JPH0349687A - 新抗腫瘍性抗生物質レゾルチオマイシン及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はストレプトミセス属に属する微生物を培養して
、その培養物から得られる新規な抗腫瘍性抗生物質レゾ
ルチオマイシンに関するもの及び本発明はレゾルチオマ
イシンの製造法に関するものである。

（従来の技術と発明が解決しようとする課題）従来，微
生物が生産する種々の抗腫瘍性抗生物質が知られている
が，ヒトの癌を制圧する有効な化学療法剤として有用で
ある抗生物質は極めて少ない。本発明者らは，それ自身
抗腫瘍作用を示しつつ、現用されている抗腫瘍剤の効果
を促進する物質が放線菌の培養液中に産生されているこ
とを発見した。その抗腫瘍性抗生物質を単離してレゾル
チオマイシン（Ｒｅｓｏｒｔｈｉｏｍｙｃｉｎ）と命名
し、これを研究してレゾルシノールの誘導体であること
が判明したが、その構造が類似する抗生物質は未だ知ら
れていない。本発明の目的は、新規な抗種瘍性抗生物質
レゾルチオマイシンならびにその製造法を提供すること
にある。

（課題を解決するための手段） 第一の本発明の要旨とするところは、次式で表わされる
新規な抗腫瘍性抗生物質レゾルチオマイシンおよびその
塩にある． 本発明にかかる新抗生物質レゾルチオマイシンの性状は
次に示す通りである． レゾルチオマイシンは、無色〜淡黄色の油状物質であり
、メタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム
，及びジメチルスルホキサイドに易溶であるが、水、ヘ
キサンには不溶である．比旋光度（　ａ　）ｏ　’　＝
−４　−　３　４　＠（　ｃ　＝１　−　１９　ｙメタ
ノール），，元素分析値は、Ｃ　５９．１５％、８　７
．０４％、０　２２．５４％、Ｓ　　１１．２７％を示
しＣ，．Ｈ，。０４Ｓの理論値（Ｃ５７．６８％、Ｈ　
７．１０％、０　２３．２３％、８　１０．７６％）に
よく一致し、この分子式はレゾルチオマイシンのＥＩマ
ススペクトルによって証明された．レゾルチオマイシン
のクロロホルム中で測定した赤外部吸収曲線は添付図面
の第１図に示すごとくである。紫外部及び可視部吸収曲
線は第２図に示すごとく、中性及び酸性メタノール中で
２８５ｎｍに吸収極大を示し、０．０１Ｎ水酸化ナトリ
ウム含有メタノール中では３５０ｎｍに吸収極大を示し
た。重クロロホルム中で測定した１Ｈ核磁気共鳴スペク
トルは第３図に示すごときシグナルを示し，１３Ｃ核磁
気共鳴スペクトル（重クロロホルム中）は第４図のごと
くであった． レゾルチオマイシンの構造は実施例２に示した方法で得
たサンプルを用い、上記核磁気共鳴及び他の物理化学的
測定により、６−アセチルー４−（３−ヒドロキシブチ
ル）−２−メチル−５−メチルチオレゾルシノールと決
定された。この物質は新規抗生物質であることが確認さ
れた。

レゾルチオマイシンは、栄養寒天培地中で黄色ブドー球
菌，枯草菌、その他のダラム陽性細菌、大腸菌，サルモ
ネラ菌その他のダラム陰性細菌，及び酵母菌、カンジダ
などのカビ類の増殖を１００μｇ／ｍ（１で全く抑制し
なかったが，後記の試験例で示す如く、マウス白血病Ｌ
５１７８Ｙｍ胞の増殖をｌ５．５μｇ／一で５０％抑制
した．また、４０μｇ／ｒａＱのレゾルチオマイシンは
チャイニーズハムスターＶ７９細胞に対するピンクリス
チンやアクチノマイシンＤの作用を３倍増強した．従っ
て、レゾルチオマイシンは抗腫瘍剤および併用による抗
腫瘍剤の効果増強剤としての用途が考えられる。

本発明の第二の要旨とするところは、ストレプトミセス
属に属するレゾルチオマイシン生産菌を培養してレゾル
チオマイシンを蓄積せしめ、その培養物からレゾルチオ
マイシンを採取するレゾルチオマイシンの製造法にある
。

レゾルチオマイシン生産菌の一例は、昭和５９年神奈川
県伊勢原市において採取した土壌より分離された放線菌
で４５８−６の菌株番号が付された菌株がある． この４５１１−６の菌学的性状は下記の通りである。

１．形　態 ４５ト６株は、顕微鏡下で分枝した基生菌糸よりほぼま
っすぐで先が小さな螺旋状の気菌糸を形成し、輪生技は
認められない。或熟した胞子は１０〜２０個ぐらい連鎖
し、先の方は小さな螺旋状を描いている。胞子の大きさ
は０．５〜０．９　Ｘ　Ｏ．８〜１．０μ狼ぐらいの円
筒状であり，表面は平滑である。

２．各培地における生育状態（２７℃で培養して２週間
後の１１察） 気菌糸はほとんどの培地において灰色を呈したが、未或
熟な気菌糸は赤味もしくは黄味を呈する場合があった。

コロニーの裏面はうすい黄色〜黄茶色もしくは灰黄茶色
を呈した。

（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地 発育は僅かである．明るい褐灰色の気菌糸を中程度に着
生し，溶解性色素は認められない。

（２）　グルコース・アスパラギン寒天培地発育は中程
度である．淡褐色の気菌糸を良好に着生し，淡黄褐色の
溶解性色素を認める。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５） 発育は中程度である。褐灰色の気菌糸を中程度に着生し
，淡橙色の溶解性色素を認める。

（４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ一培地４）発
育は良好である．褐灰色の気菌糸を豊富に着生し、淡褐
色の溶解性色素を認める。

（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ一培地７）発育は中程
度である．茶色の気菌糸を良好に着生し、溶解性色素は
認められない。

（６）栄養寒天培地 発育は僅かである。気菌糸も生ぜず、溶解性色素も認め
られない。

（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ一培地２）発育
は良好である。褐灰色の気菌糸を豊富に着生し溶解性色
素は認められない． （８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ一培地３）発育は
良好である．褐灰色の気菌糸を良好に着生し，淡黄褐色
の溶解性色素を認める。

３．生理・生化学的性質 （１）ゼラチンの液化 グルコース・ペプトン・ゼラチン培地でゼラチンの液化
が認められる， （２）スターチの加水分解 スターチ・無機塩寒天培地でスターチの加水分解が認め
られる． （３）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化 明らかな凝固は認められず、ペプトン化が認められる。

（４）メラニン様色素の生成 チロシン・イーストエキス培地、チロシン寒天培地及び
ペブトン・イーストエキス・鉄寒天培地でメラニン様色
素の生成が認められる。

（５）炭素源の利用性 炭素源の資化性はプリドハム・ゴトリーブの基礎培地Ｎ
ａ　９を用いて２７℃で１４日間培養して判定した．Ｄ
−グルコース，Ｄ−キシロース，し−アラビノース、Ｌ
−ラムノース，Ｄ−フルクトース，ラフイノース、Ｄ−
マンニトール、イノシトールを利用して良く発育したが
、シュクロースは利用しなかった．なお、細胞壁成分は
、全菌体を用いて分析したところ、ＬＬ−ジアミノビメ
リン酸が検出された．（６）生育温度 イースト・麦芽寒天培地及びオートミール寒天培地にお
いて２０〜４０℃の範囲で生育し、至適温度は前者で２
７〜３７℃、後者では２７〜３０℃であった．以上，４
５Ｂ−６株は，その形態学的特徴と細胞壁タイプよりス
トレプトミセス属に帰属する．さらに、形態、培養性状
、生理・生化学的性状などの特徴から、４５｝１−　６
株はストレプトミセス・コリナスであることが判定され
る． なお，４５｝１−６株は、工業技術院微生物工業技術研
究所に平成元年５月３ｌ日寄託申請し，受託番号は微工
研菌寄第１０７５３号である。

４５Ｈ−　６株は、他の放線菌の多くの菌株の場合にみ
られるように、その性質が変化しやすく、例えば紫外線
、エックス線、放射線、薬品などを用いる人工的変異手
段で変異しうるものであるが、いずれの変異株であって
も抗生物質レゾルチオマイシン生産能を有するものはす
べて本発明の方法に使用することができる． 本発明のレゾルチオマイシンの製造法を実施するに当た
っては、レゾルチオマイシン生産菌、例えばストレプト
ミセス・コリナス４５Ｈ−　６株を栄養源含有培地に接
種して好気的に培養して発育させることによってレゾル
チオマイシンを含む培養物を得る．用いる培地中の栄養
源としては、放線菌の栄養源として用いられる公知のも
のが使用できる．例えば、市販されているペプトン，肉
エキス，コーン・スチープ・リカー、綿実粉、落花生粉
、大豆粉、酵母エキス、ＮＺ−アミン、カゼインの氷解
物，魚粉，硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモ
ニウムなどの窒素源、および市販されているグリセリン
，蔗糖、澱粉，グルコース、マルトース，糖蜜などの炭
水化物，あるいは脂肪などの炭素源を使用できる。また
、食塩、リン酸塩、炭酸カルシウム、ｌＡ酸マグネシウ
ムなどの無機塩を添加できる．その他，必要に応じて微
量の金属塩を添加することもできる。これらのものは生
産菌が利用し、レゾルチオマイシンの生産に役立つもの
であればよく、公知の放線菌の培養材料はすべて用いる
ことができる。

本発明によって得られる培養物から、例えば培養濾液か
らレゾルチオマイシンを採取するに当たっては、レゾル
チオマイシンの性状を利用した通常の分離手段、例えば
溶剤抽出法，イオン交換樹脂法、吸着または分配クロマ
ト法、沈澱法などの操作を単独又は適宜組合わせて油出
精製することができる。また、遊離の形で得られたレゾ
ルチオマイシンの溶液を，塩基、例えば水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属化合物、水酸化
カルシウム、水酸化マグネシウムなどのアルカリ土類金
属化合物、アンモニウム塩などの無機塩基、エタノール
アミンなどの有機塩基により処理すれば、レゾルチオマ
イシンはそれら用いた塩基の塩類の形で分離することが
できる。

以下に実施例を示すが，レゾルチオマイシンの性状と化
学構造が本発明によって明らかになったので、その性状
に基づきレゾルチオマイシンの製造法を種々考案するこ
とができる．従って、本発明は実施例に限定されるもの
ではなく、実施例の修飾手段は勿論、本発明によって明
らかにされたレゾルチオマイシンの性状に基づいて公知
の手段を施してレゾルチオマイシンを生産，濃縮，抽出
、精製する方法をすべて包括する。

実施例１ オートミール寒天培地（１リットルの培地中オートミー
ル２０ｇ、イーストエキス１ｇ、寒天１５ｇ〉の寒天斜
面培地に培養したストレプトミセス４５１｛−６株（微
工研菌寄第１０７５３号）を，同じ組成の液体培地Ｉ０
０−を含む坂口フラスコに接種し、２７℃、４日間振盪
培養を行なった．培養液４リットルを遠心（毎分１万回
転，１５分）により上清と菌体とに分けたのち、上滑に
ダイヤイオンＨＰ−２０４１脂（三菱化成社１１）４０
０−を加え吸着させ、その後、樹脂を水洗し、メタノー
ル４リットルで溶出、溶出した液を減圧濃縮後、水に溶
解させた。これをＩＮ塩酸でＰＨ３にし，酢酸エチル６
４０−で３回に分けて抽出，酢酸エチル層を減圧濃縮乾
固の後，クロロホルム層に溶解させ、シリカゲル力ラム
クロマトグラフィを行なった。クロロホルムーメタノー
ル（２００　：　ｌ）で溶出して得られた活性成分を減
圧濃縮乾固後、メタノールに溶解し、ＯＤＳ逆相高速液
体クロマトグラフィにかけたところ、保持時間２４分に
均一な活性のピークが現れた．活性画分を集めて減圧下
に濃縮乾固したところ、２．５■のレゾルチオマイシン
が得られた．〔α）５’　＝−４．３４゜（Ｃ＝１．１
９，メタノール）． 叉凰銖主 大量のレゾルチオマイシンを得るために、ジャー培養器
２基にオートミール・イーストエキス培地をそれぞれ３
０リットル入れ、種培養鹸（坂口フラスコによる培養）
６００一ずつ加え，さらに２７℃，１２０時間培養した
（毎分２００回転、通気量毎分ｌＯリットル）．培養液
６０リットルはセライト（ジョンス・マンビル社製）を
加えて吸引濾過したのち、上清をｐＨ３に合わせ、これ
を酢酸エチル１００リットルで抽出した．その後は、実
施例１と同様にして分離精製を行ない，高速液体クロマ
トグラフィによる分画により３９．１■のレゾルチオマ
イシンを得た。

次に、試験例によって、本発明によるレゾルチオマイシ
ンは，癌細胞の増殖を抑制する作用をもつこと（試験例
１）及び抗癌剤の効果を増強する作用をもつこと（試験
例２）を例証する．区抜目よ マウス白血病Ｌ５１７８Ｙ細胞をウシ胎児血清１０％を
含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃で３日間培養すると
，ｔｓ，ｏｏｏ個／一の細胞が９８万個／ｌＩＱに増え
た。このとき，レゾルチオマイシンを種々な濃度で培地
中に加えておくと、その濃度に応じて細胞の増殖は阻害
され、ｌ５．５μＨ／ｍＱのレゾルチオマイシン濃度で
細胞の増殖の５０％阻害（ＩＣ，。）が観察された．莢
抜量又 チャイニーズハムスターＶ７９細胞を、１０％コウジ血
清を含むイーグルＭＥＭ培地中に２００〜３００１ｔｉ
ｉ胞／プレートの細胞濃度でまき、２０時間後に抗膝瘍
剤として知られるピンクリスチンを培地に添加し３７℃
で７〜８日間培養した．その後，プレート上の細胞を１
０％ホルマリン溶液で固定、クリスタルバイオレットで
染色し、コロニーの数を数えたところ，ピンクリスチン
の■Ｃｓｌｌは１７．３ｎｇ／ｔＱであったが、ピンク
リスチンとともにレゾルチオマイシンを４０μｇ／閣藍
添加すると、ピンクリスチンのＩＣ，　．は５．１ｎｇ
／ｍｊ２となり，ピンクリスチンの抗癌効果を３．４倍
増強した．同様の実験で、レゾルチオマイシン４０μｇ
／ｔａＱはアクチノマイシンＤの効果を３．３倍増強し
た。

【図面の簡単な説明】

添付図面の第１図はレゾルチオマイシンのクロロホルム
中で測定した赤外部吸収曲線を示す。第２図は中性・酸
性メタノール中および０．０１Ｎ水酸化ナトリウム含有
メタノール中で測定したレゾルチオマイシンの紫外部お
よび可視部吸収曲線を示す．第３図は重クロロホルム中
で測定したレゾルチオマイシンの１Ｈ核磁気共鳴スペク
トル（５００Ｍ　Ｈｚ　）であり、第４図はその１３Ｃ
核核気共鳴スペクトル（１００ＭＩｌｚ）である。 四唄丑

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる抗腫瘍性抗生物質レゾルチオマイシンおよ
   びその塩。 ２、ストレプトミセス属に属するレゾルチオマイシン生
   産菌を、栄養源を含有する培地中で培養し、その培養物
   からレゾルチオマイシンを採取することを特徴とするレ
   ゾルチオマイシンの製造法。