JP2022528132A - Ｃｓｑ－タグを用いたタンパク質の発現及び精製方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＣＳＱ－タグ（Ｃａｌｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ－ｔａｇ）を用いたタンパク質の発現、水溶化及び精製方法に関するものであり、ＣＳＱ－タグ及び目的タンパク質を含む組み換え発現ベクター、前記組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及びＣＳＱ－タグを用いた目的タンパク質の発現及び精製方法を提供しようとする。本発明は、医薬品及び化粧品に多く使用されているタンパク質を、ＣＳＱ－タグを用いて発現を増加させ、カルシウムにより容易に分離できるようにすることで、タンパク質素材及び医薬品のコストを下げることが期待される。【選択図】図１
Description
本発明は、ＣＳＱ－タグ（Ｃａｌｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ－ｔａｇ）を用いたタンパク質の発現、水溶化、及び精製方法に関するものであり、ＣＳＱ－タグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードするヌクレオジド配列を含む核酸、前記核酸を含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された細胞、及びＣＳＱ－タグを用いた目的タンパク質の発現、水溶化、及び精製方法を提供しようとする。本発明は、医薬品及び化粧品に多く使用されているタンパク質を、ＣＳＱ－タグを用いて発現及び水溶化を向上させ、カルシウムにより容易に分離できるようにすることで、タンパク質素材及び医薬品のコストを下げることが期待される。
近年、遺伝子工学及び生物学の発展によって特定のタンパク質を大量生産または取得し、各種産業及び疾病の治療などに使用しようとする試みが多く行われている。それで、希望のタンパク質を取得するためのタンパク質調合技術、大量生産技術、及び精製技術などが重点的に開発されている。しばしば、人間に必要な目的のタンパク質は、これを発現するベクターで形質転換された細胞を培養し、希望のタンパク質を発現させて生産することができる。場合によっては、このようなタンパク質は、真核細胞、原核細胞などで発現することがあり、特別な場合には、形質転換された植物や形質転換された動物において発現することがある。例えば、乳を分泌する形質転換された動物において発現し、形質転換された動物の乳を介して目的のタンパク質を取得するなどの方法などが試みられている。この場合、細胞培養物または乳から目的のタンパク質を分離精製することができる。
別途の分泌による目的タンパク質の取得方法を有しない動植物や微生物においてタンパク質を発現させる場合には、まず、貯蔵器官や細胞内部からタンパク質を抽出する過程を行う必要がある。このような形質転換細胞から目的のタンパク質を取得する作業は容易でない。このため、取得を容易にするため、目的のタンパク質を、天然型ではなくタグ（ｔａｇ）を含む形態に組み換える方法が多く使用されている。精製のためにタグ（ｔａｇ）を用いる方法は、多様なタンパク質精製技術の中で非常に高い効率性を示す方法の一つであり、この時に使用されるタグは、ペプチドタグとタンパク質タグとに大別される。ペプチドタグは、短いアミノ酸からなるものであり、代表的にはヒスタグ（ｈｉｓ－ｔａｇ、ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｔａｇ）があり、特に、ヘキサヒスチジンタグ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ、Ｈｉｓ６－ｔａｇ）が多く使用されている。ヒスチジンペプチドは、ニッケルと特異的な化学的親和力を有し、当該タグを含む融合タンパク質は、ニッケルを含むカラムによって高純度に精製することができる。タンパク質タグは、特定の成分に結合するタンパク質のドメインが持つ特徴などを用いるために当該ドメインなどを含むタグである。代表的には、ＧＳＴ－タグ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｔａｇ）がある。ＧＳＴタグは、ＧＳＴの基質であるグルタチオン固定媒介体とするカラムによって高純度に精製することができる。
それで、本発明者らは、目的タンパク質の取得を容易にするための新規なタグを開発するために鋭意研究を行った結果、ＣＳＱ（Ｃａｌｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ）タグを目的タンパク質に融合させることで目的タンパク質が容易に発現及び水溶化、並びに精製可能であることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、ＣＳＱ－タグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び前記核酸を含む発現ベクターを提供することにある。本発明に係る組み換え発現ベクターの模式図を図１に示す。
本発明のまた他の目的は、前記発現ベクターで形質転換された細胞を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、ＣＳＱタグを用いた目的タンパク質の発現及び精製方法を提供することにある。本発明に係る目的タンパク質の発現及び精製方法の一例を図２に示す。
本発明は、目的タンパク質の発現及び水溶化向上のためのＣＳＱタグ、及び目的タンパク質を含む融合タンパク質に関するものである。
前記ＣＳＱタグは、配列番号１または配列番号２からなるアミノ酸でコードされ得る。
前記ＣＳＱタグは、配列番号４または配列番号４からなるヌクレオチド配列で暗号化され得る。
前記ＣＳＱタグ及び目的タンパク質は、配列番号５～８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる加水分解酵素分解ペプチドを介して融合され得る。
前記目的タンパク質は、高分子タンパク質、糖タンパク質、サイトカイン、成長因子、血液製剤、ワクチン、ホルモン、酵素、及び抗体からなる群から選択されることを特徴とする。例えば、前記目的タンパク質は、インターロイキン－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、免疫グロブリン、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ヒトフィブロネクチンエクストラドメインＢ（Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｅｘｔｒａ Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、ＥＢＤ）、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、形質転換成長因子（Ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－α ａｎｄ －β、ＴＧＦ－α、－β）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、胎盤成長因子（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＩＧＦ）、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １ ａｎｄ ２、ＦＧＦ－１、－２）、ケラチノサイト成長因子（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＫＧＦ）、グルカゴン様ペプチド－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１、ＧＬＰ－１）、エクセンディン、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、ＬＨＲＨ（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、副腎皮質刺激ホルモン（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン－放出ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、オキシトシン（Ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、チモシンα－１（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ ａｌｐｈａ－１）、コルチコトロピン放出因子（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ビバリルジン（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、バソプレシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インスリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、小胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素性ホルモン、副甲状腺ホルモン、黄体分泌ホルモン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＰＲ）、エンケファリン（Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部分泌因子、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＨＰＲ）、胸腺液性因子（Ｔｈｙｍｉｃ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｆａｃｔｏｒ、ＴＨＦ）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、及びグルコロニダーゼからなる群から選択され得る。
前記目的タンパク質は、配列番号９～１９からなる群から選択されるアミノ酸でコードされ得る。
本発明は、また、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関するものである。
本発明は、また、前記核酸を含む発現ベクターに関するものである。
本発明は、また、前記発現ベクターで形質転換された細胞に関するものである。
前記細胞は、エシェリヒア・コリ、バチルス・サブチルス、バチルス・チューリンゲンシス、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス種、酵母、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株、または植物細胞であり得る。
本発明は、さらに、前記融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを製造するステップ；
Ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に形質導入して形質転換体を得るステップ；
Ｃ）前記形質転換体からＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を発現させるステップ；
Ｄ）カルシウムを用いて前記発現した形質転換体からＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を沈殿させるステップ；及び、
Ｅ）加水分解酵素を用いて融合タンパク質から目的タンパク質を分離するステップ；
を含む、ＣＳQタグを用いた目的タンパク質の発現及び精製方法に関するものである。
Ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に形質導入して形質転換体を得るステップ；
Ｃ）前記形質転換体からＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を発現させるステップ；
Ｄ）カルシウムを用いて前記発現した形質転換体からＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を沈殿させるステップ；及び、
Ｅ）加水分解酵素を用いて融合タンパク質から目的タンパク質を分離するステップ；
を含む、ＣＳQタグを用いた目的タンパク質の発現及び精製方法に関するものである。
本発明に係るＣＳＱタグを用いた目的タンパク質の発現、水溶化及び精製方法によれば、ＣＳＱの高発現及び高水溶性によって、発現が容易でないか凝集しやすいタンパク質を、水溶液状態で発現でき、また、カルシウムにより沈殿し、カラムを用いることなく簡単に分離して精製できるため、タンパク質素材及び医薬品のコストを下げることが期待される。
本明細書において使用された用語「カルセクエストリン（Ｃａｌｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ、ＣＳＱ）」とは、筋小胞体（Ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）のカルシウム－結合タンパク質であって、細胞質より筋小胞体においてカルシウムの濃度が高くても、筋肉収縮後にカルシウムと結合し、筋小胞体のシスターネにカルシウムイオンを貯蔵できるようにする。一つのカルセクエストリン分子が複数のカルシウム（例えば、カルセクエストリン１分子当たり４０～５０個のカルシウム結合部位を有する）と結合することができ、カルシウム貯蔵能力が非常に優れている。カルセクエストリンは、カルシウムが少ない時は単量体として存在するが、カルシウムの量が増加すると、多量体に変化し、大きさが大きくなる性質を有している。
本明細書において使用された用語「目的タンパク質」とは、特定の目的によって高純度または大量に取得する必要がある任意のタンパク質をいい、これには、天然型タンパク質、変異体タンパク質、または新規な組み換えタンパク質などが制限なく含まれる。目的タンパク質は、産業的、医療的、学問的の理由などから、高純度または大量取得が求められるタンパク質であり得、好ましくは、医薬用または研究用組み換えタンパク質であり得、より好ましくは、高分子タンパク質、糖タンパク質、サイトカイン、成長因子、血液製剤、ワクチン、ホルモン、酵素、及び抗体からなる群から選択されるものであり得る。さらに好ましくは、目的タンパク質は、抗体の軽鎖または重鎖の両方または一方であり得、最も好ましくは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）または重鎖可変領域（ＶＨ）であり得る。
本明細書において使用された用語「加水分解酵素による分解ペプチド」は、ＣＳＱタグと目的タンパク質との間に包含することができ、これは、加水分解酵素により切断され、ＣＳＱタグと目的タンパク質とを分離することができる。
本明細書において使用された用語「ベクター」とは、適当な宿主細胞において目的タンパク質を発現し得る発現ベクターであって、核酸挿入物が発現するように作動可能に連結された必須の調節要素を含む核酸作製物を意味する。前記ベクターは、当業界においてよく使用されるプラスミドは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、または他のベクターを含み、当業界においてよく使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８/９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、及びｐＵＣ１９など）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚｌ、及びＭ１３など）、またはウイルス（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０など）を操作して製作され得る。
本明細書において使用される用語「形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、ＤＮＡを宿主に導入し、ＤＮＡが染色体の因子として、または染色体の統合完成により複製可能になるものとして、外部のＤＮＡを細胞内に導入して人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味する。前記形質転換方法には、ＣａＣｌ２沈殿法、ＣａＣｌ２方法にＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）という還元物質を使用することで効率を高めるＨａｎａｈａｎ方法、電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌法、アグロバクテリア媒介形質転換法、ＰＥＧを用いた形質転換法、デキストランサルフェート、リポフェクタミン及び乾燥・抑制媒介された形質転換法などが含まれるが、これに限定されない。
本明細書において使用される用語「宿主細胞」とは、他の微生物または遺伝子を寄生させて栄養を供給する細胞であって、ベクターが宿主細胞に形質転換されることで宿主細胞内で多様な遺伝的または分子的影響を及ぼすような細胞を意味する。本発明のベクターを原核細胞に安定かつ連続的にクローニング及び発現させ得る宿主細胞としては、当業界で公知の宿主細胞を制限なく使用することができ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ，Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ １７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルス・サブティリス、バチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属の菌株、並びに、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、及び多様なシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがある。また、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合は、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、及びＭＤＣＫ細胞株）や植物細胞などを用いることができる。
第１の具現例によれば、
本発明は、ＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を提供しようとする。
本発明は、ＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を提供しようとする。
本発明に係る融合タンパク質において、前記ＣＳＱタグは、ＣＳＱ１またはＣＳＱ２を含むことを特徴とする。
本発明に係る融合タンパク質において、前記ＣＳＱ１及びＣＳＱ２は、それぞれ、配列番号１及び配列番号２からなるアミノ酸でコードされることを特徴とする。前記配列番号１のアミノ酸は、配列番号３のヌクレオチド配列で暗号化され、前記配列番号２のアミノ酸は、配列番号４のヌクレオチド配列で暗号化され得る。
本発明に係る融合タンパク質において、前記ＣＳＱタグ及び目的タンパク質は、配列番号５～８からなる群から選択されるアミノ酸からなる加水分解酵素による分解ペプチドを介して融合されることを特徴とする。
本発明に係る融合タンパク質において、前記目的タンパク質は、高分子タンパク質、糖タンパク質、サイトカイン、成長因子、血液製剤、ワクチン、ホルモン、酵素、及び抗体からなる群から選択されることを特徴とする。例えば、前記目的タンパク質は、インターロイキン－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、免疫グロブリン、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ヒトフィブロネクチンエクストラドメインＢ（Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｅｘｔｒａ Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、ＥＢＤ）、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、形質転換成長因子（Ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－α ａｎｄ －β、ＴＧＦ－α、－β）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、胎盤成長因子（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＩＧＦ）、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １ ａｎｄ ２、ＦＧＦ－１、－２）、ケラチノサイト成長因子（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＫＧＦ）、グルカゴン様ペプチド－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１、ＧＬＰ－１）、エクセンディン、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、ＬＨＲＨ（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、副腎皮質刺激性ホルモン（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン－放出ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、オキシトシン（Ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、チモシンα－１（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ ａｌｐｈａ－１）、コルチコトロピン－放出因子（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ビバリルジン（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、バソプレシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インスリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、小胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素性ホルモン、副甲状腺ホルモン、黄体分泌ホルモン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＰＲ）、エンケファリン（Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部分泌因子、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＨＰＲ）、胸腺液性因子（Ｔｈｙｍｉｃ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｆａｃｔｏｒ、ＴＨＦ）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、及びグルコロニダーゼからなる群から選択され得る。
本発明に係る融合タンパク質において、前記目的タンパク質は、配列番号９～１９からなる群から選択されるアミノ酸でコードされることを特徴とする。
第２の具現例によれば、
本発明は、ＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び前記核酸を含む発現ベクターを提供しようとする。
本発明は、ＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び前記核酸を含む発現ベクターを提供しようとする。
本発明に係る核酸または発現ベクトルにおいて、前記ＣＳＱタグは、配列番号１または配列番号２からなるアミノ酸でコードされることを特徴とする。前記配列番号１のアミノ酸は、配列番号３のヌクレオチド配列で暗号化され、前記配列番号２のアミノ酸は、配列番号４のヌクレオチド配列で暗号化され得る。
本発明に係る核酸または発現ベクターにおいて、前記ＣＳＱタグ及び目的タンパク質は、配列番号５～８からなる群から選択されるアミノ酸からなる加水分解酵素による分解ペプチドを介して融合されることを特徴とする。
本発明に係る核酸または発現ベクターにおいて、前記目的タンパク質は、高分子タンパク質、糖タンパク質、サイトカイン、成長因子、血液製剤、ワクチン、ホルモン、酵素、及び抗体からなる群から選択されることを特徴とする。例えば、前記目的タンパク質は、インターロイキン－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、免疫グロブリン、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ヒトフィブロネクチンエクストラドメインＢ（Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｅｘｔｒａ Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、ＥＢＤ）、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、形質転換成長因子（Ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－α ａｎｄ －β、ＴＧＦ－α、－β）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、胎盤成長因子（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＩＧＦ）、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １ ａｎｄ ２、ＦＧＦ－１、－２）、ケラチノサイト成長因子（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＫＧＦ）、グルカゴン様ペプチド－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１、ＧＬＰ－１）、エクセンディン、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、ＬＨＲＨ（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、副腎皮質刺激性ホルモン（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン－放出ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、オキシトシン（Ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、チモシンα－１（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ ａｌｐｈａ－１）、コルチコトロピン－放出因子（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ビバリルジン（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、バソプレシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インスリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、小胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素性ホルモン、副甲状腺ホルモン、黄体分泌ホルモン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＰＲ）、エンケファリン（Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部分泌因子、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＨＰＲ）、胸腺液性因子（Ｔｈｙｍｉｃ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｆａｃｔｏｒ、ＴＨＦ）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、及びグルコロニダーゼからなる群から選択され得る。
本発明に係る核酸または発現ベクターにおいて、前記目的タンパク質は、配列番号９～１９からなる群から選択されるアミノ酸でコードされることを特徴とする。
第３の具現例によれば、
本発明は、ＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を含む発現ベクターで形質転換された細胞を提供しようとする。
本発明は、ＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を含む発現ベクターで形質転換された細胞を提供しようとする。
本発明に係る形質転換された細胞において、前記ＣＳＱタグは、配列番号１または配列番号２からなるアミノ酸でコードされることを特徴とする。前記配列番号１のアミノ酸は、配列番号３のヌクレオチド配列で暗号化され、前記配列列番号２のアミノ酸は、配列番号４のヌクレオチド配列で暗号化され得る。
本発明に係る形質転換された細胞において、前記ＣＳＱタグ及び目的タンパク質は、配列番号５～８からなる群から選択されるアミノ酸からなる加水分解酵素による分解ペプチドを介して融合されることを特徴とする。
本発明に係る形質転換された細胞において、前記目的タンパク質は、高分子タンパク質、糖タンパク質、サイトカイン、成長因子、血液製剤、ワクチン、ホルモン、酵素、及び抗体からなる群から選択されることを特徴とする。例えば、前記目的タンパク質は、インターロイキン－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、免疫グロブリン、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ヒトフィブロネクチンエクストラドメインＢ（Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｅｘｔｒａ Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、ＥＢＤ）、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、形質転換成長因子（Ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－α ａｎｄ －β、ＴＧＦ－α、－β）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、胎盤成長因子（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＩＧＦ）、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １ ａｎｄ ２、ＦＧＦ－１、－２）、ケラチノサイト成長因子（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＫＧＦ）、グルカゴン様ペプチド－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１、ＧＬＰ－１）、エクセンディン、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、ＬＨＲＨ（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、副腎皮質刺激性ホルモン（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン－放出ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、オキシトシン（Ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、チモシンα－１（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ ａｌｐｈａ－１）、コルチコトロピン－放出因子（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ビバリルジン（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、バソプレシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インスリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、小胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素性ホルモン、副甲状腺ホルモン、黄体分泌ホルモン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＰＲ）、エンケファリン（Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部分泌因子、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＨＰＲ）、胸腺液性因子（Ｔｈｙｍｉｃ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｆａｃｔｏｒ、ＴＨＦ）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、及びグルコロニダーゼからなる群から選択され得る。
本発明に係る形質転換された細胞において、前記目的タンパク質は、配列番号９～１９からなる群から選択されるアミノ酸でコードされることを特徴とする。
本発明に係る形質転換された細胞において、前記細胞は、エシェリヒア・コリ、バチルス・サブチルス、バチルス・チューリンゲンシス、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス種、酵母、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株、または植物細胞であることを特徴とする。
第４の具現例によれば、
本発明は、ＣＳＱタグを用いた目的タンパク質の発現及び精製方法を提供しようとするものであって、 当該方法は、
Ａ）ＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを製造するステップ；
Ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に形質導入して形質転換体を得るステップ；
Ｃ）前記形質転換体からＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を発現させるステップ；
Ｄ）カルシウムを用いて前記発現した形質転換体からＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を沈殿させるステップ；及び、
Ｅ）加水分解酵素を用いて融合タンパク質から目的タンパク質を分離するステップ；を含む。
本発明は、ＣＳＱタグを用いた目的タンパク質の発現及び精製方法を提供しようとするものであって、 当該方法は、
Ａ）ＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを製造するステップ；
Ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に形質導入して形質転換体を得るステップ；
Ｃ）前記形質転換体からＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を発現させるステップ；
Ｄ）カルシウムを用いて前記発現した形質転換体からＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を沈殿させるステップ；及び、
Ｅ）加水分解酵素を用いて融合タンパク質から目的タンパク質を分離するステップ；を含む。
本発明に係る目的タンパク質の発現及び精製方法において、前記ＣＳＱタグは、配列番号１または配列番号２からなるアミノ酸でコードされることを特徴とする。前記配列番号１のアミノ酸は、配列番号３のヌクレオチド配列で暗号化され、前記配列番号２のアミノ酸は、配列番号４のヌクレオチド配列で暗号化され得る。
本発明に係る目的タンパク質の発現及び精製方法において、前記ＣＳＱタグ及び目的タンパク質は、配列番号５～８からなる群から選択されるアミノ酸からなる加水分解酵素による分解ペプチドを介して融合されることを特徴とする。
本発明に係る目的タンパク質の発現及び精製方法において、前記目的タンパク質は、高分子タンパク質、糖タンパク質、サイトカイン、成長因子、血液製剤、ワクチン、ホルモン、酵素、及び抗体からなる群から選択されることを特徴とする。例えば、前記目的タンパク質は、インターロイキン－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、免疫グロブリン、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ヒトフィブロネクチンエクストラドメインＢ（Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｅｘｔｒａ Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、ＥＢＤ）、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、形質転換成長因子（Ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－α ａｎｄ －β、ＴＧＦ－α、－β）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、胎盤成長因子（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＩＧＦ）、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １ ａｎｄ ２、ＦＧＦ－１、－２）、ケラチノサイト成長因子（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＫＧＦ）、グルカゴン様ペプチド－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１、ＧＬＰ－１）、エクセンディン、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、ＬＨＲＨ（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、副腎皮質刺激性ホルモン（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン－放出ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、オキシトシン（Ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、チモシンα－１（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ ａｌｐｈａ－１）、コルチコトロピン－放出因子（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ビバリルジン（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、バソプレシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インスリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、小胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素性ホルモン、副甲状腺ホルモン、黄体分泌ホルモン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＰＲ）、エンケファリン（Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部分泌因子、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＨＰＲ）、胸腺液性因子（Ｔｈｙｍｉｃ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｆａｃｔｏｒ、ＴＨＦ）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、及びグルコロニダーゼからなる群から選択され得る。
本発明に係る目的タンパク質の発現及び精製方法において、前記目的タンパク質は、配列番号９～１９からなる群から選択されるアミノ酸でコードされることを特徴とする。
以下、発明の理解を助けるために様々な実施例を提示する。後述の実施例は、発明をより分かり易くするために提供されるものに過ぎず、本発明の保護範囲はこれらの実施例によって限定されない。
実施例１：ＣＳＱ－タグを用いたＥＤＢの分離
１－１．ＣＳＱ１ＴＥＶまたはＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターへのＥＤＢクローニング
ＣＳＱ１ＴＥＶまたはＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターにＥＤＢをクローニングするため、下記のオリゴヌクレオチドＥＤＢ－Ｆ１及びＥＤＢ―Ｂ１を合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）。一方、比較例として、公知のＨｉｓ ｔａｇまたはＧＳＴ ｔａｇとＥＤＢの融合タンパク質を製造した。
１－１．ＣＳＱ１ＴＥＶまたはＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターへのＥＤＢクローニング
ＣＳＱ１ＴＥＶまたはＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターにＥＤＢをクローニングするため、下記のオリゴヌクレオチドＥＤＢ－Ｆ１及びＥＤＢ―Ｂ１を合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）。一方、比較例として、公知のＨｉｓ ｔａｇまたはＧＳＴ ｔａｇとＥＤＢの融合タンパク質を製造した。
5’-AATGGATCCGAGGTGCCCCAACTCACTGAC-3’（配列番号２０）
5’-ATTCTCGAGTTACGTTTGTTGTGTCAGTGTAGTAGG-3’（配列番号２１）
増幅するため、ＥＤＢ－Ｆ１ ２０ｐｍｏｌ、ＥＤＢ－Ｂ１ ２０ｐｍｏｌ、ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ ４μｌ（Ｅｌｐｉｓｂｉｏ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）、及びテンプレート１０μｇを混合し、合計２０μｌになるように蒸留水を加えた混合液を作った。この混合液をＰＣＲ反応（９５℃で５分、３０回：９５℃で３０秒、４２℃で３０秒、７２℃で４５秒、及び７２℃で５分）を行い、増幅後、精製して（ＰＣＲ精製キット、ＧｅｎｅＡｌｌ、ソウル、大韓民国）、ＥＤＢ１４（配列番号９）、ＥＤＢ２１（配列番号１０）、ＥＤＢ２６（配列番号１１）遺伝子を得た。ＥＤＢ遺伝子を、ＣＳＱ１ＴＥＶまたはＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎベクターに挿入するため、ＣＳＱ１ＴＥＶまたはＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターとインサートＤＮＡを制限酵素処理した。約１μｇのインサートＤＮＡをＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）及びＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）で一日間反応させた後、ＰＣＲ精製キットを用いて精製ＤＮＡを得た。また、約４０μｇのＣＳＱ１ＴＥＶまたはＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターにＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）を入れ、３時間反応させた後、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）を用いて、インサートＤＮＡをＣＳＱＴＥＶまたはＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎベクターと常温で３時間連結した（図３）。
その後、ＣＳＱ１ＴＥＶまたはＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターとＥＤＢインサートを連結反応させたＤＮＡをトランスフォーミングした。コンピテントセルであるＤＨ５αを氷上で溶かし、１００μｌのコンピテントセルに連結反応させた溶液２μｌと混合した後、３０分間反応させた。次に、４２℃で１分間ヒートショックを行い、ＳＯＣ培地（ｍｅｄｉａ）を２００μｌ入れた後、３７℃で３０分間培養して塗抹した。塗抹して得られたコロニーをランダムに６個選んでＰＣＲを行い、ＤＮＡ電気泳動してインサートを確認した。クローニングされたコロニーを、バイオニアにシーケンシング依頼し、確認した。
比較例として、Ｈｉｓ ｔａｇまたはＧＳＴ ｔａｇとＥＤＢの融合タンパク質は、バイオニアから提供されたｐＢＴ７－Ｎ－ＨｉｓとｐＢＴ７－Ｎ－ＧＳＴベクターに上述のような方法でクローニングした。
１－２．ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＥＤＢ、ＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＥＤＢ、Ｈｉｓ－ＥＤＢ、ＧＳＴ－ＥＤＢの精製
バイオニアでシーケンスが確認されたＤＮＡを全てＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた２０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた４００ｍｌのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．７まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－D-チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１８℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で1時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＥＤＢとＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＥＤＢタンパク質を得た（図４）。
バイオニアでシーケンスが確認されたＤＮＡを全てＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた２０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた４００ｍｌのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．７まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－D-チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１８℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で1時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＥＤＢとＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＥＤＢタンパク質を得た（図４）。
Ｈｉｓ－ＥＤＢは、次のような方法で発現精製した。ｐＢＴ７－Ｎ－ＨｉｓベクターにＥＤＢ１４をクローニングしたものを、ＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２２０ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた２０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２２０ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた４００ｍｌのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．７まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、３７℃で２２０ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｘｇで１０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇを、イソプロパノール１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。
ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。蒸留水とライシスバッファでＮｉ－ＮＴＡ親和性レジン（Ｅｌｐｏｓｂｉｏ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）を洗浄した後、上層液をレジンに結合させた。洗浄バッファ（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び２０ｍＭイミダゾール）６００ｍｌで洗浄した後、溶出バッファ（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び２５０ｍＭイミダゾール）を用いて、Ｎ－末端Ｈｉｓ－ｔａｇ ＥＤＢ１４タンパク質を溶出させ、獲得した（図４）。
ＧＳＴ－ＥＤＢは、次のような方法で発現精製した。ｐＢＴ７－Ｎ－ＧＳＴベクターにＥＤＢ１４をクローニングしたものを、ＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２２０ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた２０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２２０ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた４００ｍｌのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．７まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、３７℃で２２０ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｘｇで１０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．０５％ＮＰ－４０）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇを、イソプロパノール１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。
ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。蒸留水とライシスバッファでＧＳＴ・Ｂｉｎｄアガロースレジン（Ｅｌｐｏｓｂｉｏ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）を洗浄した後、上層液をレジンに結合させた。洗浄バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）６００ｍｌで洗浄した後、溶出バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１０ｍＭ還元型（フリー）グルタチオン）を用いて、Ｎ－末端ＧＳＴ－ｔａｇ ＥＤＢ１４タンパク質を溶出させ、獲得した（図４）。
その結果、ＥＤＢ１４タンパク質の場合、Ｈｉｓ－ｔａｇやＧＳＴ－ｔａｇを用いては上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）に発現していないが、ＣＳＱ－ｔａｇを用いる場合は、水溶化されて上澄液に発現可能であることが確認された。
１－３．ＴＥＶプロテアーゼを用いたＥＤＢの分離
ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＥＤＢタンパク質からＥＤＢのみを分離するため、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国）５μｌを加え、３０℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図５）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＥＤＢ融合タンパク質は、カルシウムにより沈殿した後、ＴＥＶプロテアーゼを用いて容易に分離可能であることが確認された。
ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＥＤＢタンパク質からＥＤＢのみを分離するため、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国）５μｌを加え、３０℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図５）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＥＤＢ融合タンパク質は、カルシウムにより沈殿した後、ＴＥＶプロテアーゼを用いて容易に分離可能であることが確認された。
実施例２：ＣＳＱ－タグを用いたＥＧＦの分離
２－１．ＣＳＱ１ＴＥＶとＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターへのＥＧＦクローニング
ＣＳＱ１ＴＥＶとＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターにＥＧＦをクローニングするため、下記の２つのオリゴヌクレオチドＥＧＦ－Ｆ１及びＥＧＦ－Ｂ１を合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）。
２－１．ＣＳＱ１ＴＥＶとＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターへのＥＧＦクローニング
ＣＳＱ１ＴＥＶとＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターにＥＧＦをクローニングするため、下記の２つのオリゴヌクレオチドＥＧＦ－Ｆ１及びＥＧＦ－Ｂ１を合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）。
5'-AATGGATCCAACTCTGATAGCGAATGCCCG-3'（配列番号２２）
5'-ATTCTCGAGTTA ACGCAGTTCCCACCATTT-3'（配列番号２３）
増幅するため、ＥＧＦ－Ｆ１ ２０ｐｍｏｌ、ＥＧＦ－Ｂ１ ２０ｐｍｏｌ、ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ ４μｌ（Ｅｌｐｉｓｂｉｏ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）、及びテンプレート１０μｇを混合し、合計２０μｌになるように蒸留水を加えた混合液を作った。この混合液をＰＣＲ反応（９５℃で５分、３０回：９５℃で３０秒、４２℃で３０秒、７２℃で４５秒、及び７２℃で５分）を行い、増幅後、精製して（ＰＣＲ精製キット、ＧｅｎｅＡｌｌ、ソウル、大韓民国）、ＥＧＦ遺伝子（配列番号１２）を得た。ＥＧＦ遺伝子を、ＣＳＱ１ＴＥＶとＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎベクターに挿入するため、ベクターとインサートＤＮＡを制限酵素処理した。約１μｇのインサートＤＮＡをＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）及びＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）で一日間反応させた後、ＰＣＲ精製キットを用いて精製ＤＮＡを得た。また、約４０μｇのＣＳＱ１ＴＥＶとＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターにＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）を入れ、３時間反応させた後、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）を用いて、インサートＤＮＡをベクターと常温で３時間連結した（図６）。
その後、ＣＳＱ１ＴＥＶまたはＣＳＱ１ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターとＥＧＦインサートを連結反応させたＤＮＡをトランスフォーミングした。コンピテントセルであるＤＨ５αを氷上で溶かし、１００μｌのコンピテントセルに連結反応させた溶液２μｌと混合した後、３０分間反応させた。次に、４２℃で１分間ヒートショックを行い、ＳＯＣ培地を２００μｌ入れた後、３７℃で３０分間培養して塗抹した。塗抹して得られたコロニーをランダムに６個選んでＰＣＲを行い、ＤＮＡ電気泳動してインサートを確認した。クローニングされたコロニーを、バイオニアにシーケンシング依頼し、確認した。
２－２．ＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＥＧＦまたはＣＳＱ１ＴＥＶ－ＥＧＦの精製
バイオニアでシーケンスが確認されたＤＮＡをＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた２０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた４００ｍｌのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．７まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１８℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＥＧＦとＣＳＱ１ＴＥＶ－ＥＧＦタンパク質を得た（図７）。
バイオニアでシーケンスが確認されたＤＮＡをＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた２０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた４００ｍｌのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．７まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１８℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＥＧＦとＣＳＱ１ＴＥＶ－ＥＧＦタンパク質を得た（図７）。
２－３．トロンビンプロテアーゼを用いたＥＧＦの分離
ＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＥＧＦタンパク質からＥＧＦのみを分離するため、トロンビンプロテアーゼ５μｌを加え、２２℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図８）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＥＤＢ融合タンパク質は、トロンビンプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
ＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＥＧＦタンパク質からＥＧＦのみを分離するため、トロンビンプロテアーゼ５μｌを加え、２２℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図８）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＥＤＢ融合タンパク質は、トロンビンプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
実施例３：ＣＳＱ－タグを用いたＫＧＦ１、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２の分離
３－１．ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＫＧＦ１、ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＶＥＧＦ、及びＣＳＱ１ＴＥＶ－ＦＧＦ２の精製
ＫＧＦ１（配列番号１３）、ＶＥＧＦ（配列番号１４）、及びＦＧＦ２（配列番号１５）の遺伝子を、バイオニアで合成した後、ＣＳＱ１ＴＥＶにクローニングした後、ＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μｇ/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのLB培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた３０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた１ＬのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．６まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液にＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＫＧＦ１とＣＳＱ１ＴＥＶ－ＶＥＧＦ、及びＣＳＱ１ＴＥＶ－ＦＧＦ２タンパク質を得た（図９、図１１、図１３）。
３－１．ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＫＧＦ１、ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＶＥＧＦ、及びＣＳＱ１ＴＥＶ－ＦＧＦ２の精製
ＫＧＦ１（配列番号１３）、ＶＥＧＦ（配列番号１４）、及びＦＧＦ２（配列番号１５）の遺伝子を、バイオニアで合成した後、ＣＳＱ１ＴＥＶにクローニングした後、ＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μｇ/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのLB培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた３０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた１ＬのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．６まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液にＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＫＧＦ１とＣＳＱ１ＴＥＶ－ＶＥＧＦ、及びＣＳＱ１ＴＥＶ－ＦＧＦ２タンパク質を得た（図９、図１１、図１３）。
３－２．ＴＥＶプロテアーゼを用いたＫＧＦ１、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２の分離
ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＫＧＦ１タンパク質（以下、ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＶＥＧＦ及びＣＳＱ１ＴＥＶ－ＦＧＦタンパク質の場合でもＣＳＱ１ＴＥＶ－ＫＧＦ１と同様にして実験を行う）からＫＧＦ１のみを分離するため、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国）５μｌを加え、３０℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図１０、図１２、図１４）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＫＧＦ１融合タンパク質、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＶＥＧＦタンパク質、並びにＣＳＱ－ｔａｇ及びＦＧＦタンパク質は、いずれもＴＥＶプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＫＧＦ１タンパク質（以下、ＣＳＱ１ＴＥＶ－ＶＥＧＦ及びＣＳＱ１ＴＥＶ－ＦＧＦタンパク質の場合でもＣＳＱ１ＴＥＶ－ＫＧＦ１と同様にして実験を行う）からＫＧＦ１のみを分離するため、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国）５μｌを加え、３０℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図１０、図１２、図１４）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＫＧＦ１融合タンパク質、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＶＥＧＦタンパク質、並びにＣＳＱ－ｔａｇ及びＦＧＦタンパク質は、いずれもＴＥＶプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
実施例４：ＣＳＱ－タグを用いたＢＭＰ２、ＴＧＦβ、ＨＲＰ、及びＧＬＰ１の分離
４－１．ＴＥＶＣＳＱ１またはＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１ベクターへのＢＭＰ２及びＴＧＦβクローニング
ＴＥＶＣＳＱ１またはＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１ベクターにＢＭＰ２及びＴＧＦβをクローニングするため、下記のオリゴヌクレオチドＡｍｐｌｉｆｙ－Ｆ１及びＡｍｐｌｉｆｙ－Ｂ１を合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）。
４－１．ＴＥＶＣＳＱ１またはＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１ベクターへのＢＭＰ２及びＴＧＦβクローニング
ＴＥＶＣＳＱ１またはＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１ベクターにＢＭＰ２及びＴＧＦβをクローニングするため、下記のオリゴヌクレオチドＡｍｐｌｉｆｙ－Ｆ１及びＡｍｐｌｉｆｙ－Ｂ１を合成した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）。
5'-CAGCAAGACAGCGATGGATCC-3'（配列番号２４）
5'-CGACTTACAGGTGATCTCGAG-3’（配列番号２５）
増幅するため、Ａｍｐｌｉｆｙ－Ｆ１ ２０ｐｍｏｌ、Ａｍｐｌｉｆｙ－Ｂ１ ２０ｐｍｏｌ、ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）及びテンプレート１０μｇを混合し、合計２０μｌになるように蒸留水を加えた混合液を作った。この混合液をＰＣＲ反応（９５℃で５分、３０回：９５℃で３０秒、４７℃で３０秒、７２℃で４５秒、及び７２℃で５分）を行い、増幅後、精製して（ＰＣＲ精製キット、ＧｅｎｅＡｌｌ、ソウル、大韓民国）、ＢＭＰ２（配列番号１６）及びＴＧＦβ（配列番号１７）遺伝子を得た。ＢＭＰ２遺伝子（以下、ＴＧＦβ遺伝子の場合でもＢＭＰ２と同様にして行う）を、ＴＥＶＣＳＱ１またはＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１ベクターに挿入するため、ＴＥＶＣＳＱ１またはＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１ベクターとインサートＤＮＡを制限酵素処理した。約１μｇのインサートＤＮＡをＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）で一日間反応させた後、ＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）で二日間反応させた。次に、ＰＣＲ精製キットを用いて精製ＤＮＡを得た。また、約３μｇのＴＥＶＣＳＱまたはＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱベクターにＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｔａｋａｒａ、日本国）を入れ、３時間反応させた後、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）を用いて、インサートＤＮＡをＴＥＶＣＳＱまたはＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱベクターと常温で３時間連結した（図１５）。
その後、ＴＥＶＣＳＱ１またはＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１ベクターとＢＭＰ２インサートを連結反応させたＤＮＡをトランスフォーミングした。コンピテントセルであるＤＨ５αを氷上で溶かし、１００μｌのコンピテントセルに連結反応させた溶液５μｌと混合した後、３０分間反応させた。次に、４２℃で３０秒間ヒートショックを行い、ＳＯＣ培地を２００μｌ入れた後、３７℃で４０分間培養して塗抹した。塗抹して得られたコロニーをランダムに選んで、クローニングされたコロニーを、バイオニアにシーケンシング依頼し、確認した。ＨＲＰ（配列番号１８）とＧＬＰ１（配列番号１９）遺伝子も、同じくバイオニアで合成した後、上記と同様にしてＴＥＶＣＳＱ１にクローニングした。
４－２．ＢＭＰ２－ＴＥＶＣＳＱ１またはＢＭＰ２－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１、ＴＧＦβ－ＴＥＶＣＳＱ１またはＴＧＦβ－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１、ＨＲＰ－ＴＥＶＣＳＱ１、及びＧＬＰ１－ＴＥＶＣＳＱ１の精製
バイオニアでシーケンスが確認されたＢＭＰ２－ＴＥＶＣＳＱ１、ＢＭＰ２－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１、ＴＧＦβ－ＴＥＶＣＳＱ１、ＴＧＦβ－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１、ＨＲＰ－ＴＥＶＣＳＱ１、ＧＬＰ－ＴＥＶＣＳＱ１ベクターのそれぞれをＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた３０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた１ＬのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．６まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＢＭＰ２－ＴＥＶＣＳＱ１とＢＭＰ２－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１タンパク質を得た（図１６、図１８、図２０、図２２）。
バイオニアでシーケンスが確認されたＢＭＰ２－ＴＥＶＣＳＱ１、ＢＭＰ２－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１、ＴＧＦβ－ＴＥＶＣＳＱ１、ＴＧＦβ－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１、ＨＲＰ－ＴＥＶＣＳＱ１、ＧＬＰ－ＴＥＶＣＳＱ１ベクターのそれぞれをＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた３０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた１ＬのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．６まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＢＭＰ２－ＴＥＶＣＳＱ１とＢＭＰ２－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１タンパク質を得た（図１６、図１８、図２０、図２２）。
４－３．ＴＥＶプロテアーゼを用いたＢＭＰ２、ＴＧＦβ、ＨＲＰ、及びＧＬＰ１の分離
ＢＭＰ２－ＴＥＶＣＳＱ１タンパク質（以下、ＴＧＦβ－ＴＥＶＣＳＱ１、ＨＲＰ－ＴＥＶＣＳＱ１、及びＧＬＰ１－ＴＥＶＣＳＱ１タンパク質の場合でもＢＭＰ２－ＴＥＶＣＳＱ１と同様にして実験を行う）からＢＭＰ２を分離するため、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国）２μｌを加え、３０℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図１７、図１９、図２１、図２３）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＢＭＰ２融合タンパク質は、ＴＥＶプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
ＢＭＰ２－ＴＥＶＣＳＱ１タンパク質（以下、ＴＧＦβ－ＴＥＶＣＳＱ１、ＨＲＰ－ＴＥＶＣＳＱ１、及びＧＬＰ１－ＴＥＶＣＳＱ１タンパク質の場合でもＢＭＰ２－ＴＥＶＣＳＱ１と同様にして実験を行う）からＢＭＰ２を分離するため、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国）２μｌを加え、３０℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図１７、図１９、図２１、図２３）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＢＭＰ２融合タンパク質は、ＴＥＶプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
４－４．トロンビンプロテアーゼを用いたＢＭＰ２及びＴＧＦβの分離
ＢＭＰ２－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１タンパク質（以下、ＴＧＦβ－ＴＥＶＣＳＱ１タンパク質の場合でもＢＭＰ２－ＴＥＶＣＳＱ１と同様にして実験を行う）からＢＭＰ２を分離するため、トロンビンプロテアーゼ５μｌを加え、２２℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図１７、図１９）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＢＭＰ２融合タンパク質は、トロンビンプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
ＢＭＰ２－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ１タンパク質（以下、ＴＧＦβ－ＴＥＶＣＳＱ１タンパク質の場合でもＢＭＰ２－ＴＥＶＣＳＱ１と同様にして実験を行う）からＢＭＰ２を分離するため、トロンビンプロテアーゼ５μｌを加え、２２℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図１７、図１９）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＢＭＰ２融合タンパク質は、トロンビンプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
実施例５：ＣＳＱ－タグを用いたＢＭＰ２及びＫＧＦ１の分離
５－１．ＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターへのＢＭＰ２及びＫＧＦ１クローニング
ＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターにＢＭＰ２及びＫＧＦ１をクローニングするため、合成したオリゴヌクレオチドＡｍｐｌｉｆｙ－Ｆ１及びＡｍｐｌｉｆｙ－Ｂ１を使用した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）。増幅するため、Ａｍｐｌｉｆｙ－Ｆ１ ２０ｐｍｏｌ、Ａｍｐｌｉｆｙ－Ｂ１ ２０ｐｍｏｌ、ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）及びテンプレート１０μｇを混合し、合計２０μｌになるように蒸留水を加えた混合液を作った。この混合液をＰＣＲ反応（９５℃で５分、３０回：９５℃で３０秒、４７℃で３０秒、７２℃で４５秒、及び７２℃で５分）を行い、増幅後、精製して（ＰＣＲ精製キット、ＧｅｎｅＡｌｌ、ソウル、大韓民国）、ＢＭＰ２（配列番号１６）及びＫＧＦ１（配列番号１３）遺伝子を得た。ＢＭＰ２遺伝子（以下、ＫＧＦ１遺伝子の場合でもＢＭＰ２と同様にして行う）を、ＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎベクターに挿入するため、ＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターとインサートＤＮＡを制限酵素処理した。約１μｇのインサートＤＮＡをＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）で一日間反応させた後、ＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）で二日間反応させた。次に、ＰＣＲ精製キットを用いて精製ＤＮＡを得た。また、約３μｇのＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターにＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｔａｋａｒａ、日本国）を入れ、３時間反応させた後、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）を用いて、インサートＤＮＡをＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎベクターと常温で３時間連結した（図２４）。
５－１．ＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターへのＢＭＰ２及びＫＧＦ１クローニング
ＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターにＢＭＰ２及びＫＧＦ１をクローニングするため、合成したオリゴヌクレオチドＡｍｐｌｉｆｙ－Ｆ１及びＡｍｐｌｉｆｙ－Ｂ１を使用した（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）。増幅するため、Ａｍｐｌｉｆｙ－Ｆ１ ２０ｐｍｏｌ、Ａｍｐｌｉｆｙ－Ｂ１ ２０ｐｍｏｌ、ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）及びテンプレート１０μｇを混合し、合計２０μｌになるように蒸留水を加えた混合液を作った。この混合液をＰＣＲ反応（９５℃で５分、３０回：９５℃で３０秒、４７℃で３０秒、７２℃で４５秒、及び７２℃で５分）を行い、増幅後、精製して（ＰＣＲ精製キット、ＧｅｎｅＡｌｌ、ソウル、大韓民国）、ＢＭＰ２（配列番号１６）及びＫＧＦ１（配列番号１３）遺伝子を得た。ＢＭＰ２遺伝子（以下、ＫＧＦ１遺伝子の場合でもＢＭＰ２と同様にして行う）を、ＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎベクターに挿入するため、ＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターとインサートＤＮＡを制限酵素処理した。約１μｇのインサートＤＮＡをＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）で一日間反応させた後、ＸｈｏＩ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ）で二日間反応させた。次に、ＰＣＲ精製キットを用いて精製ＤＮＡを得た。また、約３μｇのＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターにＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｔａｋａｒａ、日本国）を入れ、３時間反応させた後、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）を用いて、インサートＤＮＡをＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎベクターと常温で３時間連結した（図２４）。
その後、ＣＳＱ２ＴＥＶまたはＣＳＱ２ＴｈｒｏｍｂｉｎベクターとＢＭＰ２インサートを連結反応させたＤＮＡをトランスフォーミングした。コンピテントセルであるＤＨ５αを氷上で溶かし、１００μｌのコンピテントセルに連結反応させた溶液５μｌと混合した後、３０分間反応させた。また、４２℃で３０秒間ヒートショックを行い、ＳＯＣ培地を２００μｌ入れた後、３７℃で４０分間培養して塗抹した。塗抹して得られたコロニーをランダムに選んで、クローニングされたコロニーを、バイオニアにシーケンシング依頼し、確認した。
５－２．ＣＳＱ２ＴＥＶ－ＢＭＰ２またはＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＢＭＰ２、及びＣＳＱ２ＴＥＶ－ＫＧＦ１またはＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＫＧＦ１の精製
バイオニアでシーケンスが確認されたＤＮＡを全てＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた３０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた１ＬのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．６まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＣＳＱ２ＴＥＶ－ＢＭＰ２とＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎ―ＢＭＰ２タンパク質を得た（図２５、図２７）。
バイオニアでシーケンスが確認されたＤＮＡを全てＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた３０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ)が含まれた１ＬのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．６まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＣＳＱ２ＴＥＶ－ＢＭＰ２とＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎ―ＢＭＰ２タンパク質を得た（図２５、図２７）。
５－３．ＴＥＶプロテアーゼを用いたＢＭＰ２及びＫＧＦの分離
ＣＳＱ２ＴＥＶ－ＢＭＰ２タンパク質（以下、ＣＳＱ２ＴＥＶ－ＫＧＦ１タンパク質の場合でも同様にして実験を行う）からＢＭＰ２を分離するため、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国）２μｌを加え、３０℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図２６、図２８）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＢＭＰ２融合タンパク質は、ＴＥＶプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
ＣＳＱ２ＴＥＶ－ＢＭＰ２タンパク質（以下、ＣＳＱ２ＴＥＶ－ＫＧＦ１タンパク質の場合でも同様にして実験を行う）からＢＭＰ２を分離するため、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国）２μｌを加え、３０℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図２６、図２８）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＢＭＰ２融合タンパク質は、ＴＥＶプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
５－４．トロンビンプロテアーゼを用いたＢＭＰ２及びＫＧＦの分離
ＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＢＭＰ２タンパク質（以下、ＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＫＧＦ１タンパク質の場合でも同様にして実験を行う）からＢＭＰ２を分離するため、トロンビンプロテアーゼ５μｌを加え、２２℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図２６、図２８）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＢＭＰ２融合タンパク質は、トロンビンプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
ＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＢＭＰ２タンパク質（以下、ＣＳＱ２Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＫＧＦ１タンパク質の場合でも同様にして実験を行う）からＢＭＰ２を分離するため、トロンビンプロテアーゼ５μｌを加え、２２℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図２６、図２８）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＢＭＰ２融合タンパク質は、トロンビンプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
実施例６：ＣＳＱ－タグを用いたＨＲＰ及びＧＬＰ１の分離
６－１．ＨＲＰ－ＴＥＶＣＳＱ２またはＨＲＰ－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ２、及びＧＬＰ１－ＴＥＶＣＳＱ２の精製
ＨＲＰ（配列番号１８）及びＧＬＰ１（配列番号１９）の遺伝子をバイオニアで合成した後、ＴＥＶＣＳＱ２とＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ２ベクターにクローニングした後、ＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた３０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた１ＬのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．６まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｎＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＨＲＰ－ＴＥＶＣＳＱ２とＨＲＰ－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ２、及びＧＬＰ１－ＴＥＶＣＳＱ２タンパク質を得た（図２９、図３１）。
６－１．ＨＲＰ－ＴＥＶＣＳＱ２またはＨＲＰ－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ２、及びＧＬＰ１－ＴＥＶＣＳＱ２の精製
ＨＲＰ（配列番号１８）及びＧＬＰ１（配列番号１９）の遺伝子をバイオニアで合成した後、ＴＥＶＣＳＱ２とＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ２ベクターにクローニングした後、ＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた３０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた１ＬのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．６まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｎＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＨＲＰ－ＴＥＶＣＳＱ２とＨＲＰ－ＴｈｒｏｍｂｉｎＣＳＱ２、及びＧＬＰ１－ＴＥＶＣＳＱ２タンパク質を得た（図２９、図３１）。
６－２．ＴＥＶプロテアーゼを用いたＨＲＰ及びＧＬＰ１の分離
ＨＲＰ－ＴＥＶＣＳＱ２タンパク質（以下、ＧＬＰ１－ＴＥＶＣＳＱ２タンパク質の場合でも同様にして実験を行う）からＨＲＰを分離するため、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国）２μｌを加え、３０℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図３０、図３２）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＨＲＰ融合タンパク質、並びにＣＳＱ－ｔａｇ及びＧＬＰ１融合タンパク質は、いずれもＴＥＶプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
ＨＲＰ－ＴＥＶＣＳＱ２タンパク質（以下、ＧＬＰ１－ＴＥＶＣＳＱ２タンパク質の場合でも同様にして実験を行う）からＨＲＰを分離するため、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、米国）２μｌを加え、３０℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図３０、図３２）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＨＲＰ融合タンパク質、並びにＣＳＱ－ｔａｇ及びＧＬＰ１融合タンパク質は、いずれもＴＥＶプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
実施例７：ＣＳＱ－タグを用いたＥＧＦ及びＫＧＦ１の分離
７－１．ＣＳＱ１－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＥＧＦ及びＣＳＱ２－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＫＧＦ１の精製
ＥＧＦ（配列番号１２）、ＫＧＦ１（配列番号１３）の遺伝子をバイオニアで合成した後、ＣＳＱ１－Ｓｓｐ ＤｎａとＣＳＱ２－Ｓｓｐ Ｄｎａベクターにクローニングした後、ＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた３０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた１ＬのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．６まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＣＳＱ１－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＥＧＦ、及びＣＳＱ２－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＫＧＦ１タンパク質を得た（図３３、図３５）。
７－１．ＣＳＱ１－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＥＧＦ及びＣＳＱ２－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＫＧＦ１の精製
ＥＧＦ（配列番号１２）、ＫＧＦ１（配列番号１３）の遺伝子をバイオニアで合成した後、ＣＳＱ１－Ｓｓｐ ＤｎａとＣＳＱ２－Ｓｓｐ Ｄｎａベクターにクローニングした後、ＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた３０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた１ＬのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．６まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＣＳＱ１－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＥＧＦ、及びＣＳＱ２－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＫＧＦ１タンパク質を得た（図３３、図３５）。
７－２．ｐＨを用いたＥＧＦ及びＫＧＦ１の分離
ＣＳＱ１－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＥＧＦタンパク質（以下、ＣＳＱ２－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＫＧＦ１タンパク質の場合でも同様にして実験を行う）からＥＧＦを分離するため、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．５、５００ｍＭ ＮａＣｌバッファを用いて常温で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図３４、図３６）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＥＧＦ融合タンパク質は、ｐＨを用いて容易に分離されることが確認された。
ＣＳＱ１－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＥＧＦタンパク質（以下、ＣＳＱ２－Ｓｓｐ Ｄｎａ－ＫＧＦ１タンパク質の場合でも同様にして実験を行う）からＥＧＦを分離するため、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ６．５、５００ｍＭ ＮａＣｌバッファを用いて常温で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図３４、図３６）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＥＧＦ融合タンパク質は、ｐＨを用いて容易に分離されることが確認された。
実施例８：ＣＳＱ－タグを用いたＥＧＦ及びＢＭＰ２の分離
８－１．ＥＧＦ－ＧｙｒＡ－ＣＳＱ１及びＢＭＰ２－ＧｙｒＡ－ＣＳＱ２の精製
ＥＧＦ（配列番号１２）、ＢＭＰ２（配列番号１６）の遺伝子をバイオニアで合成した後、ＧｙｒＡ－ＣＳＱ１とＧｙｒＡ－ＣＳＱ２ベクターにクローニングした後、ＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。
８－１．ＥＧＦ－ＧｙｒＡ－ＣＳＱ１及びＢＭＰ２－ＧｙｒＡ－ＣＳＱ２の精製
ＥＧＦ（配列番号１２）、ＢＭＰ２（配列番号１６）の遺伝子をバイオニアで合成した後、ＧｙｒＡ－ＣＳＱ１とＧｙｒＡ－ＣＳＱ２ベクターにクローニングした後、ＢＬ２１細胞に形質転換した後、アンピシリンが含まれた寒天培地に塗抹した。
寒天平板培地で育てた群落を、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた５ｍｌのＬＢ培地に接種した後、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、グリセロールと１：１の割合で混合してストック１ｍｌを作り、－８０℃のディープフリーザに保管した。アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた３０ｍｌのＬＢ培地にストック１００μｌを接種し、３７℃で２００ｒｐｍの速度で混合しながら一日間培養した後、アンピシリン（５０μg/ｍｌ）が含まれた１ＬのＬＢ培地に移し、ＯＤ＝０．６まで培養した。次に、１ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノサイド（ＩＰＴＧ）を入れ、１７℃で２００ｒｐｍの速度で一日間培養した。４℃で４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿した細胞を除く上層液を全て除去し、ライシスバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で懸濁した。－８０℃で一日間保管した後、取り出して完全に溶かした後、ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅ Ｓｕｌｆｏｎｙｌ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）１０ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かした後、溶解したＥ．ｃｏｌｉに１ｍｌ入れた。ソニケーターを用いてＥ．ｃｏｌｉを溶解させた後、４℃で１３，０００ｒｐｍの速度で１時間遠心分離した。上層液に、ＣａＣｌ２ ２０ｍＭを入れ、４℃で１時間反応した。次に、５０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。上層液を除去し、沈殿物にＥＤＴＡを入れて懸濁し、ＥＧＦ－ＧｙｒＡ－ＣＳＱ１及びＢＭＰ２－ＧｙｒＡ－ＣＳＱ２タンパク質を得た（図３７、図３９）。
８－２．ジチオスレイトール（ＤＴＴ）用いたＥＧＦ及びＢＭＰ２の分離
ＥＧＦ－ＧｙｒＡ－ＣＳＱ１タンパク質（以下、ＢＭＰ２－ＧｙｒＡ－ＣＳＱ２タンパク質の場合でも同様にして実験を行う）からＥＧＦを分離するため、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＤＴＴバッファを用いて常温で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図３８、図４０）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＥＧＦ融合タンパク質は、ＤＴＴを用いて容易に分離されることが確認された。
ＥＧＦ－ＧｙｒＡ－ＣＳＱ１タンパク質（以下、ＢＭＰ２－ＧｙｒＡ－ＣＳＱ２タンパク質の場合でも同様にして実験を行う）からＥＧＦを分離するため、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＤＴＴバッファを用いて常温で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図３８、図４０）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＥＧＦ融合タンパク質は、ＤＴＴを用いて容易に分離されることが確認された。
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に記述したところ、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は、好適な実施形態に過ぎず、これらによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるべきである。
前記ＣＳＱタグは、配列番号３または配列番号４からなるヌクレオチド配列で暗号化され得る。
２－３．トロンビンプロテアーゼを用いたＥＧＦの分離
ＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＥＧＦタンパク質からＥＧＦのみを分離するため、トロンビンプロテアーゼ５μｌを加え、２２℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図８）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＥＧＦ融合タンパク質は、トロンビンプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
ＣＳＱ１Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ＥＧＦタンパク質からＥＧＦのみを分離するため、トロンビンプロテアーゼ５μｌを加え、２２℃で一日間反応させた後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した（図８）。その結果、ＣＳＱ－ｔａｇ及びＥＧＦ融合タンパク質は、トロンビンプロテアーゼを用いて容易に分離されることが確認された。
Claims (12)
- 目的タンパク質の発現及び水溶化向上のためのＣＳＱタグ、及び目的タンパク質を含む、融合タンパク質。
- 前記ＣＳＱタグは、配列番号１または配列番号２からなるアミノ酸でコードされることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記ＣＳＱタグは、配列番号４または配列番号４からなるヌクレオチド配列で暗号化されることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記ＣＳＱタグ及び目的タンパク質は、配列番号５～８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる加水分解酵素分解ペプチドを介して融合されることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記目的タンパク質は、高分子タンパク質、糖タンパク質、サイトカイン、成長因子、血液製剤、ワクチン、ホルモン、酵素、及び抗体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
- 前記目的タンパク質は、インターロイキン－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、免疫グロブリン、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）、サイトカイン、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ヒトフィブロネクチンエクストラドメインＢ（Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｅｘｔｒａ Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、ＥＢＤ）、骨形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、形質転換成長因子（Ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－α ａｎｄ －β、ＴＧＦ－α、－β）、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ、ＢＤＮＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、胎盤成長因子（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＰＩＧＦ）、肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １ ａｎｄ ２、ＦＧＦ－１、－２）、ケラチノサイト成長因子（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＫＧＦ）、グルカゴン様ペプチド－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ－１、ＧＬＰ－１）、エクセンディン、ソマトスタチン（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）、ＬＨＲＨ（Ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、副腎皮質刺激ホルモン（Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、成長ホルモン－放出ホルモン（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ）、オキシトシン（Ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、チモシンα－１（Ｔｈｙｍｏｓｉｎ ａｌｐｈａ－１）、コルチコトロピン放出因子（Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ－Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）、カルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ビバリルジン（Ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、バソプレシン（Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、インスリン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、小胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素性ホルモン、副甲状腺ホルモン、黄体分泌ホルモン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ Ｇｅｎｅ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＰＲ）、エンケファリン（Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部分泌因子、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＨＰＲ）、胸腺液性因子（Ｔｈｙｍｉｃ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｆａｃｔｏｒ、ＴＨＦ）、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、及びグルコロニダーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の融合タンパク質。
- 前記目的タンパク質は、配列番号９～１９からなる群から選択されるアミノ酸でコードされることを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。
- 請求項１～７のうちのいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
- 請求項８に記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項９に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
- 前記細胞は、エシェリヒア・コリ、バチルス・サブチルス、バチルス・チューリンゲンシス、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス種、酵母、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株、または植物細胞であることを特徴とする、請求項１０に記載の形質転換された細胞。
- Ａ）請求項１～７のうちのいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを製造するステップ；
Ｂ）前記発現ベクターを宿主細胞に形質導入して形質転換体を得るステップ；
Ｃ）前記形質転換体からＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を発現させるステップ；
Ｄ）カルシウムを用いて前記発現した形質転換体からＣＳＱタグ及び目的タンパク質を含む融合タンパク質を沈殿させるステップ；及び、
Ｅ）加水分解酵素を用いて融合タンパク質から目的タンパク質を分離するステップ；
を含む、ＣＳＱタグを用いた目的タンパク質の発現及び精製方法。
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