigène de globule de graisse de lait humain dans certains tumeurs du colon).
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Les groupes utilises pour la liaison peuvent entre des groupes acide carboxylique de polyamino- acides synthétiques comme l'acide poly-l-glutamique et l'acide poly-1-aspartique ou des protéines inertes comme l'albumine du sérum humain ou un dextrane fonctionnalisé tel que le carboxymethyl-dextrane peuvent servir de porteurs, dont la dimension peut se situer entre 10 et 60 kilodaltons.