JPH0323000A - ヒトパラインフルエンザ２型ウイルス同定用検査薬に用いるｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトパラインフルエンザ２型ウイルス同定用
検査薬に用いるＤＮＡ断片に関し、より詳しくは、ヒト
バラインフルエンザ２型ウイルス（以下、ＰＩＶ−２と
略称する）ヘムアグルヂニンノイラミニダーゼ（以下、
ＨＮと略称する）の遺伝子ＲＮＡに相浦性を示すＤＮＡ
断片に間する。

〔従来の技術及びその問題点〕

従来、ウイルスは、血清学的性状に基づいて同定されて
いる．その主な方法としてエンザイムリンクドイムノソ
ルベントアッセイ法（以下、ＥＬＩＳＡ法と略称する）
、中和反応法、補体結合反応法、血球１集抑制反応法、
蛍光抗体法、寒天内沈降反応法等があるが、これらいず
れの万ｌ去も検体中のウイルスに対する抗体を測定する
ことにより判定を行うものであって、確度の高い判定を
行うためには、一般的に感ｔ！１週間後のウイルス抗体
価が上昇し始める段階で行わなければならず、場合によ
っては、さらに数週間後に再測定を行って確認すること
が必要であり、従って、発症前及び早Ｕ診断が難しいと
いう問題点がある。

通常、ＰＩＶ−２（７）測定にはＥＬ　Ｉ　ＳＡ法が用
いられており、この方法は、検体中のＰＩＶ−２に対す
る抗体を測定するもので、例えば、ＰｚＶ−２を固定化
したプレートに、被検体を加え反応させた後洗浄し、さ
らに抗ＰＩＶ−２抗体を加え同様にして反応させ、次い
で酵素標識抗体を加えて反応後、発色させることにより
測定するものであるが、この方法も上記同様発症前及び
早期診断が難しいという問題点を有している． 本発明は、」４記のような問題点の解決を目的とするも
ので、ＰＩＶ−２！＠染症の早期診断を可能にする検査
薬に有用なＤＮＡ断片を提供するものである． 〔問題を解決するための手段〕 本発明は、下記［式］、 ［式］　；　ＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＴＴＡ＾ＧＧＴＧＴ
ＣＧＴＡＡＣＧＴＣＴＣＧＴＧＡＣＡＣＣＧＧＧＴＴＣ
ＡＧＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＡＣＣＣＡ
ＡＴＴＴＡＡＣ＾ＣＣＣＡＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＧＡ
ＡＣＡＣＡＧＴＡＴＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＣＡＡＡＡＧ
ＡＣＣＴＣＡＡＡＡＡＣＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＧＡ丁
ＣＣＡＣＴＣＡＡＣＡＴＡＴＡＡＴＴＧＴ＾＾ＧＡＴＴ
ＡＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＡＡＧＡＴＴＡＣＡＧＣＡＡＴ
ＣＴＡＴＣＴＣＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＡ
ＧＧＡＣＡＴＧＴＡＧ＾＾ＴＣＡＴＴＴＴＣＣＧＡＡＣ
ＴＧＣＣＡＣＡＡＴＴＣＴＴＧＧ＾＾ＴＡＴＧＣＡＣＡ
ＴＴＧＡＴＴＧＴＴＣＴＡＴＧＴＴＣＡＡＧＴＡＴＴＣ
７ＴＣＡＴＧＡＧＡＴＡＡＴＴＣＡＴＣＴＴＧＡＴＧＴ
ＴＴＣＣＴＣＴＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＧＡＴ
ＧＡＴＴＣＡＣ＾ＧＣＡＡＧＧＣＡＴＴＡＴＴＣで表さ
れるＤＮＡ断片を提供することによって、Ｐ　Ｉ　Ｖ−
２感染症の発症前及び早期診断が難しいという問題点の
解決を図ったものである．本発明によって提供されるＤ
ＮＡ断片は、ＰＩＶ−２●ＨＮの遺伝子ＲＮＡに相補性
を示すので、これをＰＩＶ−２同定用検査薬に用いた場
合、ＰＩＶ−２の同定を直接行うことができ、従来の間
接的同定法による問題点の解決を可能にしたものである
． 本発明における上記［式］で表されるＤＮＡ断片の製造
方法は、特に制限はなく、常法に従うことができ、例え
ば、 （ａ）ＰＩＶ−２ｇ染細胞から得られるｍＲ　ＮＡより
調製されたｃＤＮＡを大腸菌のブラスミトベクター等の
適当なベクターに導入し大腸菌にクローン化させ、 ■ブロープとしてヌクレオカブシドＲＮＡを用いてスク
リーニングを行う方法、 ■ブロープとして上記式で表される塩基配列に基づいて
合成されたオリゴヌクレオチドを用いてスクｌ／−ニン
グを行う方法、 ■ＰＩＶ−２に対する抗体を用いてスクリーニングを行
う方法、 等でＰＩＶ−２・Ｉ　Ｎ遺伝子をコードするクローンを
単離し、この単離されたクローンのブラスミドからイン
サートＤＮＡを分離する方法、（ｔ））上記［式］で表
されるＰＩＶ−２・ＨＮの遺伝子ＲＮＡに相浦性を示す
塩基配列に基づいて、ホスホアミダイト｝去（Ｎａｔｕ
ｒｅ、３１０巻、　１０５頁、　１９８４）に従って、
合成ヌクレオチドを作成する方法、 （ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）を併用する方法、等によっ
て製造することができる． 上記方法によって得られた本発明のＤＮＡ断片は、以下
のようにして用いることができる．例えば、上記方法で
得られたＤＮＡ断片は、必要ならば適当な制限酵素（例
えば、ＰｓｔｌＳ　ＥｃｏＲ１等）で十数塩基以上にさ
らに切断後、故射性同位元素等で標識して検査薬とし、
この検査薬を、検体く咽頭液等）から抽出したＲＮＡを
固定化したナイロン膜等と反応後、オートラジオグラフ
ィー等で判定するノーザンハイブリダイゼーション法（
以下、ノーザン法と略称する）等てＰＩＶ−２の同定を
行うことができる。

〔実施例〕

以下、実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する
． ΩユＲＮΔＪ８ま１ 牛胎児血清６％を含むイーグル必須培養液中でべ口細胞
を増殖させた後、この培養液を新たに調整したアクチノ
マイシンＤ（２μｇ／ｎｌ）を含むイーグル必須培ＩＩ
液と交換しｋ．次いでＰＩＶ−２（東芝株〉を接種し、
同培養液中で２４時間培真を行なった．ウイルス感染培
養細胞をトリブシン／ＥＤＴＡｔｊｆｆ合液で剥した後
、８０００　ｒ　ｐｍで１０分間遠心することにより細
胞を集め、グアニジンイソチオシアネート液（６Ｍグア
ニジンイソチオシアネート、５ｍＭクエン酸ナトリウム
、０．ＩＭ２−メルカブトエタノール、０．５％ラウロ
イルザルコシン酸ナトリウム）を加え、ホモゲナイザー
中で素早く溶解し、２１Ｇ注射針をつけた注射筒に５回
通すことで染色体ＤＮＡをせん断した。得られた細胞溶
解液を、再度８０００ｒｐｍで遠心し、得られた上澄液
９ｍｌを、５．７Ｍ塩化セシウム水溶液３摺１の入った
別の遠心チューブに重層し、ベックマンローター（Ｂｅ
ｃｋｍａｎＳＷ４０Ｔｉ　　　ｒｏｔｏｒ）　　にて、
　３７０００ｒｐｍで１８時間１８℃で超遠心を行い、
遠心後ＲＮＡベレットを回収した。

上記のようにして得られるＲＮＡから、オリゴｄＴセル
ローズＴｙｐｅ７　（ファルマシア（Ｐｈ３ｒｍａｃｉ
ａ）社製）を用いてポリＡＭを含むｍＲＮＡ　（以下、
ｐｏ　ｌｙ　（Ａ＋）ＲＮＡと略称する〕を分離、精製
した。

２　　ｃＤＮＡラ　　ーリーの ｃＤＮＡライブラリーは、岡山・バーグ法に従い合成し
た．すなわち、上記ｐｏｌｙ（Ａ＋）ＲＮＡ４μｇに蒸
留水５μ１を加え、６５℃で１０分間加温した後急冷し
、次にオリゴｄＴプライムドベクター（ｐＵｃ１１Ｂベ
クターのＫｐｎｌサイトにオリゴｄＴを付加した（０．
８〜１．２μ８７μ！））１０μ１、合成反応液（５０
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−塩酸纏衝液ｐＨ８．３、３００ｍ
Ｍ塩化カリウム、８０ｍＭ塩化マグネシウム、３ｍＭジ
チオスレイトール）３μ１、及び、２０ｍＭｄＡＴＰ、
２０ｍＭｄＣＴＰ，２０ｍＭｄＧＴＰ，２０ｍＭｄＴＴ
Ｐを各々１ｌ１１づつ加え、さらに２０ｕｎｉｔｓＲＮ
ａｓｉｎ，４０ｕｎｉｔｓリバーストランスクリブター
ゼを加えた後、蒸留水で全量を３０μｌとし、４２℃３
０分間反応を行い第一＠　ｃ　ＤＮＡを合成した．第一
鎖ｃ　ＤＮＡ合成終了後、ｄＧＴＰ存在下ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを用いて１０
〜３０個のｄＧ塩基を付加した．次に制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩによる消化を行い、さらにｄＣ塩基鎖を持つリン
カーとアニール後、大腸菌ライゲースにより閉環状とし
た．最後にＲＮａｓｅＨ存在下、ＤＮＡポリメラーゼに
より第二鎖の合成を行い、完全なプラスミドＤ　Ｎ　Ａ
を作成した．次に塩化カルシウム処理を施すことにより
得られるコンペテント細胞（ＤＨ１）１００〜２００μ
１に、０．４Ｍ塩化マグネシウム／０．１Ｍ塩化カルシ
ウムの混合液ｌＯμ１、及び、上記ＤＮＡ０．０２μｇ
を加え、Ｏ℃で４０分間次いで４２℃で９０秒問放置し
、次に培ＩＩ液（バクトトリブトン１０ｇ，　　イース
トイクストラク｝　５　ｇ，　　塩化ナトリウム５ｇを
１０００ｍｌの蒸留水に溶解した溶液）１．５ｍｌを加
え、３７℃で４０分間放置することにより形質転換細胞
を得た．上記により２００μ１のコンペテント細胞（Ｄ
Ｈ１）に、０．０２μｇのブラスミドＤＮＡを導入する
ことにより、アンビシリン存在下で１　４００個の独立
したクローンを得た． ３　　クレ　　　シ”ＲＮＡブロー　のＰＩＶ−２ｇ染
ベロ細胞に、０．６％ノニデットＰ−４０、１０ｍＭバ
ナジルリボヌクレオチド複合体を含む１Ｍ（０．１５Ｍ
塩化ナトリウム、０．０５ＭＴｒｉｓ−塩酸縫衝液）を
加え、水中で１時間ビベティングによる可溶化を行い、
８０００ｒｐｍで１０分間遠心した．次いで塩化セシウ
ムの４０％水溶液、３０％水溶液、２５％水溶γ夜の各
々ｌｍｌ、２　．５　ｍｌ，　１　ｍｌをこの順に重層
した遠心チューブに、上記遠心で得られた上澄液９ｍｌ
をさらに重層し、ベックマンロータ−ＳＷ４０Ｔｉにて
、３７０００ｒｐｍ，１８時間１６℃で平衡密度勾配遠
心を行った。遠心後、３０％の塩化セシウム水溶液層に
生じたウイルスのヌクレオカブシドバンドを回収した。

次に０．１％ＳＤＳ及びブロテイナーゼＫ　（２．５ｍ
ｇ／ｎ＋Ｉ）を加え、５６℃１５分問蛋白分解を行った
後、フェノール及びフェノール／クロロホルム混液で処
理を行い、ヌクレオカブシドＲＮＡを得た。得られたヌ
クレオカプシドＲＮＡに５　０ｍＭＴ　ｒ　ｉ　ｓ−塩
酸緩衝ＭｐＨ９．７を加え、９５℃ｌＯ分間加温した後
室温まで徐々に冷やした．次にこのＲＮＡ溶液２０μｌ
に緩衝液（２５０ｍＭＴｒｉｓ一塩酸、５０ｍＭ塩化マ
グネシウム、２５ｍＭＤＴＴ，７．５ｍＭスペルミン、
５００ｍＭ塩化カリウム）１０μ１、及び３２ＰＡＴＰ
　（１　００μＣｉ／［３００ｐＭ）３μ１、Ｔ　４−
　Ｄ　Ｎ　Ａ力イネース２ｕｎｉｔｓを加えた後、蒸留
水で全量を６０μ１とし、３７℃で１時間反応させヌク
レオカブシドＲＮＡプローブを得た． ４　コロニーハ　　リ　　ゼー・゛ヨゝ上記の形質転換
細胞１００〜２００μｌを、アンビシリン（１２０μｓ
／ｓｌ）を含む１５ｃｍの寒天プレート（１　０ｇバク
トトリブトン、５ｇイーストイクストラクト、５ｇ塩化
ナトリウム、１５ｇアガーを加え蒸留水で全量を１００
０ｍｌとした〉に蒔き、１２時間３７℃で培養した．ニ
トロセルロース躾に生じたコロニーを写し取り、３７℃
で６時間培養した．次にこの膜を、０．５Ｎ水酸化ナト
リウム／１．５Ｍ塩化ナトリウム混合液で１０分間処理
し、さらに１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５ＭＴｒ
ｉｓ−塩酸緩衝液ｐＨ８．０にｌＯ分間置いた後、０．
３Ｍ塩化ナトリウム７０．０３Ｍクエン酸ナトリウム混
合液中で５分間リンスした．リンス後、膜を風屹し、８
０℃で１時間吸引しながらベーキングを行うことにより
ＤＮＡを膜に固定した． このようにして得られた膜５枚当りに、変性鮭Ｒ　ＮＡ
　（　１　ｍｇ／ａ＋ｌ）ｔ　ｍｌ、ＳＳＰＥ液（３．
６Ｍ塩化ナトリウム、２００ｍＭ第一りん酸ナトリウム
、２　０ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ）７．５ｇｍｌ、デンハー
ド液（２％ＢＳＡ，２％Ｆ五ｃａｌｌ，２％ポリビニル
ビロリドン）！．２５ｏ１、　１０％ＳＤＳ１．２５ｍ
ｌからなるプレハイブリダイゼーション液を加え、４２
’ＣＩ２時間反応させ、次に新たに調製した上記ブレハ
イブリダイゼーション液に上記ヌクレオカブシドＲＮＡ
ブローブを、５００万Ｃｉ／ｍｌとなるように加え、４
２℃で１８時間反応を行った。反応終了後、０．１％Ｓ
ＤＳを含む２０倍希釈のＳＳＰＥ液中で４２℃５分間２
回洗浄し、次に０．ｌ％ＳＤＳを含む２００倍希釈のＳ
ＳＰＥ液中で４２℃１５分間２回洗浄を行った．洗浄終
了後、膜を風乾し、Ｘ線フィルム（ＲＸＩ５、コッダク
社！！）を用いて、−８０℃１２時間オートラヂオグラ
フィーを行い、数個の陽性クローンを得た．但とＬニヱ
２丑 上記の陽性クローンを用いてノーザン法を行った．すな
わち、前記（１〉の方法で得られたＰＩＶ・２感染細胞
由来ｐｏ　ｌｙ　（Ａ＋）ＲＮＡ，　　ウイルス非感染
細胞由来ｐｏ　ｌｙ　（Ａ＋）ＲＮＡ及びｒＲＮＡマー
カーを、各々１．５％アガロースゲル中で電気泳勤後、
ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社ｌ１＞に
転写し、風乾後ＵＶ照射をすることによりＲＮＡをナイ
ロン膜に共有結合させ、次に上記の各陽性クローンをブ
ロープとして各々パイプリダイゼーションを行った． すなわち、ナイロン膜を上記プレハイブリダイゼーショ
ン液中で４２℃１２時間反応させ、次に各陽性クローン
から作られた３２ｐでラベルされたブローブを１００万
ＣＬ／ｍｌとなるようにブレハイブリダイゼーション液
に加え、４２℃１８時間反応させた．反応終了後、上記
（４）と同様に洗浄を行い、Ｘ線フィルムを用いてオー
トラジオグラフィーを行い、その結果２１００ｂａｓｅ
の位置にハイブリダイズするクローンを１個得た．この
クローンをｐＭ２Ｈと命名した． なお、各陽性クローンのブロープは、各クローンをＩ｛
ｉｎｄｍ及びＥｃｏＲＩで消化後、低融点アガロースを
用いた電ス泳勤によりインサートＤＮＡを分離し、抽出
後、３２Ｐ　ｄ　Ｃ　Ｔ　Ｐを用いたランダムプライム
ラベルにより得た． 上記（５〉で得られたクローンｐＭ２Ｈを種々の制限酵
素で切断して、その制限酵素地図を作成し、第１図にそ
の結果を示した．図において１及び５はベクターＤＮＡ
，４及び６はノンコーディングノージョン、２及び３は
コーディングリージョンであり、その中で２及び６は本
発明に係わるＰＩＶ−２・ＨＮの遺伝子ＲＮＡに相補性
を示すＤＮＡ断片である． 第ｌ図に従ってクローンｐ　Ｍ　２　Ｈを各制限酵素で
切断後、得られたフラグメントをブラスミドｐＵＣ１１
Ｂのマルチクローニングサイトに各々導入シ、ＳＥＱＵ
ＥＮＡＳＥ▼’キッ｝（東洋紡社！！）を用いてシーク
エンスを行った．又、一部はキロシークエンス用デレー
ションキット（宝酒造社製〉を用いてデレーションミュ
ータントを作成し、シークエンスを行い塩基配列を決定
した．その結果は、前記［式］に示す通りであった。

７　　　への　　　ＰＩＶ−２の 上記（４）で得られたｐＭ２Ｈクローンを、Ｐｓｔｌで
切断後、低融点アガロースを用いた電気泳動によりイン
サートＤＮＡの一部を分離、抽出し、３２ｐを用いたラ
ンダムプライムラベリングによりブローベを作成した．
次に、前記（１）の方法で得られたＰＩＶ−２感染細胞
由来ＲＮＡ、ウイルス非感染細胞由来ＲＮＡｌｔ０．３
５μｇづつナイロン膜にプロットした後、風乾、ＵＶ照
射、以降の処理は上記（５）のノーザン法と全く同様に
して反応させラジオオートグラフィーを行った。その結
果、第２図のｂで示すようにＰＩＶ−２感染細胞由来Ｒ
ＮＡをプロットした部分に反応が認められ、ＰＩ　Ｖ−
２に感染していることが確認された．これに対して、ウ
イルス非感染細胞由来ＲＮＡをプロットした部分（第２
図のａで示す部分）には反応が全く認められなかった． 〔発明の効果〕 本発明によって提供される、前記［式］で表さｔｉＤＮ
Ａ断片は、Ｐ　ＩＶ−２−ＨＮ（１）遺伝子ＲＮＡに特
異的に相補性を示すので、Ｐ　Ｉ　Ｖ−２感染症の早Ｕ
４診断の検査薬に極めて有用に用いることができる． ４．図面の簡単な説明 第１１！Ｉは、上記［式］で表されるＰＩＶ−２・ＨＮ
遺伝子に相補性を示すＤＮＡ（ｐＭ２Ｈ）のｃＤＮＡ領
域の制限酵素地図、第２図はＰＩＶ−２による感染及び
非感染の判定結果である。

１、５●●◆・●●ベクターＤ　Ｎ　Ａ，４、６・●・
◆・・ノンコーディングリージョン、２、３●●＠４ｈ
コーディングリージョンつ特許出願人　藤倉化成株式会
社 第１図 手続補正書く方式） 平成　ｌ年１０月２０日 特許庁長官　　吉　田　文　毅　　殿 １．事件の表示 平成　１年特許願第１５４７４６号 ２．発明の名称 ヒトパラインフルエンザ２型ウィルス同定用検査薬に用
いるＤＮＡ断片 ３．補正をする者 事件との関係　　特許出願人 （電話　０３−　９６６−　５１４１）６．補正の内容 （１）明細書第１６頁第１１、１２行の「第２図はＰＩ
Ｖ−２による感染及び非感染の判定結果である．」を削
除する． 〈２〉図面の「第２図」を削除する。

手続補正書 平成 特許庁長官 事件の表示 （自発） １年１０月２０日 平成 ｌ年特許穎第１５４７４６号 発明の名称 ヒトバラインフルエンザ２型ウィルス同定用検査薬に用
いるＤＮＡ断片 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 イタハ゛シクハスネ 住　　所　　東京都板橋区蓮根３丁目２５番３号フシー
クラ　ｈ　　セイ 名　称　藤倉化成株式会社 ５． 補正の内容 手続補正書 （自Ｍ） （１） 明！ａ書第１５頁第１６行の「第２図のｂで示す平成 ２年 ９月１７日 ように」 を削除する。

特許庁長官 （２） 明ｍ書第１５頁第１７行のｒ部分に反応が」を 事件の表示 ｒ部分には、 試料中のＰＩＶ−２ウィルスＲＮＡ とハイブリッドを形成した同ブローブにより生じ平成 ｌ年特許願第１５４７４６号 る陽性シグナルが」 と補正する． 発明の名称 （３） 明繍書第１５頁末行の「 （第２図のａで示す部 分）」 を削除する． ヒトバラインフルエンザ２型ウィルス同定用検査薬に用
いるＤＮＡ断片 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 イタノビノクＪ１スネ 住　　所　　東京都板橋区蓮根３丁目２５番３号フシ゛
クラ　ｈ　　セイ 名　称　藤倉化成株式会社 補正の対象 明細書の「特許請求の範囲」及び「発明の詳細な６．補
正の内容 （１）特許請求の範囲の全文を別紙の通りに補正する． （２〉　明細書第３頁第１３行において、　ｒ本発明は
、下記［式］、」とあるを、　ｒ本発明は、ＤＮＡを構
成する塩基配列の全部または一部が、下記［式］』と補
正する。

（３）明細書第４頁第３行において、　「で表されるＤ
ＮＡ断片」とあるを、　『の全部または一部で表される
単位であるＤＮＡ断片」と補正する．（４）明細書第４
頁第５行の次に、以下の文章を加入する． ｒ　本発明におけるＤＮＡ断片は、上記［式］の全部ま
たは一部で表される単位のみで構成されていてもよく、
また、該単位が他の適宜なＩ）ＮＡベクターに組み込ま
れた状態で構成されていてもよい。　』 （６）明繍書第１２頁第１７行において、　「コツダク
社」とあるを、　「コダック社」と補正する．（６）明
細書第１５頁第５行の次に、以下の文章を加入する． ｆ（７−１）　　上記［式コの１番から３６６番で表さ
れるＤＮＡ断片を用いる場合：ｊ （７）明細書第１６頁第１行の次に、以下の文章を加入
する． ｒ（７−２）　　上記［式］（７）１２９番から２１４
番で表されるＤＮＡ断片を用いる場合； ｐＭ２Ｈクローンを、Ａｌｕ　　Ｉ　　とＡｆｌｌＴＩ
で切断後、低融点アガロースを用いた電気泳勤により約
８５塩基対の位置に泳動されるバンドを切り出し、ＤＮ
Ａ断片を抽出した後、エタノール沈置によりＤＮＡ′Ｉ
ｔ回収しｋ． 得られたＤＮＡ断片はランダムプライムラベリングによ
りプローブとした．すなわち、ＤＮＡ断片０．１μｇに
蒸留水１０μｌ　を加え、沸騰水中で２分間置き急冷し
、次に牛血清アルブミン１μ＋　（１　０ｍ，ｇ／ｍ　
Ｉ）、ランダム液（０．４４ＭＨＥＰＥＳ　　ｐＨ８．
６、　１１０ｍＭＴｒｉｓ一塩酸ｐＨ８、　１　１ｍＭ
　　ＭｇＣ　１２、　２２ｍＭ２−メルカブトエタノー
ル、４４μＭ　　ｄＡＴＰ，４４　　μＭ　　ｄＧＴＰ
，　　４４μＭ　　ｄＴＴＰ．　　０．１２ｍＭＴｒｉ
ｓ−塩酸　ｐＨ７．５、０．１２ｍＭ″’ＥＤＴＡ，ｌ
ｌｕｎｉｔｓ／ｍｌオリゴヌクレオチドｐｄ（Ｎ）ｅ（
ファルマシア株式会社１！））１１．４μ１、（α３２
Ｐ）ｄＣＴＰ　　５μｌ（１００μＣｉ／６００ｐＭ）
、クレノウ２．５ｕｎｉｔｓを加え、室温で６時間反応
させ、得られた反応液をＢｉｏ−ｇｅｌ　　Ｐ６０によ
り精製しブローブとした。

次に、上記（１）の方法で得られたＰＩＶ−２感染綱胞
由来ＲＮＡ、ウイルス非感染細胞由来ＲＮＡを０．３５
μｇ　ずつナイロン膜にプロットした後、風乾、ＵＶ照
射し、上記（５）のプレハイブリダイゼーション液中で
４２℃で１２時間反応させた．次に沸騰水浴中で２分間
置いた後急冷処理を施した先のブローブを１００万Ｃｉ
／ｍｌとなるように加え、さらに４２℃で１８時間反応
させた。

反応終了後、０．１％　ＳＤＳを含む２０倍希釈のＳＳ
ＰＥ液中で４２℃で５分間、２回洗浄し、次に０．１％
ＳＯＳを含む２００倍希釈のＳＳＰＥ液中で４２℃で１
５分間、２回洗浄を行った。洗浄終了後、膜を風乾し、
Ｘ線フイルムを用いて−８０℃で１２時間オートラジオ
グラフイーを行つた． その結果、ＰＩＶ−２感染細胞由来ＲＮＡをプロットし
た部分には試料中のＰＴＶ−２ウイルスＲＮＡとハイブ
リッドを形成した同ブローブにより生じる陽性シグナル
が認められ、ＰＩＶ−２に感染していることが確認され
た。

これに対してウイルス非感巣繍胞由来ＲＮＡをプロット
した部分には反応が全く認められなかった． （７−３）　　上記［式］の１５０番から１６８番で表
される塩基配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチ
ドを用いる墳合； 上記［式］で示される塩基配列に基づいて十数塩基以上
のオリゴヌクレオチドを合成してブローブとすることが
できる． ＤＮＡ合成機（ＤＮＡシンセサイザー　モデル３８１Ａ
（アブライドバイオシステムズジャパン株式会社ｉｔ）
）を用いて合成したオリゴヌクレオチド（５’　−ＡＡ
ＴＴＧＴＡＡＧＡＴＴＡＡＴＡＡＴＡ−３’　）を、オ
リゴヌクレオチド精製カートリッジ（アブライドバイオ
システムズジャパン株式会社製）を用いて精製した． 得られた合成オリゴヌクレオチド１μｌ（１０ｐｍｏ　
ｌ　ｅ　ｓ／ｕ　ｌ）当り、緩衝液（０．５Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−塩酸ｐＨ７．６、０．１Ｍ　ＭｇＣ　１２、５０ｍ
Ｍ　ヂチオスレイトール、１ｍＭ　スベルミジン塩酸、
１ｍＭ　ＥＤＴＡ）２，ｕ　１，　　蒸留水１１．４μ
１、（ｙ３２−Ｐ）ＡＴＰ　　５μ１　（２ｎｍｏ　１
ｅｓ／μ１）、バクテリオファージＴ４ボリヌクレオチ
ドキナーゼ８ｕｎ　ｉ　ｔを加えｋ後、３７℃で４５分
間反応した．次に反応液をＢｉｏ−ｇｅｌＰ８０により
精製し、得られた精製品をブローブとして用いた． 次に、上記（１）の方法で得られたＰＩＶ−２ｇ染細胞
由来Ｒ　Ｎ　Ａ，　　ウイルス非感染細胞由来ＲＮＡを
０．３５μｇずつナイロン膜にプロットした後、風乾、
ＵＶＮ射し、上記（５）のプレハイブリダイゼーション
液中で４２℃で１２時間反応させた．次に先のブローブ
を１００万Ｃｉ／ｍｌとなるように加え、さらに４２℃
で１８時間反応させた。反応終了後、０．１％　ＳＤＳ
を含む２０倍希釈のＳＳＰＥ液中で４２℃で５分間、２
回洗浄し、次に０．１％ＳＤＳを含む２００倍希釈のＳ
ＳＰＥ液中で４２℃で１５分間、２回洗浄を行った。

洗浄終了後、膜を風乾し、Ｘ線フィルムを用いて−８０
℃で１２時間オートラジオグラフィーを行った． その結果、ＰＩＶ−２感染細胞由来ＲＮＡをプロットし
た部分には試料中のＰＩＶ−２ウイルスＲＮＡとハイブ
リッドを形成した同ブローブにより生じる陽性シグナル
が認められ、ＰＩＶ−２に感染していることが確認され
た。

これに対してウイルス非感染繕胞由来ＲＮＡをプロット
した部分には反応が全く認められなかった．　１ 別　　　紙 特許請求の範囲 ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　の　　　　　　
　　一下記［式コ肛Ｌ益工上旦二１で表される亀血工邊
玉ヒトバラインフルエンザ２型ウイルス同定用検査薬に
用いるＤＮＡ断片。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記［式］で表わされるヒトパラインフルエンザ２型ウ
   ィルス同定用検査薬に用いるＤＮＡ断片。 ［式］；ＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＴＴＡＡＧＧＴＧＴＣＧ
   ＴＡＡＣＧＴＣＴＣＧＴＧＡＣＡＣＣＧＧＧＴＴＣＡＧ
   ＴＴＣＡＡＡＴＡＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＡＣＣＣＡＡＴ
   ＴＴＡＡＣＡＣＣＣＡＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＡＧＡＡＣ
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