JPH03127999A - オリゴヌクレオチドの形成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はオリゴヌクレオチドの形成方法に関する。

特に、本発明はオリゴヌクレオチドに捕捉機能を付加す
る方法に関する。さらに、本発明は相補的核酸配列を含
有する核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて遺
伝子のごとき核酸配列の存在を検出するための手段に関
する。

〔従来の技術〕

ハイブリダイゼーション反応において、標識（ｌａｂｅ
ｌ）されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド
、すなわちプローブは標的核酸と塩基対を形成しうる。

核酸の検出に際しては、種々のハイブリダイゼーション
峡が用いられてきた。直接的ハイブリダイゼーション法
では、検体（ｓｐｅｃｉｍｅｎ）は溶液中または固体担
体に固定されている。同定されるべき核酸は、１つの標
識されたプローブを用いて証明（ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔ
ｅ）されている。

米国、特許第４４８６５３９号明細書に、サンドイッチ
ハイブリダイゼーション法が記載されている。この方法
では、２つの別個のプローブが用いられている。１つは
標識され検出に用いられる検出プローブであり、他の１
つは反応混合物から標的核酸を分離するために固体担体
に固定化された捕捉プローブである。

このような従来のフィルターを支持体とした核酸のハイ
ブリッド形成分析では、検体試料中の核酸の固定、プレ
ハイブリダイゼーション、標識プローブとのハイブリッ
ド形成、洗浄、検出という一連の操作を必要とするので
時間がかかり、例えば臨床実験で日常的に用いるのには
適さないという問題を有する。

特に核酸の固定化における焼き付け、プレハイブリダイ
ゼーション、洗浄という操作は煩雑で、分析に要する時
間を長くする原因となっている。［Ｌｉｎ　　ｅｔ　　
ａｌ、＋　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ、Ｖｏｌ、５５．　５０９ページ（１９８５）］。

また、フィルター上でのハイブリッド形成は、固相の一
本鎖核酸と液相の標識プローブとの反応が溶液中で不均
一な状態で実施されるため、ハイブリッドの形成速度が
遅いという問題を有する。しかもハイブリッド形成効率
は極めて低く、通常、添加された標識プローブのうち計
算上期待される値の数％がハイブリッド形成に利用され
るにすぎない。

さらに、フィルターを支持体とした核酸のハイブリッド
形成分析は、感度や精度が低いという問題もある。

以上の点から最近では溶液中でのハイブリダイゼーショ
ンが注目されている。

溶液中でのハイブリダイゼーション法は、英国特許出願
公開第２１６９４０３号明細書に記載されている。この
方法においては、同一液相中に共存する２つの異なるプ
ローブが用いられている。検出プローブには検出されう
る標識が標識されており、捕捉プローブには他の部分（
ｍｏｉｅｔｙ）に対して親和性を有する部分が付着され
ている。ハイブリダイゼーション後、捕捉プローブ、標
的核酸および検出プローブの間で形成されたハイブリッ
ド（ｈｙｂｒｉｄ）は、親和性ペア（ｐａｉｒ）の他の
部分によってハイブリダイゼーション溶液から分離され
つる。

溶液中でハイブリダイゼーション反応を行った場合、検
出物を何らかの形で分離・固定することが必要である。

一般的には次の２つの方法が知られている。

■５’、３’未満を化学的に修飾し、捕捉用物質をとり
込ませる。例えば特開昭６３−２４３８７５号にあるよ
うにＴ　ｅ　ｒ　ｍ　ｉ　ｎ　ａ　ｌ　　Ｄ　ｅ　ｏ　
ｘ　ｙ　ｎ　ｎ　ｃ　Ｉ　ｅ　ｏ　ｔ　ｉ　ｄ　ｙ　＋
Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを用いて捕捉物質を３′側に結
合させていく方法である。

また■有機溶媒を用いて核酸全体を固定する方法、これ
は、特開昭５９−１２２４９９号などに詳しＬ）。

〔本発明が解決しようとしている課題〕ハイブリダイゼ
ーション反応では、先ず最初に、プローブと標的ＤＮＡ
が水素結合によりハイブリッドを形成するようにある一
定の温度で反応させる。

このとき、温度が高すぎると、プローブと相補的配列を
もつＤＮＡとが結合できず、逆に低すぎると、プローブ
が非特異的にＤＮＡに結合してしまう。また、反応溶液
中にホルムアミドを加えると、非特異的ハイブリッドの
形成が妨げられる。

次にハイブリダイゼーション反応以後、溶液の塩濃度を
下げて、或はまた、溶液の温度を上げて、非特異的に結
合したプローブを洗い流す。これらの操作により、プロ
ーブと相補的な配列をもつＤＮＡ断片のみが検出される
ことになる。

長いプローブ（１０００塩基対）の場合には、これらの
条件はほぼ確立されているが、合成オリゴヌクレオチド
を用いた場合の条件設定はなかなか難しい。現在オリゴ
ヌクレオチドプローブとしてよく利用されているのは３
０　ｍ　ｅ　ｒ以下のものであるが、このような短いプ
ローブの場合、それが所望のＤＮＡとのハイブリッドが
確実に形成されるようにハイブリダイゼーションの反応
条件を緩める。つまり、温度を低くする、或はまた、ホ
ルムアミド含量を少なくする等の条件の設定が必要にな
る。また反応以後の洗いについても本来のハイブリッド
形成を壊さず、プローブの非特異的結合を除去する条件
を選択しなければならないことになるが、この条件設定
は試行錯誤が必要となる。

この問題を解決するために、オリゴヌクレオチドプロー
ブを二種類用意し、第一のプローブでスクリーニングし
たあと、第二のプローブで再びスクリーニングする方法
がよ（とられている。しかし、この方法は、手間がかか
り時間を要する。

それよりも、より長いプローブを用い、ハイブリダイゼ
ーションの条件、及び、洗いの条件を厳しくして、非特
異的ハイブリッドを完全に除去するほうが好ましい。

つまり、一般に捕捉プローブとして利用されるＤＮＡオ
リゴヌクレオチドの長さが長ければ長いほど、ハイブリ
ダイゼーション時の相補的結合の誤りが防げる。しかし
、従来の２法（前述の■及び■の方法）では、いずれも
必要とするＤＮＡ全体を合成する必要がある。

一方、ＤＮＡ合成装置での合成収率は合成しようとする
オリゴヌクレオチドの長さが長いほど低下する問題があ
る。これに加え、５′或は３′末端に化学修飾物を施し
て結合させる方法は以下の問題点を有する。

修飾される部位が１か所または２か所程度に限定される
ため、十分な保持力が得られに＜＜、保持力の高いプロ
ーブを得ることは困難である。

また、捕捉用の核酸が長い場合その核酸中に相補的配列
が存在する確率が高まりハイブリダイゼーション反応中
にそれ自身が高次構造を形成して捕捉の機能を果たさな
くなりハイブリッド形成の効率が著しく減少する。

有機溶媒を用いて核酸全体を担持させる方法では、上記
のような捕捉用核酸自身が高次構造を取ることは避けら
れるが、核酸全体の特性を変えずに核酸を固定化する条
件を捜し出すには時間がかかり実用的ではない。

本発明の目的はこのような従来の捕捉用プローブの欠点
を解消する捕捉用プローブとして用いるオリゴヌクレオ
チド作製方法及び該オリゴヌクレオチドを提供すること
である。

〔課題を解決するための手段及び作用〕そこで本発明は
、 ａ）おのおののオリゴヌクレオチドの末端領域の一部が
互いに相補的な配列部をもつ少なくとも一対のオリゴヌ
クレオチドを合成する工程、 ｂ）前記一対のオリゴヌクレオチドを該相補的な配列部
で結合させる工程、 Ｃ）いずれか一方もしくは双方のオリゴヌクレオチドに
担体と特異的に反応する固定化物質を有する核酸塩基を
重合させる工程、 ｄ）さらにＣ）の工程を経て得られたオリゴヌクレオチ
ドを１木枯に分離する工程とを有することを特徴とする
オリゴヌクレオチドの形成方法を提供するものである。

また、本発明は、 ｅ）おのおのの３′末端領域で互いに相補的な配列部を
もつ第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオ
チドを合成する工程及び前記第一又は第二のオリゴヌク
レオチドの５′末端領域と相補的な配列部をもつ５′末
端領域を有する第三のオリゴヌクレオチドを合成する工
程、 ｆ）前記第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌク
レオチドを該相補的な配列部で結合させる工程、及び前
記第一のオリゴヌクレオチド又は第二のオリゴヌクレオ
チドのいずれかと第三のオリゴヌクレオチドを該相補的
な配列部で結合させる工程、 ｇ）前記ｅ）とｆ）の工程を経て得られたオリゴヌクレ
オチドに担体と特異的に反応する固定化物質を有する核
酸塩基を重合・連結させる工程、 ｈ）さらにｇ）の工程を経て得られたオリゴヌクレオチ
ドを一本鎖に分離する工程を有することを特徴とするオ
リゴヌクレオチドの形成方法を提供するものである。

つまり、本発明はブライマー伸展法において、二本鎖の
それぞれの鎖が鋳型とブライマーの両方を兼ね備えるよ
うに発明されたものである。

本発明における鋳型及び、プライマーとは、合成された
二種類のオリゴヌクレオチドが相補的配列で部分的二本
鎖を形成した場合に、非結合部である突き出た一本鎖を
鋳型といい、部分的二本鎖を構成するそれぞれの鎖のう
ち、突き出た一本鎖と反対側の結合に関与している鎖を
プライマーという。

つまり、本発明を具体的に説明すると以、下のようにな
る。

（ａ）　３’末端に６塩基対以上の相補的な配列を持つ
二本の一本鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置によ
って合成する。（ｂ）次に、アニーリング反応によりこ
れら二本のオリゴヌクレオチドを相補的な部分で結合さ
せ、部分的に二本鎖を構成させる。（Ｃ）このとき形成
された部分的二本鎖が二本のそれぞれ合成されたＤＮＡ
のブライマーとして働く。異なるヌクレオチドトリフオ
スフェート並びに固定化物質であるヌクレオチドトリフ
オスフェート誘導体、及び該ヌクレオチドトリフオスフ
ェートとヌクレオチドトリフオスフェート誘導体の重合
のための試薬によって、つきでた−本鎖部分を鋳型とし
て、５′側から３′側方向に相補的な配列をもつオリゴ
ヌクレオチドを合成しながら二本鎖を形成する。その際
、固定化物質は一対のオリゴヌクレオチドのいずれか一
方もしくは双方に導入されるが、おのおのに導入された
方が担体と反応しやすいという点で収率的に高いオリゴ
ヌクレオチドが形成できる。（ｄ）、　　（Ｃ）工程で
得られた二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖に分離する
。

より詳細に説明すると、（ａ）で合成されるオリゴヌク
レオチドの長さは、実際に必要な長さより短かくて良い
。相補的な領域の長さは６から８塩基対が好ましいが、
それより短かくても、或は、長くてもかまわない。

（ｂ）アニーリング反応では、該二種類の一本鎖オリゴ
ヌクレオチド混合物を適当な緩衝液中で、６５度以上で
１分間以上、好ましくは６５度にて１０分間、或は、９
５度にて１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放冷
する。この反応により、該オリゴヌクレオチドは互いに
相補的な配列で結合し、部分的二本鎖を形成する。

（ｃ）該溶液に合成試薬としてヌクレオチドトリフオス
フェートであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。

及び、ＴＴＰを適当量加える。

このとき、一種類以上の固定化物質を加える。

本発明でいう固定化物質は、重合試薬との併用により伸
展反応でＤＮＡハイブリッド形成体に導入されるヌクレ
オチドトリフオスフェートに担体と特異的親和性により
結合する結合基を有したヌクレオチドトリフオスフェー
ト誘導体であり、具体的に上記ヌクレオチドトリフオス
フェート誘導体として、ビオチン、重金属誘導体、ホモ
ポリヌクレオチド類等が使用される。

親和性ペアの部分は、他の成分（（ｏｍｐｏｎｅｎｔ）
に対する親和性を有する成分である。たとえば、ビオチ
ン−アビジンまたはストレプトアビジン、重金属誘導体
−チオ基ならびにポリｄＧ−ポリｄＣ。

ポリｄＡ−ポリｄＴおよびポリｄＡ−ポリＵのような種
々のホモポリヌクレオチド類がそのような親和性ペアと
してあげられる。

上記担体は、前記ヌクレオチドトリフオスフェート誘導
体と親和性により結合し、ヌクレオチドトリフオスフェ
ートとは結合しないもので、ヌクレオチドトリフオスフ
ェート誘導体と結合することによりハイブリッド形成体
を非ハイブリッド形成体より分離できる性質を有してい
るものであればよい。

また、重合試薬として用いる酵素には、Ｅ、　ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼ■、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎ
ｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ　、　　Ｍ　ａ
　ｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ　。

ｅｔ、ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　
　１０８．　　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂａｒ
　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｓ、　Ｔａｂｏｒ　ｅｔ、　ａｌ、　　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４．４７６７−４７７１
　　（１９８７）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ，
Ｋ、　５ａｉｋｉ、　ｅｔ。

ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９．４８７−４９１　（
１９８８）、他の入手可能なりＮＡポリメラーゼ類、逆
転写酵素、及び他の酵素、例えば、各核酸の相補的であ
るブライマー伸展生成物を形成するために適当な態様で
のヌクレオチドの結合を促進する酵素が含まれる。

上記の形成方法で二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させ
ると、ｌｏｏｍｅｒ以上の長さのオリゴヌクレオチドか
ら成る二本鎖オリゴヌクレオチドが簡便に作成できるよ
うになる。

ｄ）二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖に分離すること
により固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチドが作
成出来る。該固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチ
ドをプローブ核酸として試料核酸とハイブリッドさせる
と、前記固定化物質を担体に結合させることで、該ハイ
ブリッド形成体を非ハイブリッド形成体より効率よく、
分別させることができる。

つまり、本発明のオリゴヌクレオチドは簡便な方法で作
成した捕捉用プローブであるといえる。

また別な方法で得たオリゴヌクレオチドを以下に説明す
る。

所望の核酸塩基配列に対し、（■）第１図のように３′
末端、或はまた５′末端に６塩基対以上の相補的な配列
を持つ複数個の１本鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合戊
合成によって合成する。（■）次に、各オリゴヌクレオ
チドの５′末端にリン酸基を付ける。（■）次に、アニ
ーリング反応によりこれら２本のオリゴヌクレオチドを
相補的な部分で結合させ、部分的に２本鎖を構成させる
。（■）このとき形成された部分的２本鎖の１本が他方
の合成されたオリゴヌクレオチドのプライマーとして働
く。種類の異なるヌクレオチドトリフオスフェート並び
に固定化物質であるヌクレオチドトリフオスフェート誘
導体、及び該ヌクレオチドトリフォスフェートとヌクレ
オチドトリフオスフェート誘導体の重合のための試薬に
よって、つきでた１本鎖部分を鋳型として、５′側から
３′側方向に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドを
合成しながら２本鎖を形成する。（■）このようにして
作製されたオリゴヌクレオチドにニック（切れ目）が入
っている場合には、酵素等により切れ目がないように連
結してもよい。（■）２本鎖を分離して１本鎖のオリゴ
ヌクレオチドを形成する。

より詳細に説明すると、 （■）で合成されるオリゴヌクレオチドの長さは、ＤＮ
Ａ合成装置で１度の合成できる長さ（通常１００ｍｅｒ
以下）である。各オリゴヌクレオチドにおける相補的な
領域の長さは６から８塩基対が好ましいが、それより短
くても、或は、長くても構わない。

（■）５′末端にリン酸基を付ける方法は化学的合成に
よっても、ＡＴＰ存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ等酵素による方法でも良い。

少なくとも該操作により、オリゴヌクレオチドの末端に
リン酸基を付けておけば、上記（■）の工程で核酸塩基
を重合させていった時、重合試薬の選択のし方によって
は、重合時に自然に重合された核酸塩基とリン酸基の付
いたオリゴヌクレオチドの末端部で連結が行われること
がある。しかし、それだけでは連結が不充分である場合
には、以下（■）でのべるように連結試薬を用いて連結
させる。

（■）アニーリング反応では、該複数個の１本鎖オリゴ
ヌクレオチド混合物を適当な緩衝液中で、６５度以上で
１分間以上、好ましくは６５度にて１０分間、或いは、
９５度にて１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放
冷する。この反応により、該オリゴヌクレオチドは互い
に相補的な配列で結合し、部分的２本鎖を形成する。

（■）該溶液に合成試薬としてヌクレオチドトリフオス
フェートであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴ
Ｐを適当量加える。

このとき、一種以上の固定化物質を加える。固定化物質
並びに重合試薬として用いる酵素に関する説明は前述の
通りである。

（■）の反応は、ＤＮＡリガーゼによって行なわれる。

ＤＮＡリガーゼは、Ｅ、ｃｏｌｉ由来のものでもファー
ジＴ４由来のものでも良いし、或は、同じ様な働きをす
る他の酵素でも良い。

以上により、２本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。

■ （−ｅ−）変性は熱変性（例えば、９５度にて５分）で
も、アルカリによる方法でも、二本鎖を一本鎖に分離す
る方法であれば他の方法でも良い。

上記の各方法により得られたオリゴヌクレオチド核酸配
列が遺伝子疾患、癌性疾患または伝染性疾患と関連して
いると、解析に有効に利用できる。

以下、実施例を挙げて具体的に説明する。

Ｊニノ 実施例１ （捕捉プローブ） プラスミドｐＵｃ１９の塩基配列の一部に対応する下記
のような二種類のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置
（Ａｐｐｌｉｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８１Ａ型
）によ社会８１Ａ型 ５　’　ＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧ
ＣＧＣＡＧ　３’５’　ＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧ
ＧＣＴＧＣＧＣＡＡ３’このうちの３′末端から８塩基
がそれぞれ互いに相補的な配列をもつ。

これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部について
、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミド電気泳動を
行ないその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度
であったので、それ以上の精製を行わずに以下の反応に
用いた。

エツペンドルフチューブに各オリゴヌクレオチド　２ｕ
ｇ　（約１３０ｐｍｏｌｅ）にＩＯＸアニーリング溶液
（ｌ　ＯＯｍ　Ｍ　　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｊ！　　
ｐ　Ｈ８、Ｏ−６０ｍ　ｌ’ｖ１ＭｇＣｉ　２−６０ｍ
Ｍ　β−メルカプトエタノール−５００ｍＭＮａＣｊり
を５μｌ加え、蒸留水にて５０μｌに調整した。これを
６５度の温水が入ったビーカー中で１゜分間加温し、そ
の後室温になるまでゆっくり冷ました（所要時間約１時
間）。この反応で二本のオリゴヌクレオチドは下図のよ
うな部分的二本鎖を形成する。

５　’　ＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧ
ＣＧＣＡＧ　３　’３’　ＡＡＣＧＣＧＴＣＧＧＡＣＴ
ＴＡＣＣＧＣＴＴＡＣ５この溶液５０　μＡに１　ｍ　
Ｍ　　ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　、　　ｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐ及びｄＣ
ＴＰをそれぞれ２　μｊ７　、０．４ｍＭビオチン化Ｕ
ＴＰ（ＢＲＬ社製）を５μｆ、ＩＯＸアニーリング溶液
５μｌ、蒸留水３２μｌを加え、よく混和したあとＤＮ
ＡポリメラーゼＩのＫ　ｌ　ｅ　ｎ　ｏ　ｗ断片（ＴＯ
ＹＯＢＯ社製）１６単位を加え、３７度にて１時間加温
し、伸展反応を行なった。

その後、未反応のビオチン化ＵＴＰを除去するために、
反応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−ｇｅｌ　　ｐ２　
；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製　０．５Ｘ５ｃｍ）で精製した。

目的のヌクレオチドはほとんどカラムを素通りした分画
に回収された。

各フラクションを０　、５　ｍ　Ｒずつ収集し、それぞ
れ２μｌをニトロセルロースフィルターに吸着させ、Ｂ
ＲＬ社のプロトコールに従って発色反応を行ったところ
、２番目のフラクションが強く発色し、目的のオリゴヌ
クレオチドにビオチンが導入されていることが確認でき
た。

そこで、このフラクションを捕捉プローブ溶液とした。

（検出を行う核酸の調整） 一方、検出を行う核酸としてｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１９
及びその混合物の３種を用意した。

以後簡便のため、ｐＢＲ３２２を試料Ａ、ｐＵｃ１９を
試料Ｂ１及びｐＢＲ３２２，ｐＵｃＩ９混合物を試料Ｃ
と呼ぶことにする。

試料Ａ、　Ｂ、　Ｃをそれぞれ同様の手順で調製を行う
が、例として試料Ａについてのみ以下に説明を行う。試
料に標識を施した。

２、Ｏｉｌｌ　１０倍ＴＡバ’７７７＋、１６．０μＡ
Ｈ，、○にｌμｇ／２μｌ試料ＤＮＡを加えた反応溶液
に１０ｕｎｉｔのＨ４ｎｄ　ｍを加え３７°Ｃ，２時間
で完全分解した。これに２，０ｕｎｉｔＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼを加え２２°Ｃ１６０分反応させた。反応液に
２　ｍ　Ｍ　　ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　。

ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰを各３．０　μｊ７加え、さらに
ｐ３２ＴＴＰ３０μＣｉを加え３７°Ｃ，４０分反応を
行った。

反応の停止は１００　ｍ　Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　Ｉ　
Ｏμｌで行った。

前記プローブ溶液４５μｌづつ、Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれの
溶液に加え、これに蒸留水を加え１５０μＥとする。

そののち、反応混合液を５０°Ｃで１時間インキュベー
ションし、ハイブリダイゼーション反応を行わせた。ハ
イブリダイゼーション反応後、ＩＭＮａ（Ｊ’。

２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）及び１ｍＭＥ
ＤＴＡでの２５ｗ／ｖ％ストレプトアビジンーアガロー
ス懸濁液２００μｌを加えた。

回転ミキサー中に１５分間３７°Ｃでビオチン化分子と
ストレプトアビジン−アガロースとが結合するように放
置した。アガロースを短時間の遠心分離により集め、上
澄液を吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）により除去した。

ついで、アガロースを前記緩衝化ＬＭ　　ＮａＣｌ！中
で１度および１５０ｍＭ　　ＮａＣ１，１５ｍＭクエン
酸ナトリウム（ｐＨ８）および０．２％ＳＤＳを含む溶
液中で２度３７°Ｃで洗浄した。

洗浄後沈殿物の放射活性をシンチレーンヨンカウンター
で数度測定したところｐＵｃ１９を含む生物学的試料は
１０６〜１０’ｃｐｍの値を示したのに対し、ｐＢＲ３
２２のみの試料におけるその値はバックグランドの２倍
に満たなかった。

以上より本方法による捕捉プローブが十分機能している
ことが確認できた。

実施例２ プラスミドｐＵｃ１９の塩基配列の一部に対応する下記
のような四種類のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置
（Ａｐｐｌｉｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８１Ａ型
）によ社会８１Ａ型 ５’　　ＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＧ
ＣＧＡＡＧＡＧＧ３’５’　　ＧＧＧＣＧＡ　　　　　
　　　　　　　　　　３’このうちの３′末端、或はま
た、５′末端から８塩基がそれぞれ互いに相補的な配列
をもつ。

これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部について
、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行いその純度を調べた。その結果、９５％以上の純
度であったので、それ以上の精製を行わずに以下の反応
に用いた。

各オリゴヌクレオチド２ｇ（約１３０　ｐ　ｍ　ｏ　ｌ
　ｅ　）をエツベンドルフチューブに入れ、１０×キナ
ーゼ緩衝液（０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＥ　ｐＨ８，０
−０，１Ｍ　ＭｇＣｌ２２０．１Ｍ−メルカプトエタノ
ール）１０　１．１ｍＭＡＴＰ　　１０　１．及び、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼＩＡ（１０単位）（ＴＯＹ
ＯＢＯ社製）を加え、３７度にて１時間加温した。

次にＩＯＸアニーリング溶液（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ　ｐＨ８，０−６０ｍＭ　　ＭｇＣｊｌ！２−６
０ｍＭβメルカプトエタノール−５００ｍＭ　　ＮａＣ
Ｊ’）を５μｌ加え、蒸留水にて５０μｌに調整した。

これを６５度の温水が入ったヒーカー中で１０分間加温
し、その後室温になるまでりっくり冷ました（所要時間
約１時間）。この反応で　木のオリゴヌクレオチドは下
図のような部分的ニー＝鎖を形成する。

５’　　ＧＣＣＡＴＴ・・・ＣＴＧＣＧＣＡＡ　　　Ｇ
ＧＧＣＧＡＴＣ・・・ＣＣＴＣＴＴＣＧ３’　ＧＡＣＧ
ＣＧＴＴ・・・ＣＣＣＧＣＴＡＧ　　　ＧＧＡＧＡＡＧ
Ｃ・・・この溶液５０μｌ！に１ｍＭｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＣＴＰをそれぞれ２　μＥ　、　０．４ｍＭビ
オチン化ＵＴＰ　（ＢＲＬ社製）を５μＡ、ＩＯＸアニ
ーリング溶液５μｌ。

蒸留水３２μｌを加え、よ（混和したあとＤＮＡポリメ
ラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ社製）１６単
位を加え、３７℃にて１時間加温し、伸展反応を行った
。

その後、未反応のビオチン化ＵＴＰを除去するために、
反応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−ｇｅｌ　　Ｐ２Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社製　０．５Ｘ５ｃｍ）で精製した。目的
のヌクレオチドはほとんどカラムを素通りした分画に回
収された。

各フラクションを０．５ｍｊｌ！ずつ収集し、それぞれ
２μｌをニトロセルロースフィルターに吸着させ、ＢＲ
Ｌ社のプロトコールに従って発色反応を行ったところ、
２番目のフラクションが強く発色し、目的のオリゴヌク
レオチドにビオチンが導入されていることが確認できた
。

そこでこのフラクション−和チエプローブ溶液とした。

一方、検出を行う核酸としてｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１９
及びその混合物の３種を用意した。

以後簡便のため、ｐＢＲ；２２を試料Ａ、ｐＵｃ１９を
試料Ｂ１及びｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１９混合物を試料Ｃ
と呼ぶことにする。

試料Ａ、　Ｂ、　Ｃをそれぞれ同様の手順で調製を行う
が、例として試料Ａについてのみ以下に説明を行う。試
料に標識を施した。

２．０μｌ　ｔｏ倍ＴＡバッファー、　１６．０μ１Ｈ
２０にｌμｇ／２μｌ試料ＤＮＡを加えた反応溶液に１
０ｕｎｉｔのＨｉｎｄ　ｍを加え３７°Ｃ，２時間で完
全分解した。これに２．０ｕｎｉｔＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼを加え２２°Ｃ９６０分反応させた。反応液に２ｍ
ＭｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰを各３．０μｌ加え、さらにｐ３
２ＴＴＰ３０μＣｉを加え３７°Ｃ，４０分反応を行っ
た。

反応の停止は１００ｍＭ　　ＥＤＴＡＩＯｌｌｌで行っ
た。

前記プローブ溶液４５μｌづつ、Ａ、Ｂ、Ｃそれぞれの
溶液に加えこれに蒸留水を加え１５０μｌとする。

そののち、反応混合液を５０℃で１時間インキュベーシ
ョンし、ハイブリダイゼーション反応を行わせた。ハイ
ブリダイゼーション反応後、１ＭＮａｃｌ！。

２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）及び１ｍＭＥ
ＤＴＡでの２５　ｗ　／　ｖ％ストレプトアビジン−ア
ガロース懸濁液２００μｌを加えた。

回転ミキサー中に１５分間３７℃でビオチン化分子とス
トレプトアビジン−アガロースとが結合するように放置
した。アガロースを短時間の遠心分離により集め、上澄
液を吸引（ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）により除去した。つ
いで、アガロースを前記緩衝化ＬＭ　Ｎａ（Ｊ！中で１
度および１５０ｍＭ　　ＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸ナ
トリウム（ｐＨ８）および０．２％ＳＤＳを含む溶液中
で２度８７℃で洗浄した。

洗浄後沈殿物の放射活性をシンチレーションカウンター
で数度測定したところｐＵｃ１９を含む生物学的試料は
１０’〜１０’ｃｐｍの値を示したのに対し、ｐＢＲ３
２２のみの試料におけるその値はバックグランドの２倍
に満たなかった。

以上より本方法による捕捉プローブが十分機能している
ことが確認できた。

〔発明の効果〕

上記実施例から明らかなように、本発明により長く安定
な捕捉プローブが簡便に作成できるようになった。

（１）従来のプライマー伸展法では、１００　ｍ　ｅ　
ｒ以上のプローブを一度に作成することは、困難であっ
た。なぜなら、そのためには、その長さの鋳型ＤＮＡの
合成が必要であり、また、ＤＮＡ合成装置の合成限界が
１００　ｍ　ａ　ｒ程度だからである。

これに対し、本発明の方法では、短い長さのオリゴヌク
レオチドを合成りＮＡ　Ｌ／、部分的二本鎖を形成させ
ることにより多数の一本鎖ＤＮＡを連結し、−本の鎖の
部分を酵素により合成させることにより、長い捕捉プロ
ーブが作成できるようになった。

（２）重合試薬による反応においても、従来のブライマ
ー伸展法の場合には、酵素によって多数のヌクレオチド
を重合させなければならなかった。ところが、酵素が伸
展させつる長さにもそれぞれ限界があり、２００ｍｅｒ
以上のヌクレオチドの重合は、はとんど不可能であった
。

本発明の場合には、長いＤＮＡを合成させる場合に酵素
によって重合させるヌクレオチドの長さを１ブロツク当
たり１００ｍｅｒ以下にした。このことにより、これま
でで合成出来なかった長いＤＮＡプローブの作成が可能
になった。

それに加え結合を行う部位が数ケ所以上存在するため結
合が強固で安定したものとなり、そのうえプローブ自体
で高次構造をとることを防ぐことが可能となった。

さらに本坊によりＤＮＡ全体の特性を変化させることな
く簡易に捕捉プローブを作成することができるようにな
った。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に用いる部分的２本鎖を説明するため
の概略図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ）おのおののオリゴヌクレオチドの末端領域の
   一部が互いに相補的な配列部をもつ少なくとも一対のオ
   リゴヌクレオチドを合成する工程、 ｂ）前記一対のオリゴヌクレオチドを該相補的な配列部
   で結合させる工程、 ｃ）いずれか一方もしくは双方のオリゴヌクレオチドに
   担体と特異的に反応する固定化物質を有する核酸塩基を
   重合させる工程、 ｄ）さらにｃ）の工程を経て得られたオリゴヌクレオチ
   ドを１本鎖に分離する工程とを有することを特徴とする
   オリゴヌクレオチドの形成方法。
2. （２）ａ）おのおののオリゴヌクレオチドの末端領域の
   一部が互いに相補的な配列部をもつ少なくとも一対のオ
   リゴヌクレオチドを合成する工程、 ｂ）前記一対のオリゴヌクレオチドを該相補的な配列部
   で結合させる工程、 ｃ）いずれか一方もしくは双方のオリゴヌクレオチドに
   担体と特異的に反応する固定化物質を有する核酸塩基を
   重合させる工程、 ｄ）さらにｃ）の工程を経て得られたオリゴヌクレオチ
   ドを１本鎖に分離する工程とを経て形成することを特徴
   とする核酸プローブの形成方法。
3. （３）ｅ）おのおのの３′末端領域で互いに相補的な配
   列部をもつ第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌ
   クレオチドを合成する工程および前記第一又は第二のオ
   リゴヌクレオチドの５′末端領域と相補的な配列部をも
   つ５′末端領域を有する第三のオリゴヌクレオチドを合
   成する工程、 ｆ）前記第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌク
   レオチドを該相補的な配列部で結合させる工程、および
   前記第一のオリゴヌクレオチド又は第二のオリゴヌクレ
   オチドのいずれかと第三のオリゴヌクレオチドを該相補
   的な配列部で結合させる工程、 ｇ）前記ｅ）とｆ）の工程を経て得られたオリゴヌクレ
   オチドに担体と特異的に反応する固定化物質を有する核
   酸塩基を重合・連結させる工程、 ｈ）さらにｇ）の工程を経て得られたオリゴヌクレオチ
   ドを１本鎖に分離する工程を有することを特徴とするオ
   リゴヌクレオチドの形成方法。
4. （４）ｅ）おのおのの３′末端領域で互いに相補的な配
   列部をもつ第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌ
   クレオチドを合成する工程および前記第一又は第二のオ
   リゴヌクレオチドの５′末端領域と相補的な配列部をも
   つ５′末端領域を有する第三のオリゴヌクレオチドを合
   成する工程、 ｆ）前記第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌク
   レオチドを該相補的な配列部で結合させる工程、および
   前記第一のオリゴヌクレオチド又は第二のオリゴヌクレ
   オチドのいずれかと第三のオリゴヌクレオチドを該相補
   的な配列部で結合させる工程、 ｇ）前記ｅ）とｆ）の工程を経て得られたオリゴヌクレ
   オチドに担体と特異的に反応する固定化物質を有する核
   酸塩基を重合・連結させる工程、 ｈ）さらにｇ）の工程を経て得られたオリゴヌクレオチ
   ドを１本鎖に分離する工程とを経て形成することを特徴
   とする核酸プローブの形成方法。