JPH0330672A - 新規耐熱性および耐酸性プルラナーゼ酵素およびその製造方法 - Google Patents
新規耐熱性および耐酸性プルラナーゼ酵素およびその製造方法Info
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- JPH0330672A JPH0330672A JP2163011A JP16301190A JPH0330672A JP H0330672 A JPH0330672 A JP H0330672A JP 2163011 A JP2163011 A JP 2163011A JP 16301190 A JP16301190 A JP 16301190A JP H0330672 A JPH0330672 A JP H0330672A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野］
本発明は、一定の炭水化物の加水分解に有用な新規酵素
および新規桿菌である、バチルス・ナガノエンシス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）により好気
培養で該酵素を製造する方法に関する。
および新規桿菌である、バチルス・ナガノエンシス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）により好気
培養で該酵素を製造する方法に関する。
多数の高分子炭水化物は、グルコース単位が互いにα−
１，６−グルコシド結合またはα−１，４−グルコシド
結合により結合されているグルコースのプリマーである
。これらの結合を開裂しそれによって大きな炭水化物分
子を、種々の用途により有用なより小さな分子に破壊し
得ることはかなり工業的に重要である。グルコシド結合
の破壊はしばしば微生物により生産される酵素によって
行われる。
１，６−グルコシド結合またはα−１，４−グルコシド
結合により結合されているグルコースのプリマーである
。これらの結合を開裂しそれによって大きな炭水化物分
子を、種々の用途により有用なより小さな分子に破壊し
得ることはかなり工業的に重要である。グルコシド結合
の破壊はしばしば微生物により生産される酵素によって
行われる。
α−アミラーセとして知られている酵素のうちの一郡は
α−１，４−グルコシド結合を開裂する。αアミラーゼ
酵素はバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルス・ステア
ロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉＬｕｓ ）のような微生物により生産
される。このような酵素はα−１，６−グルコシド結合
を開裂しない。
α−１，４−グルコシド結合を開裂する。αアミラーゼ
酵素はバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルス・ステア
ロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｉＬｕｓ ）のような微生物により生産
される。このような酵素はα−１，６−グルコシド結合
を開裂しない。
グルコアミラーゼと呼ばれることもある別の種類の酵素
は、α−１，６−およびα−１，４−グルコシド結合の
両方を開裂することができる。これらの酵素は一度に１
つのグルコース単位を炭水化物分子の非還元末端から除
去する。該酵素はα−１，６−グルコシド結合を加水分
解し得るが、α−１，４−グルコシド結合をずっと速や
かに加水分解する。
は、α−１，６−およびα−１，４−グルコシド結合の
両方を開裂することができる。これらの酵素は一度に１
つのグルコース単位を炭水化物分子の非還元末端から除
去する。該酵素はα−１，６−グルコシド結合を加水分
解し得るが、α−１，４−グルコシド結合をずっと速や
かに加水分解する。
慣用のデキストロース製造方法において、デンプンは二
段階で加水分解される。第一段階では、デンプンはα−
アミラーゼ酵素を用いて約５．５〜７のｐＨで処理する
ことにより液化される。液化されたデンプンは次にｐＨ
４〜５で作用するグルコアミラーゼ酵素を用いて糖化さ
れる。
段階で加水分解される。第一段階では、デンプンはα−
アミラーゼ酵素を用いて約５．５〜７のｐＨで処理する
ことにより液化される。液化されたデンプンは次にｐＨ
４〜５で作用するグルコアミラーゼ酵素を用いて糖化さ
れる。
デンプンの加水分解方法が、約３０％乾燥固形分の通常
の濃度で行われる時、約９６％のデキストロースしか形
成されない。転換がこの点を越えて明らかに進行しない
一つの理由は、少なくとも２，３のグルコース単位がα
−１，６−結合により結合されている少糖がかなり多数
存在していることによる。
の濃度で行われる時、約９６％のデキストロースしか形
成されない。転換がこの点を越えて明らかに進行しない
一つの理由は、少なくとも２，３のグルコース単位がα
−１，６−結合により結合されている少糖がかなり多数
存在していることによる。
グルコアミラーゼを増加して添加することによりこれら
のα−１，６−結合のより多数の開裂を得ようとする試
みは、デキストロースの少糖への再重合を引き起こす。
のα−１，６−結合のより多数の開裂を得ようとする試
みは、デキストロースの少糖への再重合を引き起こす。
同様の問題は、デンプンを高マルトースシロップに変換
する時に生じる。グルコース単位の間にα−１，６−結
合を含む少糖は、マルトース産生（ｍａ ｌ ｔｏｇｅ
ｎ ｉｃ）酵素により加水分解されず、その結果シロッ
プ中の所望のマルトースがより低い比率となる。
する時に生じる。グルコース単位の間にα−１，６−結
合を含む少糖は、マルトース産生（ｍａ ｌ ｔｏｇｅ
ｎ ｉｃ）酵素により加水分解されず、その結果シロッ
プ中の所望のマルトースがより低い比率となる。
これらの問題を克服するために、先達の研究者はグルコ
アミラーゼ、または別の糖化酵素にα−１゜６−結合を
開裂する酵素を添加することを提案している。プルラナ
ーゼとして記載されている酵素がこの目的のために使用
された。この酵素は多糖類であるプルラン中のα−１，
６−結合を加水分解して三糖類であるマルトトリオース
とすることができる。該酵素はプルラン中のα−１，４
−結合を加水分解しない。開示された第一のプルラナー
ゼは、ＫＬｅｂｓｉｅｔＬａ ｐｎｅａｔｎｏｎｉａｅ
（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅＳ）によ
り生産される酵素であった。デンプンを加水分解する方
法における該酵素の使用については、米国特許筒３，８
９７．３（１５号に記載されている。
アミラーゼ、または別の糖化酵素にα−１゜６−結合を
開裂する酵素を添加することを提案している。プルラナ
ーゼとして記載されている酵素がこの目的のために使用
された。この酵素は多糖類であるプルラン中のα−１，
６−結合を加水分解して三糖類であるマルトトリオース
とすることができる。該酵素はプルラン中のα−１，４
−結合を加水分解しない。開示された第一のプルラナー
ゼは、ＫＬｅｂｓｉｅｔＬａ ｐｎｅａｔｎｏｎｉａｅ
（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅＳ）によ
り生産される酵素であった。デンプンを加水分解する方
法における該酵素の使用については、米国特許筒３，８
９７．３（１５号に記載されている。
しかしながら、この酵素には２つの欠点がある。
該酵素は一般にｐＨ５，５〜６で活性であるが、このｐ
Ｈではグルコアミラーゼの活性が劇的に減ぜられる。さ
らに、該酵素は不耐熱性であり５０℃よりはるかに高い
温度で使用することができない。商業的な作業において
は、基質の微生物汚染の危険を減するために、糖化反応
を６０℃またはそれ以上で行うのが好ましい。
Ｈではグルコアミラーゼの活性が劇的に減ぜられる。さ
らに、該酵素は不耐熱性であり５０℃よりはるかに高い
温度で使用することができない。商業的な作業において
は、基質の微生物汚染の危険を減するために、糖化反応
を６０℃またはそれ以上で行うのが好ましい。
上述の限界に打ち勝つために提案されたーのプルラナー
ゼは米国特許筒４，７３４，３６４号に記載されている
方法により、米から抽出される。この酵素はＫｌｅｂｓ
ｉｅＬＬａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの酵素より耐熱
性かつ耐酸性であるが、通常の糖化反応条件下で所望さ
れると同等の活性を保持しない。さらに、この酵素は先
ず米から抽出される時に別の酵素で汚染され、そして糖
化方法において使用され得る前に大規模な精製を必要と
する。
ゼは米国特許筒４，７３４，３６４号に記載されている
方法により、米から抽出される。この酵素はＫｌｅｂｓ
ｉｅＬＬａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの酵素より耐熱
性かつ耐酸性であるが、通常の糖化反応条件下で所望さ
れると同等の活性を保持しない。さらに、この酵素は先
ず米から抽出される時に別の酵素で汚染され、そして糖
化方法において使用され得る前に大規模な精製を必要と
する。
良好な耐熱性を持つ別の酵素は米国特許筒４．６２８，
（１２８号に開示さている。Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏ
ｂｉｕｍｂγｏｃｋｉ ｉから得られるこの酵素は、プ
ルランをマルトトリオースに加水分解する能力に基づい
てプルラナーゼとして分類されていた。しかしながら、
該酵素はデンプン中のα−１，６−グルコシド結合をほ
とんど加水分解しないので、デキストロースの製造方法
に使用するには不適当である（Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｊ、
ＢａｃｔｅｒｉｏＬｏｇｙ、 １６９．４３（１２−
０７ （１９８７））。
（１２８号に開示さている。Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏ
ｂｉｕｍｂγｏｃｋｉ ｉから得られるこの酵素は、プ
ルランをマルトトリオースに加水分解する能力に基づい
てプルラナーゼとして分類されていた。しかしながら、
該酵素はデンプン中のα−１，６−グルコシド結合をほ
とんど加水分解しないので、デキストロースの製造方法
に使用するには不適当である（Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｊ、
ＢａｃｔｅｒｉｏＬｏｇｙ、 １６９．４３（１２−
０７ （１９８７））。
耐熱性および耐酸性が改善されたことが報告されている
別のプルラナーゼは微生物のＢａｃｉＬＬａｓαｃｉｄ
ｏｐｕｌＬｕＬｙｔｉｃｕｓにより生産される。これは
米国特許筒４，５６０，６５１号に記載されそして商品
名ＦＲＯＭＯＺＹＭＥで販売されている。
別のプルラナーゼは微生物のＢａｃｉＬＬａｓαｃｉｄ
ｏｐｕｌＬｕＬｙｔｉｃｕｓにより生産される。これは
米国特許筒４，５６０，６５１号に記載されそして商品
名ＦＲＯＭＯＺＹＭＥで販売されている。
本発明者は、デンプン中のα−１，６−グルコシド結合
を加水分解しかつＢａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐａＬ
Ｌｕ、Ｌｙｔｉｃｕｓから得られる酵素よりもいっそう
高い熱安定性を有するプルラナーゼ酵素を生産する新規
微生物を発見した。さらに、該酵素は、デンプンの糖化
に通常使用される酸性ｐＨ条件で良好な活性および安定
性を示す。このため、該酵素をグルコアミラーゼと共に
首尾よく使用してデキストロースをより増加した収率で
得ることができる。該酵素を、マルトース産生酵素と共
に使用して高マルトース含量のマルトースシロップを製
造することも可能である。
を加水分解しかつＢａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐａＬ
Ｌｕ、Ｌｙｔｉｃｕｓから得られる酵素よりもいっそう
高い熱安定性を有するプルラナーゼ酵素を生産する新規
微生物を発見した。さらに、該酵素は、デンプンの糖化
に通常使用される酸性ｐＨ条件で良好な活性および安定
性を示す。このため、該酵素をグルコアミラーゼと共に
首尾よく使用してデキストロースをより増加した収率で
得ることができる。該酵素を、マルトース産生酵素と共
に使用して高マルトース含量のマルトースシロップを製
造することも可能である。
本発明に従って、バチルス・ナガノエンシス（Ｂａｃｉ
Ｌｔｕｓ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）から得られる耐熱
性・耐酸性のプルラナーゼ酵素調製物が提供される。
Ｌｔｕｓ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）から得られる耐熱
性・耐酸性のプルラナーゼ酵素調製物が提供される。
この酵素は、６０℃で水溶液中でｐＨ４，５で基質の存
在下で２３２時間保持される時、少なくとも約５０％の
プルラン加水分解活性を保持し得る。
在下で２３２時間保持される時、少なくとも約５０％の
プルラン加水分解活性を保持し得る。
また本発明に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎｏ、 ＡＴＣＣ
５３９０９を有するバチルス・ナガノエンシス（Ｂａｃ
ｉＬｌｕｓ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）と呼ばれる新規
微生物の生物学的に純粋な培養菌が提供される。
ｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎｏ、 ＡＴＣＣ
５３９０９を有するバチルス・ナガノエンシス（Ｂａｃ
ｉＬｌｕｓ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）と呼ばれる新規
微生物の生物学的に純粋な培養菌が提供される。
さらに、本発明に従って、プルラナーゼの製造方法が提
供される。この方法は、バチルス・ナガノエンシス（Ｂ
ａｃｉｌｌａｓ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）のプルラナ
−ゼ生産菌株を適当な栄養培地中で培養し次いでプルラ
ナーゼ酵素を培地から単離することを包含する。
供される。この方法は、バチルス・ナガノエンシス（Ｂ
ａｃｉｌｌａｓ ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）のプルラナ
−ゼ生産菌株を適当な栄養培地中で培養し次いでプルラ
ナーゼ酵素を培地から単離することを包含する。
さらに、本発明に従って、デンプン水解物をグルコアミ
ラーゼおよび有効量の本発明のプルラナーゼ酵素調製物
を用いて糖化することを包含する澱粉水解物からのデキ
ストロースの製造方法が提供される。
ラーゼおよび有効量の本発明のプルラナーゼ酵素調製物
を用いて糖化することを包含する澱粉水解物からのデキ
ストロースの製造方法が提供される。
最後に、本発明によれば、デンプン水解物をマルトース
産生酵素および有効量の本発明のプルラナーゼ酵素調製
物を用いて糖化することを包含する澱粉水解物からの高
マルトースシロップの製造方法が提供される。
産生酵素および有効量の本発明のプルラナーゼ酵素調製
物を用いて糖化することを包含する澱粉水解物からの高
マルトースシロップの製造方法が提供される。
本発明のプルラナーゼは、第一に日本国長野系の木台地
方で集められた土壌試料から単離された微生物から得ら
れた。該微生物は、次の特徴を有する：該微生物は２７
℃〜約４０℃の温度で（成長に最適な温度は約３０℃〜
約３７℃）良好に成長する。
方で集められた土壌試料から単離された微生物から得ら
れた。該微生物は、次の特徴を有する：該微生物は２７
℃〜約４０℃の温度で（成長に最適な温度は約３０℃〜
約３７℃）良好に成長する。
成長の開始に最適なｐＨは約５〜５．５である。該微生
物は成長を開始するのに６．５未満のｐＨを必要とする
。
物は成長を開始するのに６．５未満のｐＨを必要とする
。
１：
栄養細胞−幅０．５〜１．０ミクロン、長さ２〜１０ミ
クロンの桿菌。
クロンの桿菌。
胞子−卵形体の、終わりに近い所で生じる−は胞子嚢の
膨張を引き起こす。
膨張を引き起こす。
集落−半透明〜不透明の、きらきら光る、滑らかな凸状
体。
体。
生血ヱｍ反息；
ダラム反応 陽性カタラーゼ
陽性好気性成長
陽性嫌気性成長 陰
性５０℃での成長 陰性３０〜３
７℃での成長 良好５χＮａＣ１中で
の成長 陰性グルコースからの酸９
可変マンニトールからの酸”
陽性 アラビノースからの酸０ 陽性キシロースか
らの酸１ 酸性ショ糖からの酸
陰性ニドラードのニトリドへの還元
陰性シトラードの利用 陰性プロピオ
ナートの利用 陰性チロシンの分解
陰性デンプン加水分解
陽性ｖｐ反応 陰性レシ
チナーゼ（Ｌｅｃｉ ｔｈｉｎａｓｅ） 陰
性０〉１４日の遅れ こららの分類基準に基づいて、該微生物はバチルス（Ｂ
ａｃｉ ＬＬｕｓ ）の新種であると考えられ、我々は
バチルス・ナガノエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｇ
ａｎｏｅｎｓｉｓ）という名称を与えた。純粋に単離さ
れた菌株は、メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅに所
在のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎに、特許手続上の微生物の寄託に関
するブタペスト条約の規則に従って寄託されている。該
微生物にはＡＴＣＣＮｏ。
陽性好気性成長
陽性嫌気性成長 陰
性５０℃での成長 陰性３０〜３
７℃での成長 良好５χＮａＣ１中で
の成長 陰性グルコースからの酸９
可変マンニトールからの酸”
陽性 アラビノースからの酸０ 陽性キシロースか
らの酸１ 酸性ショ糖からの酸
陰性ニドラードのニトリドへの還元
陰性シトラードの利用 陰性プロピオ
ナートの利用 陰性チロシンの分解
陰性デンプン加水分解
陽性ｖｐ反応 陰性レシ
チナーゼ（Ｌｅｃｉ ｔｈｉｎａｓｅ） 陰
性０〉１４日の遅れ こららの分類基準に基づいて、該微生物はバチルス（Ｂ
ａｃｉ ＬＬｕｓ ）の新種であると考えられ、我々は
バチルス・ナガノエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｇ
ａｎｏｅｎｓｉｓ）という名称を与えた。純粋に単離さ
れた菌株は、メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅに所
在のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎに、特許手続上の微生物の寄託に関
するブタペスト条約の規則に従って寄託されている。該
微生物にはＡＴＣＣＮｏ。
５３９０９が与えられた。
本発明のプルラナーゼの製造に使用する微生物。
は、好気性条件下に、炭水化物源として可溶性デンプン
およびマルトース、酵母エキス、タンパク質および無機
質を含む成長培地中で成長させる。
およびマルトース、酵母エキス、タンパク質および無機
質を含む成長培地中で成長させる。
微生物はグルコースの存在下に０．５％の濃度で成長す
るが、その成長はグルコースの濃度が０．７５％と同程
度の時抑制される。プルラナーゼの生産に最適な発酵培
地のｐｌ＋は約５〜約６でありそして最適温度は約３０
℃〜約３７℃である。
るが、その成長はグルコースの濃度が０．７５％と同程
度の時抑制される。プルラナーゼの生産に最適な発酵培
地のｐｌ＋は約５〜約６でありそして最適温度は約３０
℃〜約３７℃である。
当該微生物により生産されるプルラナーゼは発酵培地中
に***される。この事実はプルラナーゼが細胞外酵素で
あることを示す。該酵素は発酵培地から、遠心分離また
は濾過のような慣用の手段を用いて細胞を除去すること
により得られる。該酵素は所望であれば限外濾過または
別の慣用の方法によって濃縮されるごともできる。
に***される。この事実はプルラナーゼが細胞外酵素で
あることを示す。該酵素は発酵培地から、遠心分離また
は濾過のような慣用の手段を用いて細胞を除去すること
により得られる。該酵素は所望であれば限外濾過または
別の慣用の方法によって濃縮されるごともできる。
プルラナーゼ酵素の調製および性質の以下の記載におい
て、全ての部および％は、特記なき限り、重量部および
重量％を表す。
て、全ての部および％は、特記なき限り、重量部および
重量％を表す。
１土プ去二九分捉
プルラナーゼ活性を、酵素の存在下にプルランからの還
元糖の遊離により（グルコースとして）測定する。ｐＨ
４，５に調整された、１％のプルラン、測定する酵素お
よびアセタート緩衝剤を含む溶液（０，５ｍｊりを６０
″Ｃで１０分間培養する。次いで酵素作用を水浴中で急
、速に冷却することにより終結させる。次いで１容積あ
たり０．０７１重量％（ｗ／ｖ）のに、３Ｆｅ（ＣＮ）
、溶液を添加する。溶液を混合し、５分間煮沸しそして
室温に冷却する。３７３ ｎｍでの吸光度を測定しそし
て、同じ方法で反応させた０〜０．０４％の濃度の０．
５ ｄグルコース溶液に関するグルコース濃度に対する
３７３ ｎｍでの吸光度の標準曲線を比較して、ミクロ
モルの還元ｔＪ！ （グルコースとして）に変換する。
元糖の遊離により（グルコースとして）測定する。ｐＨ
４，５に調整された、１％のプルラン、測定する酵素お
よびアセタート緩衝剤を含む溶液（０，５ｍｊりを６０
″Ｃで１０分間培養する。次いで酵素作用を水浴中で急
、速に冷却することにより終結させる。次いで１容積あ
たり０．０７１重量％（ｗ／ｖ）のに、３Ｆｅ（ＣＮ）
、溶液を添加する。溶液を混合し、５分間煮沸しそして
室温に冷却する。３７３ ｎｍでの吸光度を測定しそし
て、同じ方法で反応させた０〜０．０４％の濃度の０．
５ ｄグルコース溶液に関するグルコース濃度に対する
３７３ ｎｍでの吸光度の標準曲線を比較して、ミクロ
モルの還元ｔＪ！ （グルコースとして）に変換する。
観察された吸光度を、酵素の不存在下で基質溶液により
生じる非特異的な吸光度および明示された基質の不存在
下で上澄みブイヨンにより生じる非特異的な吸光度のた
めに修正する。プルラナーゼ活性の一単位は、当該分析
条件下に１分間あたり１ミクロモルの還元糖（グルコー
スとして測定される）を生産するのに必要な酵素量とし
て定義される。
生じる非特異的な吸光度および明示された基質の不存在
下で上澄みブイヨンにより生じる非特異的な吸光度のた
めに修正する。プルラナーゼ活性の一単位は、当該分析
条件下に１分間あたり１ミクロモルの還元糖（グルコー
スとして測定される）を生産するのに必要な酵素量とし
て定義される。
ブルー −ゼの量。■
本発明のプルラナーゼ酵素を生産するバチルス（Ｂａｃ
ＩＬＬｕｓ）菌株は、適当な発酵培地で培養する前に固
体基質上で増殖される。固体斜面培地および液体培地の
組成を第１表に示す。細胞をまず斜面上で成長させ次い
で初期培地に移す。１６時間後、細胞を第二培地に接種
しそこでさらに６時間成長させた後、最終生産培地に移
す。発酵は一般に通気して約３０’Ｃ〜約３７℃の温度
でかつ約５〜約６の初期ｐＨで行われる。プルラナーゼ
酵素は培地に分泌される。
ＩＬＬｕｓ）菌株は、適当な発酵培地で培養する前に固
体基質上で増殖される。固体斜面培地および液体培地の
組成を第１表に示す。細胞をまず斜面上で成長させ次い
で初期培地に移す。１６時間後、細胞を第二培地に接種
しそこでさらに６時間成長させた後、最終生産培地に移
す。発酵は一般に通気して約３０’Ｃ〜約３７℃の温度
でかつ約５〜約６の初期ｐＨで行われる。プルラナーゼ
酵素は培地に分泌される。
発酵が約２４時間〜約４８時間行われた後、細胞および
他の固体の砕片を遠心分離または濾過により除去する。
他の固体の砕片を遠心分離または濾過により除去する。
上澄み液中のプルラナーゼ酵素収量は、１ｍあたり約１
５〜約３０単位に変わる。溶液を所望であれば減圧下に
限外濾過または蒸発させることにより濃縮してもよい。
５〜約３０単位に変わる。溶液を所望であれば減圧下に
限外濾過または蒸発させることにより濃縮してもよい。
微生物の培養菌は、１％のアミロペクチンを含む栄養寒
天培地上で胞子変態段階において短期使用のために維持
されることができる。培養菌の長期保存のためには、細
胞を１０％−／Ｖグリセロール中中子７０゛Ｃ凍結する
かまたは１２％−／νのショ糖または２０％−／Ｖのス
キムミルク中で凍結乾燥し次いで冷蔵することができる
。
天培地上で胞子変態段階において短期使用のために維持
されることができる。培養菌の長期保存のためには、細
胞を１０％−／Ｖグリセロール中中子７０゛Ｃ凍結する
かまたは１２％−／νのショ糖または２０％−／Ｖのス
キムミルク中で凍結乾燥し次いで冷蔵することができる
。
可？容性デンプン
マルトース
酵母エキス
バタトー トリプトン
（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ）
ポリペプトン
アミロペクチン
（Ｎ１１４）２ＳＯ４
Ｋｌｌ□ＰＯ１
ＭｇＳＯｎ ７８２０
ＣａＣＩｚ ２ＨｚＯ
０，１
０，２
１，０
０，１
０，（１３
０，（１２
０，（１２
３，０
１，０
１，５
１，０
０，２５
０，１３
０，（１５
０，（１６
ＭｎＣ１ｚ ４ＨｚＯＯ，（１８）０１０，（１８）１
Ｐｅｓｏ、７Ｈ，ＯＯ，（１８）１寒天
２．０ 調整されたｐＨ５，（１６，０ の° ゛ 反応温度の酵素に対する影響を、標準プルラナーゼ分析
（ｐＨ４，５）を種々の温度で０．１Ｍのアセタート緩
衝液を用いて行うことにより測定する。このｐＨで、酵
素の温度最適条件は約６２．５℃であることがわかった
。
Ｐｅｓｏ、７Ｈ，ＯＯ，（１８）１寒天
２．０ 調整されたｐＨ５，（１６，０ の° ゛ 反応温度の酵素に対する影響を、標準プルラナーゼ分析
（ｐＨ４，５）を種々の温度で０．１Ｍのアセタート緩
衝液を用いて行うことにより測定する。このｐＨで、酵
素の温度最適条件は約６２．５℃であることがわかった
。
に・ るＨの≦１
酵素のプルラナーゼ活性を、プルラナーゼ分析を６０℃
で種々のｐＨ値（０，１Ｍのアセタート緩衝液）で行う
ことにより測定する。酵素は約ｐＨ５で最大活性を示し
そしてｐ）１４．０〜５．５で最大活性の９０％を越え
る活性を示した。
で種々のｐＨ値（０，１Ｍのアセタート緩衝液）で行う
ことにより測定する。酵素は約ｐＨ５で最大活性を示し
そしてｐ）１４．０〜５．５で最大活性の９０％を越え
る活性を示した。
鼓稟夏乱然立
緩衝液中で基質の不存在下に酵素の安定性を調べるため
、酵素の試料を０．１Ｍのアセタート緩衝液（ｐＨ４，
５）中で１−あたり約１単位の濃度に稀釈しそして６０
℃で培養する。種々の時間培養された試料の残余酵素活
性を分析する。これらの条件下で酵素半減期は２１．６
分であった。試験を０．１ Ｍアセタート緩衝液中でｐ
ｎｓ、ｏで繰り返した場合、半減期は４９．８分であっ
た。
、酵素の試料を０．１Ｍのアセタート緩衝液（ｐＨ４，
５）中で１−あたり約１単位の濃度に稀釈しそして６０
℃で培養する。種々の時間培養された試料の残余酵素活
性を分析する。これらの条件下で酵素半減期は２１．６
分であった。試験を０．１ Ｍアセタート緩衝液中でｐ
ｎｓ、ｏで繰り返した場合、半減期は４９．８分であっ
た。
市販のプルラナーゼ酵素であるＢａｃｉｌｌｕｓ ａｃ
ｉｄ。
ｉｄ。
ｐａｌ １ｕＬｙｔ １ｃｕｓからのＰＲＯＭＯＺＹＭ
Ｅ （コネチカット州、Ｗｉｌｔｏｎ所在のＮｏｖｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の試料を同じ条件下で試験
すると、該酵素はｐＨ４，５でたった５、９分そしてｐ
Ｈ５，０で１４．１分の著しく低い半減期を有していた
。
Ｅ （コネチカット州、Ｗｉｌｔｏｎ所在のＮｏｖｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の試料を同じ条件下で試験
すると、該酵素はｐＨ４，５でたった５、９分そしてｐ
Ｈ５，０で１４．１分の著しく低い半減期を有していた
。
本発明のプルラナーゼ酵素の熱安定性をデンプン水解物
の存在下に同様に測定する。この場合、酵素を、１０デ
キストロース当量（Ｄ、Ｅ、）のデンプン水解物の３０
％−／νの溶液中１ｄあたり約８０単位の濃度に稀釈す
る。該溶液を６０℃で培養しそして試料を種々の時間で
取り出して残余酵素活性を測定する。反応がｐＨ４，５
で行われる時、原料は２３２時間の半減期を有していた
。比較試験は市販のプルラナーゼ酵素であるＦＲＯＭＯ
ＺＹＭＢ、 （コネチカット州、Ｗｉｌｔｏｎ所在のＮ
０ＶＯＬａｂｓ）を用いて行われる。Ｂａｃ ｔＬｔｕ
ｓ ａｃｉｄｏｐｕｔＬｕＬｙｔｉｃｕｓによって生産
されるこの酵素は同一条件下に約１２１時間の半減期を
有していた。これらの例は明らかに本発明の酵素の優れ
た安定性を示す。
の存在下に同様に測定する。この場合、酵素を、１０デ
キストロース当量（Ｄ、Ｅ、）のデンプン水解物の３０
％−／νの溶液中１ｄあたり約８０単位の濃度に稀釈す
る。該溶液を６０℃で培養しそして試料を種々の時間で
取り出して残余酵素活性を測定する。反応がｐＨ４，５
で行われる時、原料は２３２時間の半減期を有していた
。比較試験は市販のプルラナーゼ酵素であるＦＲＯＭＯ
ＺＹＭＢ、 （コネチカット州、Ｗｉｌｔｏｎ所在のＮ
０ＶＯＬａｂｓ）を用いて行われる。Ｂａｃ ｔＬｔｕ
ｓ ａｃｉｄｏｐｕｔＬｕＬｙｔｉｃｕｓによって生産
されるこの酵素は同一条件下に約１２１時間の半減期を
有していた。これらの例は明らかに本発明の酵素の優れ
た安定性を示す。
プルーノの ＼”
プルランの５％水溶液を本発明の酵素（プルラン溶液１
戚あたり１単位）で１時間ｐＨ４，５そして６０℃で処
理することにより加水分解する。ペーパークロマトグラ
フィーにより測定された生成物は主にマルトトリオース
と少量のマルトヘキサオースである。
戚あたり１単位）で１時間ｐＨ４，５そして６０℃で処
理することにより加水分解する。ペーパークロマトグラ
フィーにより測定された生成物は主にマルトトリオース
と少量のマルトヘキサオースである。
いｊ−−゛キス ロース
１８．８のり、Ｉｌｉ、を持つデンプン水解物を粒状コ
ーンスターチをα−アミラーゼ酵素を用いて加水分解す
ることにより調製する。１（１８） ｐｐｍカルシウム
イオンを含むデンプンの３０％ｗ／ｖ水溶液にデンプン
Ｉｇ （乾燥量基準）あたり本酵素２．５単位を添加す
る。使用したα−アミラーゼはＧ−ＺＹＭＥ” Ｇ９９
５ にュージャージー州、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃ１１
ｆｆｓに所在のＥｎｚｙｓ＋ｅ Ｂｉｏ−３ｙｓｔｅｍ
ｓ Ｌｔｄ、）である。この混合物（ｐＨ６，０）を攪
拌しなから９８℃で’３０分間加熱し次いで冷却する。
ーンスターチをα−アミラーゼ酵素を用いて加水分解す
ることにより調製する。１（１８） ｐｐｍカルシウム
イオンを含むデンプンの３０％ｗ／ｖ水溶液にデンプン
Ｉｇ （乾燥量基準）あたり本酵素２．５単位を添加す
る。使用したα−アミラーゼはＧ−ＺＹＭＥ” Ｇ９９
５ にュージャージー州、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃ１１
ｆｆｓに所在のＥｎｚｙｓ＋ｅ Ｂｉｏ−３ｙｓｔｅｍ
ｓ Ｌｔｄ、）である。この混合物（ｐＨ６，０）を攪
拌しなから９８℃で’３０分間加熱し次いで冷却する。
３０％ｗ／ｖの１８．８ Ｄ、Ｅ、澱粉水解物を含む溶
液をｐＨ４，３に調整しそして６０℃でグルコアミラー
ゼと本発明のプルラナーゼ酵素との混合物を用いて加熱
する。グルコアミラーゼはＥｎｚｙｍｅ Ｂｉｏ−Ｓｙ
ｓｔｅｍｓＬｔｄ、から入手できる市販のグルコアミラ
ーゼＧ−ＺＹＭＥ ” Ｇ９９０である。該酵素はデン
プン水解物中乾燥基質１ｇあたり０．２単位の割合で使
用される。
液をｐＨ４，３に調整しそして６０℃でグルコアミラー
ゼと本発明のプルラナーゼ酵素との混合物を用いて加熱
する。グルコアミラーゼはＥｎｚｙｍｅ Ｂｉｏ−Ｓｙ
ｓｔｅｍｓＬｔｄ、から入手できる市販のグルコアミラ
ーゼＧ−ＺＹＭＥ ” Ｇ９９０である。該酵素はデン
プン水解物中乾燥基質１ｇあたり０．２単位の割合で使
用される。
本発明のプルラナーゼはデンプン水解物中乾燥基質１ｇ
あたり０．９単位の割合で使用される。試料のデキスト
ロース含量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）により種々の時間で分析された。比較試験は、プルラ
ナーゼ酵素を添加しないことを除いて、同一の割合で使
用して行われる。第■表に示した結果は、本発明のプル
ラナーゼ酵素をグルコアミラーゼとともに使用すると、
グルコアミラーゼ単独で得られるよりも速いデキストロ
ース生産およびより大きいデキストロース最大収量が得
られることを示す。
あたり０．９単位の割合で使用される。試料のデキスト
ロース含量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）により種々の時間で分析された。比較試験は、プルラ
ナーゼ酵素を添加しないことを除いて、同一の割合で使
用して行われる。第■表に示した結果は、本発明のプル
ラナーゼ酵素をグルコアミラーゼとともに使用すると、
グルコアミラーゼ単独で得られるよりも速いデキストロ
ース生産およびより大きいデキストロース最大収量が得
られることを示す。
一゛キス ロース
Ｌデ土ス上二ニス
反応時間 グルコアミラーゼｊ刺匪
Ｌ グ沙λ１−鉦元二五 並よ１１互旦去ユ亙２３
９２．７ ９５．６４７
９５．４ ９６．５７１
９６．０ ９６．５９６ ９６
．０ ９６．５デンプン水解物をグルコア
ミラーゼおよび本発明のプルラナーゼ酵素を用いて糖化
することによりデキストロースを製造する時、糖化は約
４．０〜約６．０のｐＨでそして約５５℃〜約６５℃の
温度で行われることができる。
Ｌ グ沙λ１−鉦元二五 並よ１１互旦去ユ亙２３
９２．７ ９５．６４７
９５．４ ９６．５７１
９６．０ ９６．５９６ ９６
．０ ９６．５デンプン水解物をグルコア
ミラーゼおよび本発明のプルラナーゼ酵素を用いて糖化
することによりデキストロースを製造する時、糖化は約
４．０〜約６．０のｐＨでそして約５５℃〜約６５℃の
温度で行われることができる。
いたマル −ス １
３０％ｗ／ｖの１（１８）．Ｅ、デンプン水解物を含む
溶液をρ１１５．０に調整しそして５５℃で市販の麦芽
エキスおよび本発明のプルラナーゼ酵素の混合物と共に
加熱する。麦芽エキスはデンプン水解物（乾燥量基準）
の０．２重量％の割合で使用される。プルラナーゼはデ
ンプン水解物中乾燥物質１ｇあたり０．９単位の割合で
使用される。試料のマルトース含量はＨＰＬＣにより種
々の時間で分析される。比較例は麦芽エキスのみを用い
て行われる。第■表に示された結果は、本発明のプルラ
ナーゼ酵素は、デンプン水解物がマルトース産生酵素に
より糖化される時に該水解物からのマルトースの生産を
増加することを示す。また、Ｂ、 ａｃｉｄｏｐｕｌＬ
ｕＬｙｔｉｃｕｓから得られた市販のプルラナーゼを越
えた本発明のプルラナーゼの酵素の優れたマルトース生
産能力をも示す。
溶液をρ１１５．０に調整しそして５５℃で市販の麦芽
エキスおよび本発明のプルラナーゼ酵素の混合物と共に
加熱する。麦芽エキスはデンプン水解物（乾燥量基準）
の０．２重量％の割合で使用される。プルラナーゼはデ
ンプン水解物中乾燥物質１ｇあたり０．９単位の割合で
使用される。試料のマルトース含量はＨＰＬＣにより種
々の時間で分析される。比較例は麦芽エキスのみを用い
て行われる。第■表に示された結果は、本発明のプルラ
ナーゼ酵素は、デンプン水解物がマルトース産生酵素に
より糖化される時に該水解物からのマルトースの生産を
増加することを示す。また、Ｂ、 ａｃｉｄｏｐｕｌＬ
ｕＬｙｔｉｃｕｓから得られた市販のプルラナーゼを越
えた本発明のプルラナーゼの酵素の優れたマルトース生
産能力をも示す。
反応時間
Ｕ屓匪Ｌ 麦芽
５ ４９．９
２４ ５５．３
麦芽およびＢ、ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓブルー −ゼ
５０．２
６２．０
４２ ５６．０ ６６．０プルラ
ナーゼ酵素をマルトース産生酵素調製物と共に使用する
ことによりデンプン水解物がら高マルトースシロップを
生産する際、約４．５〜約５．５のｐＨおよび約５５℃
〜約６０’Ｃの温度で糖化を行うのが好ましい。
ナーゼ酵素をマルトース産生酵素調製物と共に使用する
ことによりデンプン水解物がら高マルトースシロップを
生産する際、約４．５〜約５．５のｐＨおよび約５５℃
〜約６０’Ｃの温度で糖化を行うのが好ましい。
従って、本発明によれば、熱安定なプルラナーゼ酵素、
その製造方法およびこの酵素を用いたデキストロースお
よび高マルトースシロップの製造方法が提供される。本
発明はその特定の実施態様と共に開示されているが、多
くの別の方法、修正および変更が先行記載を考慮すれば
当業者に明らかであることは明白である。従って、特許
請求の範囲の趣旨および範囲内で明らかな別法、修正お
よび変更の全てを含むことが意図されている。
その製造方法およびこの酵素を用いたデキストロースお
よび高マルトースシロップの製造方法が提供される。本
発明はその特定の実施態様と共に開示されているが、多
くの別の方法、修正および変更が先行記載を考慮すれば
当業者に明らかであることは明白である。従って、特許
請求の範囲の趣旨および範囲内で明らかな別法、修正お
よび変更の全てを含むことが意図されている。
Claims (19)
- （１）バチルス・ナガノエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｎ
ａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）から得られる耐熱性・耐酸性の
プルラナーゼ酵素調製物であり、該酵素は、６０℃で水
溶液中でｐＨ４．５で基質の存在下に２３２時間保持さ
れる時、少なくとも約５０％のプルラン加水分解活性を
保持することができる、上記調製物。 - （２）バチルス・ナガノエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｎ
ａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）の菌株が菌株ＡＴＣＣＮｏ．５
３９０９である、請求項１のプルラナーゼ酵素調製物。 - （３）６０℃で測定される時約５のｐＨで最大プルラナ
ーゼ加水分解活性を有する請求項２記載のプルラナーゼ
酵素調製物。 - （４）ｐＨ４．５で測定される時約６２．５℃の温度で
最大プルラナーゼ加水分解活性を有する、請求項２記載
のプルラナーゼ酵素調製物。 - （５）微生物、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒ
ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮｏ．ＡＴＣＣ５３９０９を有
するバチルス・ナガノエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｎａ
ｇａｎｏｅｎｓｉｓ）の生物学的に純粋な培養菌。 - （６）バチルス・ナガノエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｎ
ａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）のプルラナーゼ生産菌株を適当
な栄養培地中で培養し次いでプルラナーゼを培地から単
離することを特徴とする、プルラナーゼ酵素の製造方法
。 - （７）バチルス・ナガノエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｎ
ａｇａｎｏｅｎｓｉｓ）の菌株が菌株ＡＴＣＣＮｏ．５
３９０９である、請求項６記載の方法。 - （８）栄養培地が可溶性デンプン、マルトース、酵母エ
キス、タンパク質および無機質を含む、請求項６記載の
方法。 - （９）ｐＨが約５〜約６でありかつ温度が約３０℃〜約
３７℃である、請求項６記載の方法。 - （１０）デンプン水解物を、グルコアミラーゼおよび有
効量の請求項１記載のプルラナーゼ酵素調製物を用いて
糖化することを特徴とする、デンプン水解物からのデキ
ストロースの製造方法。 - （１１）デンプン水解物を、グルコアミラーゼおよび有
効量の請求項２記載のプルラナーゼ酵素調製物を用いて
糖化することを特徴とする、デンプン水解物からのデキ
ストロースの製造方法。 - （１２）デンプン水解物を、グルコアミラーゼおよび有
効量の請求項３記載のプルラナーゼ酵素調製物を用いて
糖化することを特徴とする、デンプン水解物からのデキ
ストロースの製造方法。 - （１３）デンプン水解物を、グルコアミラーゼおよび有
効量の請求項４記載のプルラナーゼ酵素調製物を用いて
糖化することを特徴とする、デンプン水解物からのデキ
ストロースの製造方法。 - （１４）糖化が約４．０〜約６．０のｐＨでかつ約５５
℃〜約６５℃の温度で行われる、請求項１０記載の方法
。 - （１５）デンプン水解物を、マルトース産生酵素および
有効量の請求項１記載のプルラナーゼ酵素調製物を用い
て糖化することを特徴とする、デンプン水解物からの高
マルトースシロップの製造方法。 - （１６）デンプン水解物を、マルトース産生酵素および
有効量の請求項２記載のプルラナーゼ酵素調製物を用い
て糖化することを特徴とする、デンプン水解物からの高
マルトースシロップの製造方法。 - （１７）デンプン水解物を、マルトース産生酵素および
有効量の請求項３記載のプルラナーゼ酵素調製物を用い
て糖化することを特徴とする、デンプン水解物からの高
マルトースシロップの製造方法。 - （１８）デンプン水解物を、マルトース産生酵素および
有効量の請求項４記載のプルラナーゼ酵素調製物を用い
て糖化することを特徴とする、デンプン水解物からの高
マルトースシロップの製造方法。 - （１９）糖化が約４．５〜約５．５のｐＨでかつ約５５
℃〜約６０℃の温度で行われる、請求項１５記載の方法
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US37136089A | 1989-06-26 | 1989-06-26 | |
| US371,360 | 1989-06-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0330672A true JPH0330672A (ja) | 1991-02-08 |
Family
ID=23463657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2163011A Pending JPH0330672A (ja) | 1989-06-26 | 1990-06-22 | 新規耐熱性および耐酸性プルラナーゼ酵素およびその製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0405283A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0330672A (ja) |
| KR (1) | KR910001038A (ja) |
| CA (1) | CA2019756C (ja) |
| FI (1) | FI903151A0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6298132B1 (en) | 1997-05-09 | 2001-10-02 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Ringing-tone control device for telephone set, using audio signal sent by caller |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3173849B2 (ja) * | 1992-02-26 | 2001-06-04 | 天野エンザイム株式会社 | 新規な枝切り酵素及びその製造法 |
| JPH05236959A (ja) * | 1992-02-28 | 1993-09-17 | Yoshiyuki Takasaki | プルラナーゼ、その製造法及び該酵素を用いる澱粉の 糖化法 |
| US5665585A (en) * | 1992-09-03 | 1997-09-09 | Alko-Yhiot Oy | Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma |
| DE69325981T2 (de) * | 1992-12-28 | 2000-02-03 | Genencor Int | Pullulanase, Mikroorganismen die sie produzieren, Verfahren zur Herstellung und ihre Anwendung |
| BE1006483A3 (fr) * | 1992-12-28 | 1994-09-13 | Solvay | Pullulanase, microorganismes la produisant, procedes de preparation de cette pullulanase, utilisations et compositions comprenant celle-ci. |
| BE1007313A3 (fr) * | 1993-07-15 | 1995-05-16 | Solvay | Pullulanase, microorganismes la produisant, procedes de preparation de cette pullulanase et utilisations de celle-ci. |
| US6300115B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-10-09 | Enzyme Bio-Systems Ltd. | Pullulanase expression constructs containing α-amylase promoter and leader sequences |
| EP1601699B1 (en) | 2003-03-10 | 2016-04-27 | Danisco US Inc. | Grain compositions containing pre-biotic isomalto-oligosaccharides and methods of making and using same |
| ES2556985T3 (es) | 2011-01-11 | 2016-01-21 | Capsugel Belgium Nv | Nuevas cápsulas duras que comprenden pululano |
| CA3059529A1 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Capsugel Belgium Nv | Process for making pullulan |
| WO2018189584A1 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Capsugel Belgium Nv | Pullulan capsules |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57174089A (en) * | 1981-04-20 | 1982-10-26 | Novo Industri As | Chain dividing enzyme product |
| JPS61162183A (ja) * | 1985-01-07 | 1986-07-22 | Agency Of Ind Science & Technol | プルラナ−ゼ様酵素の製造法 |
-
1990
- 1990-06-18 EP EP19900111460 patent/EP0405283A3/en not_active Withdrawn
- 1990-06-21 FI FI903151A patent/FI903151A0/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-06-22 JP JP2163011A patent/JPH0330672A/ja active Pending
- 1990-06-25 CA CA002019756A patent/CA2019756C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-25 KR KR1019900009424A patent/KR910001038A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6298132B1 (en) | 1997-05-09 | 2001-10-02 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Ringing-tone control device for telephone set, using audio signal sent by caller |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI903151A0 (fi) | 1990-06-21 |
| CA2019756A1 (en) | 1990-12-26 |
| CA2019756C (en) | 1999-03-02 |
| KR910001038A (ko) | 1991-01-30 |
| EP0405283A3 (en) | 1991-03-06 |
| EP0405283A2 (en) | 1991-01-02 |
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