JPH03244399A - 植物の形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、遺伝子工学的手法により植物体に遺伝子を導
入して新しい形質を持った新品種を開発する際、その形
質転換体を効率よく検出あるいは確認するためのプライ
マーとしてのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法に
関するものである。

更に詳しくは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚ
ｏｇｅｎｅｓ　　Ａ４株を用いて植物組織より毛状根誘
導を行う場合、得られた根がたんなる不定根なのか、形
質転換した毛状根なのかを判断するのに極めて有効なプ
ライマーとしてのオリゴヌクレオチドおよびその検出方
法に関する。

［従来技術］ 植物の品種改良技術において、近年では遺伝子工学的手
法により植物体へある種の外来遺伝子を導入し、その遺
伝子に特有な形質を発現させることによって、既存様に
は無かった新しい形質を付加しようとする試みが数多く
なされている。新しく得られた植物が真に形質転換体で
あるか否かの確認は、植物の外観形態のみならず遺伝子
レベルでの確認が必要となってくる。例えば、Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを用いて遺
伝子導入を行い、得られた形質転換体のｍ認を行う場合
、Ｒｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡが植物ゲノムに組み込
まれているか否かの検定が重要となる。この場合、従来
はサザンハイプリダイゼーション法等、支持体上におけ
る検体核酸と遺伝子プローブのハイブリダイゼーション
により形質転換の確認がなされてきた。

［発明が解決しようとする課題］ 遺伝子導入された形質転換体の検出を、前記の従来法で
行うと、検体としての植物体を多く必要とし、操作も煩
雑で熟練を要し、結果が得られるまでに２〜３日もの日
時を要していた。また、検出感度や選択性も低いもので
あったこと等から、簡便、迅速かつ効率的な形質転換体
の検出方法の開発が期待されているのが実情である。

本発明の目的は、まさにこの点にあり、外来遺伝子の導
入による形質転換植物体を選別するため、オリゴヌクレ
オチドを核酸合成反応のプライマーとして機能させた遺
伝子のコピー数増幅技術を利用したものであり、簡便、
迅速かつ効率的な形質転換体の検出に関し、プライマー
としてのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法を提供
することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重
ねてきたところ、オリゴヌクレオチドをプライマーとし
て用いた遺伝子増幅法により、植物ゲノムに組み込まれ
た　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏ−ｇｅｎ
ｅｓＡ　４株のＲｉプラスミド由来のＴ−ＤＮＡを効率
よく検出することを見い出し、さらに研究を重ねて本発
明を完成するに至った。

ここに、遺伝子増幅法は、５ａｉｋｉらが開発したＰｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法
（以下、略してＰＣＲ法；　　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３
０．１３５０　（１９８５））に基づき行っている。こ
の方法では、ある特定のヌクレオチド配列領域を検出す
る場合、その領域の一端は十鎮を他端は一端をそれぞれ
認識してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを、一
方のプライマーおよび他方のプライマーとして用意し、
それらを熱変性により１本鎖状態にした試料核酸に対し
て鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプライマーとして
機能させ、生成した２本鎮核酸を１本鎖に分離し、再度
同様な反応を起こさせる。この−連の操作を繰り返すこ
とで、２つのプライマーにはさまれた領域は確実に検出
できるまでにコピー数が増大してくる。検体としては、
植物体のあらゆる組織、器官、例えば、根、葉、茎、花
弁など、また、毛状根、腫瘍組織、カルスでもよい。こ
れらの検体をＰＣＲ反応の試料として用いるには、植物
検体から核酸成分を遊離させる前処理が必要である。し
かし、プライマーがハイブリダイズできる核酸は数分子
から数十分子以上存在すればＰＣＲ反応は進むので、検
体を酵素、界面活性剤、アルカリ、あるいは機械的破砕
等で短時間処理する簡単な操作だけでＰＣＲ反応を進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。

本発明でプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは
、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ
　　Ａ　４株のＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡにコードさ
れている遺伝子であって、毛状根の誘導に関係する遺伝
子ｒｏｌ　Ａ　（ＯＲＦ−１０）　　（Ｌ、　Ｖｉｌａ
ｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ　；　　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎ
ｅｔ、　２１０．１１１−１１５　（１９Ｂ？）　）を
標的とし、該遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なオリ
ゴヌクレオチドが用いられる。例えば、（５°）　ｄ−
ＧＴＴＡＧＧＣＧＴＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＧ（３’）
・（ａ配列）又は、 （５’）　ｄ−Ｔ［ｌ：ＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＧＴＡ
ＧＧＴＣ（３’）・・・（ｂ配列）を含有するオリゴヌ
クレオチドが挙げられる。また、これらの上記の配列に
相補的なヌクレオチド配列（それぞれａ”配列、ｂ゛配
列する）を含有するオリゴヌクレオチドも同様に用いる
ことができる。

また、本発明でプライマーとして用いるオリゴヌクレオ
チドは、特異性や検出感度および再現性から考えて、少
なくとも連続した１０塩基以上、好ましくは１５塩基か
ら３０塩基程度までのヌクレオチド断片でよく、化学合
成したものあるいは天然のものどちらでもよい。

また、本発明における２つのプライマーとは、例えば一
方のプライマーがａ配列を含有するオリゴヌクレオチド
であれば、他方のプライマーは、ｂ配列を含有するオリ
ゴヌクレオチドであり、方がａ”配列のものであれば、
他方はｂ°配列のものである。

また、プライマーは、検出用として特に標識しなくても
よい。プライマーによって規定されているプラスミド上
のＴ−ＤＮＡにおける増幅領域は、５０塩基から２００
０塩基となればよく、好ましくは２００塩基から３００
塩基程度である。鋳型依存性ヌクレオチドの重合反応に
は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いるが、この酵素は
９０〜９５℃の温度で活性が維持されるならば、いずれ
の生物種由来でもよい。この酵素は既知物質であり、例
えばＰｅｒｋｉｎ　Ｂ１ｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製のもの
を用いてもよい。熱変性温度は、通常９０〜９５℃、プ
ライマーをハイブリダイズさせるアニーリングＨ乍の温
度は通常３７〜６５℃、ヌクレオチド重合反応は通常５
０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲを試料と
してのＤＮＡ量にもよるが、通常２０サイクル以上で、
好ましくは３０〜４５サイクル行って標的とするヌクレ
オチド断片のコピー数を増幅させる。検出に際しては、
酵素反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にかけれ
ば増幅されたヌクレオチド断片の存在およびその長さが
確認できる。その結果から、検体中に、プライマーが認
識すべき配列を持った核酸が存在していたか否か判定で
きる。この判定は、Ｔ−ＤＮＡの有無を直接判定するも
のとなる。なお、増幅されたヌクレオチド断片の検出に
は、例えば、アクリルアミド電気泳動など各種の電気泳
動やクロマトグラフィーも有効である。また、電気泳動
では、マーカーを入れて分子量を決定し、および／又は
臭化エチジウム等を用いての核酸染色法を用いることに
より、プライマー等に標識をせずに検出を行うことがで
きる。

〔実施例〕

試料の調製 ワサビダイコン毛状根０．２ｇ（新鮮重量）を液体窒素
で凍結後、乳鉢を用いて粉砕した。粉砕細胞に緩衝液１
００　μｍ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，
０，５０ｍＭ　ＢＤＴＡ　％　　５ｍＭ　Ｄｉｔｈｉｏ
ｔｈｒｅｉｔｏｌ、　　０．５％５Ｏ３）とＰｅｃｔｉ
ｎａｓｅ　（５０００ｕｎｉｔｓ）　　ｌ　Ｏμｍを加
え、６０℃で５分間さらに３０℃で２時間インキュベー
トした。

次に、５μβのＬＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０，
５０μＡの０．５　Ｍ　Ｅ［ｌＴＡ、　　５μ！の２０
％ＳＤＳ溶液を加え、さらに、２μβのＰｒｏｔｅｉｎ
ａｓｅ　Ｋ　　（２０ｍｇ／ｍｌ　）を加えて５０℃、
４時間インキュベートした。

４℃、１５．００Ｏｒｐｍで５分遠心分離を行って上清
を回収し、０．５容の２−ｐｒｏｐａｎｏｌを加え、２
０℃、１５，０００ｒｐｍで２分遠心分離を行った。得
られた沈澱を７５％ｅｔｈａｎｏｌで洗浄し乾燥後１ｍ
ｌの蒸留水を加えて試料液とした。

なお、ワサビダイコンの毛状根誘導、得られた毛状根の
無菌化と培養は、Ｎｏｄａらの方法（ＰｌａｎｔＣｅｌ
ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　６，２８３−２８６（１９８７）
）によった。

ＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの毛状根の誘導に関する遺
伝子　ｒｏｌ　Ａ　（Ｌ、　Ｖｉｌａｉｎｅ　ｅｔ　ａ
ｌ　；　　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２１０．１１１−１１５　（１
９８７）　）の塩基配列（Ｓｌｉｇｈｔｏｍ、　　Ｊ、
Ｌ１Ｄｕｒａｎｄイａｒｄｉｆ、ＭｌＪｏｕａｎｉｎ。

し、　　ａｎｄ　　Ｔｅｐｆｅｒ、Ｄ、　　；　　Ｊ、
　　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２６１．　　１０８−
１２１（１９８６））から、 （５’）　ｄ−ＧＴＴＡＧＧＣＧＴＧＣＡＡＡＧＧＣＣ
ＡＡＧ（３’）−（ａ配列）及び、 （５’）　ｄ−ＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＣＣＣＧＴＡＧＧ
Ｔ［：（３’）・・・（ｂ配列）を選び、それと同じ配
列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、それぞれプ
ライマー（ａ）及びプライマー（ｂ）とした。化学合成
には島津ＤＮＡ合成機ＭＳ−１を用い、トリエステル法
により行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製には
Ｃ１８逆相カラムを用いた。

ＰＣＲ 前記の試料液３μｌを用いそれに滅菌蒸留水１６．０５
μｃ１０ｘ反応用バッフｙ　　３ｔｔＬｄＮＴＰ溶液４
．８　ｔｔ　ｊ！、プライマー（ａ）１．’５μＡ。

プライマー（ｂ）１．５μｌそして耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ０．１５μｌを加え、３０μｌの反応液を調製し
た。この反応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧ
ＭＡ社製）を５０μｌ重層した。添加液の詳細は下記の
通りである。

１０×反応用バッフｙ　　：　　５００ｍＭＫＣｌ。

１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）　、　　
１５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　。

０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン。

ｄＮＴＰ溶液：ｄＡＴＰ、　　ｄｃ’ｒｐ、ｄＧＴＰ。

ｄＴＴＰを混合したもので、終濃度はいずれも１゜５ｍ
Ｍ０ プライマー（ａ）および（ｂ）：前述した化学合成精製
品の各水溶液（５０Ｄ　Ｕ／ｍｌ）。

耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：Ｔａｑ　　ＤＮＡポリメラ
ーゼ（５ｕｎｉｔ／ｍｌ　；　Ｐｅｒｋｉｎ　［ｉｌｍ
ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製）。

反応条件は、次の通りである。

熱変性＝　９４℃、１分 アニーリング：　３７℃、１分 重合反応：　６０℃、１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間５パ分）とし、これを４２サイクル
（総所要時間約４時間）反復した。

これらの操作は、Ｐｅｒｋｉｎ　　Ｂ１ｍｅｒ　　Ｃｅ
ｔｕｓ社製ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒに上
記反応条件をプログラムして行った。

検出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下の条件で行った。

アガロースゲルはゲル濃度２％（Ｗ／Ｖ）とし、臭化エ
チジウム（０，５μｇ／ｍｌ）を含むものを用いた。泳
動は定電圧１００Ｖで３０分行った。なお、操作方法な
らびに他の条件は、Ｍａｎｉａｔｉｓ等によるＭｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）に記載されて
いた技法で行った。反応液の他に分子量マーカーの泳動
も同時に行い、相対移動度の比較により、ゲル中、紫外
線光等で検出されたヌクレオチド断片の長さを算出した
。

結果 前述したように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉ
ｚｏｇｅｎｅｓＡ４株のＴ−ＤＮＡは、すでに塩基配列
が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、すな
わち、ＰＣＲによってプライマーが増幅させるヌクレオ
チドの大きさは推定できる。それによると、プライマー
（ａ）とプライマー（ｂ）を用いた場合、推定値２０２
塩基対のヌクレオチドが増幅されたはずである。この推
定はアガロースゲル電気泳動図（第１図）とよく一致し
た。

［発明の効果］ 本発明では、ＰＣＲの採用によりプライマーが植物体の
標的ヌクレオチドのコピー数を増幅する。

しかも増幅されるヌクレオチド配列は２つ以上のプライ
マーの反応によって規定できるので、本発明に従えば形
質転換体から特定の外来遺伝子、特に毛状根の誘導に関
連する遺伝子を高感度で容易に検出できるし、検出に際
しては高い選択性が得られる。

本発明では、高い検出感度が得られるにもかかわらず検
出には多量の検体を必要とせず、検体の前処理も簡便で
ある。しかも、反応時間が短く、検出も簡単な機材で済
み、操作もまた容易なため、結果を得るまでの時間を大
幅に短縮できる。例えば、サザンハイプリダイゼーショ
ン法を用いた従来法では、数１０ｇ以上の葉、茎などの
検体が必要であったが、本発明では数ｇ程度の検体があ
れば十分である。また、検出にアガロースゲル電気泳動
と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プ
ライマー等に標識をせずに検出が行え、しかも、ヌクレ
オチド断片の長さが確認できるので、結果の信頼性が高
くなる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、増幅されたヌクレオチド断片のアガロースゲ
ル電気泳動図を示す。図中、（イ）はマーカー（φＸ１
７４　／Ｈｉｎｃ　Ｉｆ）を、（ロ）はＡ、　ｒｈｉｚ
ｏｇｅｎｅｓ　Ａ４株を、（ハ）は形質転換されていな
いワサビダイコンの葉（対照）を、そして（ニ）は形質
転換されたワサビダイコン毛状根を示す。 第１図 （イ） （τ、ｌ） （ハ） （＝）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥￥ｒｈｉｚｏｇ
   ｅｎｅｓ￥Ａ４株のＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡにコー
   ドされている遺伝子であって、毛状根の誘導に関係する
   遺伝子ｒｏｌＡ（ＯＲＦ−１０）を標的とし、該遺伝子
   のヌクレオチド配列に相補的な下記の（ａ）又は（ｂ）
   配列を有するオリゴヌクレオチド。 （５′）ｄ−ＧＴＴＡＧＧＣＧＴＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡ
   ＡＧ（３′）・・・（ａ）（５′）ｄ−ＴＣＧＴＡＴＴ
   ＡＡＴＣＣＣＧＴＡＧＧＴＣ（３′）・・・（ｂ）（２
   ）植物ゲノムに￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￥￥ｒｈ
   ｉｚｏｇｅｎｅｓ￥Ａ４株のＲｉプラスミド由来のＴ−
   ＤＮＡが組み込まれた植物の形質転換体を検出する方法
   であって、 （イ）検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列に、
   一方のプライマーをハイブリダイ ズさせて、４種のヌクレオチドの重合反応 により鎖長反応を行ない、 （ロ）得られた２本鎖ヌクレオチド配列を１本鎖に分離
   し、その相補鎖を他方のプライマ ーによる鎖長反応の鋳型として機能させ、 （ハ）これら２つのプライマーによる同時の鎖長反応及
   び鎖長反応生成物の鋳型からの分 離操作を繰り返すことにより、特定のヌク レオチド断片のコピー数を増幅し、 （ニ）増幅された該ヌクレオチド断片を電気泳動又はク
   ロマトグラフィーにより検出し、 および、 （ホ）該断片の分子量の決定および／又は核酸染色によ
   り、前記の検体中に認識されるべ きヌクレオチド配列が存在しているか否か を判定すること の工程を包含することを特徴とする形質転換体の検出方
   法。