JPH03500415A - インターロイキン２類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン■類似体 本発明は、−ｍ的には遺伝子材料の操作、より特定的には、インターロイキン■ 類似体の発現を達成する組換え手順で有用な特異的ＤＮＡ配列の製造に係る。 １１へ１１ 分子量約１５，０００の糖タンパク質であるインターロイキンＩＩ　（ＩＬ−２ ）は、体内免疫応答をコントロールするリンフ才力インと呼ばれるタンパク質の グループに属する。　ＩＬ−２はある種の白血球、レクチン−または抗原−活性 化Ｔ細胞によって産生され、体内免疫系においてリンパ球調節分子として中心的 な役割を果たす。 ＩＬ−２は、胸腺細胞***誘発を促進し、活性化ＴＭｉ胞クワクローン期国ツ工 ■−増殖を刺激し、細胞障害性Ｔ細胞反応性を誘発し、活性化Ｂ細胞及びリンフ 才力イン活性化細胞に対する免疫作用を調節し、ヌードマウス牌細胞の培養物中 のプラーク形成性細胞応答を誘発し、γインターフェロンの産生を調節すると報 告されてきた。　ＩＬ−２はまた、天然キラー細胞活性を増加させ、選択された 免疫不全状態のリンパ球の免疫機能の回復を媒介する。 更に実験室では、機能的モノクローナルＴ細胞の培養物を維持してＴ細胞分化の 分子的性質を研究するため、及び、分化したＴ細胞の機能メカニズムの解明を助 けるためにＩＬ−２が使用されている。従って、ＩＬ−２は、悪性新生物及び免 疫不全疾患の研究及び治療の双方に有用である。 ＩＬ−２は、標的細胞の表面の特異的高親和性レセプターに結合することによっ てその効果を発揮する。従って、ＩＬ−２分子は、免疫応答における細胞増殖を 調節するレセプター−エフェクター相互作用の研究の焦点となる。 標的細胞に対するＴＬ−２の作用を媒介する主体となる高親和性（ＫＤ〜１０− １１Ｍ＞レセプターは、サイズ５５ｋＤ（ｐ５５またはＴａｅ）及び７５ｋＤ（ ｐ７５）の異なる２つの膜結合タンパク質から成る。これらの２つのタンパク質 の各々は、単独ではＩＬ−２に対する見掛は親和性の低い（ＫＤ〜１０−＠Ｍ） レセプターとして作用し、ＩＬ−２活性には両方のタンパク質が必要である。 このことは、ＩＬ−２が活性を発揮するためにはｐ５５及びｐ７５の双方と結合 して三量体の複合体を形成する必要があること、従って、ＩＬ−２が異なる２つ のレセプター結合部位を有していなければならないことを示唆する。 末梢血液リンパ球及び腫瘍細胞系から得られる精製された天然ＩＬ−２の量は少 ないので、組換えＩＬ−２の産生ができるようになるまではこのリンフ才力イン の生物学的役割を十分に研究することができなかった。 Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、等はＮａｔｕｒｅ、　３０２：３０５〜３１０（１ ９８３）に、Ｊｕｒｋａｔ白血病細胞系に由来の部分精製ＩＬ−２ｍＲＮ＾から 調製されたｃＤＮ＾ライブラリィからクローニングされたヒトＩＬ−２をコード する相補的ＤＮＡの配列解析、クローニング及び発現を記載した。ＩＬ−２は１ ３３個のアミノ酸残基を含み、計算分子量約１５，４２０であると発表された。 　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉは、培養サルｃｏｓｓ胞中でのＩＬ−２のｃＤＮ＾のクロ ーニング平原及び発現を記載している。この文献には、大腸菌中でのＩＬ−２ｅ ＤＮ＾の発現はまだ成功していないと記載されている。　１９８４年９月１９日 付けの欧州特許出願第１１８，６１７号、１９８４年９月１９日付けの同１１８ ，９７７号、及び１９８４年９月２６日付けの同第１１９，６２１号、並びに米 国特許第４，７３８，９２７号も参照されたい。 ＲｏｓｅｎｂｅｒＨ等は５ｃｉｅｎｃｅ、２２３：１４１２’−１４１５（１９ ８４）に、Ｊｕｒｋａｔ腫瘍細胞系及び正常ヒト末梢血液リンパ球に由来のＩＬ −２遺伝子の別のｃＤＮ＾クローンの単離を報告している。彼等は、大腸菌に遺 伝子を挿入し、ポリペプチド産物を精製し、その生物学的活性を検定した。ヒト ＩＬ−２遺伝子の部位特異的突然変異誘発に関しては、Ｈａｎｇ等、　５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２２４：１４３１〜１４３３（１９８４）及び１９８４年５月３０日 付けの欧州特許出願第１０９゜７４８号を参照されたい。 ＩＬ−２の変形（ｍｏｄｉｒ　１ｅａｔｉｏｎ）に関する文献としては、Ｊｕ等 。 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：５７２３（１９８７）；Ｌｉａｎｇ等 、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。 競上：３３４（１９８６）及びＭｉｙａｊｉ等、＾ｇｒ’＋ｃ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、　５１：１１３５（１９８７）がある。 免疫療法の研究で現在使用されているＩＬ−２含有調製物に代替して使用できる 精製ＩＬ−２類似体を量産する方法及び材料の開発は極めて重要な課題である。 本発明の目的は、改良された形態のＩＬ−２を提供することである。 本発明の目的はまた、現在使用されているＩＬ−２調製物よりも毒性の少ないＩ Ｌ−２類似体を提供することである。 生物学的活性に影響を与えることなくリガンドを結合し得るＴＬ−２類似体を提 供することも本発明の目的の１つである。 更に、本発明の目的は、ＩＬ−２の精製方法を提供することである。 本発明のその他の目的及び諸特徴は、以下の記載及び請求の範囲より十分に理解 されよう。 光１１ケＪＬＬ 本発明は、変形されたレセプタードメインを有するＩＬ−２類似体及び安定なＩ Ｌ−２構造を有する類似体に係る９本発明はまた、リガンドを結合し得るように 改変されたＩＬ−２類似体に係る。より特定的には本発明は、宿主細胞による人 工遺伝子（イａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ　ｇｅｎｅ）の発現産物であるポリペプチ ドに係る。該ポリペプチドは以下の式［１］、Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ 　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＧｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＬｅｕ　Ｇｌｎ　Ｍ ｅｔ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　ＡｓｎＴｙｒ　Ｌｙ ｓ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　ＬｅｕＴｈｒ 　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ Ｔｈｒ　Ｃ１ｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　［１コＧｌｕ　にＩｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｃ１ｕ　に ｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ＾ｓｎ　Ｌｅｕ＾Ｉａ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ 　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ＾ｒｇ　Ｐｒｏ＾ｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓ ｅｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　ＡｓｎＶａｌ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅ ｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ 　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｃ１ｕＴｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　 Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＡｒｇＴｒｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐ ｈｅ　Ｘ　にＩｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　５ｅｒＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ で示されるアミノ酸配列を有しており、式中の４７．５１．８０．８１．１０６ ．１０９．１１２．１１９．１２０．１２３．１２７．１３１及び１３３番目の 出発アミノ酸残基の少なくとも１つが置換アミノ酸残基によって置換されるか、 または、８．４７．４８．５１．５４．８０．８１．１０６．１０９．１１２． １１９．１２０．１２１．１２３．１２７．１２９．１３０．１３１．１３２及 び１３３番目の出発アミノ酸残基の少なくとも２つが置換アミノ酸残基によって 置換され、及び／または、カルボキシ末端に１つの付加的残基が結合し、ＸはＣ ｙｓ、Ａｌａ及びＳｅｒから成るグループから選択されている。 本発明はまた、以下のＩＬ−２類似体を包含する：ＩＬ、＝２の１つまたは複数 の任意のへリックス（好ましくはへリックスＡ及び／またはへリックスＦ）中の １つ、２つ、３つまたはそれ以上の出発アミノ酸が該ヘリックスの両親媒性を維 持または弱める置換アミノ酸によって置換されたＩＬ−２類似体；ヘソックスＡ 、Ｂ、Ｂ’及び／またはＥ中の１つ、２つ、３つまたはそれ以上の出発アミノ酸 が出発アミノ酸とは異なる電荷を有する置換アミノ酸によって置換された顕似体 ；ヘソックスＡ、Ｂ、Ｂ’、Ｃ，Ｄ、Ｅ及び／またはＦ中の１つ、２つ、３つま たはそれ以上の出発アミノ酸が、αへリックス椹造に対して出発アミノ酸よりも 優先性の置換アミノ酸によって置換された類似体０本発明はまた、かかるポリペ プチドをコードする人工（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ）ＤＮＡ配列に係る。 更に、本発明はかかるペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体、並びに ＩＬ−２及びＩＬ−２類似体の精製方法に係る。 ・′　の、ｔ；Ｂ 第１（＾）図はＩＬ−２のα炭素主鎖の説明図である。第１（Ｂ）図はへソック スを円筒で示すＩＬ−２の立体構造の説明図である。 第２図はＩＬ−２とそのレセプターとの可能な相互作用モードを示す概略図であ る。 第３図はＩＬ−２ｉ造及び対応するアミノ酸の位置を示す説明図である。 １ｉｒＩ監 インターロイキンＩＩ　（’ＩＬ−２Ｊ）の新規なポリペプチド類似体が知見さ れた０本発明の第１の実施態様では、天然ＩＬ−２の推定された（ｐｒｏｐｏｓ ｅｄ）レセプター結合ドメインの部位特異的変形（ｓｉｔｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃ 　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び、Ｉし２螺旋構造及びＩＬ−２全体構造を 安定させる改変（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）が得られる。第２の実施態様では、推 定されたレセプター結合ドメインからは遠く隔たっているが別の分子との化学反 応は容易なＩＬ−２の部位に異常（ｏｄｄ）システィンのごときアミノ酸を組み 込む。 本発明はまた、選択された微生物宿主（例えば、細菌、酵母及び培養哺乳類細胞 ）中で前記ＩＬ−２類似体の合成を指令し得る人工遺伝子を提供する。好ましい 形態の人工遺伝子においては、塩基配列が、予定の宿主微生物例えば大腸菌中で のコドンの発現優先性に基づいて、同じアミノ酸を特定する複数の代替可能コド ンから選択された１つまたはそれ以上のコドンを含む（＾］　ｔｏｎ等、国際出 願ＷＯ３３１０４０５３）　。 別の好ましい形態の人工遺伝子は、コードされるポリペプチドの付加的アミノ酸 残基（例えば開始Ｍｅｔ残基）を特定するコドンのヌクレオチド塩基を含む、こ れは、大腸菌中での直接発現を容易にする。更に別の好ましい形態の人工遺伝子 においては、所望のポリペプチドを特定するコドンの塩基配列の上流及び／また は下流及び／または内部に、発現ベクターの形成またはポリペプチド類似体の新 しい構造遺伝子の発生を容易にする１つ以上の塩基配列が存在する。 即ち、構造遺伝子の一端または両端または中間位置に、選択された制限エンドヌ クレアーゼ開裂部位を与える塩基配列と、リポソーム結合部位を与える配列、例 えばＣ＾＾ＣＧ八〇ＧＴへ存在する。 本発明はまた、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の種類及び／または位置が天 然ポリペプチドとは異なるようなＩＬ−２類似体の微生物発現を指令し得る人工 遺伝子を提供する。 本発明の実施では、人よりＮＡ配列をウィルス性または環状プラスミドＤＮＡベ クターに挿入してハイブリッドベクターを形成し、ハイブリッドベクターを使用 して細菌（例えば大腸菌）、酵母細胞のごとき微生物宿主細胞、または培１ｉ１ ｉ乳類細胞を形質転換する０次に、形質転換された微生物を適当な栄養条件下に 増殖させ、本発明のポリペプチド産物を発現させる。 本発明はまた、有効量の本発明のポリペプチド産物をＩＬ−２療法に有用な適当 な希釈剤、アジュバント及び／または担体と共に含有する医薬組成物を提供する 。 本文中でＤＮＡ配列または遺伝子の形容に使用される「人工」なる用語は、ヌク レオチド塩基の集合によって化学的に合成された産物、特定部位の突然変異誘発 によって合成された産物、または、上記のごとく合成された産物の生物学的複製 によって得られた産物を意味する。従ってこの用語は、ｃＤＮＡ法または生物学 的起源の材料を使用する遺伝子クローニング法によって「合成された」産物を除 外する。 本文中で使用される「置換アミノ酸」なる用語は、天然（「出発」）アミノ酸を 置換したアミノ酸、即ち出発アミノ酸とは異なるアミノ酸を意味する。 本発明の別の実施態様によれば、本発明のポリペプチドに特異的に結合するが天 然ＩＬ−２とは交差反応しない抗体が提供される。これらの抗体は当業者に公知 の方法で標識され得る。 本文中ではアミノ酸を以下の略号で示す、アラニン＾１ａ、アルギニン＾ｒｇ、 アスパラギン＾ｓｎ、アスパラギン酸＾ｓｐ、システィンＣｙｓ、グルタミンＧ ｌｎ、グルタミン１１　Ｇ　ｌ　ｕ、グリシンＧ１ｙ、ヒスチジンＨｉｓ、イン ロイシンｌｉｅ、ロイシンＬｅｕ、リジンＬｙｓ、メチオニンＮｅｔ、フェニル アラニンＰｈｅ、プロリンＰｒｏ、セリンＳｅｒ、トレオニンＴｈｒ、トリプト ファン丁ｒｐ、チロシンＴｙｒ、バリンＶａｌ、ヌクレオチド塩基には以下の略 号を使用する。アデニン＾、グアニンＧ、チミンＴ、ウラシルＵ及びシトシンＣ ０ 本発明を以下に詳細に記載するが、本発明を特定の操作理論に固定する意図はな い。 ＩＬ−２がαヘリックスタンパク質（第１図）であることは確認されている（Ｂ ｒａｎｄｈｕｂｅｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８：１７０７（１９８７）、該 文献の記載内容は本明細書に含まれるものとする）。このタンパク質は、アミノ 末端の近傍に短い螺旋セグメント（第１図の残基１１〜１９；ヘリックスＡ）を 有し、該セグメントに延長ループが続いている。残基３３〜５６は中央近傍でＰ ｒｏ４７によって道断即ち「ベントコされたヘリックスを形成している（従って ２つのセグメントＢ及びＢｏが形成される）。 ジスルフィドのＣｙｓ５８に続いてヘリックスＣを形成する残基６６〜７８、ヘ リックスＤを形成する残基８３〜１０１が存在し、Ｃｙｓ１０５の後に短い見掛 は螺旋状のストレッチＥを形成する残基１０６〜１１３が存在し、その次にカル ボキシ末端へソックスＦを形成する残基１１７〜１３３が存在する。分子中にβ 二次構造の見掛はセグメントは全く存在しない、総螺旋含量約６５％は、円二色 性に基づく算定値と良く一致する。Ｃｙｓ５８とＣｙｓ１０５との間のジスルフ ィドは、（第１図の配向の）分子の「頂部」のへソックスを接続する２つの延長 ループを結合する。 ヘリックスＢ、Ｃ，Ｄ及びＦは、シトクロムＣ′、シトクロムｂ、６．及びミオ ヘムエリトリンによって示される従来の４へソックスバンドルとはかなり異なっ た逆平行のαへソックスバンドルを形成する。ヘリックスの充填領域はより短く 、螺旋巻き数を３つまたは４つしか含まない、対照的に従来の４ヘリツクスバン ドルは通常、５つ以上の螺旋巻き数を含む、更に、充填角度はすべて２５度〜３ ０度の範囲である。従って、従来の４へソックスバンドルの平均約１８度よりも 幾分大きい。 マウスＩＬ−２は組換えヒトＩＬ−２と同様の構造、即ちヘリックスＡから始ま ってヘリックスＢ＋Ｂ’中にプロリン誘発ベントを含むと予想される０組換えヒ トＩＬ−２がヒト及びマウスの両方のＴ細胞に活性を示し、組換えマウスＩＬ− ２がヒトＴ細胞に対して低いが測定可能な活性を示すと報告されているのでこれ は極めて重要である。マウス及びヒトのＩＬ−２配列は全体として６４％相同で ある。成熟マウスタンパク質のアミノ酸配列は最初の７つの残基がヒト配列に等 しい。 次に、ヒトＩＬ−２のＬｅｕ１４の上流の１２残基のポリ（Ｇｌｙ）ストレッチ を含む１つ以上の挿入があり、結局、ヒトに比較して合計１５のアミノ酸が挿入 されている。従ってマウスのタンパク質のアミノ末端領域は、恐らくはヘリック スＡの第１螺旋巻きを含むヘリックスＡまではヒトタンパク質に比較してかなり の構造的差異を示す、マウスの配列中の唯一の付加的な挿入は、ヒトＩＬ−２残 基８０と８１との間のへソックスＣとＤとを結合するループ中に存在する。 ＩＬ−２レセプター結合に関する現在のデータは、分子が高親和性レセプターに 結合されたときは、該分子が独立の２つの結合部位で２つのレセプター分子、Ｐ ５５及びｐ７５、を「架橋」することを示唆する。それ以前の文献では２つのレ セプター分子の存在は予想されていなかった。従って、ＩＬ−２レセプター結合 に影響を与える種々の変形が、ｐ５５−（Ｉ　Ｌ−２）相互作用に影響を与える のか、ｐ７５−　（ＩＬ−２）相互作用に影響を与えるのかまたはその両方に影 響を与えるのかは判別できなかった。 レセプター結合で重要であると推定されるＩＬ−２配列中の領域全体の地図作成 のために、ＩＬ−２と交差反応するペプチドに対する抗体が使用された。特に、 Ｋｕｏ及びＲｏｂｂは、結合した残基８〜２７及び３３〜５４内部の領域がレセ プター結合に直接関与することを示唆する証拠を提示した。　Ｌ、　Ｋｕｏ　＆ Ｒ，Ｊ、　Ｒｏｂｂ、　Ｊ、　Ｉｍｍｎｏｌ、　１３７：１５３８（１９８６） 、他方、＾ｌ　Ｌ＋ｍａｎとその共同研究者は、残基５９〜７２．９１〜１０５ 及び１１９〜１３３のペプチドに対する抗体がＴＬ−２レセプター結合を阻害し ないことを知見した。＾、Ａｌｔｍｓ＋ｎ等、Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ 、　Ｓｃｉ。 υ、Ｓ、＾、　８１：２１７６（１９８４）。 Ｊｕ等（□）は、ヒトＩＬ−２の残基１〜１０（ヘリックスＡの初端までのアミ ノ末端）の欠失はマウスＣＴＬＬ−２細胞の増殖の誘発を３０〜５０％しか減少 させないが、残基１〜２０（ヘリックスＡを含むアミノ末端）の欠失は活性を完 全に喪失させることを証明した。Ｊｕ等１．ｕＬ、マウスＩＬ−２の欠失分析に よれば、マウスＨＴ２　Ｔ細胞の増殖活性に対する効果も同様のパターンを示す 、　Ｓ、　Ｍ、　Ｚｕｒａｗｓｋｉ等、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７゜３ ３５４（１９８６）、マウスの残基１〜１１または１〜１３（マウスＩＬ−２が ヒトＩＬ−２に構造的に類似であると想定したときにこれらはへソックスＡの上 流に存在する）の欠失は、活性を最高で５０％減少させる。配列中の最初の３７ 個のアミノ酸の種々の変更（ｃｈａｎｇｅ）に関連したマウスのポリ（Ｇｌｎ） セクション、残基１５〜２６の欠失は、突然変異タンパク質の比活性を天然タン パクの１７３に減少させた。しかしながら、マウスの残基３０（ヘリックスＡの 中央のヒトの残基１６に対応する）を通る欠失は活性を天然タンパク質の約０． ４％に減少させ、残基４１（ヒト残基２７に対応する）を通る欠失は活性を完全 に喪失させる。 活性を喪失させると報告されたその他の欠失の多くは、ＩＬ−２の三次構造全体 を破壊するような欠失である（多くは、構造中の内部へソックスまたは結合ペプ チドの重要な部分の欠失である）。 部位特異的アミノ酸置換に関するデータでは、ＩＬ−２楕遺を不安定にすること によって活性に影響を与える突然変異とレセプター結合に直接影響を与える突然 変異との識別ができない、　ＩＬ−２のジスルフィドを破壊するかまたはＴｒｐ １２１（この側鎖は構造に内蔵される）を変形する改変以外のヒトＩＬ−２の活 性低下を生じるすべての突然変異は、配列領域３〜１７及び３６〜５４に存在す る。　Ｊｕ等、！先。これは抗体競合研究によって示唆されたレセプター結合領 域の確証となる。 「ダウン」点突然変異は、ＩＬ−２モデルに配置されたときに特異的レセプター 結合表面を認識しない。 ヘリックスＢ、Ｃ，Ｄ及びＦは構造骨格を形成し、ヘリッスクＡ、Ｂ’、Ｂの一 部及びＥはＩＬ−２のレセプター結合部位を形成する（第２図）、ヘリックスＥ の関与は主として、レセプター相互作用に関与すると推定される分子の領域に対 するヘリックスＥの空間的な接近容易性及び近接性によって示唆される。 ＩＬ−２は高親和性レセプターを介してＴ細胞に結合するが、低親和性レセプタ ーを介してその他の免疫系細胞にも結合しこれらの細胞を活性化するであろう、 観察されたＩＬ−２の毒性副作用の一因は、これらの他の細胞の活性化にあると 考えられる。 ヒトＩＬ−２の　造的亦種（ｖａｒｉａｎｔ）ＩＬ−２のレセプター結合ドメイ ンの改変、及びＴＬ−２構造を安定させる改変が、Ｔ細胞に対する特異性の変化 したＩＬ−２類似体を産生じ、活性及び／または毒性が変性された改良ＩＬ−２ 分子を生じる。アミノ酸、好ましくはレセプター結合ドメインのへソックスの親 水性アミノ酸が、異なる電荷を有するアミノ酸で置換されたＩＬ−２類似体は本 発明に包含される（例えば正荷電側鎖をもつアミノ酸が負荷電側鎖または非荷電 側鎖をもつアミノ酸で置換される。後記参照）。 また、ヘリックスの構造を安定させ類似体全体を安定させるために、αヘリック ス構造に優先性を有する１つ以上のアミノ酸が、ＩＬ−２の１つ以上のへソック ス、特にヘリックスＡ、Ｂ’、Ｂ、Ｅ及びＦを置換した類似体も本発明に包含さ れる（Ｃｈｏｕ　＆　Ｆａｓｍａｎ、＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ４７：２５１（１９７８）。 本発明の理解を助けるためにＣｈｏｕ及びＦａｓｍａｎのヒエチルキーを以下に 示す。 αへソックス多　に　る Ｇ！ｕ（−）　１．５１ Ｍｅｔ　１．４５　Ｈ，＝強いα形成物質Ｌｙｓ（＋）　１．１６ Ｐｈｅ　１．１３ Ｇｌｎ　１．１１　ｈ、＝　ａ形成物質Ｔｒｐ　１．０８ １１ｅ　１．０８ ＶＪＩＩ　１．０６ ＾５ｐ（−）　１．０１　！。−弱いα形成物質）１ｉｓ（＋　）　１．００ ＾ｒｇ（十）　０．９８ Ｔｈｒ　Ｏ，８３ｉａ＝　ａに影響無しＳｅｒ　０．７７ Ｃｙｓ　Ｏ，７０ Ｔｙｒ　Ｏ，６９１）ａ＝　ａ破壊物質へｓｎ　０．６７ Ｐｒｏ　０．５７　Ｂ、＝強いα破壊物質Ｇｌｙ　Ｏ，５７ ＩＬ−２のへソックスは両親媒性ヘリックスである（Ｋａｉｓｅｒ等、　ＰＮＡ Ｓ、　８０：１１３７〜１１４３（１９８３）及びＫａｉｓｅｒ等、　５ｃｉｅ ｎｃｅ。 砒＝２４９〜２５５（１９８４））。 この両親媒性相互作用はメリチン、パルトキシン（ｐａｒ−ｄｏｘｉｎ）及びマ ガエン（ｍａｇａｎｉｎ）のごときいくつかの細胞障害性ペプチドに共通である 。より詳細には、Ｆヘリックスは極めて両親媒性で、Ｆヘリックス中のアミノ酸 のいくつかはαへソックス構造に高い優先性を有していない、従って、Ｆヘリッ クスの疎水性表面とＣヘリックス及びＤヘリックスとの相互作用は、Ｆヘリック ス配列を螺旋形態に維持するために必要なエネルギーを供給すると考えられる。 αヘリックス構造に高い優先性をもつ残基を含むように選択されたアミノ酸置換 （例えば、＾５ｎ−ｄｌ：Ｉｎ、Ｔｒｐ−＋Ｐｈｅ、５ｅｔ−＋Ｇｉｎ）を含む 改変へソックス配列を含むＩＬ−２類似体を構築した。その結果として得られる ヘリックスは、螺旋構造を維持するために強い両親媒性相互作用を必要とせず、 従ってアミノ酸置換によって、ヘリックスの両親媒性は維持されてもよく（例え ば親水性ｇ！Ｉ鎖を有するアミノ酸が親水性側鎖な有する別のアミノ酸で置換さ れると、上記の３つの置換は両親媒性を維持する）、または変性されてもよい（ 例えば親水性側鎖を有するアミノ酸が疎水性側鎖を有するアミノ酸で置換される ）。 活性を損なうことなく別の分子と共有結合し得る類似体を横築した。これらの類 似体は、毒素、リポータ−基または抗ウイルス性もしくはその他の治療用化合物 に結合され、治療的に重要なＩＬ−２複合体（ｃｏｎ　ｊｕｇａｔｅ）の開発、 及び高感度生物学的アッセイ開発のための特異的標１１Ｌ−２の産生に使用され る。これらの部位特異的結合（ｓｉｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｎｊｕｇａｔｉ ｏｎ）を得る最も便利な方法は、特有の反応性スルフヒドリル基を有する異常シ スティン残基の導入を介した方法である。天然異常システィン（Ｃｙｓ１２５） は、埋没しており未反応になり易いので、戦略の焦点は、化学的に接近容易なシ スティンを（＾Ｉａ”５）ＴＬ−２に組み込むことにある。 本発明は、既存アミノ酸の置換の変形として、付加アミノ酸が既存アミノ酸間に 挿入された改変を含む。 １、ＩＬ−２のレセプター結ムドメインの　六　びＬｊ］！ｊ告を支叉」にＬ配 炊ヌ− 高親和性レセプター相互作用に関与するαへワックス領域の親水性アミノ酸（第 １図、第２図及び第３図のＡ、Ｂ、Ｂ′及びＥ）は有望なアミノ酸置換部位であ る。これらの部位が別のアミノ酸（特にレセプターと相互作用するヘリックス表 面の電荷を変えるアミノ酸）でＷ換されると、レセプター結合特性が影響を受け て分子の活性スペクトルが変化する。かかる変化はまた、種々の細胞型のレセプ ターと相互作用する分子の能力を変化させる。これらの細胞は夫になる０例えば 、ＩＬ−２レセプターのｐ７５成分だけを保有する細胞は、ｐ７５ドメインが改 変されたＩＬ−２種に応答しないので、分子が生物学的に有意なレセプター結合 を生じることはもはやできない、　ＩＬ−２細胞刺激方法にかかる選択性を導入 すると、材料の治療指数を向上させることができる（例えば、１つの細胞型の刺 激に起因する好ましくない副作用を減少させ同時に適当なエフェクター細胞型を 刺激するＩＬ−２の能力を維持し、結局病気を抑える）０例えば、レセプター結 合ドメインのへソックスのある種の改変は、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１及びＴＮＦの ごときリンフ才力イン誘発能力が減少しているが（＾ｌａ’　”）ＩＬ−２また は天然ＩＬ−２に比較して均等（ｅｑｕｉ−ｖａｌｅｎｔ）の生物学的活性を有 するＩＬ−２類似体を産生させ得る。 本発明を理解し易くするために、アミノ酸１１ｅ、Ｌｅｕ、　Ｎｅｔ、Ｐｈｅ、 　Ｐｒｏ、　Ｔｒｐ、　Ｔｙｒ及びＶａｌの側鎖が通常は非極性（疎水性）、ア ミノ酸＾Ｉａ、＾ｓｎ、　Ｃｙｓ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ及びＴｈｒの側鎖が 極性（親水性）で非荷電、アミノ酸＾ｒｇ、Ｈｉｓ及びＬｙｓ の側鎖が親水性で正荷電、アミノ酸 ＾ｓｐ及びＧｌｕ の側鎖が親水性で負荷電と考える。 Ｈｏｐｐ　＆　Ｗｏｏｄｓ、　ＰＮＡＳ″７８　Ｎｏ、６：３８２４〜３８２８ （１９８１）；Ｋｙｔｅ　＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｅ、　Ｂｉ ｏｌ、　１５７：１０５〜１３２（１９８２）；Ｐａｒｋｅｒ等、　Ｂｉｏｃｈ ｅ＋ａｉｓｔｒｙ、　２５：５４２５〜５４３２（１９８６）も参照されたい。 Ａ、Ｅへ１・・　スの　１ 短いＥヘリックスがレセプター結合に関与する。従って、Ｅへソックスはレセプ ター結合を改変する突然変異の好適な標的である。３つのアミノ酸側基Ｇｌｕ１ ０６、＾５ｐ１０９及び＾１ａｌ１２はレセプターと相互作用できるようにＥへ ソックスから突出している。第３図はＩＬ−２の構造、推定されたレセプター結 合ドメイン及び対応するアミノ酸の位置を示す。 レセプター−エフェクター（例えばＩＬ−２）相互作用の一部はレセプターの荷 電基と反対電荷のエフェクターの荷電基との静電相互作用によって媒介される。 Ｅヘリックスは、正荷電アミノ酸側鎖を有さす、３つの負荷電アミノ酸側鎖を有 する（１；Ｉｕ１０６、＾５ｐ１０９及びＧｌｕｌｌＯ）　、従ってＩＬ−２の Ｅへソックスの電荷型の改変によって結合効率が変化する。＾５ｐ１０９→Ｌｙ ｓ１０９の置換は１つの突然変異でレセプター結合を改変する。＾５ｐ１０９は Ｅヘリックスの中心から突出した保存（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸である。 　ＧＩｕ１０６、＾５ｐ１０９、＾１ａｌ１２−　Ｌｙｓ１０６、Ｌｙｓ１０９ 、Ｌｙｓｌ１２の置換はＥヘリックスを負荷電表面から正荷電表面に完全に転換 させる。ＣＩｕ１０６または＾５ｐ１０９（酸残基）がＬｙｓで置換されるとＥ ヘリックスの電荷が正味＋２変化する。中性残基（＾Ｉａｌ１２）がＬｙｓで置 換されると電荷が＋１変化する。３つの残基全部がＬｙｓで置換されると電荷が ＋５変化する。これらの変更を、個別に行なってもよくまたは一緒に行なっても よい、更に、αヘリックス構造に対してより高い優先性を有するアミノ酸で置換 してもよい。 Ｂ、Ｂ　びＢ′へソックスの アミノ酸Ｌｙｓ４８、Ｔｈｒ５１及びＬｙｓ５４はレセプターと相互作用できる ようにＢ°ヘリックスから突出している。Ｂ′ヘリ・ンクスは１つの負荷電アミ ノ酸側鎖（ＧＩｕ５２）と４つの正荷電アミノ酸側鎖（Ｌｙｓ４８、Ｌｙｓ４９ 、Ｌｙｓ５４及び旧５５５）とを含む。 Ｌｙｓ４８、Ｔｈｒ５１、Ｌｙｓ５４−＋　ＣＬｕ４８、＾５ｐ５１、ＣＩｕ５ ４置換は、Ｂ’へソックスを正荷電表面から負荷電表面に完全に転換する。 Ｂヘリックスと同様の電荷の変化が生じる。Ｅヘリ・ンクス改変の場合と同様に 、これらの変更を個別に行なってもよく一緒に行なってもよい、　ＩＬ−２の別 のヘリ・ンクスと同様に、αヘリックス構造に対してより高い優先性を有するア ミノ酸で置換してもよい。 Ｃ、Ｐｒｏ４７→Ｇｌ　４７ ＢへソックスがＢヘリックスとＢｏへソックスとに***することがＩＬ−２の独 特の構造的特徴である。　Ｐｒｏ４７は、Ｂ′残基をレセプターと適切に相互作 用させる最適角度でＢヘリ・ンクス及びＢｏへソックスを固定的に保持すると考 えられてり）る、　Ｐｒｏ４７→ＣＩｙ４７置換はＢヘリックスとＢ“へソック スとの間のヒンジ部（ｈｉｎｇｅ　ｊｏｉｎｔ）の可撓性を増し、重要なり′残 基の位置を調節し、結局ＩＬ−２−レセプター相互作用を変性する。別のアミノ 酸による４７位の置換も本発明に包含される。 Ｄ、Ａへ１ツクスの改１ Ａヘリックスはレセプター結合に関与する。Ａヘリ・／クスは１つの負荷電アミ ノ酸側鎖（Ｃ，ｆｕｌ１５）と１つの正荷電側鎖（Ｈｉｓ１６）とを有する。Ｔ Ｌ−２の別のへソックスと同様に、αへソックス構造に優先性を有するアミノ酸 で置換することによってＡヘリックスの構造を強化し得る。Ｅ、Ｂ及びＢｏへソ ックスと同様のへソックスＡにおける電荷の変化も本発明に包含される。Ｉ！Ｌ 後に、Ａへソックスの両親媒性を維持または減少させるアミノ酸置換も本発明に 包含される。 Ｅ、旦ヱΣ艮二二り一乙！と改変 Ｆヘリックスは両親媒性ヘリックスである。Ｆへソックスのいくつかのアミノ酸 はαへソックス構造に高い優先性をもたない、従って、Ｆへソックスの疎水性表 面とＣ及びＤへソックスとの相互作用はＦヘリックスを螺旋形態に維持するため に必要なエネルギーを供給すると考えられる。 αヘリックス構造に対してより高い優先性を有する残基を含むように選択してア ミノ酸置換（例えば、＾ｓｎ→Ｇｌｎ、Ｔｒｐ→Ｐｈｅ、５ｅ−Ｇｌｎ）を行な って、改ン（ソックス配列を含むＩＬ−２類似体を構築した。その結果、Ｆヘリ ックスが螺旋構造を維持するために強力な両親媒性相互作用を必要とせず、従っ てヘリックスの両親媒性を維持または減少させ得る。 １１、Ｉ　ンドと茅七ムしマるＩＬ−２の改亦リガンドと結合と得る置換部位は 、カルボキシル末端及び活性ＩＬ−２の構造を極力乱さないように選択された表 面露出分子部分である。例えば、システィン残基の付加、挿入または置換によっ て、以下の部分に化学的に結合し得るスルフヒドリル基が得られる。 （ａ）放射性標識部分（アッセイ用、イメージング用）。リポータ−基をＩＬ− ２に結合すると、得られた活性ＩＬ−２類似体を高速かつ高感度で検出できる。 これらの結合体は、高感度ＩＬ−２生物学的アッセイの開発で鍵成分（ｋｅｙ　 ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）として使用される。 （ｂ）酵素的部分（アッセイ、治療薬の指向性デリバリ−用）。 （ｅ）毒素（ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏにおける選択的細胞傷害用 ）、細胞障害剤とＩＬ−２との複合体は、ＩＬ−２レセプターを有する細胞に毒 素を案内する。これらの複合体はある種の白血病、移植拒絶反応、自己免疫また は免疫異常状態（ａｌｔｅｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　５ｔａｔｅ）またはその他の 病理的に有意な細胞鶏口の治療に有用である。 （ｄ）薬剤（治療薬の指向性デリバリ−用０例えばＡＩＤＳ用＾ＺＴ）。 ）１１Ｖ感染し易い細胞の殆どはＩＬ−２レセプターを保有する細胞である。　 ＴＬ−２とレトロウィルスインヒビター例えば＾ＺＴ（逆転写酵素インヒビター ）との複合体は、インヒビターを感染細胞に案内し、ＩＬ−２レセプターを介し てインヒビターのインターナリゼーションメカニズムを与える。これらの複合体 はエイズ及びその他の関連疾患の治療に有用である。 （ｅ）抗体またはマイトジェン（選択的細胞標的化例えば、０ＫＴ４または均等 物を使用するヘルパーＴ細胞の標的化及び／またはＴＬ−２応答状態への選択的 細胞の活性化）等。 ＩＬ−２のＸ線構造観察によれば、ＩＬ−２分子のレセプター結合ドメインを妨 害することなく別の分子をＩＬ−２のカルボキシ末端またはアミノ酸７９〜８２ にわたる領域に結合させることが可能である（第３図参照）、遊離システィン残 基をＩＬ−２のカルボキシ末端及び／または７９〜８２領域で（Δ１ｍ’　”） ＩＬ−２（１つのジスルフィド結合を含むが遊離システィンを含まないＩＬ−２ 類似体）に組み込んだ、これらの位置への遊離システィン残基の組込みが、組換 えＩＬ−２遺伝子の改変によって得られた場合には、ＩＬ−２と細胞表面レセプ ターとの結合に影響を与えることなく別の分子が（１つ以上の）遊離スルフヒド リル基との反応によってＩＬ−２に特異的に化学結合し得る。 ＩＬ−２のカルボキシ末端領域はレセプター結合に関与せず異常システィンの組 込みに好適な部位である。　Ｌｅｕ１３２を選択した。その理由はこのアミノ酸 がＣ末端に近接して（最終アミノ酸の直後に）位置するため、及びヒト、ウシ及 びマウスのＩＬ−２配列を比較したときに保存されない残基であるためである。 システィンがＩＬ−２のカルボキシ末端に単に付加された類似体（（Ｃｙｓ”’ ）ＩＬ−２）は、Ｃ末端に異常システィンを組み込むという目的を達成している 。 Ｂ、Ｃへ１・・　スとＤへ１ツクス　のＢの　−の　１ヒト、ウシ及びマウスの ＩＬ−２の配列を並列させると、ヒト配列に比較してウシ及びマウスの配列がア ミノ酸８ｏと８１との間に挿入を含む、該アミノ酸は、ＩＬ−２のＣヘリックス とＤへソックスとを連結する４つのアミノ酸（アミノＭ７９〜８２）のループの 一部である。この観察及び分子のこの領域が推定されたレセプター結合ドメイン 及び分子中の別のＣｙｓ残基から離間している事実から、この部位が異常システ ィン残基の理想的な挿入部位であると結論できる。Ｌｅｕ８０→Ｃｙｓ８０のご とき置換も本発明に包含される。 Ｃ，アミン末端　域の改１ 非保存残基におけるＬｙｓ８→Ｃｙｓ８？！換はアミノ末端の近傍に反応性基を 与える。 ■、′　またけ５ム　ＩＬ−２フラグメントＩＬ−２のある種の構造用成分また はその組み合わせは、本来の（ｉｎｔａｃｔ）ＩＬ−２の生物学的特性を、（１ つまたは複数の）ＩＬ−２レセプターに結合する能力と共に保持または喪失して いる。かかるペプチドは本来のＩＬ−２の代わりにまたはその作用拮抗物質とし て有用である。この用途に適したペプチドは、Ａ、Ｂ、Ｂ’及びＥヘリックスの 少なくとも１つを含む０例えば本発明は、本来の親分子の立体構造的制約（ｃｏ ｎ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ）にかかわりなく、別の 種としてそれ自体の内部対称性（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｓｙ＋ｎｍｅｔｒｙ）を維 持するＡ及びＢへソックス領域を含む、かかる別の構造はＩ’Ｌ　−２レセプタ ーの成分に結合し、ＩＬ−２の生物学的活性を有していたりまたは有していなか ったりする。かかる構造はＩＬ−２応答性細胞のサブセットのみに活性を維持し ており、従ってＩＬ−２応答をより高い精度で操作できる。かかる別の構造は生 物学的活性を喪失しているが、ＩＬ−２結合の競合的インヒビターとして機能し 、ＩＬ−２の刺激作用が関与する生理学的状態に拮抗するために有用である。か がる構造は、ＩＬ−２レセプターをを亢進または減退させるべく調節し、その結 果としてＩＬ−２に対する細胞受容性（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒｅｃｅｐｔｉｖｉ ｔｙ）に影響を与える。 Ｖ−Ｌ些１へ臭え 本発明に包含されるその他の類似体は、天然ＩＬ−２のアミノ酸配列に以下の改 変が１つ以上存在することを特徴とする前記のごときＩＬ−２類似体を包含する 。 （ａ）分子内折り畳み部位を与えるアミノ酸残基の欠失及び／または置換、 （ｂ）末端アミノ酸残基の欠失、 （ｃ）末端アミノ酸残基へのアミノ酸残基の付加、（ｄ）強酸性条件下で加水分 解に不安定な部位を与えるアミノ酸残基の欠失及び／または置換、 （ｅ）グルタミン残基によるアミノ酸残基の置換、（ｆ）フェニルアラニン残基 によるアミノ酸残基の置換、（ｇ）トリプトファン残基の欠失及び／または置換 、（ｈ）アスパラギン残基の欠失及び／または置換、（ｉ）システィン残基の欠 失及び／または置換、（ｊ）セリン残基によるアミノ酸残基の置換、及び、（ｋ ）アラニン残基によるアミノ酸残基の置換。 ＴＬ−２制　び　九　２、 ＩＬ−２及びＩＬ−２類似体は極めて疎水性のタンパク質であり、従って、同じ く疎水性の発熱物質に結合する傾向がある。 これらのペプチドは酸性ｐＨ値で安定な単量体形態とし得る。 これらの条件下に発熱物質は、発熱物質の単量体分子量がＩＬ−２の分子量と同 等である場合にも、より高い分子量の集塊を形成し易い。従って、集塊形態の発 熱物質から単量体ＩＬ−２を分離するために、サイズに基づいてタンパク質を分 別する処理手順が使用される。この段階を行なう適当な手順はＹＭ−３０膜（八 ｍ１ｃｏｎ）による限外濾過である。　ＩＬ−２の収量を増加するために希釈と 限外濾過とを繰返し行なってもよい、グルコース、マンニトールまたはその他の 賦形剤（ｂｕｌｋｉＢ　ａｇｅｎｔ）は毒性調節剤として添加され得る。また、 限外濾過で濃縮するかまたは適当な緩衝剤で希釈することによって所望濃度のＩ Ｌ−２が得られる。また、例えばセファデックスＧ−７５を使用したサイズ排除 クロマトグラフィーによって単量体ＩＬ−２から発熱物質を分離してもよい、界 面活性剤（例えばラウレート、サルコシン、ドデシル硫酸ナトリウム）はこの方 法を無効にする。その理由は、界面活性剤の存在下では発熱物質が低分子量形態 に分解され、ＩＬ−２と同等の見掛は分子量になるからである。イオン交換クロ マトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーのごときＩＬ−２溶液から発熱物 質を除去すると期待された手１１Ｎは試験条件下で無効であることが判明した０ 本発明の方法は大規模化が容易であり従って経済効率がよい。 以下の実施例は、本発明に従ってＩＬ−２及びそのポリペプチド類似体の微生物 発現をコードするＤＮＡ配列の製造を示す、また、所望のポリペプチドの微生物 発現のための発現ベクターの構築を示す。 支り九Ｌ オリゴヌクレオチド配列の構築 この実施例は、本発明に従ってＩＬ−２類似体遺伝子を製造するために使用され るオリゴヌクレオチド配列の合成手順を示す。 いくつかの中間洗浄を含む４段階手順でオリゴヌクレオチド配列を合成した。＾ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（八Ｂｌ）　Ｍｏｄｅｌ　３８０自動シン セサイザーを使用し八Ｂｌかち得られた試薬を用いて合成を行なった。支持カラ ム中のポリマー結合ジメトキシトリチル保護ヌクレオシドを、まずジクロロメタ ン中の３％トリクロロ酢酸で１分間処理して、その５°保護基（ジメトキシトリ チル）を除去した０次にポリマーをアセトニトリルで洗浄した。洗浄したポリマ ーを次に無水アセトニトリルですすぎ、アルゴン下に維持し、次いでアセトニト リル中のテトラゾールを用いアセトニトリル中の保護ヌクレオシドホスホラミジ ット＜ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）と縮合させた。 この反応を２．０分間継続させた。次に一過によって反応体を除去した０次いで 、無水酢酸、２．６−ルチジン及びテトラヒドロフラン（１：１：８）の混合物 を１部とテトラヒドロフラン中の６．５％ジメチルアミノピリジン１部とを混合 して調製した溶液を用い、未反応の５゛−ヒドロキシル基をキャッピングした。 １分後、キャッピング溶液を除去し、酸化溶液（Ｈ２０／２．６−ルチジン／Ｔ ＨＦ、１：１０：４０中の０．ＩＮのＬ）で１．５分間処理した０次にアセトニ トリルですすいだ、トリクロロ酢酸／メチレンクロリド脱保護のサイクルを再開 し、所望のオリゴヌクレオチド配列が得られるまで繰り返した。 最終オリゴヌクレオチド鎖を室温にて新しい濃アンモニアで２．０時間処理した 。ポリマーから溶液を傾瀉し、濃アンモニア溶液を密封管で６０℃で１６時間加 熱した。 各オリゴヌクレオチド溶液を１−ブタノール及びエチルエーテルで抽出し、分光 光度計（２６０ｎｍ）で各溶液の濃度を測定した０分取電気泳動用に５．０吐単 位の各オリゴヌクレオチドを乾燥し、１５％ポリアクリルアミド、７モル尿素ゲ ルに充填した。を気泳動後に得られたバンドをＵＶシャドウィングによって可視 化し、ゲルから切断し、抽出し、に−５０セファデックスカラムで脱塩すると精 製オリゴヌクレオチドが得られた。 えＩ隨よ オリゴヌクレオチドの特定部位の突然変異誘発によるＩＬ−２類似体の構築 この実施例では組換え法を使用したＩＬ−２類似体の製造を説明する。　１９８ ５年２月２８日付けの５ｏｕｚａ等のＰＣＴ出願第１１１０８５７００８１７号 に記載の特定部位の突然変異誘発手順を用い、（大腸菌優先性コドンを有する） 表１のＤＮＡ配列に表２のオリゴヌクレオチドを使用した。 ４５　（ｕ　（ＩＪ　ロ　。　ロ　ロ　−Ｈに　＜−ト＜　口　２　８　≧　巳 　＝旨　口　に　旨　ｉ　５　ミ　暑　ヨ　葺ジ　ミ　ジ　匡　リ　審　己　ご 　ジ　厘オリゴヌクレオチドの特定部位の突然変異誘発のために、発現ベクター ｐｃＦＭ　５３６　ＩＬ−２に由来のＩＬ−２のＸｂａ　Ｉ　〜ＢａｍＨＩ領域 を、Ｍ１３ｍｐｌＯ及びＭ１３ｍｐＨの双方にクローニングし、単鎖ファージＤ ＮＡを単離してＤＮＡ配列を決定した。ここではｐｃＦ８５３６　（米国特許第 ４，７１０，４７３号参照、該特許は本発明に含まれるものとする）を使用した が、任意の適当な発現ベクターを使用することが可能である。このＤＮＡを表２ の合成デオキシヌクレオチドと混合した。これらの混合物中のＤＮＡを６５℃に 加熱してアニーリングし、次に室温まで徐冷した。 オリゴマーは配列の中央に天然の組換えＩＬ−２配列とは異なる適当な塩基変化 を生じていた。アニーリングしたＤＮＡに＾ＴＰ−ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、　ｃｌ ＧＴＰ、　ＴＴＰ、　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのＫ Ｉｅｎｏｕ＋フラグメントを付加した。この反応で、単鎖プライマーをもつファ ージＤＮＡが、共有結合によって閉鎖された二重鎖環状ＤＮＡに変換された。ｉ ｎ　ｖｉｔｒ。 合成した二重鎖ＤＮＡを、最初にアルカリ性ショ糖濃度勾配で精製しないで、大 腸菌ＪＭ１０３株に直接トランスフェクトした。トランスフェクションに由来す る多くのプラークは、ファージＤＮＡを出発組換えＩＬ−２配列と共に含んでい たが、いくつかのプラークは所望の塩基変化を有するＩＬ−２配列を含んでいた 。これらのプラークを同定するために、プラークをニトロセルロースフィルター にのせ、フィルターを＾ＴＰ（γ−３２Ｐ）で末端標識した合成デオキシヌクレ オチドとハイブリダイズした。ハイブリダイズ後、フィルターを合成デオキシヌ クレオチド及びその相補的ＤＮＡ配列の融点より低温の０〜３℃で洗浄した。こ れらの洗浄条件では、突然変異した配列を含むファージのプラークに対応する強 いオートラジオグラフィー信号が選択的に残存した。各類似体陽性のクローンを ＤＮＡ配列決定によって確認し、これらのクローンをｐｃＦＭ　５３６のＸｂａ 　Ｉ　〜ＢａｍＨＩにバッククローニングした。 組換えＩＬ−２類似体の培養物を、１１あたり１０ｇのトリプトンと５．の酵母 抽出物と５ｇのＮａＣ１とを含む３０℃の培地で＾、。。 が０．５になるまで震盪しながら増殖させ、次いで４２℃に急激に加熱した。フ ラスコの震盪を４２℃で３時闇続げた。 １υ、ｏｏｏｘａで４℃で２０分間遠心して細胞を採集した。細胞ベレットを０ ．４．湿潤重量、′・ｐの割合でＩＩａＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）に再 度懸濁させ、１０，０００ｐｓｉ、４℃のフレンチ圧力槽（Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒ ｅｓｓｕｒｅ　Ｃｅ１ｌ）に１５分ずつ２回通し、破壊された細胞の上滑を廃棄 した。５ｏＩＩＩＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＥＤＴ＾、５ｍＭのＤＴＴ、０．５Ｍ のＮａＣ１，１％のデオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、ｐＨ９，０に出発 ベレットを湿潤重量で０．２５ｇ／凝ｌの割合で再懸濁させ、室温で３０分間混 合させた。これらの混合物を１４℃で１０，０００ｘ　Ｇで１５分間遠心し、上 清を廃棄した。湿潤重量０．１５１？／ｉｉ’の割合で出発ベレットをＨ２Ｏに 再懸濁させ、４℃で１０，０ＯＯＸ　Ｇで１５分間遠心した。上清を廃棄し、ベ レットを室温で４％のラウリル酸ナトリウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５％エタノ ール、５０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８，７にタンパク質的２０〜３０ｚｇ／ｍｌの割 合で可溶化した。可溶化したタンパク質を、２％ラウリル酸ナトリウム、５０ｍ ＭのＴｒｉｓ及び５％エタノール、ｐＨ８，７を用いたセファデックスＧ−７５ でクロマトグラフィー処理した。　５ＤＳ−ＰＡにＥで分画を分析し、９５％以 上の純度のＩＬ−２含有分画をプールした。 いくつかの場合には、発熱物質及び内毒素を実質的に含有しないＩＬ−２類似体 を得るのが望ましい、このためには分子を更に精製する。タンパク質を、Ｃｕ” の存在下に酸化し、濃縮し、１％ラウレート／２５＋ｅＭ　Ｔｒｉｓ１５％エタ ノール、ｐＨ８，７で平衡させたセファデックスＧ−７５でクロマトグラフィー 処理した。単量体の形態のＩＬ−２を含有する分画をプールし、等容のエタノー ルを添加してタンパク質を沈降させた。遠心によってペレットを採集し、５０％ エタノールで洗浄し、次に５０％酢酸で可溶化した。ＩＬ−２類似体を再生させ るように溶液を５０倍に希釈し、：ｄＡｔａシ、次に採集濃度及びｐＨが１０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４となるように酢酸ナトリウムバッファに対して透析− 過した。 割１１１ １Ｌ−２類似体の活性 この実施例は実施例２で製造した類似体の活性に関する。 ＩＬ−２の天然配列とは異なる２つのアミノ酸配列を含む多数のＩＬ−２類似体 を製造した。試験した全部の類似体が、１２５位に＾ｌａを有していた。これら の実験の陽性対照として、（天然配列とは異なる１つのアミノ酸を含む）（＾１ ａＩ２５）ＩＬ−２を使用した。（Ａｓｐ”）ＩＬ−２及び（Ｇ　ｌ　ｕ”　） ＩＬ−２は、ＩＬ−２の推定されたレセプター結合Ｂ“ドメインにアミノ酸変化 を有する分子である。より詳細には、（Ａｓｐ”　）　ＩＬ−２においては、５ １位の中性トレオニンが負荷電アスパラギン酸によって置換され、（にＩＬＬ” ）ＩＬ−２においては、正荷電リジンが負荷電グルタミン酸によって置換されて いる。　（にＩＦ”）ＩＬ−２においては、ＢドメインとＢ′ドメインとの間の プロリンがグリシンによって置換されている。この変化は分子の有意な精造的結 果を有すると予測され、生物学的活性のかなりの低下を予想させた９これらの類 似体をＩＬ−２活性に関するいくつかのｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイで試験した。 ３Ｈ−チミジンをマウスＴ細胞系ＣＴＴＬ−１またはヒト末梢血液白血球（ｈＰ ＢＬ）に組み込んでｈＰＢＬ培養物から産生されるリンフ才力イン活性キラー細 胞（ＬＡＫ細胞）を測定した。また、ｈＰＢＬ培養物中でＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ 及びＴＮＦ産生が誘発される能力を測定した０部分的に精製した材料によってこ れらの実験を行なった。高度に精製した材料を使用した別のＣＴＬＬ−１アツセ イでは、（＾１ａ１２５）ＩＬ−２の比活性は７．８Ｘ　１０’Ｌｌ／ｍｙであ り、（Ｇｌｕ”）ＩＬ−２の比活性は７．９ｘ　１０’Ｕ／肩ｇであり、（Ａｓ ｐ”）ＩＬ−２の比活性は６．６Ｘ　１０’Ｕ／ｒｇであることが判明した。い くつかの実験の結果を以下の表３に示す。 ＤＮＡ配列の所望の変化をコードする以下のプライマーを使用した特定部位の突 然変異誘発を利用した。 ＥＣ０Ｒ）　の１然１　；　プーイマーＥｃｏＲ１部位が存在するので、Ｆへソ ックスをコードするＩＬ−２遺伝子の部分をＥｃｏＲｌ及びＢａｍＨＪ消化によ って切除できる。第２段階では、切除された遺伝子の部分を改変Ｆへソックスの アミノ酸配列をコードする合成りＮＡ配列で置換する。この方法を使用し、以下 のＩＬ−２類似体Ｃ４及びＣ５を構築した。 及髭【１ Ｃ＾＾　ＴＴＴ　ＣＴに　＾へＴ　ＣＣＴ　Ｔにに　ＡＴＣＡＣＴ　ＴＴＣＴＧ Ｔ　ＣＡに　ＴＣＣＡＴＣにＩｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　 Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ＩｌｅＡＴＣＡＧＣＡＣＴ 　ＣＴＣＡＣＣ ｌｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ匁り肩先イ本Ｊ≧４（に１ｎ１１１１ ｙｓ１２０＾１ａ１２コ＾１ａ１２）ｌｅｕ１２督＾１ａ’　コ１）ＩＬ−２Ｃ ＾＾ＴＴＣＣＴＣＣＡＧ＾＾＾ＴＧＧ　ＡＴＣＧＣＴ　ＴＴＣＣＣＡ　ＣＡＧ　 ＧＣＴ　ＡＴＣＧｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ＾ｌ ａ　Ｐｈｅ＾Ｉａ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　ｌ１ｅＣＴに　ＡＧＣＧＣＡ　ＣＴ［；　 ＡＣＣＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒｌ俳し付仁ｑΣ（［；　Ｉｎ　 ”　”Ｌｙｓ　”　’Ｐｈｅ　”　’＾１ａ１２りＧｉｎ”）Ｌｅｕ”’Ｇｌｎ ’コＯ＾１ａ’コ１＾１ａ”’）ＩＬ−２ Ｇ＾＾　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＡＧ　＾＾＾　ＴＴＣＡＴＣＧＣＴ　ＴＴＣにＣＡ　 ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＴＣＧｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉ ｌｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　ｌ１ｅＣＴＧ　ＣＡＣＧＣＡ 　ＣＴＧ　［；ＣＴＬｅｕ　（：ｌｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ綽　１’ａ（＾ ：αヘリックス、Ｂ・βシート、Ｔ・ターン）（：Ｉｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓ ｐ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　にＩｎ　Ｓｅｒ　ｌ１ ｅＴ　ＴＴＴＢＢＢＢＢ ｌｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＢＢＢＢ 矩ｍす」Ｕ【 Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｔｉｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　 Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　ｌ１ｅＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＡＡＡＡ 胆ＪＵ（ゆ」１１ Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　＾Ｉｔ　Ｐｈｅ　 Ａｌａ　Ｇｉｎ　にＩｎ　１ｉｅＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＡｌａＡＡＡＡ 本発明を好適実施例に基づいて上記に説明したが、記載の変更及び変形が可能で あることは当業者に容易に理解されよう、従って、請求の範囲は、本発明の範囲 内のかかる変更をすべて包含すると理解されたい。 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ．以下の式［Ｉ］、 【配列があります】［Ｉ］ で示されるアミノ酸配列を有しており、式中の４７、５１、８０、８１、１０６ 、１０９、１１２、１１９、１２０、１２３、１２７、１２９、１３１及び１３ ３番目の出発アミノ酸残基の少なくとも１つが置換アミノ酸残基によって置換さ れるか、または、８、４７、４８、５１、５４、８０、８１、１０６、１０９、 １１２、１１９、１２０、１２１、１２３、１２７、１２９、１３０、１３１、 １３２及び１３３番目の出発アミノ酸残基の少なくとも２つが置換アミノ酸残基 によって置換され、ＸがＣｙｓ、Ａｌａ及びＳｅｒから成るグループから選択さ れることを特徴とする宿主細胞による人工遺伝子の発現によって産生されたポリ ペプチド産物。 ２．アミノ酸配列中に以下の、 Ｌｙｓ８→Ｃｙｓ８ Ｐｒｏ４７→Ｇｌｙ４７ Ｔｈｒ５１→ＡＳＰ５１ Ｌｅｕ８０→Ｃｙｓ８０ Ａｒｇ８１→Ｃｙｓ８１ ＧＩｕ１０６→Ｌｙｓ１０６ Ａｓｐ１０９→Ｌｙｓ１０９ Ａｌａ１１２→Ｌｙｓ１１２ Ａｓｎ１１９→Ｇｌｎ１１９ Ａｒｇ１２０→Ｌｙｓ１２０ Ｔｈｒ１２３→Ａｌａ１２３ Ｓｅｒ１２７→Ａｌａ１２７またはＧｌｎ１２７ＩＩｅ１２９→Ｌｅｕ１２９ Ｓｅｒ１３０→Ｇｌｎ１３０ Ｔｈｒ１３１→Ａｌａ１３１ Ｌｅｕ１３２→Ｇｙｓ１３２ Ｔｈｒ１３３→Ａｌａ１３３ Ｇｙｓ１３４の付加 から選択されたｌつ以上の置換が存在し、また任意に以下の、 Ｌｙｓ４８→Ｇｌｙ４８ Ｌｙｓ５４→Ｇｌｕ５４ Ｔｒｐ１２１→Ｐｈｅ１２１ から選択されたｌつ以上の置換が存在しうることを特徴とする請求項ｌに記載の ポリペプチド。 ３．（Ｃｙｓ８）ＩＬ−２ （Ｇｌｙ４７）ＩＬ−２ （Ａｓｐ５１）ＩＬ−２ （Ｃｙｓ８０）ＩＬ−２ （Ｇｙｓ８１）ＩＬ−２ （Ｌｙｓ１０６）ＩＬ−２ （Ｌｙｓ１０９）ＩＬ−２ （Ｌｙｓ１１２）ＩＬ−２ （Ｇｙｓ１３２）ＩＬ−２ （Ｇｙｓ１３４）ＩＬ−２ から成るグループから選択されることを特徴とする請求項２に記載のポリペプチ ド。 ４．前記ポリペプチドがアミノ酸配列中に、（ａ）分子内折り畳み部位を与える アミノ酸残基の欠失及び／または置換、 （ｂ）末端アミノ酸残基の欠失、 （ｃ）末端アミノ酸残基へのアミノ酸残基の付加、（ｄ）高酸性の条件下で加水 分解に不安定な部位を与えるアミノ酸残基の欠失及び／または置換、 （ｅ）グルタミン残基によるアミノ酸残基の置換、（ｆ）フェニルアラニン残基 によるアミノ酸残基の置換、（ａ）トリプトファン残基の欠失及び／または置換 、（ｈ）アスパラギン残基の欠失及び／または置換、（ｉ）システイン残基の欠 失及び／または置換、（ｊ）セリン残基によるアミノ酸残基の置換、及び、（ｋ ）アラニン残基によるアミノ酸残基の置換から選択された改変を１つ以上含むこ とを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。 ５．８、８０及び１３２番目のアミノ酸残基の少なくとも１つが、リガンドと結 合し得る置換アミノ酸残基によって置換されているか及び／またはリガンドと結 合し得る１３４番目のアミノ酸残基が付加されていることを特徴とする請求項１ に記載のポリペプチド産物。 ６．前記置換アミノ酸残基及び前記１３４番目のアミノ酸残基がＧｙｓであるこ とを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。 ７．前記８、８０、８１、１３２または１３４番目のアミノ酸残基を介してラベ ルに結合されていることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。 ８．前記８、８０、８１、１３２または１３４番目のアミノ酸残基を介して酵素 部分に結合されていることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。 ９．前記８、８０、８１、１３２または１３４番目のアミノ酸残基を介して毒素 に持合されていることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。 １０．前記８、８０．８１、１３２または１３４番目のアミノ酸残基を介して医 薬に結合されていることを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。 １１．前記８、８０、８１、１３２及び１３４番目のアミノ酸残基を介して抗体 またはマイトジェンに結合されていることを特徴とする請求項５に記載のポリペ プチド。 １２．天然ヒトＩＬ−２と交差反応しないことを特徴とする請求項１のポリペプ チド産物に特異的に結合する抗体。 １３．標識されていることを特徴とする請求項１２に記載の抗体。 １４．選択された宿主細胞中で請求項１に記載のポリペプチドの合成を指令し得 る人工遺伝子。 １５．選択された宿主細胞中で請求項２のポリペプチドの合成を指令し得る人工 遺伝子。 １６．塩基配列が、予定された宿主細胞中でのコドン発現優先性に基づいて、同 じアミノ酸を特定する複数の代替可能コドンから選択された１つ以上のコドンを 含むことを特徴とする請求項１４に記載の人工遺伝子。 １７．塩基配列が、大腸菌中でのコドン発現優先性に基づいて、同じアミノ酸を 特定する複数の代替可能コドンから選択された１つ以上のコドンを含むことを特 徴とする請求項１４に記載の人工遺伝子。 １８．ポリペプチドを特定する塩基コドンが、合成されたポリペプチド中の付加 的な開始及び／または終結アミノ酸を夫々特定する開始及び／または終結コドン を含むことを特徴とする請求項１４に記載の人工遺伝子。 １９．付加的な開始アミノ酸を特定する前記開始コドンが開始メチオニン残基を 特定するコドンであることを特徴とする請求項１８に記載の人工遺伝子。 ２０．ポリペプチドを特定する塩基コドンの上流及び／または下流及び／または 該コドン中に、制限エンドヌクレアーゼ酵素開裂認識部位を与える塩基配列の一 部を含む塩基の配列が存在することを特徴とする請求項１４に記載の人工遺伝子 。 ２１．ポリペプチドを特定する塩基コドンの上流に、リボソーム結合部位を与え る塩基配列の一部を含む塩基の配列が存在することを特徴とする請求項１４に記 載の人工遺伝子。 ２２．前記リボソーム結合部位が配列【配列があります】によって特定されるこ とを特徴とする請求項２１に記載の人工遺伝子。 ２３．標識されていることを特徴とする請求項１４に記載の人工遺伝子。 ２４．請求項１４または１５に記載の人工遺伝子を含む生物学的に機能性ＤＮＡ 形質転換ベクター。 ２５．請求項１４または１５に記載の人工遺伝子を含むベクターによって形質転 換された細胞。 ２６．（ａ）界面活性剤非含有ＩＬ−２溶液のｐＨを発熱物質がＩＬ−２単量体 の分子量より大きい分子量の集塊を形成するようなｐＨに調整し、 （ｂ）サイズによってＩＬ−２溶液から集塊を分離する段階を含むことを特徴と する発熱物質含有ＩＬ−２溶液から発熱物質を除去する方法。 ２７．段階（ｂ）で、（ｉ）ＩＬ−２溶液を希釈し、（ｉｉ）ＩＬ−２溶液から 集塊を分離する処理を繰り返すことを特徴とする請求項２６に記載の方法。 ２８．段階（ｂ）で、限外濾過またはサイズ排除クロマトグラフィーによってＩ Ｌ−２溶液から集塊を分離することを特徴とする請求項２６に記載の方法。 ２９．天然ＩＬ−２の生物学的特性を１つ以上有し、ヘリックスＡ及び／または ヘリックスＦの少なくとも２つの出発アミノ酸が置換アミノ酸によって置換され 、前記置換アミノ酸が置換アミノ酸を含有する各ヘリックスの両親媒性を変性し ていることを特徴とする宿主細胞による人工遺伝子の発現によって産生されたＩ Ｌ−２類似体。 ３０．置換アミノ酸が、置換アミノ酸を含有する各ヘリックス中の疎水性側鎖を もつアミノ酸と親水性側鎖をもつアミノ酸との比率を変化させることを特徴とす る請求項２９に記載のＩＬ−２類似体。 ３１．前記少なくとも２つの出発アミノ酸が疎水性側鎖を有するアミノ酸であり 、前記置換アミノ酸が親水性側鎖をもつアミノ酸であることを特徴とする請求項 ２９に記載のＩＬ−２類似体。 ３２．前記置換アミノ酸の各々が、該アミノ酸によって置換される出発アミノ酸 よりもαヘリックス構造に対して優先性を有することを特徴とする請求項２９に 記載のＩＬ−２類似体。 ３３．天然ＩＬ−２の生物学的特性を１つ以上有し、ヘリックスＥの少なくとも １つの出発アミノ酸及び／またはヘリックスＡ、Ｂ及び／またはＢ′の少なくと も２つの出発アミノ酸が置換アミノ酸によって置換され、前記置換アミノ酸の各 々は、置換アミノ酸によって置換される出発アミノ酸とは異なる電荷を有するこ とを特徴とする宿主細胞による人工遺伝子の発現によって産生されたＩＬ−２類 似体。 ３４．前記出発アミノ酸が親水性アミノ酸であることを特徴とする請求項３３に 記載のＩＬ−２類似体。 ３５．前記出発アミノ酸が荷電アミノ酸であることを特徴とする請求項３３に記 載のＩＬ−類似体。 ３６．前記置換アミノ酸の各々が、該アミノ酸によって置換される出発アミノ酸 よりもαヘリックス構造に対して優先性を有することを特徴とする請求項３３に 記載のＩＬ−２類似体。 ３７．天然ＩＬ−２の生物学的特性を１つ以上有し、ヘリックスＣ、Ｄ及び／ま たはＥの少なくとも１つの出発アミノ酸及び／またはヘリックスＡ、Ｂ、Ｂ′及 び／またはＦの少なくとも２つの出発アミノ酸が置換アミノ酸によって置換され 、前記置換アミノ酸の各々は、置換アミノ酸によって置換される出発アミノ酸よ りもαヘリックス構造に対して優先性を有することを特徴とする宿主細胞による 人工遺伝子の発現によって産生されたＩＬ−２類似体。 ３８．ヘリックスＡ、Ｂ、Ｂ′、Ｅ及び／またはＦの前記出発アミノ酸が前記置 換アミノ酸によって置換され、前記置換アミノ酸の各々は、該置換アミノ酸によ って置換される出発アミノ酸よりもαヘリックス構造に対して優先性を有するこ とを特徴とする請求項３７に記載のＩＬ−２類似体。 ３９．ヘリックスＦの前記少なくとも１つのアミノ酸が、αヘリックス構造に対 して優先性を有する前記置換アミノ酸によって置換されていることを特徴とする 請求項３７に記載のＩＬ−２類似体。 ４０．前記置換アミノ酸がＧｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、 Ｃｌｎ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐ及びＨｉｓから成るグループから選択 されることを特徴とする請求項３７に記載のＩＬ−２類似体。 ４１．天然ＩＬ−２の生物学的特性を１つ以上有し、ヘリックスＡ、Ｂ′、Ｃ、 Ｄ及び／またはＥの少なくとも１つの出発アミノ酸及び／またはヘリックスＢ及 び／またはＦの少なくとも２つの出発アミノ酸が置換アミノ酸によって置換され 、前記置換アミノ酸の各々は、該置換アミノ酸によって置換される出発アミノ酸 よりもαヘリックス構造に対して優先性を有しており、前記置換アミノ酸の各々 は、該置換アミノ酸を含有する各ヘリックスの両親媒性を変性することを特徴と する宿主細胞による人工遺伝子の発現産物であるＩＬ−２類似体。 ４２．出発アミノ酸が親水性のとき、置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、 Ｔｒｐ、Ｉｌｅ及びＶａｌから成るグループから選択され、出発アミノ酸が疎水 性のとき、置換アミノ酸はＧｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ及びＨｉｓ から成るグループから選択されることを特徴とする請求項４１に記載のＩＬ−２ 類似体。 ４３．ＩＬ−２レセプターと結合し得、ヘリックスＡ、Ｂ、Ｂ′及びＥの少なく とも１つを含み、ヘリックスＣ、Ｄ及びＦを含まないことを特徴とする宿主細胞 による人工遺伝子の発現産物であるペプチド。 ４４．ヘリックスＡ、Ｂ、Ｂ′及びＥの少なくとも１つの出発アミノ酸が、αヘ リックス構造に対して該アミノ酸よりも優先性を有する置換アミノ酸によって置 換されていることを特徴とする請求項４３に記載のペプチド。 ４５．有効量の請求項１に記載のポリペプチドと、製薬上許容される希釈剤、ア ジュバントまたは担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。