JPH03232489A - 部分的二本鎖オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの形成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は二本鎖のオリゴヌクレオチドの形成方法に関す
る。

また、さらに本発明は、標識された二本鎖オリゴヌクレ
オチドを形成する方法にも好適に利用されつる形成方法
に関する。

〔従来の技術〕

近年の遺伝子操作技術の発達により、成る特定の遺伝子
をクローニングし、それを大腸菌または枯草菌等で発現
させ、大量に遺伝子産物である蛋白質を得ることが可能
になった。この方法では、増殖の早い菌に蛋白質を産生
させるために、本来、酵素で精製分離等が困難な蛋白質
をも容易にしかも大量に得られるという利点があり、工
業的には低コスト化が可能になる。

しかし、一方、どのような蛋白質でも同じ方法でうま（
発現できるとは限らない。そのような場合に、所望の蛋
白質の構造遺伝子の塩基配列を宿主である、例えば、大
腸菌でよく使用されるコドンに置き換えて合成遺伝子を
構成することにより、発現可能になった例も多い。

また、最近では蛋白質を改変し、その機能とアミノ酸配
列の関連を調べたり、より高機能にする試みがなされて
いる。このような場合、あらかじめその蛋白質の構造遺
伝子に、アミノ酸配列は変えずに、可能な限りの制限酵
素切断部位を導入した遺伝子を構築し、それを合成し、
発現させて、その後導入された制限酵素切断部位を利用
して一部を入れ替え、蛋白質を改変する場合が多い。

現在、行なわれている遺伝子（以下本件では二本鎖オリ
ゴヌクレオチドという。）合成方法に、例えば、所望の
ＤＮＡの各鎖を１００ｍｅｒ以下に分けて、ＤＮＡ合成
装置で合成し、アニーリングによって二本鎖にする方法
もしくはそれら二本鎖にしたあとで、それぞれ順番に並
ぶように連結する方法がある。具体的に説明すると、１
００塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成しようと
する場合、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを２本合
成し、次に、それぞれ相補的なオリゴヌクレオチド同士
をアニールし、二本鎖を形成させたり、もしくは２００
塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成しようとする
場合、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを４本合成し
、次にそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチド同士をアニ
ールし、二本鎖を形成させ、該二本鎖の二組を連結する
等の方法がとられている。

上記二本鎖のオリゴヌクレオチドを作成するにあたって
は、−重鎖のオリゴヌクレオチドが１００ｍａｒ以下で
あるなら、それぞれ二本合成し、アニーリングによって
二本鎖に形成させなくても、ブライマー伸展法により、
二本鎖を形成させることができる。

具体的には１００塩基対の二木鎖オリゴヌクレオチドを
合成する場合、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを一
本合成し、それを鋳型とし、また別に該オリゴヌクレオ
チドと相補的な配列を持っ８塩基以上のオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして結合させ、順次プライマー側か
ら核酸塩基を重合させていくことができる。

一方、代表的なりＮＡ標識方法としては（１）末端標識
法、（２）ニックトランスレーション法、（３）置換合
成法、及び（４）プライマー伸展法を利用したものが知
られている。

以下、標識された二本鎖オリゴヌクレオチドを得る各方
法について説明する。

末端標識法は５′末端のリン酸基をアルカリフォスファ
ターゼで除去し、それにポリヌクレオチドキナーゼを作
用させて再びリン酸化する際に標識する方法で、３２ｐ
での放射性標識に利用されている。また、３′末端の標
識には、ターミナルトランスフェラーゼ法、ＤＮＡポリ
メラーゼ法等がある。ターミナルトランスフェラーゼ法
は酵素により標識されたヌクレオチドトリフオスフェー
ドを３′末端に多数個順次結合させる方法であり、一方
ＤＮＡポリメラーゼ法は制限酵素で切断されたＤＮＡの
突き出た一本鎖部分を酵素により修飾し、相補的な二本
鎖を形成させる際に、標識ヌクレオチドを取り込ませる
方法である。該末端標識法はこのように標識される部位
が１か所または２か所程度に限定されるため、比活性の
高いプローブを得ることは困難である。一般的には比活
性の高い放射性同位元素による標識が行なわれる。

これに対しニックトランスレーション及び置換合成法は
、多数の標識化合物を取り込ませ、高い比活性を持つＤ
ＮＡプローブを作製することができる。つまり、ニック
トランスレーションでは膵臓由来のＤＮａｓｅｌでＤＮ
Ａの二本鎖をランダムに加水分解し、切れ目を作る。こ
の切れ目をＤＮＡポリメラーゼＩが認識しＤＮＡ鎖を５
′側から分解し、それと同時に５′側から３′側へポリ
メラーゼ活性によりニックを持たないＤＮＡ鎖を鋳型と
して相補的なりＮＡが合成され、その際基質として標識
されたヌクレオチドトリフオスフェードが取りこまれる
。また、置換合成法はＴ４ＤＮＡポリメラーゼの３′エ
キソヌクレアーゼ活性により二本鎖の両３′末端を適当
な長さ削り、その後ポリメラーゼ活性により修復する際
に標識ヌクレオチドを取り込む方法である。該方法はい
ずれも数百塩基対以上の長いＤＮＡを標識する場合にの
み有効である。

プライマー伸展法は、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法
であるサンガー法を応用したもので、鋳型となる一本鎖
ＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、その３′末端と相
補的な配列を持つ８塩基以上のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして結合させ、ＤＮＡポリメラーゼＩのｌａ
ｒｇｅｆｒａｇｍｅｎｔ等により５′側から３′側に相
補的な配列を持つＤＮＡを合成させる際に、標識ヌクレ
オチドを取り込ませる方法である。

ところで、近年プロティンシーケンサ−の発達、及びＤ
ＮＡ合成装置の普及は、遺伝子操作を著しく進展させた
。つまり、少量の蛋白質からそのアミノ酸配列の一部を
容易に知ることができるようになり、さらに、ＤＮＡ合
成装置によりオリゴヌクレオチドが自動的に合成できる
ようになったことにより、目的の蛋白質のアミノ酸配列
の一部を決め、それを基にＤＮＡの塩基配列を推定し化
学合成し、何らかの標識を施してプローブとして用いる
ことができるようになった。

更に該オリゴヌクレオチドプローブは、カマ状赤血球、
ある種の筋ジストロフィー導条（の遺伝子疾患、癌性疾
患または伝染性疾患と関連する制限酵素断片長条型によ
る遺伝子解析（ＲＦＬＰ：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　　
ｆ　ｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ　　ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈｉｓｍ）にも広く利用されてきている。

〔本発明が解決しようとしている問題点〕このように、
最近、特に合成遺伝子を作製することが非常に重要にな
ってきているが、市販のＤＮＡ合成装置の合成能力は、
現在のところ１００ｍｅｒ程度以下である。しかもその
収率は高いとはいえない。従って、合成したオリゴヌク
レオチドをゲル電気泳動等で分離し、所望のバンドのみ
を抽出しなければならない。例えば、前述した事例の場
合（２００塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成す
る場合）、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを４本合
成し、さらに精製してから使用することになる。

次に、これらのオリゴヌクレオチドをアニールして、二
本鎖を形成させ、連結するわけであるが、二組のオリゴ
ヌクレオチドはＡＢの順と、ＢＡの順の２種類の結合の
仕方がある。そのため、結合体について、塩基配列を決
めで、ＡＢの順のみを選択する必要がある。必ず両方向
について二種類の結合体が得られ、それを塩基配列を決
めることにより、所望のもののみを得る操作が必要であ
る。しかし、上記の操作はかなり繁雑であり、しかも純
度を満足させるために精製を行うと、合成収率が悪くな
り、純度及び収率ともに満足できる方法ではなかった。

また、前述のように、プライマー伸展法等により二本鎖
オリゴヌクレオチドを形成したとじても、アニールで連
結させる前の二本鎖オリゴヌクレオチドの最大塩基対の
数は１００までであり、（現在のところ一本鎖オリゴヌ
クレオチドの合成能力は１００ｍｅｒ以下であるため）
、連結の操作なしに、−度２００塩基対の二本鎖オリゴ
ヌクレオチドを合成する方法は得られていなかった。

一方、一般にプローブとして利用されるＤＮＡオリゴヌ
クレオチドの長さが長ければ長いほど、ハイブリダイゼ
ーション時の相補的結合の誤りが防げる。しかしプライ
マー伸展法によって長い標識ＤＮＡを得るためには、鋳
型となる一本鎖ＤＮＡとして長いものが必要になる。と
ころが、ＤＮＡ合成装置での合成収率は合成しようとす
るオリゴヌクレオチドの長さが長いほど低下する。

しかも鎖長の短い副産物も増加するため、鋳型ＤＮＡと
して利用するためには目的のものを分離精製する必要が
ある。

またＤＮＡポリメラーゼによって長い領域を合成する場
合、何らかの障害により途中で合成が止まり、標識され
たオリゴヌクレオチドの長さに差が出てくることがある
。特に、非放射性標識物質を取り込ませる場合、標識物
質の側鎖等が酵素反応の妨げとなって、予定されたもの
より短い産物ができやすい。このことは単にハイブリダ
イゼーションの効率を低下させるのみならず、ハイブリ
ダイゼーション反応条件（温度、ホルムアミド含量等）
に影響を与え、ハイブリダイゼーション反応そのものが
うまく行かないことになりかねない。

更に、この方法では二本鎖のうち片方の鎖は鋳型として
のみ機能するだけで、標識され、ハイブリダイゼーショ
ン反応溶液中でプローブして働（のはプライマー側の一
本のみである。したがって全ＤＮＡのうち実際に利用さ
れるのは半分だけということになり、効率が悪い。さら
に、ハイブリダイゼーション反応の際に、この未標識の
鋳型ＤＮＡが標識されたプローブと拮抗し、検出感度の
低下をひきおこす可能性もある。

この問題は、プローブの長さに関係なくプライマー伸展
法で合成されたプローブすべてにあてはまるものであり
、高感度な検出を要求されるような系では、大量のプロ
ーブが必要とされ、さらに場合によっては標識のはいっ
ていない鋳型部分のみを回収する操作も必要となりうる
。

また、アニールで連結させる際、アニール部分が長い程
安定であるが、遺伝子病の検出等に用いられる短かいプ
ローブの場合にはアニール部分の全体に対して占める割
合が増し、標識される部分が減少し、プローブとしての
比活性が低いものとなる。

〔発明の目的〕

そこで、本発明は、二本鎖オリゴヌク１ノオチドを簡便
に形成できる方法であって、精度よくかつ合成収率も高
い形成方法を提供することを目的とする。

また、本発明は、精度よくかつ合成収率も高い標識され
た二本鎖オリゴヌクレオチドの形成方法であって、さら
に比活性の高いプローブとして働く標識二本鎖オリゴヌ
クレオチドを形成する方法を提供することを目的とする
。

〔目的を達するための手段及び作用〕

つまり、本発明は、 ａ）おのおののオリゴヌクレオチドの末端領域の一部が
互いに相補的な塩基配列部をもち、かつ該相補的な塩基
配列部は、一方のオリゴヌクレオチドと他方のオリゴヌ
クレオチドとで形成する水素結合数を１３以上とする塩
基配列部である少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを
合成する工程、 ｂ）前記一対のオリゴヌクレオチドを該相補的な塩基配
列部で結合させる工程、 Ｃ）おのおののオリゴヌクレオチドに核酸塩基を重合さ
せる工程とを有することを特徴とするオリゴヌクレオチ
ドの形成方法を提供するものである。

また、上記Ｃ）工程で標識を施した核酸塩基を用いた標
識二本鎖オリゴヌクレオチドの形成方法を提供するもの
である。

更に、上記工程で得られた、おのおののオリゴヌクレオ
チドの末端領域の一部が相補的な配列で結合した部分的
二本鎖オリゴヌクレオチドであって、かつ該相補的な配
列部の塩基の給水素結合数が１３個以上であり、おのお
のの非結合部は鋳型である部分的二本鎖オリゴヌクレオ
チドも提供する。

本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、プラ
イマー伸展法において、二本鎖のそれぞれの鎖が鋳型と
プライマーの両方を兼ね備えるように発明されたもので
ある。

本発明における鋳型及び、プライマーとは、合成された
二種類のオリゴヌクレオチドが相補的配列部で部分的二
本鎖を形成した場合に、非結合部である突き出た一本鎖
を鋳型といい、部分的二本鎖を構成するそれぞれの鎖の
うち、突き出た一本鎖と反対側の結合に関与している鎖
をプライマーという。

つまり、本発明を具体的に説明すると以下のようになる
。

（ａ）３’末端に一方のオリゴヌクレオチドと他方のオ
リゴヌクレオチドとで形成する水素結合を１３個以上と
する塩基配列部である相補的な塩基配列を持つ二本の一
本鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置によって合成
する。（ｂ）次に、アニーリング反応によりこれら二本
のオリゴヌクレオチドを相補的な部分で結合させ、部分
的に二本鎖を構成させる。（Ｃ）このとき形成された部
分的二本鎖が二本のそれぞれ合成されたＤＮＡのプライ
マーとして働（。異なるヌクレオチドトリフオスフェー
ド、及び該ヌクレオチドトリフオスフェードの重合のた
めの試薬によって、つきでた−本鎖部分を鋳型として５
′側から３′側方向に相補的な配列をもつオリゴヌクレ
オチドを合成しながら二本鎖を形成する。

より詳細に説明すると、（ａ）で合成されるオリゴヌク
レオチドの長さは、実際に必要な長さより短くて良い。

一対のオリゴヌクレオチドを形成した際の相補的な領域
の総水素結合数は１６〜２４個が好ましいが、１３個以
上、より好ましくは１６個以上であればそれより短（て
も、或は、長くてもかまわない。

（ｂ）アニーリング反応では、該二種類の一本鎖オリゴ
ヌクレオチド混合物を適当な緩衝液中で、６５度以上で
１分間以上、好ましくは６５度にて１０分間、或は、９
５度にて１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放冷
する。この反応により、該オリゴヌクレオチドは互いに
相補的な配列で結合し、部分的二本鎖を形成する。

（Ｃ）該溶液に合成試薬としてヌクレオチドトリフオス
フェードであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及び、
ＴＴＰを適当量加える。

また、重合試薬として用いられる酵素には、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　　ＤＮΔポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼのＫ
ｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、ｅｔ、ａｌ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　１０８゜Ｃ
ｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂａｒ　　Ｌａ−ｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）　、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓ、Ｔ
ａｂｏｒ　　ｅｔ、ａｌ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４゜４７６７
−４７７１　（１９８７）　、熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｒ，に、５ａｉｋｉ、ｅｔ。

ａｌ、　　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２３９．　４８７−４
９１（１９８８）　、他の入手可能なりＮＡポリメラー
ゼ類、逆転写酵素、及び他の酵素、例えば、各核酸の相
補的であるプライマー伸展生成物を形成するために適当
な態様でのヌクレオチドの結合を促進する酵素が含まれ
る。

また、重合反応温度は、アニールした部分の水素結合が
切れずに上記重合試薬のいずれかが働く温度であれば良
い。

例えば、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片を用い
て０〜４０℃で重合反応を行なう系が好ましい。

更に、オリゴヌクレオチドに標識を施した核酸塩基を重
合させる場合には該溶液に合成試薬としてヌクレオチド
トリフオスフェードであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、及び、ＴＴＰを適当量加え、このとき、一種類以上
の標識ヌクレオチドトリフオスフェードを加える。この
場合、該標識物質のみを加えてもよいし、未標識物質を
混在させてもよい。標識物質としては、放射性同位元素
はもちろんのこと、ビオチン或は、ジニトロフェニルヌ
クレオチド誘導体をはじめとする非放射性標識物質を使
用することができる。重合試薬として用いる酵素として
は前述の通りである。

また、該標識物質のかわりに固定化物質を用いることに
より機能性オリゴヌクレオチドを得ることができる。該
固定化物質は、重合試薬との併用により伸展反応でＤＮ
Ａハイブリッド形成体に導入されるヌクレオチドトリフ
オスフェードに担体と特異的親和性により結合する結合
基を有したヌクレオチドトリフオスフェード誘導体であ
り、具体的に上記ヌクレオチドトリフオスフェード誘導
体として、ビオチン、重金属誘導体、ホモポリヌクレオ
チド類等が使用される。

親和性ベアの部分は、他の成分（ｃ　ｏｍｐ　。

ｎｅｎｔ）に対する親和性を有する成分である。

たとえば、ビオチン−アビジンまたはストレプトアビジ
ン、重金属誘導体−チオ基ならびにポリｄＧ−ポリｄＣ
，ポリｄＡ−ポリｄＴおよびポリｄＡポリＵのような種
々のホモポリヌクレオチド類がそのような親和性ペアと
してあげられる。

上記担体は前記ヌクレオチドトリフオスフェード誘導体
と親和性により結合し、ヌクレオチドトリフオスフェー
ドとは結合しないもので、ヌクレオチドトリフオスフェ
ード誘導体と結合することによりハイブリッド形成体を
非ハイブリッド形成体より分離できる性質を有している
ものであればよい。重合試薬として用いる酵素としては
前述の通りである。

上記の形成方法で二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させ
ると、１００ｍｅｒ以上の長さのオリゴヌクレオチドか
ら成る二本鎖オリゴヌクレオチドが簡便に作成できるよ
うになる。

（１）従来のブライマー伸展法では、１００ｍｅｒ程度
の遺伝子を一度に精度良くかつ収率よく作成することは
、困難であった。なぜなら、そのためには、その長さの
鋳型ＤＮＡの合成が必要であり、また、ＤＮＡ合成装置
の合成限界が１００ｍａ　ｒ程度だからである。しかも
、１００ｍａｒを合成しようとすると、その合成収率は
、現状では１０％以下である。そのため、次反応の前に
所望の長さのもののみ精製し、副産物を除くことが必要
である。しかし、１塩基の違いもな（精度良く精製する
ことは非常に難しい。

これに対し、本発明の方法では、プローブの長さより短
い長さのオリゴヌクレオチドを合成するだけで十分であ
る。これにより、１００塩基対の遺伝子を作製する場合
、アニーリングの部分を８塩基対とすると、例えば、５
４塩基の長さのオリゴヌクレオチドを２本合成すれば良
いことになる。当然のことながら、１００塩基のオリゴ
ヌクレオチドを合成する場合に比べると５４塩基の場合
の方が、合成収率も良いし、副産物も少ない。

従って、精製も簡単である。

更に、本発明によれば、これまでほとんど不可能であっ
た１００ｍｅｒ以上の遺伝子の合成、例えば２００塩基
対の遺伝子の合成等が一度に行なえるようになる。合成
装置で一度に合成できる限界である１００ｍｅｒのオリ
ゴヌクレオチドを２本合成し、酵素による伸展反応を行
なえば、２００塩基対に近い長さの遺伝子が合成される
ことになる。

（２）重合試薬による反応においても、従来の方法の場
合には、酵素によって多数のヌクレオチドを重合させな
ければならなかった。ところが、酵素が伸展させうる長
さにもそれぞれ限界がある。その結果反応が途中で止ま
ってしまい短い遺伝子ができやすい。

本発明の場合には、酵素によって重合させるヌクレオチ
ドの長さが従来よりかなり短い。１００ｍｅｒの遺伝子
を作成する場合、従来法では９２塩基伸展させるのに対
し、４６塩基ずつ伸展させれば良い。９２塩基伸展させ
るのにくらべて、４６塩基伸展させる場合の方が、反応
が短時間に、より完全に進行する。このことにより、長
さの揃った二本鎖ＤＮＡが得られ、ベクターへの連結反
応効率、及び、トランスフォーメーション効率が大幅に
向上する。

さらに、二本鎖オリゴヌクレオチドが標識されている場
合、本発明の方法を用いると、以下のような効果がある
。

（３）重合試薬による反応においても、従来の方法の場
合には、酵素によって多数のヌクレオチドを重合させな
ければならなかった。ところが、酵素が伸展させつる長
さにもそれぞれ限界がある。放射性同位体を用いた標識
の場合でも、酵素反応生成物をゲル電気泳動で調べてみ
ると、所望のバンドよりも短い副産物が多数見られる。

従って、従来の方法の場合、所望の長さのＤＮＡのみゲ
ルから切り出して、それからＤＮＡを抽出してからプロ
ーブとして使用しなければならなかった。非放射性標識
の場合には、標識物質の構造が酵素反応を阻害し、その
結果反応が途中で止まってしまう場合も多い。しかも、
放射性同位体標識と異なり、検出には発色反応等を利用
しているため、ゲル電気泳動での精製はできず、精製が
困難である。

本発明の場合には、酵素によって重合させるヌクレオチ
ドの長さが従来よりかなり短い。５０ｍａｒのプローブ
を作成する場合、従来法では４２塩基伸展させるのに対
し、２１塩基ずつ伸展させればよい。４２塩基伸展させ
るのにくらべて、２１塩基伸展させる場合のほうが、反
応が短時間に、より完全に進行し、精製が不要である。

このことにより、精製の手間が省けただけでなく、非放
射性物質による長さの揃った標識オリゴヌクレオチドを
容易に得ることが可能になる。

さらに、その結果精製したオリゴヌクレオチドの二本鎖
は、両方の鎖に標識物質が取り込まれており、それぞれ
の鎖が比居性の高いプローブとして働き、ハイブリダイ
ゼーションの効率が高まる。

また、本発明により得られる標識二本鎖オリゴヌクレオ
チドの核酸配列遺伝子疾患、癌性疾患または伝染性疾患
と関連していると、解析に有効に利用できる。

以下に、実施例を挙げて具体的に説明する。

実施例１ ａ０合成オリゴヌクレオチドの作製 下記のような９種類のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成
装置（ＡＢＩ、３８１Ａ型）により合成した。（最終目
的物である２０ｍｅｒの二本鎖ＤＮＡが同一配列になる
様に設計した。）■　　５′ ■　　５′ ■　　５′ ■　　５′ ■　　５′ ■　　５′ ■　　５′ ３′ ＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣ３’ ＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴ３’ ＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧ３’ ＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴ３’ ＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴＴ３’ ＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡ３’ ＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴＴＴ ■ ５’　　ＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡ３
’ ■ ５’　　ＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡ３
’ このうち■と■、■と■、■と■、■と■、■と■、■
と■は３′末端がそれぞれ互いに相補的な配列であり、
■とのは互いに全てが相補的な配列である。

これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部について
、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミド電気泳動を
行いその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度で
あったので、それ以上の精製を行わずに以下の反応に用
いた。

エツペンドルフチューブに各オリゴヌクレオチド２ｕｇ
　（約１３０ｐｍｏｌｅ）に１０ｘアニリング溶液（１
００ｍＭＴｒ　１ｓ−ＨＣｆｐＨ８，０−６０ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２−６０ｍＭ　　β−メルカプトエタノール−
５００ｍＭＮａＣ１）を５μｌ加え、蒸留水にて５０μ
βに調整した。これを６５度の温水が入ったビーカー中
で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっ（り冷ま
した（所要時間　約１時間）。

この反応で■■と■、■Ｏと■、■■と■、■■と■、
■■と■、■■と■オリゴヌクレオチドは下記のように
総水素結合数１１〜１６で部分的二本鎖を形成する。

■（■と■）相補的部分の総水素結合数・１１５′３′ ＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣ ３ＴＴＡ　ＧＣＴＧＣＧＡＧＴＴ５′ ■ （■と■） 相補的部分の総水素結合数・ また■■と■は全てが相補的なので、 下記のよ うな二本鎖を形成する。

”ＡＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＴＧＣＧＡＧＴＴ５’■〜
■溶液５０μｌにＩｍＭ　　ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴ
Ｐ、及びｄＣＴＰをそれぞれ２μｌ。

１０ｘアニーリング溶液５μｌ、蒸留水３２μｌを加え
、よく混和したあとＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ
ｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ社製）１６単位を加え、３７度に
て１時間加温し、伸展反応を行った。

ｂ、評価 ■〜■の二本鎖ＤＮＡが計画通り作成されているか確認
するため、ａの反応溶液からフェノール抽出、エタノー
ル沈殿を行った後、Ｈ，０２０μｍに溶解して、■〜■
の二本鎖ＤＮＡの５′末端をｐ　３２で標識した。

１．５ｍｌ容のエツペンドルフチューブに、上記ａの生
成物２０μｌＳ混合試薬液（０，５Ｍ　　Ｔ　ｒ　ｉ　
ｓ　−ＨＣｌ　　ｐ　Ｈ７、６，０，１ＭＭ　ｇ　ＣＩ
　２　　５０　ｍ　Ｍジチオスレイトール、１ｍＭスペ
ルミジン）４μｌ、Ｃｒ　−”Ｐ：］　ＡＴＰ（１２５
ｕＣｉ、３．０ＯＯＣｉ／ｒｎｍｏ　１）１２．５μｌ
およびＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（１２単位°）
３μｌを加え、３０分間３７℃で反応させた（反応液の
総量３９．５μｌ）。反応後、２．５Ｍ酢酸アンモニウ
ム２００μｌを加え、反応を停止させた。

この反応生成物の中から、未反応の”Ｐ　−Ａ　ＴＰを
除去するために、反応溶液に９８％ホルムアミド−０，
０５％キシレンジアノ−ルーブロモフェノールブルー溶
液２０μｌを加えて、９０度で２分間加熱し、変性させ
てから、７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行った。１００ＯＶ、３時間の泳動後ゲルを
ガラス板からはずし、そのうえにＸ線フィルムをあてて
、約３０秒間放置した。このフィルムを現像したところ
、■と同位置に、■と■は同程度の強度ではっきりした
バンドを示すのに対し、■■は■の５０％程度の強度、
更に■、■については１０％程度のうすいバンドが観察
された。

以上のことから、相補的配列部の総水素結合数が少なく
とも１３個以上の時、本方法によって使用に耐え得る二
本鎖オリゴヌクレオチドが形成されることがわかった。

実施例２ 表１は相補的部分の塩基数とその総水素結合数の組み合
わせを示したものである。表１に示したＡ−Ｊについて
相補的部分の塩基配列を任意にかえて、各々５組（１０
種類）のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置（ＡＰＩ
、３８１Ａ型）により合成した。これらは実施例１と同
様に３′末端にそれぞれ互いに相補的な配列をもつもの
である。

これらの合成されたオリゴヌク１ノオチドの一部につい
て、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミド電気泳動
を行いその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度
であったので、それ以上の精製を行わずに以下の反応に
用いた。

エツペンドルフチューブに各オリゴヌクレオチド２ｕｇ
　（約１３０ｐｍｏｌｅ）に１０ｘアニリング溶液（１
００ｍＭＴｒ　１ｓ−ＨＣＡｐＨ８，０−６０ｍＭ　　
ＭｇＣｆｆ１．−６０ｍＭ　　β−メルカプトエタノー
ル−５００ｍＭＮａＣｆ）を５μ！加え、蒸留水にて５
０μｌに調整した。これを６５度の温水が入ったビーカ
ー中で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり
冷ました（所要時間　約１時間）。

この反応で二本のオリゴヌクレオチドは下記のような部
分的二本鎖を形成する。

５”　ＣＴＣＴＧ＾ＣＡＣ＾ＴＧＣＡＧＣＴＣＣＧＧＧ
　３１１１１ ３”ＧＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣ＾ＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧ
　５゜この溶液５０μ、ｆ’にＩｍＭ　　ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、及びｄ　ＣＴ　Ｐをそれぞれ２μｌ、０．４ｍ
Ｍビオチン化ＵＴＰ　（ＢＲＬ社製）を５μ１１１０ｘ
アニーリング溶液５μ１１蒸留水３２μｌを加え、よく
混和したあとＤＮＡポリメラーゼ■のＫ　１　ｅ　ｎ　
ｏ　ｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ社製）１６単位を加え、３７
度にて１時間加温し、伸展反応を行った。

その後、未反応のビオチン化ＵＴＰを除去するために、
反応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉ。

ｇｅｌ　　Ｐ２；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製０．５Ｘ５ｃｍ、
）で精製した。目的の標識ヌクレオチドはほとんどカラ
ムを素通りした分画に回収された。

各フラクションを０．５ｍｌずつ収集し、それぞれ２μ
！をニトロセルロースフィルターに吸着させ、ＢＲＬ社
のプロトコールに従って発色反応を行った。その結果に
ついて、２番めのフラクションが強く発色したものを２
点、弱く発色したものを１点、全く発色しなかったもの
を０点と点数化し、（５組のオリゴヌクレオチドの総得
点）／１０×１００〔％〕として表２に示した。

尚、２番めのフラクションが強く発色したものは、これ
らのオリゴヌクレオチドがビオチンによって標識されて
いることを示している。

以上の結果より、相補的な配列部の総水素結合数が１３
個以上の安定な配列であれば、本方法によって使用に耐
え得るオリゴヌクレオチドが形成できることがわかった
。

更に、相補的な配列部の総水素結合数が１３〜１５個の
場合には、該相補的配列部の塩基配列によりオリゴヌク
レオチドが形成されるものとそうでないものが存在する
ので、汎用的には１６個以上が望ましいといえる。

表 １ 表 実施例３ さらに表３に示したに−Ｒについて、各々３組（６種類
）の下記のようなオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置
（Ａｐｐｌｉｄ　　Ｂｉｏｓｙｓ−ｔ　ｅｍｓ社　３８
１Ａ型）により合成した。表３は、塩基数とその総水素
結合数の組み合わせを示したものである。

Ｋ−１５’ＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣ
ＧＧ３’ ５’　　ＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＧ
ＧＧ３’ に−２ ５’　　ＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣ
Ｇ３’ ５’　　ＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＧＧ
ＧＣ３’ に−３ ５′ ＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣ ＴＣＧＣＣＧ３’ ５′ ＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴ ＣＴＣＧＧＣＧ３’ −１ ５′ Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　ＣＣＡ、Ｇ　Ｇ　Ａ　Ａ　ＣＣＧＴＡ
ＡＡＡ３’ ５′ ＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧ ＣＣＴＴＴＴＡＣ３’ −２ ５′ Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　ＣＣＡ　Ｇ　Ｇ　Ａ、Ａ　ＣＣＡ　Ｇ
　ＴＡＴＴ３’ ５′ Ａ　Ａ　ＣＧ　ＣＣＡ　Ｇ　ＣＡ　Ａ　ＣＧ　ＣＧ　Ｇ
ＣＣＡＡＴＡＣＴ３’ −３ ５′ ＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＡＡＧ ＴＡＡ３’ ５’　　ＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧＣＣＴＴＡ
ＣＴＴ３’ ５’　　ＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧ
ＴＴＴＴ３’ ５’　　ＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡ
Ａ　ＣＣ３’ −２ ５’　　ＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＡＴ
ＧＧＴＡ３’ ５’　　ＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＴＡＣ
ＣＡＴ３’ ５’　　ＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＴＣ
ＡＧＴＴ３′ ５′ ＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧ ５’　　ＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧ
ＴＧＡ３’ ５′　ＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴＴ
ＴＣＡＣＡＣ３’ ５’　　ＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＧＣＧＴＡＧ
ＣＧＴ３’ ５’　　ＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴ
ＴＡＣＧＣＴＡ３’ ５’　　ＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＧＣＧＣＴＡ
ＧＡＣ３’ ５’　　ＣＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴ
ＴＧＴＣＴＡＧ３′ ○−１ ５′ ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣ ５’　　ＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧ
ＡＴＣＣＣＣ３’ ○ ５’　　ＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＣ
ＡＴＣ３’ ５’　　ＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡ　Ｇ　Ａ
　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　ＣＣ３’５’　　ＡＡＴＴ
ＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＧＴＴＧＣ３’ ５′　ＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡ　Ｇ　Ａ　
Ｇ　Ｇ　Ｇ　ＣＡ　Ａ　ＣＧ　３　′５　’　　Ｔ　Ｇ
　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｇ　ＣＴ　Ａ　Ａ　ＣＴ　ＣＡ
ＣＡ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　３　’ＧＧＧＣＡＧＴ
ＧＡＧＣＧＣＡＡＣ −２ ５’　　ＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＴＡＴＴ
ＴＴＴ　３’ ５′　ＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＡＡ
ＡＴＡ３’ ５’　　ＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ
ＴＡＴ３’ ５’　　ＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＴＡ
ＴＡＴＡ３’ ５’　　ＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣ
ＡＡＡＡＡＴＣ３’ ５’　　ＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＧ
ＴＣＧＡＴＴＴＴＴ３’ −２ ５’　　ＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣ
ＴＡＴＧＴＡＴ３’ ５’　　ＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＧ
ＴＣＡＴＡＣＡＴＡ３’ −３ ５’　　ＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣ
ＴＴＡＡＣＴＴ３’ ５’　　ＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＧ
ＴＣＡＡＧＴＴＡＡ３’ −１ ５’　　ＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡ
ＡＧ３’ ５’　　ＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡ
ＣＴＴＴＡＴＧ３’ −２ ５’　　ＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＴ
ＡＣ３’ ５’　　ＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡ
ＧＴＡＴＣＴＴ３’ −３ ５’　　ＡＣＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡ、ＡＧＴＧＡＴ
ＣＴＴ３’ ５’　　ＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡ
ＡＡＧＡＴＣＡ３’ このうち３′末端の下線部がそれぞれ互いに相補的な配
列である。

これらの合成されたオリゴヌク１／オチドの一部につい
て、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミド電気泳動
を行いその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度
であったので、それ以上の精製を行わずに以下の反応に
用いた。

エツペンドルフチューブに各オリゴヌクレオチド２ｕｇ
　（約１３０ｐｍｏｌｅ）に１０ｘアニリング溶液（１
００ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣＡｐＨ８，０−６０ｍＭ　
　ＭｇＣｊ７．−６０ｍＭ　　β−メルカプトエタノー
ル−５００ｍＭＮａＣ１）を５μ！加え、蒸留水にて５
０μ！に調整した。これを６５度の温水が入ったビーカ
ー中で１０分間加温し、その後室温になるまでゆっくり
冷ました（所要時間　約１時間）。

この反応で２本のオリゴヌクレオチドは下記のような部
分的二本鎖を形成する。

Ｓ’　ＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧ
　３’１１１１ ３’ＧＧＧＣＣτＣＴＧＣＣＡＧτＧＴＣＧ＾＾ＣＡＧ
　Ｓ”この溶液５０ｕｌ！にＩｍＭ　　ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、及びｄＣＴＰをそれぞれ２μｊ？ｓ０．４ｍＭビ
オチン化ＵＴＰ　（ＢＲＬ社製）を５μ１１１０ｘアニ
ーリング溶液５μｌ、蒸留水３２μｌを加え、よく混和
したあとＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（Ｔ
ＯＹＯＢＯ社製）１６単位を加え、３７度にて１時間加
温し、伸展反応を行った。

その後、未反応のビオチン化ＵＴＰを除去するために、
反応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−ｇｅｌ　　Ｐ２；
Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製０．５Ｘ５ｃｍ）で精製した。目的
の標識ヌクレオチドはほとんどカラムを素通りした分画
に回収された。

各フラクションを０．５ｍｊＪずつ収集し、それぞれ２
μｌをニトロセルロースフィルターに吸着させ、ＢＲＬ
社のプロトコールに従って発色反応を行った。その結果
を表４に示した。表４においてＯ印を付けたオリゴヌク
レオチドでは、２番目のフラクションが強く発色し、こ
れらのオリゴヌクレオチドがビオチンによって標識され
ていることが確認できた。

以上の結果より、相補的な配列部の総水素結合数が１３
個以上の安定な配列であれば本方法によってオリゴヌク
レオチドが形成できることがわかった。

更に、相補的な配列部の総水素結合数が１３〜１５個の
場合には、該相補的配列部の塩基配列によりオリゴヌク
レオチドが形成されるものとそうでないものが存在する
ので、汎用的には１６個以上が望ましいといえる。

〔発明の効果〕

上記実施例から明らかなように、本発明により、合成収
率も良いし、副産物も少ない。従って、精製も簡単な方
法が得られた。

さらに２００塩基対に近い長さの遺伝子が一度に合成で
きる方法が得られた。

また本発明により得られた標識二本鎖オリゴヌクレオチ
ドは、アニール部分が短かく、また両方の鎖に標識物質
が取り込まれるので、それぞれの鎖について比活性が向
上した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ａ）おのおののオリゴヌクレオチドの末端領域の
   一部が互いに相補的な塩基配列部をもち、 かつ該相補的な塩基配列部は、一方のオリゴヌクレオチ
   ドとで他方のオリゴヌクレオチドとで形成する水素結合
   数を１３以上とする塩基配列部である少なくとも一対の
   オリゴヌクレオチドを合成する工程、 ｂ）前記一対のオリゴヌクレオチドを該相補的な塩基配
   列部で結合させる工程、 ｃ）おのおののオリゴヌクレオチドに核酸塩基を重合さ
   せる工程とを有することを特徴とするオリゴヌクレオチ
   ドの形成方法。 （２）前記ｃ）工程でヌクレオチドトリフオスフェード
   と重合試薬を使用する請求項１記載のオリゴヌクレオチ
   ドの形成方法。 （３）前記ｃ）工程の重合反応温度が４０℃以下である
   請求項２記載のオリゴヌクレオチドの形成方法。 （４）該重合試薬がＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ、
   Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片
   、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、
   熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素である
   請求項２記載のオリゴヌクレオチドの形成方法。 （５）前記ｃ）工程で用いる核酸塩基が標識を施したも
   のであることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレ
   オチドの形成方法。 （６）該標識ヌクレオチドが放射性同位元素、ビオチン
   誘導体、ジニトロフェニル誘導体により標識されている
   ことを特徴とする請求項５記載のオリゴヌクレオチドの
   形成方法。（７）ｄ）さらにｃ）の工程を経て得られた
   オリゴヌクレオチドを１本鎖に分離する工程とを有する
   ことを請求項１のオリゴヌクレオチドの形成方法。 （８）ｄ）さらにｃ）の工程を経て得られたオリゴヌク
   レオチドを１本鎖に分離する工程とを有することを特徴
   とする請求項５のオリゴヌクレオチドの形成方法。 （９）ａ）おのおののオリゴヌクレオチドの末端領域の
   一部が互いに相補的な塩基配列部をもち、かつ該相補的
   な塩基配列部は、一方のオリゴヌクレオチドと他方のオ
   リゴヌクレオチドとで形成する水素結合数を１３以上と
   する塩基配列部である少なくとも一対のオリゴヌクレオ
   チドを合成する工程、 ｂ）前記一対のオリゴヌクレオチドを該相補的な塩基配
   列部で結合させる工程、 ｃ）おのおののオリゴヌクレオチドに核酸塩基を重合さ
   せる工程 ｄ）さらにｃ）の工程を経て得られた２本鎖オリゴヌク
   レオチドを１本鎖に分離する工程とを有することを特徴
   とする核酸プローブの形成方法。 （１０）おのおののオリゴヌクレオチドの末端領域の一
   部が相補的な配列で結合した部分的二本鎖オリゴヌクレ
   オチドであって、かつ該相補的な配列部の塩基の総水素
   結合数が１３個以上であり、おのおのの非結合部で鋳型
   ある部分的二本鎖オリゴヌクレオチド。