JPH0323000A - ヒトパラインフルエンザ2型ウイルス同定用検査薬に用いるdna断片 - Google Patents
ヒトパラインフルエンザ2型ウイルス同定用検査薬に用いるdna断片Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18711—Rubulavirus, e.g. mumps virus, parainfluenza 2,4
- C12N2760/18722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒトパラインフルエンザ2型ウイルス同定用
検査薬に用いるDNA断片に関し、より詳しくは、ヒト
バラインフルエンザ2型ウイルス(以下、PIV−2と
略称する)ヘムアグルヂニンノイラミニダーゼ(以下、
HNと略称する)の遺伝子RNAに相浦性を示すDNA
断片に間する。
検査薬に用いるDNA断片に関し、より詳しくは、ヒト
バラインフルエンザ2型ウイルス(以下、PIV−2と
略称する)ヘムアグルヂニンノイラミニダーゼ(以下、
HNと略称する)の遺伝子RNAに相浦性を示すDNA
断片に間する。
従来、ウイルスは、血清学的性状に基づいて同定されて
いる.その主な方法としてエンザイムリンクドイムノソ
ルベントアッセイ法(以下、ELISA法と略称する)
、中和反応法、補体結合反応法、血球1集抑制反応法、
蛍光抗体法、寒天内沈降反応法等があるが、これらいず
れの万l去も検体中のウイルスに対する抗体を測定する
ことにより判定を行うものであって、確度の高い判定を
行うためには、一般的に感t!1週間後のウイルス抗体
価が上昇し始める段階で行わなければならず、場合によ
っては、さらに数週間後に再測定を行って確認すること
が必要であり、従って、発症前及び早U診断が難しいと
いう問題点がある。
いる.その主な方法としてエンザイムリンクドイムノソ
ルベントアッセイ法(以下、ELISA法と略称する)
、中和反応法、補体結合反応法、血球1集抑制反応法、
蛍光抗体法、寒天内沈降反応法等があるが、これらいず
れの万l去も検体中のウイルスに対する抗体を測定する
ことにより判定を行うものであって、確度の高い判定を
行うためには、一般的に感t!1週間後のウイルス抗体
価が上昇し始める段階で行わなければならず、場合によ
っては、さらに数週間後に再測定を行って確認すること
が必要であり、従って、発症前及び早U診断が難しいと
いう問題点がある。
通常、PIV−2(7)測定にはEL I SA法が用
いられており、この方法は、検体中のPIV−2に対す
る抗体を測定するもので、例えば、PzV−2を固定化
したプレートに、被検体を加え反応させた後洗浄し、さ
らに抗PIV−2抗体を加え同様にして反応させ、次い
で酵素標識抗体を加えて反応後、発色させることにより
測定するものであるが、この方法も上記同様発症前及び
早期診断が難しいという問題点を有している. 本発明は、」4記のような問題点の解決を目的とするも
ので、PIV−2!@染症の早期診断を可能にする検査
薬に有用なDNA断片を提供するものである. 〔問題を解決するための手段〕 本発明は、下記[式]、 [式] ; GCACGAACCCTTA^GGTGT
CGTAACGTCTCGTGACACCGGGTTC
AGTTCAAATATCGACCTCTAACCCA
ATTTAAC^CCCATTCTTATATAAGA
ACACAGTATAATTTAATCACAAAAG
ACCTCAAAAACTGACACAGCTTGA丁
CCACTCAACATATAATTGT^^GATT
AATAATAATGGAAGATTACAGCAAT
CTATCTCTTAAATCAATTCCTAAAA
GGACATGTAG^^TCATTTTCCGAAC
TGCCACAATTCTTGG^^TATGCACA
TTGATTGTTCTATGTTCAAGTATTC
7TCATGAGATAATTCATCTTGATGT
TTCCTCTGGTCTCATGGATTCCGAT
GATTCAC^GCAAGGCATTATTCで表さ
れるDNA断片を提供することによって、P I V−
2感染症の発症前及び早期診断が難しいという問題点の
解決を図ったものである.本発明によって提供されるD
NA断片は、PIV−2●HNの遺伝子RNAに相補性
を示すので、これをPIV−2同定用検査薬に用いた場
合、PIV−2の同定を直接行うことができ、従来の間
接的同定法による問題点の解決を可能にしたものである
. 本発明における上記[式]で表されるDNA断片の製造
方法は、特に制限はなく、常法に従うことができ、例え
ば、 (a)PIV−2g染細胞から得られるmR NAより
調製されたcDNAを大腸菌のブラスミトベクター等の
適当なベクターに導入し大腸菌にクローン化させ、 ■ブロープとしてヌクレオカブシドRNAを用いてスク
リーニングを行う方法、 ■ブロープとして上記式で表される塩基配列に基づいて
合成されたオリゴヌクレオチドを用いてスクl/−ニン
グを行う方法、 ■PIV−2に対する抗体を用いてスクリーニングを行
う方法、 等でPIV−2・I N遺伝子をコードするクローンを
単離し、この単離されたクローンのブラスミドからイン
サートDNAを分離する方法、(t))上記[式]で表
されるPIV−2・HNの遺伝子RNAに相浦性を示す
塩基配列に基づいて、ホスホアミダイト}去(Natu
re、310巻、 105頁、 1984)に従って、
合成ヌクレオチドを作成する方法、 (c)上記(a)及び(b)を併用する方法、等によっ
て製造することができる. 上記方法によって得られた本発明のDNA断片は、以下
のようにして用いることができる.例えば、上記方法で
得られたDNA断片は、必要ならば適当な制限酵素(例
えば、PstlS EcoR1等)で十数塩基以上にさ
らに切断後、故射性同位元素等で標識して検査薬とし、
この検査薬を、検体く咽頭液等)から抽出したRNAを
固定化したナイロン膜等と反応後、オートラジオグラフ
ィー等で判定するノーザンハイブリダイゼーション法(
以下、ノーザン法と略称する)等てPIV−2の同定を
行うことができる。
いられており、この方法は、検体中のPIV−2に対す
る抗体を測定するもので、例えば、PzV−2を固定化
したプレートに、被検体を加え反応させた後洗浄し、さ
らに抗PIV−2抗体を加え同様にして反応させ、次い
で酵素標識抗体を加えて反応後、発色させることにより
測定するものであるが、この方法も上記同様発症前及び
早期診断が難しいという問題点を有している. 本発明は、」4記のような問題点の解決を目的とするも
ので、PIV−2!@染症の早期診断を可能にする検査
薬に有用なDNA断片を提供するものである. 〔問題を解決するための手段〕 本発明は、下記[式]、 [式] ; GCACGAACCCTTA^GGTGT
CGTAACGTCTCGTGACACCGGGTTC
AGTTCAAATATCGACCTCTAACCCA
ATTTAAC^CCCATTCTTATATAAGA
ACACAGTATAATTTAATCACAAAAG
ACCTCAAAAACTGACACAGCTTGA丁
CCACTCAACATATAATTGT^^GATT
AATAATAATGGAAGATTACAGCAAT
CTATCTCTTAAATCAATTCCTAAAA
GGACATGTAG^^TCATTTTCCGAAC
TGCCACAATTCTTGG^^TATGCACA
TTGATTGTTCTATGTTCAAGTATTC
7TCATGAGATAATTCATCTTGATGT
TTCCTCTGGTCTCATGGATTCCGAT
GATTCAC^GCAAGGCATTATTCで表さ
れるDNA断片を提供することによって、P I V−
2感染症の発症前及び早期診断が難しいという問題点の
解決を図ったものである.本発明によって提供されるD
NA断片は、PIV−2●HNの遺伝子RNAに相補性
を示すので、これをPIV−2同定用検査薬に用いた場
合、PIV−2の同定を直接行うことができ、従来の間
接的同定法による問題点の解決を可能にしたものである
. 本発明における上記[式]で表されるDNA断片の製造
方法は、特に制限はなく、常法に従うことができ、例え
ば、 (a)PIV−2g染細胞から得られるmR NAより
調製されたcDNAを大腸菌のブラスミトベクター等の
適当なベクターに導入し大腸菌にクローン化させ、 ■ブロープとしてヌクレオカブシドRNAを用いてスク
リーニングを行う方法、 ■ブロープとして上記式で表される塩基配列に基づいて
合成されたオリゴヌクレオチドを用いてスクl/−ニン
グを行う方法、 ■PIV−2に対する抗体を用いてスクリーニングを行
う方法、 等でPIV−2・I N遺伝子をコードするクローンを
単離し、この単離されたクローンのブラスミドからイン
サートDNAを分離する方法、(t))上記[式]で表
されるPIV−2・HNの遺伝子RNAに相浦性を示す
塩基配列に基づいて、ホスホアミダイト}去(Natu
re、310巻、 105頁、 1984)に従って、
合成ヌクレオチドを作成する方法、 (c)上記(a)及び(b)を併用する方法、等によっ
て製造することができる. 上記方法によって得られた本発明のDNA断片は、以下
のようにして用いることができる.例えば、上記方法で
得られたDNA断片は、必要ならば適当な制限酵素(例
えば、PstlS EcoR1等)で十数塩基以上にさ
らに切断後、故射性同位元素等で標識して検査薬とし、
この検査薬を、検体く咽頭液等)から抽出したRNAを
固定化したナイロン膜等と反応後、オートラジオグラフ
ィー等で判定するノーザンハイブリダイゼーション法(
以下、ノーザン法と略称する)等てPIV−2の同定を
行うことができる。
以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する
. ΩユRNΔJ8ま1 牛胎児血清6%を含むイーグル必須培養液中でべ口細胞
を増殖させた後、この培養液を新たに調整したアクチノ
マイシンD(2μg/nl)を含むイーグル必須培II
液と交換しk.次いでPIV−2(東芝株〉を接種し、
同培養液中で24時間培真を行なった.ウイルス感染培
養細胞をトリブシン/EDTAtjff合液で剥した後
、8000 r pmで10分間遠心することにより細
胞を集め、グアニジンイソチオシアネート液(6Mグア
ニジンイソチオシアネート、5mMクエン酸ナトリウム
、0.IM2−メルカブトエタノール、0.5%ラウロ
イルザルコシン酸ナトリウム)を加え、ホモゲナイザー
中で素早く溶解し、21G注射針をつけた注射筒に5回
通すことで染色体DNAをせん断した。得られた細胞溶
解液を、再度8000rpmで遠心し、得られた上澄液
9mlを、5.7M塩化セシウム水溶液3摺1の入った
別の遠心チューブに重層し、ベックマンローター(Be
ckmanSW40Ti rotor) にて、
37000rpmで18時間18℃で超遠心を行い、
遠心後RNAベレットを回収した。
. ΩユRNΔJ8ま1 牛胎児血清6%を含むイーグル必須培養液中でべ口細胞
を増殖させた後、この培養液を新たに調整したアクチノ
マイシンD(2μg/nl)を含むイーグル必須培II
液と交換しk.次いでPIV−2(東芝株〉を接種し、
同培養液中で24時間培真を行なった.ウイルス感染培
養細胞をトリブシン/EDTAtjff合液で剥した後
、8000 r pmで10分間遠心することにより細
胞を集め、グアニジンイソチオシアネート液(6Mグア
ニジンイソチオシアネート、5mMクエン酸ナトリウム
、0.IM2−メルカブトエタノール、0.5%ラウロ
イルザルコシン酸ナトリウム)を加え、ホモゲナイザー
中で素早く溶解し、21G注射針をつけた注射筒に5回
通すことで染色体DNAをせん断した。得られた細胞溶
解液を、再度8000rpmで遠心し、得られた上澄液
9mlを、5.7M塩化セシウム水溶液3摺1の入った
別の遠心チューブに重層し、ベックマンローター(Be
ckmanSW40Ti rotor) にて、
37000rpmで18時間18℃で超遠心を行い、
遠心後RNAベレットを回収した。
上記のようにして得られるRNAから、オリゴdTセル
ローズType7 (ファルマシア(Ph3rmaci
a)社製)を用いてポリAMを含むmRNA (以下、
po ly (A+)RNAと略称する〕を分離、精製
した。
ローズType7 (ファルマシア(Ph3rmaci
a)社製)を用いてポリAMを含むmRNA (以下、
po ly (A+)RNAと略称する〕を分離、精製
した。
2 cDNAラ ーリーの
cDNAライブラリーは、岡山・バーグ法に従い合成し
た.すなわち、上記poly(A+)RNA4μgに蒸
留水5μ1を加え、65℃で10分間加温した後急冷し
、次にオリゴdTプライムドベクター(pUc11Bベ
クターのKpnlサイトにオリゴdTを付加した(0.
8〜1.2μ87μ!))10μ1、合成反応液(50
0mM Tris−塩酸纏衝液pH8.3、300m
M塩化カリウム、80mM塩化マグネシウム、3mMジ
チオスレイトール)3μ1、及び、20mMdATP、
20mMdCTP,20mMdGTP,20mMdTT
Pを各々1l11づつ加え、さらに20unitsRN
asin,40unitsリバーストランスクリブター
ゼを加えた後、蒸留水で全量を30μlとし、42℃3
0分間反応を行い第一@ c DNAを合成した.第一
鎖c DNA合成終了後、dGTP存在下ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを用いて10
〜30個のdG塩基を付加した.次に制限酵素Hind
IIIによる消化を行い、さらにdC塩基鎖を持つリン
カーとアニール後、大腸菌ライゲースにより閉環状とし
た.最後にRNaseH存在下、DNAポリメラーゼに
より第二鎖の合成を行い、完全なプラスミドD N A
を作成した.次に塩化カルシウム処理を施すことにより
得られるコンペテント細胞(DH1)100〜200μ
1に、0.4M塩化マグネシウム/0.1M塩化カルシ
ウムの混合液lOμ1、及び、上記DNA0.02μg
を加え、O℃で40分間次いで42℃で90秒問放置し
、次に培II液(バクトトリブトン10g, イース
トイクストラク} 5 g, 塩化ナトリウム5gを
1000mlの蒸留水に溶解した溶液)1.5mlを加
え、37℃で40分間放置することにより形質転換細胞
を得た.上記により200μ1のコンペテント細胞(D
H1)に、0.02μgのブラスミドDNAを導入する
ことにより、アンビシリン存在下で1 400個の独立
したクローンを得た. 3 クレ シ”RNAブロー のPIV−2g染
ベロ細胞に、0.6%ノニデットP−40、10mMバ
ナジルリボヌクレオチド複合体を含む1M(0.15M
塩化ナトリウム、0.05MTris−塩酸縫衝液)を
加え、水中で1時間ビベティングによる可溶化を行い、
8000rpmで10分間遠心した.次いで塩化セシウ
ムの40%水溶液、30%水溶液、25%水溶γ夜の各
々lml、2 .5 ml, 1 mlをこの順に重層
した遠心チューブに、上記遠心で得られた上澄液9ml
をさらに重層し、ベックマンロータ−SW40Tiにて
、37000rpm,18時間16℃で平衡密度勾配遠
心を行った。遠心後、30%の塩化セシウム水溶液層に
生じたウイルスのヌクレオカブシドバンドを回収した。
た.すなわち、上記poly(A+)RNA4μgに蒸
留水5μ1を加え、65℃で10分間加温した後急冷し
、次にオリゴdTプライムドベクター(pUc11Bベ
クターのKpnlサイトにオリゴdTを付加した(0.
8〜1.2μ87μ!))10μ1、合成反応液(50
0mM Tris−塩酸纏衝液pH8.3、300m
M塩化カリウム、80mM塩化マグネシウム、3mMジ
チオスレイトール)3μ1、及び、20mMdATP、
20mMdCTP,20mMdGTP,20mMdTT
Pを各々1l11づつ加え、さらに20unitsRN
asin,40unitsリバーストランスクリブター
ゼを加えた後、蒸留水で全量を30μlとし、42℃3
0分間反応を行い第一@ c DNAを合成した.第一
鎖c DNA合成終了後、dGTP存在下ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを用いて10
〜30個のdG塩基を付加した.次に制限酵素Hind
IIIによる消化を行い、さらにdC塩基鎖を持つリン
カーとアニール後、大腸菌ライゲースにより閉環状とし
た.最後にRNaseH存在下、DNAポリメラーゼに
より第二鎖の合成を行い、完全なプラスミドD N A
を作成した.次に塩化カルシウム処理を施すことにより
得られるコンペテント細胞(DH1)100〜200μ
1に、0.4M塩化マグネシウム/0.1M塩化カルシ
ウムの混合液lOμ1、及び、上記DNA0.02μg
を加え、O℃で40分間次いで42℃で90秒問放置し
、次に培II液(バクトトリブトン10g, イース
トイクストラク} 5 g, 塩化ナトリウム5gを
1000mlの蒸留水に溶解した溶液)1.5mlを加
え、37℃で40分間放置することにより形質転換細胞
を得た.上記により200μ1のコンペテント細胞(D
H1)に、0.02μgのブラスミドDNAを導入する
ことにより、アンビシリン存在下で1 400個の独立
したクローンを得た. 3 クレ シ”RNAブロー のPIV−2g染
ベロ細胞に、0.6%ノニデットP−40、10mMバ
ナジルリボヌクレオチド複合体を含む1M(0.15M
塩化ナトリウム、0.05MTris−塩酸縫衝液)を
加え、水中で1時間ビベティングによる可溶化を行い、
8000rpmで10分間遠心した.次いで塩化セシウ
ムの40%水溶液、30%水溶液、25%水溶γ夜の各
々lml、2 .5 ml, 1 mlをこの順に重層
した遠心チューブに、上記遠心で得られた上澄液9ml
をさらに重層し、ベックマンロータ−SW40Tiにて
、37000rpm,18時間16℃で平衡密度勾配遠
心を行った。遠心後、30%の塩化セシウム水溶液層に
生じたウイルスのヌクレオカブシドバンドを回収した。
次に0.1%SDS及びブロテイナーゼK (2.5m
g/n+I)を加え、56℃15分問蛋白分解を行った
後、フェノール及びフェノール/クロロホルム混液で処
理を行い、ヌクレオカブシドRNAを得た。得られたヌ
クレオカプシドRNAに5 0mMT r i s−塩
酸緩衝MpH9.7を加え、95℃lO分間加温した後
室温まで徐々に冷やした.次にこのRNA溶液20μl
に緩衝液(250mMTris一塩酸、50mM塩化マ
グネシウム、25mMDTT,7.5mMスペルミン、
500mM塩化カリウム)10μ1、及び32PATP
(1 00μCi/[300pM)3μ1、T 4−
D N A力イネース2unitsを加えた後、蒸留
水で全量を60μ1とし、37℃で1時間反応させヌク
レオカブシドRNAプローブを得た. 4 コロニーハ リ ゼー・゛ヨゝ上記の形質転換
細胞100〜200μlを、アンビシリン(120μs
/sl)を含む15cmの寒天プレート(1 0gバク
トトリブトン、5gイーストイクストラクト、5g塩化
ナトリウム、15gアガーを加え蒸留水で全量を100
0mlとした〉に蒔き、12時間37℃で培養した.ニ
トロセルロース躾に生じたコロニーを写し取り、37℃
で6時間培養した.次にこの膜を、0.5N水酸化ナト
リウム/1.5M塩化ナトリウム混合液で10分間処理
し、さらに1.5M塩化ナトリウムを含む0.5MTr
is−塩酸緩衝液pH8.0にlO分間置いた後、0.
3M塩化ナトリウム70.03Mクエン酸ナトリウム混
合液中で5分間リンスした.リンス後、膜を風屹し、8
0℃で1時間吸引しながらベーキングを行うことにより
DNAを膜に固定した. このようにして得られた膜5枚当りに、変性鮭R NA
( 1 mg/a+l)t ml、SSPE液(3.
6M塩化ナトリウム、200mM第一りん酸ナトリウム
、2 0mME D T A)7.5gml、デンハー
ド液(2%BSA,2%F五call,2%ポリビニル
ビロリドン)!.25o1、 10%SDS1.25m
lからなるプレハイブリダイゼーション液を加え、42
’CI2時間反応させ、次に新たに調製した上記ブレハ
イブリダイゼーション液に上記ヌクレオカブシドRNA
ブローブを、500万Ci/mlとなるように加え、4
2℃で18時間反応を行った。反応終了後、0.1%S
DSを含む20倍希釈のSSPE液中で42℃5分間2
回洗浄し、次に0.l%SDSを含む200倍希釈のS
SPE液中で42℃15分間2回洗浄を行った.洗浄終
了後、膜を風乾し、X線フィルム(RXI5、コッダク
社!!)を用いて、−80℃12時間オートラヂオグラ
フィーを行い、数個の陽性クローンを得た.但とLニヱ
2丑 上記の陽性クローンを用いてノーザン法を行った.すな
わち、前記(1〉の方法で得られたPIV・2感染細胞
由来po ly (A+)RNA, ウイルス非感染
細胞由来po ly (A+)RNA及びrRNAマー
カーを、各々1.5%アガロースゲル中で電気泳勤後、
ナイロン膜(Hybond−N、アマシャム社l1>に
転写し、風乾後UV照射をすることによりRNAをナイ
ロン膜に共有結合させ、次に上記の各陽性クローンをブ
ロープとして各々パイプリダイゼーションを行った. すなわち、ナイロン膜を上記プレハイブリダイゼーショ
ン液中で42℃12時間反応させ、次に各陽性クローン
から作られた32pでラベルされたブローブを100万
CL/mlとなるようにブレハイブリダイゼーション液
に加え、42℃18時間反応させた.反応終了後、上記
(4)と同様に洗浄を行い、X線フィルムを用いてオー
トラジオグラフィーを行い、その結果2100base
の位置にハイブリダイズするクローンを1個得た.この
クローンをpM2Hと命名した. なお、各陽性クローンのブロープは、各クローンをI{
indm及びEcoRIで消化後、低融点アガロースを
用いた電ス泳勤によりインサートDNAを分離し、抽出
後、32P d C T Pを用いたランダムプライム
ラベルにより得た. 上記(5〉で得られたクローンpM2Hを種々の制限酵
素で切断して、その制限酵素地図を作成し、第1図にそ
の結果を示した.図において1及び5はベクターDNA
,4及び6はノンコーディングノージョン、2及び3は
コーディングリージョンであり、その中で2及び6は本
発明に係わるPIV−2・HNの遺伝子RNAに相補性
を示すDNA断片である. 第l図に従ってクローンp M 2 Hを各制限酵素で
切断後、得られたフラグメントをブラスミドpUC11
Bのマルチクローニングサイトに各々導入シ、SEQU
ENASE▼’キッ}(東洋紡社!!)を用いてシーク
エンスを行った.又、一部はキロシークエンス用デレー
ションキット(宝酒造社製〉を用いてデレーションミュ
ータントを作成し、シークエンスを行い塩基配列を決定
した.その結果は、前記[式]に示す通りであった。
g/n+I)を加え、56℃15分問蛋白分解を行った
後、フェノール及びフェノール/クロロホルム混液で処
理を行い、ヌクレオカブシドRNAを得た。得られたヌ
クレオカプシドRNAに5 0mMT r i s−塩
酸緩衝MpH9.7を加え、95℃lO分間加温した後
室温まで徐々に冷やした.次にこのRNA溶液20μl
に緩衝液(250mMTris一塩酸、50mM塩化マ
グネシウム、25mMDTT,7.5mMスペルミン、
500mM塩化カリウム)10μ1、及び32PATP
(1 00μCi/[300pM)3μ1、T 4−
D N A力イネース2unitsを加えた後、蒸留
水で全量を60μ1とし、37℃で1時間反応させヌク
レオカブシドRNAプローブを得た. 4 コロニーハ リ ゼー・゛ヨゝ上記の形質転換
細胞100〜200μlを、アンビシリン(120μs
/sl)を含む15cmの寒天プレート(1 0gバク
トトリブトン、5gイーストイクストラクト、5g塩化
ナトリウム、15gアガーを加え蒸留水で全量を100
0mlとした〉に蒔き、12時間37℃で培養した.ニ
トロセルロース躾に生じたコロニーを写し取り、37℃
で6時間培養した.次にこの膜を、0.5N水酸化ナト
リウム/1.5M塩化ナトリウム混合液で10分間処理
し、さらに1.5M塩化ナトリウムを含む0.5MTr
is−塩酸緩衝液pH8.0にlO分間置いた後、0.
3M塩化ナトリウム70.03Mクエン酸ナトリウム混
合液中で5分間リンスした.リンス後、膜を風屹し、8
0℃で1時間吸引しながらベーキングを行うことにより
DNAを膜に固定した. このようにして得られた膜5枚当りに、変性鮭R NA
( 1 mg/a+l)t ml、SSPE液(3.
6M塩化ナトリウム、200mM第一りん酸ナトリウム
、2 0mME D T A)7.5gml、デンハー
ド液(2%BSA,2%F五call,2%ポリビニル
ビロリドン)!.25o1、 10%SDS1.25m
lからなるプレハイブリダイゼーション液を加え、42
’CI2時間反応させ、次に新たに調製した上記ブレハ
イブリダイゼーション液に上記ヌクレオカブシドRNA
ブローブを、500万Ci/mlとなるように加え、4
2℃で18時間反応を行った。反応終了後、0.1%S
DSを含む20倍希釈のSSPE液中で42℃5分間2
回洗浄し、次に0.l%SDSを含む200倍希釈のS
SPE液中で42℃15分間2回洗浄を行った.洗浄終
了後、膜を風乾し、X線フィルム(RXI5、コッダク
社!!)を用いて、−80℃12時間オートラヂオグラ
フィーを行い、数個の陽性クローンを得た.但とLニヱ
2丑 上記の陽性クローンを用いてノーザン法を行った.すな
わち、前記(1〉の方法で得られたPIV・2感染細胞
由来po ly (A+)RNA, ウイルス非感染
細胞由来po ly (A+)RNA及びrRNAマー
カーを、各々1.5%アガロースゲル中で電気泳勤後、
ナイロン膜(Hybond−N、アマシャム社l1>に
転写し、風乾後UV照射をすることによりRNAをナイ
ロン膜に共有結合させ、次に上記の各陽性クローンをブ
ロープとして各々パイプリダイゼーションを行った. すなわち、ナイロン膜を上記プレハイブリダイゼーショ
ン液中で42℃12時間反応させ、次に各陽性クローン
から作られた32pでラベルされたブローブを100万
CL/mlとなるようにブレハイブリダイゼーション液
に加え、42℃18時間反応させた.反応終了後、上記
(4)と同様に洗浄を行い、X線フィルムを用いてオー
トラジオグラフィーを行い、その結果2100base
の位置にハイブリダイズするクローンを1個得た.この
クローンをpM2Hと命名した. なお、各陽性クローンのブロープは、各クローンをI{
indm及びEcoRIで消化後、低融点アガロースを
用いた電ス泳勤によりインサートDNAを分離し、抽出
後、32P d C T Pを用いたランダムプライム
ラベルにより得た. 上記(5〉で得られたクローンpM2Hを種々の制限酵
素で切断して、その制限酵素地図を作成し、第1図にそ
の結果を示した.図において1及び5はベクターDNA
,4及び6はノンコーディングノージョン、2及び3は
コーディングリージョンであり、その中で2及び6は本
発明に係わるPIV−2・HNの遺伝子RNAに相補性
を示すDNA断片である. 第l図に従ってクローンp M 2 Hを各制限酵素で
切断後、得られたフラグメントをブラスミドpUC11
Bのマルチクローニングサイトに各々導入シ、SEQU
ENASE▼’キッ}(東洋紡社!!)を用いてシーク
エンスを行った.又、一部はキロシークエンス用デレー
ションキット(宝酒造社製〉を用いてデレーションミュ
ータントを作成し、シークエンスを行い塩基配列を決定
した.その結果は、前記[式]に示す通りであった。
7 への PIV−2の
上記(4)で得られたpM2Hクローンを、Pstlで
切断後、低融点アガロースを用いた電気泳動によりイン
サートDNAの一部を分離、抽出し、32pを用いたラ
ンダムプライムラベリングによりブローベを作成した.
次に、前記(1)の方法で得られたPIV−2感染細胞
由来RNA、ウイルス非感染細胞由来RNAlt0.3
5μgづつナイロン膜にプロットした後、風乾、UV照
射、以降の処理は上記(5)のノーザン法と全く同様に
して反応させラジオオートグラフィーを行った。その結
果、第2図のbで示すようにPIV−2感染細胞由来R
NAをプロットした部分に反応が認められ、PI V−
2に感染していることが確認された.これに対して、ウ
イルス非感染細胞由来RNAをプロットした部分(第2
図のaで示す部分)には反応が全く認められなかった. 〔発明の効果〕 本発明によって提供される、前記[式]で表さtiDN
A断片は、P IV−2−HN(1)遺伝子RNAに特
異的に相補性を示すので、P I V−2感染症の早U
4診断の検査薬に極めて有用に用いることができる. 4.図面の簡単な説明 第11!Iは、上記[式]で表されるPIV−2・HN
遺伝子に相補性を示すDNA(pM2H)のcDNA領
域の制限酵素地図、第2図はPIV−2による感染及び
非感染の判定結果である。
切断後、低融点アガロースを用いた電気泳動によりイン
サートDNAの一部を分離、抽出し、32pを用いたラ
ンダムプライムラベリングによりブローベを作成した.
次に、前記(1)の方法で得られたPIV−2感染細胞
由来RNA、ウイルス非感染細胞由来RNAlt0.3
5μgづつナイロン膜にプロットした後、風乾、UV照
射、以降の処理は上記(5)のノーザン法と全く同様に
して反応させラジオオートグラフィーを行った。その結
果、第2図のbで示すようにPIV−2感染細胞由来R
NAをプロットした部分に反応が認められ、PI V−
2に感染していることが確認された.これに対して、ウ
イルス非感染細胞由来RNAをプロットした部分(第2
図のaで示す部分)には反応が全く認められなかった. 〔発明の効果〕 本発明によって提供される、前記[式]で表さtiDN
A断片は、P IV−2−HN(1)遺伝子RNAに特
異的に相補性を示すので、P I V−2感染症の早U
4診断の検査薬に極めて有用に用いることができる. 4.図面の簡単な説明 第11!Iは、上記[式]で表されるPIV−2・HN
遺伝子に相補性を示すDNA(pM2H)のcDNA領
域の制限酵素地図、第2図はPIV−2による感染及び
非感染の判定結果である。
1、5●●◆・●●ベクターD N A,4、6・●・
◆・・ノンコーディングリージョン、2、3●●@4h
コーディングリージョンつ特許出願人 藤倉化成株式会
社 第1図 手続補正書く方式) 平成 l年10月20日 特許庁長官 吉 田 文 毅 殿 1.事件の表示 平成 1年特許願第154746号 2.発明の名称 ヒトパラインフルエンザ2型ウィルス同定用検査薬に用
いるDNA断片 3.補正をする者 事件との関係 特許出願人 (電話 03− 966− 5141)6.補正の内容 (1)明細書第16頁第11、12行の「第2図はPI
V−2による感染及び非感染の判定結果である.」を削
除する. 〈2〉図面の「第2図」を削除する。
◆・・ノンコーディングリージョン、2、3●●@4h
コーディングリージョンつ特許出願人 藤倉化成株式会
社 第1図 手続補正書く方式) 平成 l年10月20日 特許庁長官 吉 田 文 毅 殿 1.事件の表示 平成 1年特許願第154746号 2.発明の名称 ヒトパラインフルエンザ2型ウィルス同定用検査薬に用
いるDNA断片 3.補正をする者 事件との関係 特許出願人 (電話 03− 966− 5141)6.補正の内容 (1)明細書第16頁第11、12行の「第2図はPI
V−2による感染及び非感染の判定結果である.」を削
除する. 〈2〉図面の「第2図」を削除する。
手続補正書
平成
特許庁長官
事件の表示
(自発)
1年10月20日
平成
l年特許穎第154746号
発明の名称
ヒトバラインフルエンザ2型ウィルス同定用検査薬に用
いるDNA断片 補正をする者 事件との関係 特許出願人 イタハ゛シクハスネ 住 所 東京都板橋区蓮根3丁目25番3号フシー
クラ h セイ 名 称 藤倉化成株式会社 5. 補正の内容 手続補正書 (自M) (1) 明!a書第15頁第16行の「第2図のbで示す平成 2年 9月17日 ように」 を削除する。
いるDNA断片 補正をする者 事件との関係 特許出願人 イタハ゛シクハスネ 住 所 東京都板橋区蓮根3丁目25番3号フシー
クラ h セイ 名 称 藤倉化成株式会社 5. 補正の内容 手続補正書 (自M) (1) 明!a書第15頁第16行の「第2図のbで示す平成 2年 9月17日 ように」 を削除する。
特許庁長官
(2)
明m書第15頁第17行のr部分に反応が」を
事件の表示
r部分には、
試料中のPIV−2ウィルスRNA
とハイブリッドを形成した同ブローブにより生じ平成
l年特許願第154746号
る陽性シグナルが」
と補正する.
発明の名称
(3)
明繍書第15頁末行の「
(第2図のaで示す部
分)」
を削除する.
ヒトバラインフルエンザ2型ウィルス同定用検査薬に用
いるDNA断片 補正をする者 事件との関係 特許出願人 イタノビノクJ1スネ 住 所 東京都板橋区蓮根3丁目25番3号フシ゛
クラ h セイ 名 称 藤倉化成株式会社 補正の対象 明細書の「特許請求の範囲」及び「発明の詳細な6.補
正の内容 (1)特許請求の範囲の全文を別紙の通りに補正する. (2〉 明細書第3頁第13行において、 r本発明は
、下記[式]、」とあるを、 r本発明は、DNAを構
成する塩基配列の全部または一部が、下記[式]』と補
正する。
いるDNA断片 補正をする者 事件との関係 特許出願人 イタノビノクJ1スネ 住 所 東京都板橋区蓮根3丁目25番3号フシ゛
クラ h セイ 名 称 藤倉化成株式会社 補正の対象 明細書の「特許請求の範囲」及び「発明の詳細な6.補
正の内容 (1)特許請求の範囲の全文を別紙の通りに補正する. (2〉 明細書第3頁第13行において、 r本発明は
、下記[式]、」とあるを、 r本発明は、DNAを構
成する塩基配列の全部または一部が、下記[式]』と補
正する。
(3)明細書第4頁第3行において、 「で表されるD
NA断片」とあるを、 『の全部または一部で表される
単位であるDNA断片」と補正する.(4)明細書第4
頁第5行の次に、以下の文章を加入する. r 本発明におけるDNA断片は、上記[式]の全部ま
たは一部で表される単位のみで構成されていてもよく、
また、該単位が他の適宜なI)NAベクターに組み込ま
れた状態で構成されていてもよい。 』 (6)明繍書第12頁第17行において、 「コツダク
社」とあるを、 「コダック社」と補正する.(6)明
細書第15頁第5行の次に、以下の文章を加入する. f(7−1) 上記[式コの1番から366番で表さ
れるDNA断片を用いる場合:j (7)明細書第16頁第1行の次に、以下の文章を加入
する. r(7−2) 上記[式](7)129番から214
番で表されるDNA断片を用いる場合; pM2Hクローンを、Alu I とAfllTI
で切断後、低融点アガロースを用いた電気泳勤により約
85塩基対の位置に泳動されるバンドを切り出し、DN
A断片を抽出した後、エタノール沈置によりDNA′I
t回収しk. 得られたDNA断片はランダムプライムラベリングによ
りプローブとした.すなわち、DNA断片0.1μgに
蒸留水10μl を加え、沸騰水中で2分間置き急冷し
、次に牛血清アルブミン1μ+ (1 0m,g/m
I)、ランダム液(0.44MHEPES pH8.
6、 110mMTris一塩酸pH8、 1 1mM
MgC 12、 22mM2−メルカブトエタノー
ル、44μM dATP,44 μM dGTP
, 44μM dTTP. 0.12mMTri
s−塩酸 pH7.5、0.12mM″’EDTA,l
lunits/mlオリゴヌクレオチドpd(N)e(
ファルマシア株式会社1!))11.4μ1、(α32
P)dCTP 5μl(100μCi/600pM)
、クレノウ2.5unitsを加え、室温で6時間反応
させ、得られた反応液をBio−gel P60によ
り精製しブローブとした。
NA断片」とあるを、 『の全部または一部で表される
単位であるDNA断片」と補正する.(4)明細書第4
頁第5行の次に、以下の文章を加入する. r 本発明におけるDNA断片は、上記[式]の全部ま
たは一部で表される単位のみで構成されていてもよく、
また、該単位が他の適宜なI)NAベクターに組み込ま
れた状態で構成されていてもよい。 』 (6)明繍書第12頁第17行において、 「コツダク
社」とあるを、 「コダック社」と補正する.(6)明
細書第15頁第5行の次に、以下の文章を加入する. f(7−1) 上記[式コの1番から366番で表さ
れるDNA断片を用いる場合:j (7)明細書第16頁第1行の次に、以下の文章を加入
する. r(7−2) 上記[式](7)129番から214
番で表されるDNA断片を用いる場合; pM2Hクローンを、Alu I とAfllTI
で切断後、低融点アガロースを用いた電気泳勤により約
85塩基対の位置に泳動されるバンドを切り出し、DN
A断片を抽出した後、エタノール沈置によりDNA′I
t回収しk. 得られたDNA断片はランダムプライムラベリングによ
りプローブとした.すなわち、DNA断片0.1μgに
蒸留水10μl を加え、沸騰水中で2分間置き急冷し
、次に牛血清アルブミン1μ+ (1 0m,g/m
I)、ランダム液(0.44MHEPES pH8.
6、 110mMTris一塩酸pH8、 1 1mM
MgC 12、 22mM2−メルカブトエタノー
ル、44μM dATP,44 μM dGTP
, 44μM dTTP. 0.12mMTri
s−塩酸 pH7.5、0.12mM″’EDTA,l
lunits/mlオリゴヌクレオチドpd(N)e(
ファルマシア株式会社1!))11.4μ1、(α32
P)dCTP 5μl(100μCi/600pM)
、クレノウ2.5unitsを加え、室温で6時間反応
させ、得られた反応液をBio−gel P60によ
り精製しブローブとした。
次に、上記(1)の方法で得られたPIV−2感染綱胞
由来RNA、ウイルス非感染細胞由来RNAを0.35
μg ずつナイロン膜にプロットした後、風乾、UV照
射し、上記(5)のプレハイブリダイゼーション液中で
42℃で12時間反応させた.次に沸騰水浴中で2分間
置いた後急冷処理を施した先のブローブを100万Ci
/mlとなるように加え、さらに42℃で18時間反応
させた。
由来RNA、ウイルス非感染細胞由来RNAを0.35
μg ずつナイロン膜にプロットした後、風乾、UV照
射し、上記(5)のプレハイブリダイゼーション液中で
42℃で12時間反応させた.次に沸騰水浴中で2分間
置いた後急冷処理を施した先のブローブを100万Ci
/mlとなるように加え、さらに42℃で18時間反応
させた。
反応終了後、0.1% SDSを含む20倍希釈のSS
PE液中で42℃で5分間、2回洗浄し、次に0.1%
SOSを含む200倍希釈のSSPE液中で42℃で1
5分間、2回洗浄を行った。洗浄終了後、膜を風乾し、
X線フイルムを用いて−80℃で12時間オートラジオ
グラフイーを行つた. その結果、PIV−2感染細胞由来RNAをプロットし
た部分には試料中のPTV−2ウイルスRNAとハイブ
リッドを形成した同ブローブにより生じる陽性シグナル
が認められ、PIV−2に感染していることが確認され
た。
PE液中で42℃で5分間、2回洗浄し、次に0.1%
SOSを含む200倍希釈のSSPE液中で42℃で1
5分間、2回洗浄を行った。洗浄終了後、膜を風乾し、
X線フイルムを用いて−80℃で12時間オートラジオ
グラフイーを行つた. その結果、PIV−2感染細胞由来RNAをプロットし
た部分には試料中のPTV−2ウイルスRNAとハイブ
リッドを形成した同ブローブにより生じる陽性シグナル
が認められ、PIV−2に感染していることが確認され
た。
これに対してウイルス非感巣繍胞由来RNAをプロット
した部分には反応が全く認められなかった. (7−3) 上記[式]の150番から168番で表
される塩基配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチ
ドを用いる墳合; 上記[式]で示される塩基配列に基づいて十数塩基以上
のオリゴヌクレオチドを合成してブローブとすることが
できる. DNA合成機(DNAシンセサイザー モデル381A
(アブライドバイオシステムズジャパン株式会社it)
)を用いて合成したオリゴヌクレオチド(5’ −AA
TTGTAAGATTAATAATA−3’ )を、オ
リゴヌクレオチド精製カートリッジ(アブライドバイオ
システムズジャパン株式会社製)を用いて精製した. 得られた合成オリゴヌクレオチド1μl(10pmo
l e s/u l)当り、緩衝液(0.5M Tri
s−塩酸pH7.6、0.1M MgC 12、50m
M ヂチオスレイトール、1mM スベルミジン塩酸、
1mM EDTA)2,u 1, 蒸留水11.4μ
1、(y32−P)ATP 5μ1 (2nmo 1
es/μ1)、バクテリオファージT4ボリヌクレオチ
ドキナーゼ8un i tを加えk後、37℃で45分
間反応した.次に反応液をBio−gelP80により
精製し、得られた精製品をブローブとして用いた. 次に、上記(1)の方法で得られたPIV−2g染細胞
由来R N A, ウイルス非感染細胞由来RNAを
0.35μgずつナイロン膜にプロットした後、風乾、
UVN射し、上記(5)のプレハイブリダイゼーション
液中で42℃で12時間反応させた.次に先のブローブ
を100万Ci/mlとなるように加え、さらに42℃
で18時間反応させた。反応終了後、0.1% SDS
を含む20倍希釈のSSPE液中で42℃で5分間、2
回洗浄し、次に0.1%SDSを含む200倍希釈のS
SPE液中で42℃で15分間、2回洗浄を行った。
した部分には反応が全く認められなかった. (7−3) 上記[式]の150番から168番で表
される塩基配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチ
ドを用いる墳合; 上記[式]で示される塩基配列に基づいて十数塩基以上
のオリゴヌクレオチドを合成してブローブとすることが
できる. DNA合成機(DNAシンセサイザー モデル381A
(アブライドバイオシステムズジャパン株式会社it)
)を用いて合成したオリゴヌクレオチド(5’ −AA
TTGTAAGATTAATAATA−3’ )を、オ
リゴヌクレオチド精製カートリッジ(アブライドバイオ
システムズジャパン株式会社製)を用いて精製した. 得られた合成オリゴヌクレオチド1μl(10pmo
l e s/u l)当り、緩衝液(0.5M Tri
s−塩酸pH7.6、0.1M MgC 12、50m
M ヂチオスレイトール、1mM スベルミジン塩酸、
1mM EDTA)2,u 1, 蒸留水11.4μ
1、(y32−P)ATP 5μ1 (2nmo 1
es/μ1)、バクテリオファージT4ボリヌクレオチ
ドキナーゼ8un i tを加えk後、37℃で45分
間反応した.次に反応液をBio−gelP80により
精製し、得られた精製品をブローブとして用いた. 次に、上記(1)の方法で得られたPIV−2g染細胞
由来R N A, ウイルス非感染細胞由来RNAを
0.35μgずつナイロン膜にプロットした後、風乾、
UVN射し、上記(5)のプレハイブリダイゼーション
液中で42℃で12時間反応させた.次に先のブローブ
を100万Ci/mlとなるように加え、さらに42℃
で18時間反応させた。反応終了後、0.1% SDS
を含む20倍希釈のSSPE液中で42℃で5分間、2
回洗浄し、次に0.1%SDSを含む200倍希釈のS
SPE液中で42℃で15分間、2回洗浄を行った。
洗浄終了後、膜を風乾し、X線フィルムを用いて−80
℃で12時間オートラジオグラフィーを行った. その結果、PIV−2感染細胞由来RNAをプロットし
た部分には試料中のPIV−2ウイルスRNAとハイブ
リッドを形成した同ブローブにより生じる陽性シグナル
が認められ、PIV−2に感染していることが確認され
た。
℃で12時間オートラジオグラフィーを行った. その結果、PIV−2感染細胞由来RNAをプロットし
た部分には試料中のPIV−2ウイルスRNAとハイブ
リッドを形成した同ブローブにより生じる陽性シグナル
が認められ、PIV−2に感染していることが確認され
た。
これに対してウイルス非感染繕胞由来RNAをプロット
した部分には反応が全く認められなかった. 1 別 紙 特許請求の範囲 DNA の
一下記[式コ肛L益工上旦二1で表される亀血工邊
玉ヒトバラインフルエンザ2型ウイルス同定用検査薬に
用いるDNA断片。
した部分には反応が全く認められなかった. 1 別 紙 特許請求の範囲 DNA の
一下記[式コ肛L益工上旦二1で表される亀血工邊
玉ヒトバラインフルエンザ2型ウイルス同定用検査薬に
用いるDNA断片。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下記[式]で表わされるヒトパラインフルエンザ2型ウ
ィルス同定用検査薬に用いるDNA断片。 [式];GCACGAACCCTTAAGGTGTCG
TAACGTCTCGTGACACCGGGTTCAG
TTCAAATATCGACCTCTAACCCAAT
TTAACACCCATTCTTATATAAGAAC
ACAGTATAATTTAATCACAAAAGAC
CTCAAAAACTGACACAGCTTGATCC
ACTCAACATATAATTGTAAGATTAA
TAATAATGGAAGATTACAGCAATCT
ATCTCTTAAATCAATTCCTAAAAGG
ACATGTAGAATCATTTTCCGAACTG
CCACAATTCTTGGAATATGCACATT
GATTGTTCTATGTTCAAGTATTCTT
CATGAGATAATTCATCTTGATGTTT
CCTCTGGTCTCATGGATTCCGATGA
TTCACAGCAAGGCATTATTC
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP15474689A JPH0757200B2 (ja) | 1989-06-19 | 1989-06-19 | ヒトパラインフルエンザ2型ウイルス同定用検査薬に用いるdna断片 |
DE1990626868 DE69026868T2 (de) | 1989-06-19 | 1990-06-19 | DNS-Probe zum Nachweis vom Human-Parainfluenza-Typ-2-Virus |
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