JPH03501166A - 分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分析方法 本発明は分析技術及び該技術を実行するための手段に関する。

特に、溶液中において配位子自体が不安定である状況、あるいは試薬が希薄であ ったり、高価であったり、充分純粋な形態あるいは／または定量化可能な形態に 調合することが困難な状況下における標準分析に用いる液体キャリブレータを提 供する分析技術の改良に関する。

従来のマルチポイント較正分析の方法論は、分析条件の繰り返し起きる多様性に 関連して、未知のサンプルの標準化を促進するものである。このシステムでは、 未知物のバッチ解析が反復較正あるいは未知数を補間する標準曲線と一致するこ とが要求される。

このマルチポイント較正分析の改良は、近年メイヤーとケラ−によってＣ１１ｎ ｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４　（１）　、　１１３−１１７　（１９８ ８）において述べられている。彼らはそこで、末端使用者と無関係に準備された 標準基礎曲線を用いたワンポイント再較正分析を開示している。実際、個々の未 知サンプルは較正分析と並行して分析され、その後、未知数は観測された較正信 号の予想される基礎曲線の値に対する比率を用いて標準化される。その後規定さ れた未知のサンプル信号は蓄積された標準基礎曲線から読み取られ、例えば光学 濃度のキャブレーク、値及び対応する信号を用意し、これは分析条件における小 さな変化により、曲線を跨ぐ偏りを最も適切に予想しそれを最小化する上記曲線 上のある点で値が選択されることを表しており、その後この「シングルポイント 較正Ｊ　（ＳＰＣ）分析は試薬性能における変化のための制御を行い、他の分析 条件は器具により制御される。

このようなタイプの分析と、このような解析のために設計されたキッドにおける 液体キャリブレータの使用は、末端使用者に対して直ちに有益な便利さを与える ものである。残念ながら、多（のアナライト、例えばプロラクチンは液体の状態 では不安定であり、標準溶液は使用前にフリーズドライ配合物から再生する必要 があるであろう、この再生はエンドユーザーにとって不便であるばかりか、より 重要なこととして、かなりの不正確性の原因となり、それがフリーズドライ配合 物の使用を、特に上述のシングルポイント較正分析において潜在的に不正確にし 、且つその使用に大きな制限を加える。このように、本発明は液体配合物のよう に安定である、代わるキャリブレータの使用を含む分析方法を提供する。

最も広い意味で、本発明はサンプル中の配位子のための分析方法であって、 （ｉ）　サンプルを、配位子に対する第１の特定の結合相手、および前記配位子 または配位子アナログに対する第２の特定の結合相手よりなる試薬Ｘのアリコー トと順番にあるいは同時に温置する工程と；前記試薬Ｘは検出可能なラベルに直 接的または間接的に固定され、 （ｉｉ）　前記第１の特定の結合相手の略全でと前記試薬Ｘのある分量を分析媒 体から除去する工程と；前記試薬Ｘの量は前記配位子の量の関数であり、 （ｉｉｔ　）　前記検出可能なラベルによって前記分析媒体から除去された試薬 Ｘの量を決定する工程と；よりなり、前記分析は、前記試薬Ｘのアリコートまた は試薬Ｚ（該試薬Ｚは前記試薬Ｘと類似してラベル付けされた適切な試薬よりな る）のアリコートをそれらの特定の結合相手（前記配位子ではない）と共に温置 する工程を含む標準分析と比較することにより基準化されることを特徴とする。

従来の標準分析は、分析中の配位子の既知量を含む標準溶液を使用している。し かしながら、本発明による標準分析は非配位子キャリブレータを使用している。

本発明の一実施例（以下、実施例（Ａ）という）において、標準分析は、 ｉν）　先に定義した試薬Ｘのアリコートを、前記試薬Ｘの特定の結合相手を含 むキャリブレータ試薬Ｙの標準溶液と共に温間する工程と； ■）　前記キャリブレータ試薬Ｙの略全でと前記工程（ｉ＋）で第１の特定の結 合相手を除去するのに用いられたものと同じ方法で分析媒体から前記試薬Ｘの量 を除去する工程と；その除去される試薬Ｘの量が前記較正試薬Ｙの量に直接比例 し、ｖｉ）　前記工程（ｉＨ）で分析媒体から除去された試薬Ｘの量を決定する 工程と；により行なわれ得る。

実施例（Ａ）において、試薬Ｘに対する特定の結合相手は試薬Ｙにより与えられ る。

他の実施例（以下、実施例（Ｂ）という）において、標準分析は第１の特定の結 合相手とサンプル分析において使用された試薬Ｘの両方の代わりにキャリブレー タ試薬Ｚの標準溶液を用いて実行され得る。このようにして、例えば試薬Ｘが検 出可能にラベル付けされた抗−抗原抗体を含み、第１の特定の結合相手がハブテ ンでラベル付けされた抗−抗原抗体を含む典型的な抗原のためのサンドインチ分 析において、キャリブレータ試薬Ｚは等価的にハブテンでラベル付けされ、かつ 検出可能にラベル付けされた物質を含み得る。好ましくは、キャリブレータ試薬 Ｚは、単にサンプル分析において採用される第１の特定の結合相手をラベル付け するために使用されるハブテンで付加的にラベル付けされる試薬Ｘを含む、かか る実施例において、試薬Ｚに対する特定の結合相手は固体相に結合される抗−ハ ブテン抗体を含み得る。

試薬Ｘが配位子に対する第２の特定の結合相手を含むとき、前記配位子は二つあ るいは更に多くの同一あるいは異なるエビトビツクサイトを運搬すべきであるこ とを理解すべきである。配位子が複数の同一のエビトビツクサイトを運搬する場 合には、当業者は、第２の特定の結合相手が第１の特定の結合相手と同一であり 得ることを認めるであろう。

ここで用いられている「配位子アナログ」という用語は、分析中の配位子と同じ 特定の結合相手の同一の結合サイトと結合可能な種を意味し、２その範囲内での 分析中の配位子の既知量を含んでいる。

試薬Ｘが配位子に対する第２の特定の結合相手含む場合、サンドインチ型の分析 は、配位子の存在下において、配位子によって間接的に第１および第２の特定の 結合相手が複合体を構成し、その結果固定される試薬Ｘの量はサンプル中に存在 する配位子の量に直接比例することが認識されるであろう。サンドインチ型の分 析において、前記試薬Ｘの量と前記第１の特定の結合相手は、分析中の配位子の 量に比例した量の試薬Ｘの結合を達成するために、サンプル中の配位子の量に比 べて過剰に存在するであろう。

一方、試薬Ｘが配位子アナログを含む場合、「コンペティション型」の分析が生 じ、結合される試薬Ｘの量がサンプル中の配位子の量に反比例するように複合体 が形成される。

サンドインチ分析およびコンペティション分析の両方において、サンプル中の配 位子の量を定量化するために適切なサンプルの希薄化が必要となる。実施例（Ａ ）では、サンプル分析と標準分析の両方において、同量の試薬Ｘを用いることが 特に望ましい。

試薬Ｘに対する適切な検出可能ラベルは、放射性同位体、発蛍光団、酵素のよう な免疫分析において従来より用いられているものを含む。

媒体からの第１の特定の結合相手の除去は、当該技術分野において既知のいかな る適切な手段によって実行しても良い。例えば、第１の特定の結合相手は、該第 １の特定の結合相手に対する特定の結合相手を運搬する固体相の手段によって除 去できる。、都合の良いことに、固体相は粒子、ビード、反応容器やインサート の壁面コーティングであってもよい。実施例（Ａ）、（Ｂ）のそれぞれにおいて 、試薬ＹおよびＺを除去するのに類イ以の方法をしても良い。

ここで用いられている「基準化」という用語は、配位子の未知量を含むサンプル 分析から得られる観測された読取値を、標準較正分析から得られる観測された読 取値と比較することを意味する。

従来の標準と異なり単に分析中の配位子の既知量ではない較正試薬ＹあるいはＺ の既知量から得られる読取値は、配位子の様々な既知量を用いて実行される一連 の分析から得られる保管された標準６８曲線、すなわち従来のマルチポイント較 正曲線と比較することによってそれ自体標準化される。このようにして、較正試 薬ＹまたはＺの既知量の分析から得られる読取値は、分析中の配位子の既知量か ら得られる読取値に比例し、その結果、未知サンプルの観測値の基準化に使用す ることができる。

シングル較正分析の使用は面素性と経済性の理由によりて好まれている。しかし ながら成る条件の下で、または成る分析システムについては、他の規準化の使用 、例えばマルチポイント較正曲線を提供するために較正試薬ＹまたはＺの一連の 異なる量の使用が好まれることが理解されるであろう。

本発明の範囲に含めるべく、較正試薬Ｙは以下の４つの基準を満たす必要がある ことは明らかである：１）　較正試薬Ｙはラベル付けされた試薬Ｘに特別に結合 しなければならず； ２）　前記試薬Ｙは第１の特定の結合相手と類似した方法で分析媒体から除去さ れなければならず； ３）　前記試薬Ｙは推測可能かつ信頼できる方法で標準曲線に関連して観測され る読取値に類似する必要があり、ゆえに標準曲線上の配位子量に対して較正可能 であり；また４）　前記試薬Ｙは作用濃度および作用温度において溶液中で安定 していなければならない。

それ自体が検出可能なラベルを含む実施例（Ｂ）で用いられる較正試薬Ｚは、上 記２〜４の点を満たさなければならない。

本発明による分析方法において定義された非配位子較正試薬ＹまたはＺの使用は 、配位子自体が溶液中で不安定である場合、希薄である場合、多数の従来の標準 溶液の長期保管と準備のために充分に純粋な状態で入手することが困難であり、 および／あるいは費用が嵩む場合に極めて有効である。溶液中で不安定な標準値 は、現在のところ、しばしばより安定したフリーズドライ製品として準備される が、必要な再生処理は末端使用者にとっての不便さと、使用前の標準値に溶液の 所定量を加えることによって生じる不正確さをもたらす。

本発明の他の側面によれば、先に定義した試薬Ｘ、分析中の配位子に対する第１ の特定の結合相手、および先に定義した較正試薬ＹまたはＺの標準溶液を含む上 述の分析方法に実行するためのキッドが提供される。

本発明のキッドには、所望するのであれば、試薬Ｙ或いはＺのそれぞれに結合相 手を運搬する固体層よりなる試薬を含めても良い。

以下に本発明の好適な実施例（Ａ）について特に配位子としての抗原を参照しな がら説明する。そこでは、第１の特定の結合相手は前記抗原に対する抗体よりな る。しかしながら、本発明は抗原あるいは抗体の分析に限定されるものではない 。本発明によって分析される配位子の例は、各場合における適切な結合相手と共 に下記の表１に示される。

第１表 聞儂ヱ　牛゛　の。合パートナー 抗原　特定の抗体 抗体　抗原 ホルモン　ホルモン受容体 ホルモン受容体　ホルモン ポリヌクレオチド　補足ポリヌクレオチドストライド　ストライド アビディン　ビチオン ビチオン　アビディン プロティンＡ　免疫グロブリン 免疫グロブリン　プロティンＡ 酵素　酵素共同因子（基質） 或いは反応抑制剤 酵素共同因子（基質）　酵素 或いは反応抑制剤 レクチン　特定の炭水化物 レクチンの特定の　レクチン 炭水化物 本発明方法には非常に広く応用性があるが、特に、ペプチドホルモン（例えば甲 状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、人間の絨毛膜生殖刺 激ホルモン（ｈｃｃ）、小胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インシュリン及びプロラ クチン）を含むホルモン、或いはノンペプチドホルモン（例えばコーチノン、エ ストラジオール、プロゲステロン及びテストステロン、或いは甲状腺ホルモンチ ロキシン（Ｔ４）及びトリイオドチロニン（ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ ）等の甲状腺ホルモン）、プロティン（例えば癌胎児抗原（ＣＥ　Ａ、　）及び アルファフェトプロティン（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｊｎ）　（Ａ　Ｆ　 Ｐ　）　）　、薬剤（例えばジゴキシン）、糖、毒素、ビタミン、インフルエン ザ等のウィルス、バラインフルエンザ、アデノ、肝炎、呼吸器官の及びエイズウ ィルス或いは微生物を文句するのに使用できる。

ここで用いられている「抗体」という用語はその範囲に以下の点を含むものと理 解されたい； （ａ）　例えば羊、うさぎ、やぎ或いはねずみ等の従来から使用されている動物 から得られる例えばＩｇＧ、ＴｇＡ、ＬｇＥ、ＩｇＥ等の免疫グロブリンの種々 のクラス或いはサブクラスの全て、（ｂ）　モノクロナル抗体 （Ｃ）　抗体の完全な微粒子或いは「断片」、モノクロナル或いはボ、リクロナ ル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）　、前記断片とは抗体の結合領域、即ちＦｃ部（例 えばＦａｂ、Ｆａｂ第１および第２、Ｆ（ａｂ第１および第２）ｔのない断片、 或いは完全な抗体内の重量％ェーンの構成要素を結合するディスルフィデボンズ （ｄｉｓｕｌｐｈｔｄｅ　ｂｏｎｄｓ　）の減少した***により得られるいわゆ る「半−微粒子」断片を有するものである。抗体の断片の作成方法は本技術分野 で良く知られているのでここでは説明しない。

ここで使用されている「抗体」という用語は永久的な抗原種類（例えばプロティ ン、バクテリア、バクテリア断片、細胞、細胞断片及びウィルス）、及び適切な 条件下で抗原にされるハブチンの両方を含むものと理解されたい。

而して、本発明の一実施例において、配位子はハブテンあるいはプロラクチンの ような複エピトープ抗原であり、第１の特定の結合相手がポリクロナルあるいは モノクロナルである抗体である。

第１の特定の結合相手は、該第１の特定の結合相手に対する特定の結合相手を運 搬する固体相の手段によって分析混合物から効果的に除去され得る。このように して、例えば固体相が、その中で第１の特定の結合相手が生じさせられた種に向 けて方向付けられた抗種抗体を運搬し得る。一方、第１の特定の結合相手がＦＩ ＴＣのようなハブテンでラベル付けされる場合、欧州特許第０１０５７１４号公 報に記載された技術によって、固体相が前記ハブテンアナログとは反対に方向付 けられた抗体を運搬し得る。

本発明によるサンドインチ型分析において、例えば試薬Ｘが分析される抗原に対 する抗体を含む場合、較正試薬Ｙば、その内部で試薬Ｘ抗体が生じた種とは反対 に方向付けられた抗種抗体の既知量を含み得る。

一方、例えば試薬Ｘが分析中の抗原のアナログよりなる本発明によるコンペティ ション型の分析では、較正試薬Ｙは前記第１の特定の結合相手の抗体の既知量を 含んでいても良い。

本発明による方法は、サンドインチ型分析の場合に特に有効であることが理解さ れよう。その理由は、若し試薬Ｘが同じ種の内部で生じ、そして若し同じくハブ テンでラベル付け、すなわちＦＩＴＣでラベル付けされた第１の特定の結合相手 が使用された場合、シングル型の較正試薬Ｙは異なる配位子に対するいかなる数 の異なる分析キッド類においても使用可能であるからである。

本発明による方法および装置類は、−ζ力ｊλ吠、例えば欧州特願公開第１．７ １１４８号公報に記載されたような光学的免疫分析、あるいは例えば欧州特願公 開第１１２７２１号公報に記載されたような表面プラズモン共鳴を表示可能な光 学的構造体を含む多くの異なるタイプの分析装置に関連して使用するのに適して いる。

本発明をより深く理解するために添付図面を参照し、第１図はサンドインチ型の 免疫複合体を図式的に示すもので、１は固体相の羊の抗マウスポリクロナル抗体 、２はＰＩＴＣでラベル付けされたマウスの抗ｈＰｒｌモノクロナル抗体、 ３はプロラクチン（ｈＰｒｌ　）抗原、そして４は酵素でラベル付けされたマウ スの抗ｈＰｒｌモノクロナル抗体である。

第２図は本発明の実施例（Ａ）によるサンドインチ型の免疫複合体を図式的に示 すもので、 ｌは固体相の羊の抗マウスポリクロナル抗体、２はＦＩＴＣでラベル付けされた 羊の抗マウスポリクロナル抗体、そして ３は酵素でラベル付けされたマウスの抗ｈＰｒｌモノクロナル抗体である。

第３図〜第７図は「例」において参照される曲線、第８図および第９図はそれぞ れ新鮮な試薬と老化した試薬のためのプロラクチンの相関関係曲線、 第１０図は実施例（Ｂ）に基づいて形成された複合体を図式的に示すもので、 ｌは抗ＦＩＴＣ固体相、そして ２は検出可能なラベルＬも運搬するＦＩＴＣでラベル付けされた抗体である。

例えばプロラクチンのための従来の標準サンドインチ分析において、キャリブレ ータは分離のための固体相と、例えば第１図に図式的に示すような信号発生のた めのトレーサー試薬との間のリンカ−またはブリフジとして作用する分析中の配 位子（プロラクチン）の既知量となる。

しかしながら、以下において例示され、且つ第２図において図式的に示される本 発明の実施例において、ＰＩＴＣでラベル付けされた羊の抗マウスポリクロナル 抗体は、羊の抗ＦＩＴＣ固体相分離システムと酵素でラベル付けされて信号を発 生するマウスモノクロナル抗体との間の架橋成分を形成するためのキャリブレー タ試薬Ｙとして使用されている。

プロラクチンはすぐ使用可能なキャリブレータに対して要求される４°Ｃの液体 状態で保管された場合に周知のように不安定であり、これまで知られている全て のプロラクチンの免疫キットの製造者は、ホルモンのフリーズドライ配合物の使 用に代わる手段を提供していない。約９カ月の試薬の在庫可能期間にわたる安定 性がフリーズドライ製品について保証されているが、そのことが上述の不都合を もたらしており、したがって本発明の分析方法の利点は明確である。

以下の非限定的な例は、本発明に基づいて実行される分析方法を示すものである 。

モノクロナル抗体は、ミスティンとコラ−によってＮａｔｕｒｅ２５６（１９７ ５）　４９５−４９７で報告された方法でマウス腹水液から入手された。

個々の複合腫細胞ラインから得られた抗体は、分離した抗原決定因子からこれ等 の製造抗体を区別するために選り分けられた。

プロラクチンに対する最も高い類似性を持つものは分析に使用するために選別さ れた。

２、アルカリフォスファターゼ　′プロラクチンコンジュゲート■準盪 ０．１６ｄのＮ−こはく酸イミド４−（Ｎマレイン酸イミドメチル）シクロヘキ サン−１−カーボオキシレイト（ＳＭＣＣ）（ジメチルフォルムアミド−ＤＭＦ 中の６０ｄ）が１．６　ｍｌのアルカリフォスファターゼ（５０Ｉｄの硼酸ナト リウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、０．１ｍＭの塩化鉛、Ｐ）１７．６中の２ ■／ｄ）に加えられ、３０°Ｃで１時間温置された。酵素は、０．１　Ｍ　Ｔｒ ｉｓ、１ｓ＋Ｈの塩化マグネシウム、０．１ｍ１ｌの塩化鉛１、ＰＨ７，０にお いて平衡化されたセファデックスＧ−２５ミイデイアムコラム（ｌＸ３５ｃｍ） の通路を通って分離された。精製された酵素は＋４°Ｃで必要な時まで保管され た。

１６．３μＬのＮ−こはく酸イミド３−（２−ニチオン酸ピリジン）プロピオネ ート（ＳＰＤＰ）（エタノール中の２５−Ｍが、１−の抗プロラクチンモノクロ ナル抗体（２００ｍＭのプロピオン酸ナトリウム、ｐｕｓ、ｏ中の３■／ｄ）に 加えられ、室温で３０分温装置れた。抗体は２００ｍＭの酢酸ナトリウムバッフ ァー、ｐ）１４．５において平衡化された有効なセファデックスＧ−２５コラム （ＰＤ−１０）を通って分離された。ジチロチレイトル（ＤｉｔｈｉｏＬｈｒｅ ｉｔｏｌ）　（ＩＭ）が抗体（加えれた抗体の容積の１／２０）に加えられ、室 温で１０分放置された。抗体は２００＋ａＭのプロピオン酸ナトリウム、ｐＨ６ ，０においてセファデックスＧ−２５メデイアムコラム（ｌＸ３５ｃｍ）を用い て塩分を除去された。

上述のようにして調整された抗体およびアルカリフォスファターゼは、等モル比 で混合されて結合のために４°Ｃで２４時間放置された。その結果生したコンジ ュゲートは、２００ｍＭのプロピオン酸ナトリウム、ｌｌＩＩＭの塩化マグネシ ウム、０．１＋１Ｍの塩化鉛、ｐｌ＋６．０において平衡化されたＴＳＫ３００ ０ＳＷコラムの高性能液体クロマトグラフィー（Ｈｌ）ＬＣ）によって精製され た。コンジュゲートは、分析に使用するために分析バッファーで２，５μｇ／ｄ の濃度に薄められた。

３、ｌ　′イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に（；ムされた近プロラクチンモノ クロナルパ　の アルカリフォスファターゼに結合された抗体よりもプロラクチン分子の異なるエ ピトープに対して特有な抗プロラクチン抗体は、２、３　ｄの炭化水素塩バッフ ｙ　−（０，０２Ｍ　、ｐＨ９，１）に溶解され、５００μｌの０．５■／ｄＦ ＩＴｃに混合された。

４°Ｃで１８８時間温置た後、コンジュゲートはプロピオン酸ナトリウムバッフ ァー（０，２Ｍ　、ｐＨ６，０）で平衡化されたセファデックスＧ−２５コラム を通過して精製された。

４、　イソチオシアネー　（ＦＩＴＣに　人された　の　マウス五体葛準１ 抗マウス抗体は、精製されたマウスＩｇＧで羊を免疫化することによって得られ る従来のポリクロナル抗血清である。得られた抗血清は１８％−／Ｖのナトリウ ムサルフヱート（Ｓｕｌｐｈａｔｅ）を用いた塩化ナトリウム沈澱によって２回 精製され、その後、０．２ＦＩのナトリウムプロピオネートバッファー、ｐＦＩ ６．０で平衡化されたＴＳＫ３０００ＳＷシリカ系ＨＰＬＣコラムを通って最終 的に精製された。それから抗体プールは２．ＯＭのナトリウム炭酸水素塩バッフ ァー、ｐｕｓ、ｏで透析された。その後精製された抗マウス製品は上述のように ＦＩＴＣに結合された。

５、堆止可ｍ奏里葬皿至去−士人されるｔ＝ＦＩＴＣ−の。

抗マウス抗体は、羊を鍵穴あお貝ヘモチアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｉｍｐｅｔｈ ａｅｓ＋ｏｃｙａｎｉｎ）に結合されたＦＩＴＣで免疫化することによって得ら れる従来のポリクロナル抗血清である。磁化可能なセルロース粒子は、約５０％ の平均粒子直径３ミクロンの黒色酸化鉄（Ｆｅｚ　０４）（Ｆｏｒｒｅｓｔ　ａ ｎｄ　Ｒａｔｔｌｅ”ＭａｇｎｅＬｉｃ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｒａｄｉｏｆ＋ｎ ｍｕｎｏａｓｓａｙ”　１ｎＩｓｕａｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｃ１ｊｎｉｃ ａｌ　Ｃｈｅ＋ｍｔｓｔｒｙ＋ｐ、１４７−１６２＋Ｅｄ、Ｈｕｎｔｅｒ　ａｎ ｄＣｏｒｒｉｅ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂｕ ｒｇｈ（１９８３）を参照されたい）を含むセルロース複合物である。抗ＰＩＴ Ｃ抗血′清は、Ａｘｅｎ　外、Ｎａｔｕｒｅ２１４，１３０２−１３０４（１９ ６７）の方法に基づくセルロースの臭化シアン活性化による磁化可能なセルロー スに共有結合される。抗血清は磁化可能な固体相】グラムについて２ｄの比率で 結合された。

固体相は、０．１％のアジ化ナトリウム、０．５％の牛の血清アルブミン（ＢＳ Ａ）、フラクション■、０．２５％のＴｗｅｅｎ２０．０．５％のメトセル（ｍ ｅｔｂｏｓｅｌ　Ｉ）を含む５０ＩＩＩＭのＴｒｊｓ／ＨＣＩバッファー、ｐＨ ８，０で、６．０■／ｄに薄められた。

６、プロラクチン　°Ｌの′ 国際基準配合物７５１５０４に対して較正されたフリーズドライプロラクチンの 配合物は、加熱して不活性化された牛の血清内で０．２．０９．５．２４．９． ９５．２５．５３．９９．０５．２４７．３μｇ／ｄ　（１，ｎｇ／ｄ＝　２０ 　ｕ　Ｕ／ｄ）に薄められた。

７、バッファーの 分析バッファーは、０．５％のＢＳＡ、フラクション■、０．２％の羊の血清、 １ｍＭの塩化マグネシウム、０．１＋ＩＩＭの塩化亜鉛、０．１１の塩化ナトリ ウム、および０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ、ｐｉ＋ｓ、ｏ中の０．２％のアジ化 ナトリウムより構成された。

８、′°バッファーの 洗浄バッファーは、０．０１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣＩ、　ｐＨ８，６中の０．９％ の塩化ナトリウムより構成された。

９、　バッファーの準 基質バッファーは、１．１Ｍのジェタノールアミン溶液、０．９％の塩化ナトリ ウム、およびｐＨ８，６の１ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ８，６より構成され た。したがって、このバッファーはその中に熔解したアルカリフォスファターゼ （３，０＋ｍＭのフェノールフタレイン・モノフォスファターゼ）のための基質 を備えている。

（３−［シクロへキシルアミノコ−１−プロパンスルホン酸）よりなる溶液を、 ２４０１のＮａ０）ｌを加えてｐ）Ｉ　１３．４に調節することにより準備され た。

分扼■方法鍮 １００μ！アリコートの各標準、キャリブレータあるいは未知サンプルがピペッ トでポリスチレンの分析チューブに二重に移された。適切な抗体コンジューゲー トのそれぞれ１００μｌが各チューブに加えられた。全てのチューブは混合され 、３７°Ｃで１５分間温１された。

続いて、２００μ２の磁化可能な抗ＦＩＴＣ固体相が各チューブに加えられ、３ ７°Ｃで５分間温間された。

固体相を磁気分離した後、上澄みが汲み出されて５００μ２の洗浄バッファーが 全てのチューブに加えられた。チューブは混合されて再び磁気的に分離され、上 澄みが汲み出された。この洗浄行程は更に２度繰り返された。

３００μｌの基質溶液が全てのチューブに加えられ、それらのチューブは混合さ れて３７度で１０分温装置れた。

１、０　ｄの停止溶液が全てのチューブに加えられ、その後分析物は磁気的に分 離された。

上澄みの吸光度は、海洋科学ケミスタット分光光度計（ＯｃｅａｎＳｃｉｅｎｔ ｔｆｊｃ　Ｃｈｅｍｓｔａｔ　Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で５５０ ｎ＋＊および４９２ｎ類で測定された。２重波長の使用は欧州特許第２４９３５ ７号公報で引用されているように通用可能である。

３Ｊ−原キヤリプレータを択および軒正する最適の較正チューブは、再生された フリーズドライキャリブレークを用いたシングルポイント較正（ＳＰＣ）から得 られる標準曲線と交差するサンプル測定の正確度と精密度の双方に関して評価さ れた。１０本の標準曲線と照査基準（ｃｏｎｔｒｏｌ）が引かれた。

基礎曲線が１０本の曲線を纏めることにより描かれる。５個のパラメータの記号 論理学的な適合プログラムによって適合されるこの基礎曲線は、適合過程によっ て作られる５個のパラメータで決定される。而して、基礎曲線は欧州特許第０１ ９０００６号公報に記載された公式と共に適切なキャリブレータを決定するため に使用された。

テストされた範囲から選択されたキャリブレータ値（各標準はキャリブレータ値 に他の中間抗原値を加えたものとして順次作用される）は、精密度と正確度の間 の最適な中間物となる。

第３図は、未知のサンプル信号を基準化するためにＳＰＣを持つ選択されたフリ ーズドライキャリブレークを用いて得られたＳＰＣ未知サンプルの精密度を示す もので、その未知のサンプル信号は基礎曲線から読み取られ、従来の標準曲線か ら読まれた値を持つ同じサンプルのために得られた精密度と比較される。各サン プルは１０の別個の分析における両方の過程によって評価される。

一方、第４図ａは、範囲内において観測される平均ＳＰＣバイアス度％を示すも のである。バイアス度は次のようにして計算された： （基準値−５ｐｃ値）／（基準値）Ｘ１００基準値は基礎曲線からめた値から得 られる。抗原キャリブレータの値を選択した後、分析バッファーにおける希釈に よって非抗原キャリブレータが滴定される（第５図参照）。様々な濃度の非抗原 キャリブレータは分析され、選択された抗原のそれに類似したＯＤを与える濃度 が選択されて較正された（即ち、未知値として標準曲線と共に分析された）。そ の対応する抗原値は標準曲線から補間された。このようにして、等価な抗原値が 次のようにして非抗原キャリブレータに割り当てられた。

ｘＯＤユニットを有する抗原キャリブレータ濃度（ｎｇ／ｄあるいはμＵ／ｄ） は等価な抗原値を有するｙＯＤユニットの非抗原キャリブレータ（ｎｇ／ｄある いはμＵ／ｄ）と等しい。

濃度１．２μｇ／ｄの羊の抗マウスＦＩＴＣの非抗原キャリブレータは、５．３ ４の○Ｄ５５０ｎｍを示し、８２．４４ｎｇ／ｘｄｌの標準曲線から読まれた等 価な抗原値を有していた。

非抑原キャリブレータの性能を示すためのｎｇ／ＩｄおよびＯＤで表される非抗 原キャリブレータ値を確率した後、フリーズドライキャリブレークに関するシン グルイント較正工程が実行される。第６図は、未知信号を基準化する非抗原キャ リブレータを用いて得られた、未知のＳＰＣサンプル値の精密度を示しており、 未知信号はその後精密度図から得られる標準曲線対基礎曲線から読み取られる。

各サンプルは再び１０個の別個の分析における両工程によって評価される。第４ 図すはＳＰＣが非抗原キャリブレータと共に加えられた際に観察される平均バイ アス度％を示している。

非抗原キャリブレータの性能はこれらの実験においてフリーズドライ抗原の性能 と同等であることが示される。

標°曲　に・する非　、キャリブレータの性情を只すための臨床的な有効性： ■ 標準曲線の検出限界は、各標準曲線のゼロ信号を１０回反復したものの平均値（ χ）に２つの標準偏差（２ＳＤ）を加えたものどして評価された。この値ｘ＋２ ３Ｄは標準曲線から読み取られた。

ＳＰＣによる検出限界は２つの方法によって決定された：１）標準曲線のために 得られたゼロ信号の１０回反復した値Ｘ＋２３Ｄ　ＯＤは、キャリブレークを用 いてＳＰＣに基準化された。

この基準化されたＯＤ信号はその後基礎曲線から読み取られる。

２）別のゼロ信号およびキャリブレークは分析された。各較正信号はその一対の ゼロ信号を基準化するために用いられた。基準値の平均はその後ＳＰＣ検出限界 を与える基礎曲線から読み取られた。

以下の第２表は、検出限界におけるＳＰＣの効果を示している。

第２表■二監■ 較正比−基準比＝予怨較正値／観測較正値ＳＰＣを持つ検出限界の試薬の老化効 果も評価された。抗体コンジュゲート試薬は３０゛Ｃで７日保管された。この結 果、酵素活性度が減少し、上記老化した試薬と共に得られた最終的なＯＤとなっ た。したがって、老化実験は、キャリブレータが基礎曲線から読み取られた時に 正しい結果を与える弱めた信号を基準化できるか否かを評価するように意図され た。第７図はその結果を示しており、非抗原ＳＰＣの得られた感度と標準曲線の 得られた値が僅かに異なっていることを示している。

正亘皮Ｚ貝火及釈 分析の正確度は次の２つの方法によって推定される：１）精製されたプロラクチ ンの様々な濃度は、一連のうっ血された（ｐｏｏｌｅｄ）患者サンプルに加えら れる。結果は標準曲線に一致させる工程とシングルポイント較正工程によって計 算される。

２）各患者サンプルはプロラクチン分析希釈を用いた２倍の希釈によって希釈さ れる。結果は標準曲線とシングルポイント較正によって計算される。

新鮮な試薬と老化した試薬（３０°Ｃで５日間）の両方が用いられ、その結果は それぞれ第３表と第４表においてスパイクされたサンプルと希釈されたサンプル に対して示されている。

第　３　表　スパイキングおよｑ」旧ｘｊシニク−第　４　表　患　サンプル解 　上の希、第５表には高患者サンプルの大きな特徴的な希釈が示される。

かかるサンプルは標準曲線の範囲から読み取られ、したがって測定可能な値を示 すように希釈されなければならない。標準曲線から観測された回復率％と新鮮な 試薬および老化した試薬の両方を用いたシングルポイント工程は許容できた。

第　５　表　患　サンプルの　・な希　−準曲線に合させるために希釈された極 めて高いサンプル、色　サンプル 患者サンプル値はプロラクチンＩＥＭＡ標準曲線、および新鮮な試薬と老化した 試薬を用いたシングルポイント較正によって計算された．同じサンプルがまたプ ロラクチンＩＥＭＡにおいて評価された。

以下の数式と回帰係数が得られる。

ＩＥＭＡの新鮮な試薬標準曲線に対するＩＨＭＡの新鮮な試薬ＳＰＣａ）ＩＥＭ Ａ　ＳＰＣ＝０．８９２１ＥＭ八　曲線−１．９　５　Ｘ　１　０−”Ｒ＝０． ９９７９ Ｎ＝５０ 第８図参照 ｂ　）　ＩＥＭＡの老化した試薬ＳＰＣに対するＩＥｌＩＡの老化した試薬標準 曲線 ＩＥＭＡＳＰＣ＝０．８７６　１ＥＭＡ曲線ー０．７Ｒ＝０．９９８１ Ｎ＝５０ 第９図参照 ｃ　）　ＩＨＭＡの新鮮な試薬標準曲線に対するＩＲＭＡ　ＭＡＩＡ　ｃｌｏｎ ｅ　（Ｓｅｒｏｎ。

Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｌｔｄ） ＩＥ？ＩＡ＝　１．　０　８　ＩＲンＡ−０．５４Ｒ＝０．９９２Ｏ Ｎ＝５０ この研究によるシングルポイント較正値は新鮮な試薬および老化した試薬のため の標準曲線値よりも約１０％低く読み取れるように思われるが、それにもかかわ らずＳＰＣによって得られる結果は許容可能である。

豊作 人間の胎盤ラクトゲン（ＨＰＬ）と人間の成長ホルモンの公差反応は、第６表に 示されるシングルポイント較正で検査された。

新鮮な試薬および老化した試薬について観測される交差反応間に際立った差異は ない。

メ」」１ｍｌ肛１ヌ四υζ引鰻説 第３図は精密度を示す図で、 Δ−△は前述のシングルポイント較正（ＳＰＣ）におけるフリーズドライ抗原キ ャリブレータ、また ・−・はマニュアル標準曲線の精密度である。

第４図はバイアス度を示す図で、 ａはフリーズドライ抗原キャリブレータ、ｂは非抗原キャリブレータ、また １（ＰＲＬは人間のプロレクチンである。

第５図ａおよび第５図すは羊の抗マウスＦＩＴＣ　（非抗原キャリブレータ）の 滴定を示す図である。

第６図は精密度を示す図で、 Ｏ−Ｏは非抗原キャリブレータ、また ・−・はマニュアル曲線値である。

第７図は精密度についての試薬老化効果を示す図で、Δ−△は非抗原キャリブレ ータ、 ・−・は標準曲線、また ×−×はキャリブレータ基準化要素（日数値％）である。

Ｅ ％Ｃ１■ バイアス度（％） ％〔Ｖ 検出限界（ｎｇ／ｍり 新鮮な試薬のシングルポイント較正 老化した試薬のシングルポイント較正 国際調査報告 国際調査報告 ＧＢ　８９００Ｓ６８ ＳＡ　２ε８８７

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．サンプル中の配位子のための分析方法であって、（ｉ）前記サンプルを、前 記配位子に対する第１の特定の結合相手、および前記配位子または配位子アナロ グに対する第２の特定の結合相手よりなる試薬Ｘのアリコートと順番にあるいは 同時に温置する工程と；前記試薬Ｘは検出可能なラベルに直接的または間接的に 結合され、 （ｉｉ）前記第１の特定の結合相手の略全てと前記試薬Ｘのある分量を分析媒体 から除去する工程と；前記試薬Ｘの量は前記配位子の量の関数であり、 （ｉｉｉ）前記検出可能なラベルによって前記分析媒体から除去された試薬Ｘの 量を決定する工程と；よりなり、前記分析は、前記試薬Ｘのアリコートまたは試 薬Ｚ（該試薬Ｚは前記試薬Ｘと類似してラベル付けされた適切な試薬よりなる） のアリコートをそれらの特定の結合相手（前記配位子ではない）と共に温置する 工程を含む標準分析と比較することにより基準化されることを特徴とするもの。
2. ２．前記標準分析は前記試薬Ｘのアリコートをその特定の結合相手と共に温置す る工程を有すると共に、前記試薬Ｘのための特定の結合相手はキャリブレータ試 薬Ｙの標準溶液を有し、また前記標準分析は更に、 （ａ）キャリブレータ試薬Ｙの略全てと前記試薬Ｘのある分量を、前記工程（ｉ ｉ）において前記第１の特定の結合相手を除去するために用いられたものと同じ 方法で前記分析媒体から除去する工程と；除去された前記試薬Ｘの量は前記キャ リブレータ試薬Ｙの量に直接比例し、 （ｂ）前記工程（ｉｉｉ）のように、前記分析媒体から除去された前記試薬Ｘの 量を決定する工程と；を含む、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．同量の前記試薬Ｘが前記サンプルの分析と前記標準分析に使用される、請求 の範囲第２項記載の方法。
4. ４．分析中の前記配位子は抗原である、請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに 記載の方法。
5. ５．前記抗原はプロラクチンである、請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．前記試薬Ｚを用いて分析を基準化する、抗原を分析するための方法であって 、 前記試薬Ｘは前記抗原に対して検出可能にラベル付けされた抗体よりなり、前記 第１の特定の結合相手は前記抗原に対してハプテンでラベル付けされた抗体より なり、前記試薬Ｚは等価にハプテンでラベル付けされ且つ検出可能にラベル付け された要素よりなる、請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記試薬Ｚは前記第１の特定の結合相手に使用されたものと同じハプテンで 付加的にラベル付けされた前記試薬Ｘを含む、請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．前記検出可能なラベルは放射性同位体、発螢光団または酵素である、請求の 範囲第１〜第７項のいずれかに記載の方法。
9. ９．請求の範囲第１項で限定された試薬Ｘ、分析中の前記配位子に対する第１の 特定の結合相手および請求の範囲の第１項で限定された試薬Ｚの標準溶液よりな る、請求の範囲第１項記載の分析方法を実行するためのキット。
10. １０．前記キットが請求の範囲第１項で限定された試薬Ｘ、分析中の配位子に対 する第１の特定の結合相手および請求の範囲第２項で限定された試薬Ｙの標準溶 液よりなる、請求の範囲第２項記載の分析方法を実行するためのキット。