JPH0328200B2 - - Google Patents
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- JPH0328200B2 JPH0328200B2 JP4893383A JP4893383A JPH0328200B2 JP H0328200 B2 JPH0328200 B2 JP H0328200B2 JP 4893383 A JP4893383 A JP 4893383A JP 4893383 A JP4893383 A JP 4893383A JP H0328200 B2 JPH0328200 B2 JP H0328200B2
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Landscapes
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はジヒドロ葉酸の溶液の安定化に関す
る。さらに本発明の他の目的はこのようにして得
られたジヒドロ葉酸を基質として用いることによ
つてメソトレキセイトの測定を簡単かつ正確に実
施できるようにすることにある。
る。さらに本発明の他の目的はこのようにして得
られたジヒドロ葉酸を基質として用いることによ
つてメソトレキセイトの測定を簡単かつ正確に実
施できるようにすることにある。
メソトキセイトはアミノプテリンの商品名で古
くから白血病等の腫瘍に対する化学療法剤として
使用されてきたが、最近はさらにメソトレキセイ
トの拮抗剤であるロイコボリンとの併用で極めて
多量のメソトレキセイトを用いる治療が行なわれ
るようになつた。この場合副作用の予測あるいは
防止に体液中のメソトレキセイトの量を絶えず測
定することが不可欠であり、そのため従来に増し
て簡便かつ正確な測定法が望まれている。従来の
測定法には、高速液体クロマトグラフイ、ラジオ
イムノアツセイ、蛍光光度法等があるがいずれも
検査の前処理や複雑な操作が必要で一般の施設で
簡単に実施することは困難である。またこれらの
ほかメソトレキセイトの酵素ジヒドロフオレオレ
イトレダクターゼ（以下DHFRという）に対す
る阻害作用を利用してメソトレキセイトを測定す
る酵素法があり次第に実用化されてきた。この方
法は公知であるが本発明の目的に係つているので
その概要を述べる。
くから白血病等の腫瘍に対する化学療法剤として
使用されてきたが、最近はさらにメソトレキセイ
トの拮抗剤であるロイコボリンとの併用で極めて
多量のメソトレキセイトを用いる治療が行なわれ
るようになつた。この場合副作用の予測あるいは
防止に体液中のメソトレキセイトの量を絶えず測
定することが不可欠であり、そのため従来に増し
て簡便かつ正確な測定法が望まれている。従来の
測定法には、高速液体クロマトグラフイ、ラジオ
イムノアツセイ、蛍光光度法等があるがいずれも
検査の前処理や複雑な操作が必要で一般の施設で
簡単に実施することは困難である。またこれらの
ほかメソトレキセイトの酵素ジヒドロフオレオレ
イトレダクターゼ（以下DHFRという）に対す
る阻害作用を利用してメソトレキセイトを測定す
る酵素法があり次第に実用化されてきた。この方
法は公知であるが本発明の目的に係つているので
その概要を述べる。
酵素DHFRは次の反応を触媒する。
ジヒドロ葉酸（FAH2）＋NADPH2DHFR
―――――→
テトラヒドロ葉酸（FAH4）＋NADP
(注) NADPH2：ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドリン酸の還元型 NADP：ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸の酸化型 ここで、メソトレキセイトの存在下に本反応を
行なわせるとメソトレキセイトの量に比較して
DHFRの阻害が起り、メソトレキセイトと結合
したDHFRは不活性化し残存する活性DHFRに
よつて本反応が進行する。従つてNADPH2の波
長340nｍにおける吸光度を測定しその減少から
本反応の進行すなわち残存DHFRの活性値を求
め、その割合もしくは酵素量よりメソトレキセイ
トの量を求めることができる。
クレオチドリン酸の還元型 NADP：ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸の酸化型 ここで、メソトレキセイトの存在下に本反応を
行なわせるとメソトレキセイトの量に比較して
DHFRの阻害が起り、メソトレキセイトと結合
したDHFRは不活性化し残存する活性DHFRに
よつて本反応が進行する。従つてNADPH2の波
長340nｍにおける吸光度を測定しその減少から
本反応の進行すなわち残存DHFRの活性値を求
め、その割合もしくは酵素量よりメソトレキセイ
トの量を求めることができる。
本方法によるメソトレキセイトの測定の場合は
血清をそのまま使用でき、操作も簡便で臨床検査
に適しているが、試薬の安定性に問題があり、試
薬を夫々単一のものとして個々に分けて保存して
おき使用時に調整せねばならない不便があつた。
特にDHFRの基質として使用するFAH2の水溶液
の不安定なことは従来より解決の方法がなく本方
法の大きな欠点となつていた。
血清をそのまま使用でき、操作も簡便で臨床検査
に適しているが、試薬の安定性に問題があり、試
薬を夫々単一のものとして個々に分けて保存して
おき使用時に調整せねばならない不便があつた。
特にDHFRの基質として使用するFAH2の水溶液
の不安定なことは従来より解決の方法がなく本方
法の大きな欠点となつていた。
本発明者等は種々研究の結果、β−シクロデキ
ストリンを添加することによつて安定なFAH2水
溶液が得られることを発見し本発明を完成すると
共に本発明を利用することによつて従来のメソト
レキセイト測定の欠点を除去することに成功し
た。
ストリンを添加することによつて安定なFAH2水
溶液が得られることを発見し本発明を完成すると
共に本発明を利用することによつて従来のメソト
レキセイト測定の欠点を除去することに成功し
た。
すなわち、本発明は、ジヒドロ葉酸にβ−シク
ロデキストリンを添加することを特徴とするメソ
トキセイト測定用ジヒドロ葉酸溶液の安定化方法
である。
ロデキストリンを添加することを特徴とするメソ
トキセイト測定用ジヒドロ葉酸溶液の安定化方法
である。
次にこれらについて試験例により説明する。
試験例 １
β−シクロデキストリンの濃度とFAH2の安定
性との関係： FAH2の定量は前述のDHFRを用いる酵素法に
よる。
性との関係： FAH2の定量は前述のDHFRを用いる酵素法に
よる。
１ 試薬
(1) 150ｍMKCl
10ｍM2−メルカプトエタノール
を含む100ｍＭトリス−HCl緩衝液（PH7.5）
(2) NADPH2.0mg
DHFR0.05u
を試薬(1)緩衝液10mlに溶解する。
２ 操作
FAH2を濃度0.05mg／ml程度に試薬(1)緩衝液
に溶解して検体とする。検体0.2mlに試薬(2)2.0
mlを加え25℃、５分間加温し、反応後波長
340nmの吸光度（ODa）を測定する。次に試
薬ブランクとして試薬(1)0.2mlを検体の代りに
採りその他は検体測定の場合と同様に操作し吸
光度（ODb）を測定する。次に検体ブランク
として検体0.2mlに試薬(2)の代りに蒸留水2.0ml
を加える他は検体測定の場合と同様に操作し吸
光度（ODc）を測定する。FAH2の量は次の式
から算出する。
に溶解して検体とする。検体0.2mlに試薬(2)2.0
mlを加え25℃、５分間加温し、反応後波長
340nmの吸光度（ODa）を測定する。次に試
薬ブランクとして試薬(1)0.2mlを検体の代りに
採りその他は検体測定の場合と同様に操作し吸
光度（ODb）を測定する。次に検体ブランク
として検体0.2mlに試薬(2)の代りに蒸留水2.0ml
を加える他は検体測定の場合と同様に操作し吸
光度（ODc）を測定する。FAH2の量は次の式
から算出する。
FAH2（mg／ml）＝（ODb＋ODc−ODa）×Ｖ×MW
×Ｆε×ｖ×ｄ×1000 ただし、 MW：FAH2の分子量（ｇ） ε：NADPH、FAH2混合時の分子吸光係数 Ｖ：全容量（ml） ｖ：検体量（ml） ｄ：セル径（cm） Ｆ：希釈倍数 上記の測定法によりβ−シクロデキストリンの
種種の濃度におけるFAH2の活性を測定した。β
−シクロデキストリンは0.15MKCl、0.1％NaN3
を含む0.1Mトリス−HCl緩衝液（PH7.5）にＷ／
Ｖ％で添加した。またFAH2は濃度0.5mg／mlに
調整したものを用いた。25℃で、１〜３日間保存
した後のFAH2の残存活性を測定しその割合を第
１図に示す。この結果から明らかなようにβ−シ
クロデキストリンの添加の効果はその濃度に比し
て増加し溶解限度の2.0〜2.5％Ｗ／Ｖで最大とな
るが実質的には0.5〜2.5％Ｗ／Ｖの範囲で使用可
能である。
×Ｆε×ｖ×ｄ×1000 ただし、 MW：FAH2の分子量（ｇ） ε：NADPH、FAH2混合時の分子吸光係数 Ｖ：全容量（ml） ｖ：検体量（ml） ｄ：セル径（cm） Ｆ：希釈倍数 上記の測定法によりβ−シクロデキストリンの
種種の濃度におけるFAH2の活性を測定した。β
−シクロデキストリンは0.15MKCl、0.1％NaN3
を含む0.1Mトリス−HCl緩衝液（PH7.5）にＷ／
Ｖ％で添加した。またFAH2は濃度0.5mg／mlに
調整したものを用いた。25℃で、１〜３日間保存
した後のFAH2の残存活性を測定しその割合を第
１図に示す。この結果から明らかなようにβ−シ
クロデキストリンの添加の効果はその濃度に比し
て増加し溶解限度の2.0〜2.5％Ｗ／Ｖで最大とな
るが実質的には0.5〜2.5％Ｗ／Ｖの範囲で使用可
能である。
試験例 ２
β−シクロデキストリンと他の安定化剤：
FAH2の安定化剤としてアルコルビン酸等の還
元剤が知られており、その還元性によつてFAH2
の酸化を防いで安定化剤の働きをしているが、ア
ルコルビン酸は濃度を高くするとたしかに安定効
果は増進するが同時にFAH2の溶解性を著しく損
なうので実際には農0.05％程度で使用せざる得な
い。アルコスビン酸0.05％とβ−シクロデキスト
リン１％の添加による夫々の場合のFAH2の安定
性を測定した結果を第２図に示す。試験は試験例
１に準じて行なつた。この結果からβ−シクロデ
キストリンがアスコルビン酸に較べ極めて有効で
あることが明らかである。
元剤が知られており、その還元性によつてFAH2
の酸化を防いで安定化剤の働きをしているが、ア
ルコルビン酸は濃度を高くするとたしかに安定効
果は増進するが同時にFAH2の溶解性を著しく損
なうので実際には農0.05％程度で使用せざる得な
い。アルコスビン酸0.05％とβ−シクロデキスト
リン１％の添加による夫々の場合のFAH2の安定
性を測定した結果を第２図に示す。試験は試験例
１に準じて行なつた。この結果からβ−シクロデ
キストリンがアスコルビン酸に較べ極めて有効で
あることが明らかである。
次に本発明を実施して行なわれるメソトレキセ
イトの測定方法およびその効果について参考例等
により説明する。
イトの測定方法およびその効果について参考例等
により説明する。
参考例
メソトレキセイトの測定
１ 試薬
(1) トリス緩衝液 150ｍMKCl
0.1％NaN3
を100mMトリス−HClに溶解してPHを7.5と
する。
する。
(2) 酵素液 0.25ｍＭ NADPH
5u／ DHFR
をトリス緩衝液に溶解する。
(3) 基質液 1.1ｍＭ FAH2
1.0％ β−シクロデキストリンをトリス
緩衝液に溶解する。
緩衝液に溶解する。
(4) メソトレキセイト標準液
１×10-7Mメソトレキセイト水溶液（表示
値を付す） ２ 操作 酵素液１mlを25℃に予加温する。検体0.1
mlまたはメソトレキセイト標準液0.1mlを加
え25℃、１分加温後、基質液0.1mlを加え反
応を開始する。基質液添加２分後から２分間
の波長340nｍの吸光度の差を測定する。次
に対照として検体の代りに蒸留水0.1mlを用
い同様に測定を行なう。メソトレキセイト含
量は次の計算式により算出する。
値を付す） ２ 操作 酵素液１mlを25℃に予加温する。検体0.1
mlまたはメソトレキセイト標準液0.1mlを加
え25℃、１分加温後、基質液0.1mlを加え反
応を開始する。基質液添加２分後から２分間
の波長340nｍの吸光度の差を測定する。次
に対照として検体の代りに蒸留水0.1mlを用
い同様に測定を行なう。メソトレキセイト含
量は次の計算式により算出する。
検体のメソトレキセイト値＝
対照のΔOD−検体のΔOD／対照のΔOD−メソトレキセ
イト標準液のΔOD×メソトレキセイト標準液表示値 次にメソトレキセイト標準液を用いて同様の方
法で作成したメソトレキセイトの検量線を第３図
に示す。これによると濃度1.5×10-7Mまで直線
性が得られることが分る。
イト標準液のΔOD×メソトレキセイト標準液表示値 次にメソトレキセイト標準液を用いて同様の方
法で作成したメソトレキセイトの検量線を第３図
に示す。これによると濃度1.5×10-7Mまで直線
性が得られることが分る。
次に本発明を実施した参考例の基質液
（FAH2）の安定性を調べた試験結果は第４図の
通りである。この試験では基質液を25℃で１日、
３日、６日間保存したものを用い保存期間中に変
化したFAH2の量およびその量の変化がメソトレ
キセイト測定に及ぼす影響について調べた。
（FAH2）の安定性を調べた試験結果は第４図の
通りである。この試験では基質液を25℃で１日、
３日、６日間保存したものを用い保存期間中に変
化したFAH2の量およびその量の変化がメソトレ
キセイト測定に及ぼす影響について調べた。
上記基質液を用い、夫々新鮮なトリス緩衝液、
酵素液を用いて参考例の操作法に従つて当該例の
対照に相当する試験を行ない、その吸光度差を
DHFR感度とする。また基質液中の基質の量を
試験例１の方法によつて測定しFAH2とする。第
４図ではFAH2の量を残存活性の最初の濃度
（1.1ｍＭ）に対する100分率で表わしてある。こ
の図の２及び４からβ−シクロデキストリンを添
加した場合は３日保存のものでFAH2の量が50％
を越えているのに反し、無添加の場合は３日保存
のものは胎ど残存活性がなくなることが分る。こ
のことはβ−シクロデキストリンの添加が基質の
安定化に極めて有効であることを示している。ま
た、メソトレキセイトの測定の場合、DHFR感
度は第４図の１及び３からFAH2の量が50％を切
ると急激に低下することが明らかで、この面から
もβ−シクロデキストリンの添加はDHFRの感
度を３倍伸ばすことになる。いずれにしてもβ−
シクロデキストリンの安定剤としての添加が極め
て有用であることが分る。また本発明の基質液は
凍結乾燥品とすることが可能で他の試薬と共にキ
ヤツト製品とする場合便利である。
酵素液を用いて参考例の操作法に従つて当該例の
対照に相当する試験を行ない、その吸光度差を
DHFR感度とする。また基質液中の基質の量を
試験例１の方法によつて測定しFAH2とする。第
４図ではFAH2の量を残存活性の最初の濃度
（1.1ｍＭ）に対する100分率で表わしてある。こ
の図の２及び４からβ−シクロデキストリンを添
加した場合は３日保存のものでFAH2の量が50％
を越えているのに反し、無添加の場合は３日保存
のものは胎ど残存活性がなくなることが分る。こ
のことはβ−シクロデキストリンの添加が基質の
安定化に極めて有効であることを示している。ま
た、メソトレキセイトの測定の場合、DHFR感
度は第４図の１及び３からFAH2の量が50％を切
ると急激に低下することが明らかで、この面から
もβ−シクロデキストリンの添加はDHFRの感
度を３倍伸ばすことになる。いずれにしてもβ−
シクロデキストリンの安定剤としての添加が極め
て有用であることが分る。また本発明の基質液は
凍結乾燥品とすることが可能で他の試薬と共にキ
ヤツト製品とする場合便利である。
第１図はβ−シクロデキストリン（β−CD）
添加濃度とジヒドロ葉酸の残存活性（安定性）と
の関係を示すグラフであり、第２図はβ−CDと
他の安定化剤とのジヒドロ葉酸安定性に関する比
較結果を示すグラフである。 １……無添加、２……0.5mg／mlアスコルビン
酸、３……１％β−CD。 第３図はメソトレキセイトの検量線を示す。第
４図はβ−CD添加によるジヒドロフオレイトレ
ダクターゼの感度及びジヒドロ葉酸の安定性を示
す。 １……無添加DHFR感度、２……無添加
FAH2、３……１％β−CD DHFR 感度、４…
…１％β−CD FAH2。
添加濃度とジヒドロ葉酸の残存活性（安定性）と
の関係を示すグラフであり、第２図はβ−CDと
他の安定化剤とのジヒドロ葉酸安定性に関する比
較結果を示すグラフである。 １……無添加、２……0.5mg／mlアスコルビン
酸、３……１％β−CD。 第３図はメソトレキセイトの検量線を示す。第
４図はβ−CD添加によるジヒドロフオレイトレ
ダクターゼの感度及びジヒドロ葉酸の安定性を示
す。 １……無添加DHFR感度、２……無添加
FAH2、３……１％β−CD DHFR 感度、４…
…１％β−CD FAH2。
Claims (1)
- １ ジヒドロ葉酸にβ−シクロデキストリンを添
加することを特徴とするメソトキセイト測定用ジ
ヒドロ葉酸溶液の安定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4893383A JPS59175432A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | ジヒドロ葉酸溶液の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4893383A JPS59175432A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | ジヒドロ葉酸溶液の安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59175432A JPS59175432A (ja) | 1984-10-04 |
| JPH0328200B2 true JPH0328200B2 (ja) | 1991-04-18 |
Family
ID=12817056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4893383A Granted JPS59175432A (ja) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | ジヒドロ葉酸溶液の安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59175432A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0319598B1 (de) * | 1987-12-07 | 1991-09-25 | Holger Blum | Stabilisierte wässrige Folsäurezubereitung |
| CH684644A5 (de) * | 1992-07-13 | 1994-11-15 | Eprova Ag | 5,10-Methylentetrahydrofolsäure-Cyclodextrin-Einschlussverbindungen. |
-
1983
- 1983-03-25 JP JP4893383A patent/JPS59175432A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59175432A (ja) | 1984-10-04 |
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