CN1643148B - 小鼠***形成基因、人男性不育关连基因、以及利用该基因的诊断*** - Google Patents
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Abstract
本发明提供小鼠***形成基因组、属于该小鼠基因组的基因的人同系物、与人男性不育有关的Scot-t基因突变和鱼精蛋白-2基因突变，所述小鼠***形成基因组为由各个基因转录的mRNA合成的cDNA分别含有序列1-89的各个碱基序列的全89基因的集合。另外提供小鼠***形成基因组和与他有关的各种分子生物学的材料、或与男性不育关连基因突变有关的各种分子生物学的材料、以及使用这些材料的各种试验方法和诊断方法。
Description
技术领域
本申请发明涉及到与小鼠***形成有关的基因(mousespermatogenesis gene：以下有时记为“MSG”)的集合(基因组：MSGs)，使用这一MSGs的诊断***。更详细地讲，本申请发明涉及到以使用属于MSGs的各基因和基因材料(纯化多核苷酸、作为基因表达产物的多肽、抗体等)，对MSG的表达异常、突变、氨基酸取代等进行检测为特征的毒性试验、突变原性试验、以及基因诊断等各个方法。这一发明方法可以用于药品和化学品的突变原性试验和毒性试验(包括影响生殖的试验)、或环境激素或内分泌紊乱的检测·环境测定以及环境评价。另外，本发明的基因和基因材料、以及各个方法发明对与***的诊断·治疗·予防的方法有关的医疗技术的开发、以及其诊断剂·治疗药·预防药或避孕药的开发都有贡献。
另外，本申请发明涉及到以作为上述MSGs中含有的小鼠基因的人同系物的人男性不育关连基因的突变或表达变化，以及这些基因多型作为检查对象的男性不育的诊断方法。更详细地讲，涉及到由于点突变或基因多型为特征的来自男性不育关连基因的突变多核苷酸，作为其基因产物的突变多肽、以及以这些突变多核苷酸或突变多肽作为对象的男性不育的诊断方法。另外，本发明与上述小鼠MSG同样使用以由人同系物的信息为基础的基因材料，是对男性不育的诊断、治疗和予防有关的医疗技术的开发，或者该诊断剂、治疗药、预防药或避孕药的开发做出贡献的发明。
背景技术
小鼠***形成基因
自从内分泌紊乱(有时记为endocrione disruptors：以下记为“ED”)这一概念提倡(1997年)以来，由于这个ED引起***数减少或生殖功能障碍等诱发的危险性已广为人知，在提高人类存亡的危机意识的同时，通过MSDS(material safety data sheet)和PRTR(pollutantrelease and transfer registers)等的展开加快全球环保对策，ED的检测或测定方法、ED对生物体的影响的确认已经成为当务之急的课题。而涉及到药品、化学药品、化学品、化学物质等的以往的“对生殖的影响”的试验只不过是以致畸性为指标的试验。然而，为了避免、消除由于ED诱发生殖功能障碍逼迫的危险性，仅靠以往的致畸性试验是不完备而且不足的，在包括有关“对生殖的影响”的试验的毒性试验中，有必要追加“对哺乳动物的***形成基因或其人同源基因的突变原性”的检测、或者对***和其分化·***形成过程影响的试验(例如、使用以在小鼠***或体外中的MSG的表达异常、突变、氨基酸取代等作为指标的毒性试验和鉴定)，人们认为这些是切实的必需课题。
然而，目前有关以***形成基因的表达异常或突变为指标的毒性试验(影响生殖的试验)、突变原性试验、ED检测等技术还不清楚。其原因是由于可用作试验对象的***形成基因还没有被特定的缘故。
另外，在以日本为首的欧美先进诸国中，约10％的夫妇经历了某些形式的不育问题，其中约半数可能起因于男性方面的原因。男性不育的一部分因素有内分泌障碍、包括染色体异常在内的遗传因素、环境因素、包括潜伏***和精索静脉瘤在内的畸形等(Rubio C，et al.HumanReprod 2001；10：2084-2092；Lee PA，et al.(2000)J Urol.，164(5)，1697-1701)。然而，男性不育的大部分原因是不充分的***形成或***缺失，该问题的原因到现在还没有阐明(Cram DS，et al.(2001)JAndrol 22(5)，738-746)。而男性不育中虽然存在认为与各种各样的遗传因素有关的事例(Thielemans BFJ，et al.Eur.J.Obst Gynec 1998；81：217-225)，而所有这些事例并非都是由原因基因特定的。***的诊断、治疗、予防的方法的确立(例如、基因诊断和根据诊断的结果达到基因治疗、药物疗法、予防)是给人类带来多大福音的期望课题。另外想起发展中国家的伴随多出生率的贫困、饥饿和营养失调、爱滋病等传染病的蔓延等时，认为避孕药的开发也是重要课题。
如上所述，对毒性试验和通过突变原性试验进行的ED等的效果的检测、或***的确实的诊断，以***形成基因为对象的分子生物学的手段是不可缺的。然而，目前，在这样的试验中可以使用的***形成基因(组)还没有特定，当然、用于将那样的基因(组)应用于各种试验的手段也没有任何提案。
本申请发明是鉴于以上所述事情做出的发明，作为课题提供在与ED检测等有关的毒性试验、突变原性试验或基因诊断中可使用的小鼠***形成基因组(MSGs)、以及用于实施那样试验的材料的纯化多核苷酸、多肽、和抗体等。
另外本申请发明作为课题提供使用MSGs的毒性试验、突变原性试验和基因诊断的各个方法。
人男性不育关连基因突变
本申请发明者就属于上述MSGs的小鼠基因的人同系物与男性不育的关系进行了广泛的调查，结果发现在人Scot-t基因和鱼精蛋白基因中特定的突变和男性不育的关系。而有关Scot-t基因和鱼精蛋白基因与男性不育的关系人们了解的信息如下。
琥珀酰CoA：3-氧代酸CoA转移酶(OXCT/SCOT)是酮体的能量代谢中重要的酶之一，该酮体在肝脏中生产，被输送到末梢组织用作能源(Mitchell GA，et al.Clin.Invest.Med.1995；18：193-216)。琥珀酰CoA转移酶(SCOT)局布分布于几个组织的线粒体内，使CoA部分由琥珀酰CoA转移到乙酰乙酸催化生成乙酰乙酰CoA，乙酰乙酰CoA再被分解，生成可进入三羧酸循环的2个乙酰CoA分子(Williamson，D.H.，et al.(1971)Biochem.J.，121，41-47；Tildon JT，et al.JClinic Invest 1972；51：493-498)。Scot的cDNA可由猪和人心脏克隆(Lin，T.W.and Bridger，W.A.(1992)J.Biol.Chem.，267，975-978；Kassovska-Bratinova S，et al.Am J Hum Genet 1996；59：519-528)，到目前为止，本申请发明者等可从小鼠***的差分化cDNA文库克隆取名为编码单倍体生殖细胞特异的SCOT的scot-t的新基因(Koga M，et al.Biol Reprod 2000；63：1601-1609)。SCOT-t是对生殖细胞特异的SCOT的同种型，存在于单倍体***和***的线粒体中，认为在***形成和***的能量代谢中也起着特有的作用。通过northern blot、western blot和免疫组织科学的分析，小鼠scot-t的表达虽然在***(特别是后期***细胞)中检测到，但在前体的体细胞中没有检测到。小鼠scot-t的核苷酸序列对猪和人心脏的Scot的同源性分别为63.4％和62.7％，推定的氨基酸序列分别具有68.0％和67.4％的同源性。SCOT-t的NH2末端的1-39残基形成以线粒体为靶的信号肽序列。免疫荧光染色表明处于由附睾尾部得到的固定***中的SCOT-t蛋白质实际上分布在线粒体(Koga M，et al.Biol Reprod 2000；63：1601-1609)。在SCOT-t的氨基酸序列中虽然存在一个谷氨酸残基(氨基酸残基：341)，该残基对应于已知在包括SCOT在内的所有CoA转移酶中都保存的谷氨酸344(Rochet JC，Bridger WA.(1994)Protein Sci.，3，975-81)。本申请发明者还对进行了小鼠scot-t的人直向同源基因的克隆，并进行了特征分析。人Scot-t的mRNA的整个编码区和推定氨基酸序列相对于小鼠scot-t分别表现出75.4％和75.8％的同源性。同样发明者研究表明h-Scot-t是不含有内含子的单一基因，并在***内特异表达(Tanaka H，et al.Mol Human Reprod 2001；8：16-23)。
线粒体酶在***的运动性和功能的能量代谢中的重要性有几个报道(Pascual，M.I.，et al.(1996)Biosci.Rep.，16，35-40；Yeung，C.H.，et al.(1996)Mol.Hum.Reprod.，2，591-596；Ruiz-Pesini，E.，et al.(1998)Clin.Chem.，44，1616-1620)。Scot-t特异存在的事实表明利用酮体作为***运动能源的新代谢体系的存在。还表明，Scot-t由于在单倍体的***细胞中特异表达，他在***形成中具有某些特异的作用。
而在***形成阶段，在***核中发生显着的再编成，在该过程中组蛋白被除去，受到特定核蛋白质的取代，最终被带有高正电荷的鱼精蛋白(protamine)取代，被高度压缩(Wouters-Tyrou，D.et al.(1998)Biochimie，80，117-128；Sassone-Corsi P.(2002)Science，296，2176-2178)。人***DNA通过鱼精蛋白-1和-22种鱼精蛋白以高度凝聚的状态集中在***头部。鱼精蛋白-1是含有50个氨基酸的单一的多肽分子，鱼精蛋白-2是至少含有57个和54个氨基酸的2个不同形态的复合体(McKay，D.J.et al.(1986)Eur.J.Biochem.，158，361-366)。鱼精蛋白-2家族蛋白质是以存在于第16染色体的单一拷贝基因为基础，以含有从第66个到第101个之间的残基的前体合成的(Krawetz，S.A.et al.(1989)Genomics.5，639-645；Reeves，R.H.et al.(1989)J.Hered，80，442-446)。
表明作为核浓缩障碍的结果有可能发生男性不育。在小鼠中，鱼精蛋白-1的mRNA早期翻译的结果，发生未成熟的核浓缩，***的分化停止(Lee，K.et al.(1995)Proc.Nat.l.Acad.Sci.USA，92，12451-12455)。在以不育患者为对象的各种各样的研究中，有报道鱼精蛋白-2含量减少(Balhorn，R.et al.(1988)Experientia.，44，52-55；Belokopytova，J.A.et al.(1993)Mol.Reprod.Dev.，34，53-57)、也有报告发现了在一部分男性不育患者的***核中完全有选择的鱼精蛋白-2缺损(de Yeba，L.et al.(1993)J.Biol.Chem.，268：10553-10557)。然而，之后在由这些患者得到的鱼精蛋白-2基因的序列解析结果中没有发现成为被检测的鱼精蛋白-2减少的原因的突变存在(de Yeba，L.et al.(1993)J.Biol.Chem.，268：10553-10557；Schlicker，M.et al.(1994)Hum Reprod.，9，2313-2317)。另外，在一部分不育症患者中由于鱼精蛋白-2前体分子的加工不完全，发生鱼精蛋白-2减少(de Yebra，L.et al.(1998)Fertil Steril.，69，755-759)。
如上所述，已指出Scot-t基因或鱼精蛋白基因的某些突变可能与男性不育有关，但其实质还没有完全阐明。作为人男性不育的原因基因，本申请发明以提供Scot-t基因突变和鱼精蛋白-2基因突变作为课题。
另外本申请发明作为课题提供伴随上述的基因突变表达的突变多肽、抗这些突变多肽的抗体、以及将这些突变基因和突变多肽作为检查对象的男性不育诊断方法。
发明内容
本申请作为用于解决上述课题的发明，提供以下小鼠***形成基因组和利用他们的发明。
即，本发明提供由各基因转录的mRNA合成的cDNA分别具有序列1-89碱基序列的全部89个基因的集合的小鼠***形成基因组。
本发明提供由来自属于上述小鼠***形成基因组的各个基因的cDNA构成的cDNA文库。
本发明提供由属于上述cDNA文库的各cDNA的连续10～99个碱基的碱基序列构成的DNA片段组。
本发明提供用于对属于上述基因组的各基因DNA或属于上述cDNA组的各cDNA进行PCR扩增的一组引物组。
本发明提供备有属于上述cDNA组的1种以上的cDNA、或属于上述DNA片段组的1种以上的DNA片段的微阵列。
本发明还提供作为由序列90-167的各氨基酸序列构成的全部78个多肽的集合的小鼠***形成多肽组。
本发明提供针对属于上述***形成多肽组的各多肽的抗体组。
本发明还提供通过对属于上述小鼠***形成基因组1个以上基因表达异常或突变进行检测，对被检验物质的毒性或突变原性进行试验的方法。
另外本发明还提供通过对属于上述小鼠***形成基因组的1个以上基因表达异常或突变进行检测，对被检验个体的生殖能力进行诊断的方法。
本申请提供通过对属于上述小鼠***形成基因组的1个以上基因表达异常或突变进行检测，对被检验个体的生殖能力进行诊断的方法。
即，上述发明的MSGs是根据“***形成基因的表达异常和突变的检测可以在毒性试验(特别是生殖毒性试验)和突变原性试验中利用”这一构思，通过以下3种主要方法克隆的。
(a)使用单克隆抗体的克隆
制作特异识别***形成各个过程的单克隆抗体，对目的基因(组)进行特定。即，从小鼠***获得细胞提取级分，免疫大小鼠，使充分免疫后得到的脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合做成杂交瘤。为了从得到的各个杂交瘤找出产生特异识别***的抗体的杂交瘤，使用***切片进行反应，对各个杂交瘤的培养上清究竟产生识别什么样抗原的抗体进行筛选，得到产生***特异的抗体的杂交瘤。使用得到的单克隆抗体，从大肠杆菌表达小鼠***文库克隆编码抗体识别抗原蛋白质的基因。
(b)使用多克隆抗体的克隆
制作特异识别***(包括所有分化阶段的细胞)的多克隆抗体，对目的基因(组)进行特定。即，从小鼠***获得***提取级分，对兔充分免疫，将得到的血清注射到去雄的小鼠的腹腔，使其吸收识别***以外的抗体。收集该小鼠的血清成分，再使其与小鼠的肝脏提取级分反应，从大肠杆菌表达小鼠***文库克隆得到的血清中含有的兔抗体识别的抗原基因。
(c)使用扣除文库的克隆
做成浓缩了***特异的基因组的扣除文库，进行在各分化阶段可特异进行表达的基因组的克隆，对得到的各个克隆的功能进行解析。特别是由于***细胞是长期多数存在于动物个体的唯一的单倍体细胞，在这样的***细胞特异表达的基因组分别发挥着用于***形成的特化的功能，所以一并对这些基因组进行克隆，对***形成中的特异现象进行解析。具体来说，做成由具有全部分化阶段的***的35日龄小鼠(C57BL/6)***cDNA文库减去在不带有***细胞的17日龄小鼠***表达的mRNA的扣除文库，由该文库可以得到在***细胞的形态形成期特异表达的基因组。
通过以上(a)～(c)的方法，最终得到合计89个克隆的***特异的基因cDNA(MSGs cDNA)。然后，通过众所周知的方法决定各cDNA克隆的碱基序列，确认这些cDNA是由序列1-89的奇数序列所示碱基序列构成的。另外，对与已经报道的各种碱基序列间的同源性进行检索，发现89个MSG克隆中，已知基因约26％、同源基因为32％、而未知基因也达到了42％。
表1由左到右给出了序列1-89所示碱基序列的全部89个基因的“序列”、“基因名”(众所周知的名称)、“资料库(GenBank)登录编号”、该基因编码的“多肽的序列”、以及该“编码区”。
表1
从上述MSG克隆组中获得了如下(1)～(3)见解。
(1)关于基因结构，MGS的89个克隆中的大多数不含内含子，即使存在内含子，多数都非常少。
(2)很多都不带有TATA、CAAT、GC基元等已知转录关连因子结合序列。
(3)表达时期在***形成的阶段是特异的。例如，在原始生殖细胞→***→***细胞→***细胞(单倍体)→***→直至在雌性生殖管内获得受精能力的过程中，只在***细胞→***的阶段特异表达的基因占多数。
(4)关于表达产物的作用和功能，发现相对于体细胞的生殖细胞中存在特有的同工型，只在***形成的各个阶段，表现出相当特异的活性。例如，只在受精过程中发挥其作用。
这些见解中，与内含子有关的上述(1)和(3)特别重要。即，表明“参与***形成的基因的结构和转录(1)是比较单纯的，突变的检测不困难，而且即使基因中发生突变，其中的(3)表达也仅在生殖细胞就终止，突变性状不会出现在体细胞中，只在生殖中出现的障碍造成不育”，判断为通过对其表达异常或突变进行检测，作为生殖毒性试验或突变原性试验等可以利用。
而表1以及与上述的MSGs有关的见解的一部分详细记载于由本申请发明者发表的以下文献：Int.J.Androl.20：361-366，1997；Gene204：159-163，1997；Genomics 46：138-142，1997；Mammal.Genome 8：873-874，1997；Cytogenet.Cell Gent.78：103-104，1997；Nature387：607-611，1997；Dev.Biol.197：67-76，1998；Biol.Reprod 58：261-265，1998；Gene 237：193-199，1999；J.Biol.Chem.274：17049-17057，1999；FEBS Lett.456：315-321，1999；Genomics 57：94-101，1999；Biol.Reprod.62：1694-1701，2000；Biol.Reprod.63：993-999，2000；Genes Cells 5：265-276，2000；Biol.Reprod.63：1601-1609，2000；Gene 267：49-54，2001；Mol.Human Reprod.7：211-218，2001。
另外本申请提供上述小鼠***形成基因组中含有的基因中的与人男性不育相关连的基因突变的发明以及该基因突变的使用发明。
即，本发明提供作为与由人男性不育关连基因Scot-t转录的mRNA互补的多核苷酸，是在序列168的DNA序列中含有由以下组中选择出来的一个以上突变的多核苷酸或其互补序列。
第129位t取代为c；
第870位t取代为g；
第1071位c取代为t；以及
第1667位t取代为c。
本发明提供作为上述的Scot-t突变多核苷酸的一部分，是由含有其突变位点的连续10～99个碱基的DNA序列构成的Scot-t突变寡核苷酸或其互补序列。
本发明提供上述Scot-t突变多核苷酸或者Scot-t突变寡核苷酸、或来自与这些的互补序列在严格的条件下杂交的人染色体DNA的多核苷酸(Scot-t突变基因组多核苷酸)。
本发明提供用于作为对上述Scot-t突变多核苷酸、Scot-t突变基因组多核苷酸、或由Scot-t突变基因组多核苷酸转录的mRNA进行PCR扩增的引物组，一方引物含有由含有突变位点的连续15～45个碱基的DNA序列或其由互补序列构成的寡核苷酸的引物组。
本发明提供作为与由人男性不育关连基因鱼精蛋白-2转录的mRNA互补的多核苷酸，是在序列173的DNA序列中第248位c取代为t的多核苷酸(鱼精蛋白-2突变多核苷酸)或其互补序列。
本发明提供作为鱼精蛋白-2突变多核苷酸的一部分，是由含有其突变位点的连续10～99个碱基的DNA序列构成的寡核苷酸(鱼精蛋白-2突变多核苷酸)或其互补序列。
本发明提供与上述的鱼精蛋白-2突变多核苷酸或鱼精蛋白-2突变寡核苷酸、或来自与这些核苷酸的互补序列在严格条件下杂交的人染色体DNA的多核苷酸(鱼精蛋白-2突变基因组多核苷酸)。
本发明提供作为用于对精蛋白-2突变多核苷酸、鱼精蛋白-2突变基因组多核苷酸、或鱼精蛋白-2突变基因组多核苷酸转录的mRNA进行PCR扩增的引物组，一方的引物是由含有突变位点的连续15～45个碱基的DNA序列或其互补序列构成的寡核苷酸。
本发明提供作为上述的Scot-t突变多核苷酸或Scot-t突变基因组多核苷酸的表达产物，是序列169的氨基酸序列中含有从以下组选择出来的1个以上变位的多肽(Scot-t突变多肽)。
第38位Leu取代为Pro；
第285位Leu取代为Arg；以及
第352位Thr取代为Met。
本发明提供作为上述的鱼精蛋白-2突变多核苷酸或鱼精蛋白-2突变基因组多核苷酸的表达产物，是由从序列174氨基酸序列的第1-49位的氨基酸序列构成的多肽(鱼精蛋白-2突变多肽)。
本发明提供作为上述的Scot-t突变多肽的一部分，是由含有突变位点的连续5～30个氨基酸的氨基酸序列构成的寡肽(Scot-t突变多肽)。
本发明提供作为上述的鱼精蛋白-2突变多肽的一部分，由含有突变位点的连续5～30个的氨基酸序列构成的寡肽(鱼精蛋白-2突变多肽)。
本发明提供上述Scot-t突变寡肽作为抗原制作的抗体(抗突变Scot-t抗体)、以及以上述鱼精蛋白-2突变寡肽作为抗原制作的抗体(抗突变鱼精蛋白-2抗体)。
本发明提供以由序列174的第50-91位、或序列175的第1-11位的氨基酸序列构成的寡肽作为抗原制作的抗体(抗鱼精蛋白-2抗体)。
另外本发明提供作为人男性不育的诊断方法，其特征是检测在由被检验者分离的染色体DNA中是否存在Scot-t突变基因组多核苷酸或鱼精蛋白-2突变基因组多核苷酸。
上述诊断方法理想的方式是对由被检验者分离的染色体DNA或其mRNA和Scot-t突变多核苷酸或鱼精蛋白-2突变多核苷酸、或Scot-t突变寡核苷酸或鱼精蛋白-2突变寡核苷酸、或他们的互补序列在严格的条件下是否进行杂交进行检测。而该诊断方法的理想方式是以由被检验者分离的染色体DNA或mRNA为模板，使用上述的各个引物组，进行PCR时，检测PCR产物的有无。
本发明提供作为人男性不育的诊断方法，其特征是检测在由被检验者分离的生体样品中是否存在Scot-t突变多肽或鱼精蛋白-2突变多肽。
上述诊断方法的理想方式是检测在由被检验者分离的生体样品中是否存在与抗突变Scot-t抗体反应的多肽。而另一种理想方式是在该诊断方法中检测在由被检验者分离的生体样品中是否存在与抗突变鱼精蛋白-2抗体反应，而与抗鱼精蛋白-2抗体不反应的多肽。
本发明提供以对上述的Scot-t突变寡核苷酸或鱼精蛋白-2突变寡核苷酸进行标记为特征的DNA探针。
本发明提供一种DNA芯片，其特征是含有上述的Scot-t突变寡核苷酸和/或鱼精蛋白-2突变寡核苷酸。
本发明提供一种标记抗体，其特征是对上述的抗突变Scot-t抗体、抗突变鱼精蛋白-2抗体或抗鱼精蛋白-2抗体进行了标记。
即，本申请的发明者就Scot-t基因对516名男性(不育症255例、健康正常者261例)以及就鱼精蛋白基因对496名男性(不育症226例、健康正常者270例)的DNA资料进行分析，结果发现了在各个不育症的cDNA(Scot-t：序列168、鱼精蛋白-1：序列170、鱼精蛋白-2：序列173)中存在表2所示的那样的核苷酸突变和伴随核苷酸突变的氨基酸突变。特别是发现了由于Scot-t的一碱基取代和氨基酸突变、以及鱼精蛋白-2中一个碱基取代引起的蛋白质的缩短是男性不育的重要原因。另外序列168相当于众所周知的人Scot-t cDNA(GenBank/AB050193)的第4-1760碱基序列。序列170相当于众所周知的人鱼精蛋白-1cDNA(GenBank/M60331)的第532-1089碱基序列。而序列173相当于众所周知的人鱼精蛋白-2cDNA(GenBank/M60332)的第804-1629碱基序列。表2中核苷酸突变和氨基酸突变的位置(数字)对应于序列表的碱基位置和氨基酸位置。而“-”表示非编码区，“Silent”表示伴随核苷酸突变，氨基酸没有突变。“***”表示终止密码子发生了突变。而“deletion”表示核苷酸的缺失，“addition”表示核苷酸的付加。
表2
在本申请的各个发明中，所谓“基因”是存在于基因组DNA中，编码特定多肽(蛋白质)的双链DNA，含有其编码区(open readig frame：ORF)、以及针对ORF的表达调控区(启动子/增强子序列、阻遏序列)。
在本申请的发明中，所谓“多核苷酸”和“寡核苷酸”分别是长链和单链的核苷酸链，多核苷酸在100bp以上、寡核苷酸在100bp以下作为大致基准，但也存在例外。
在本申请发明中，所谓“多肽”和“寡肽”分别是长链和单链的肽链，多肽的大致标准在30氨基酸残基以上，而寡肽大致标准在30氨基酸残基以下，但也有例外。
另外，在以下的说明中，所谓“对生殖的影响”指的不是致畸性，而是对***形成和对生育能力的影响。
另外，有关在本发明中使用的其它用语和概念在发明的实施方式和实施例内容中进行说明。而为了实施本发明使用的各种各样的基因操作技术和分子生物学的技术等，除了特别给出其资料的技术，都是根据众所周知的文献(例如、Sambrook and Maniatis，in Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989；Ausubel，F.M.etal.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995等)，同行人容易而且确实可实施的技术。
附图的简单的说明
图1是将人Scot-t基因组DNA和蛋白质与SNPs位置一起表示的模式图。水平箭头表示2对引物。
图2表示鱼精蛋白-1的基因组DNA序列、用于PCR扩增和序列分析的引物。翻译起始点、内含子以及规范聚A付加信号肽分别用+1、白方框以及阴影表示。引物序列是下划线部分。各个蛋白质的氨基酸序列在核苷酸序列下面用大字表示。右边空白的数字表示核苷酸以及氨基酸(粗字)序列的位置编号(核苷酸位置编号是从翻译起始点(+1)开始的编号，注意与序列170不同)。SNPs以粗字表示。星号表示对于GenBank登录序列(EMBL/DDBJ/GenBank/Y00443、M29706、M60331、M60332)，证明不育和有生殖能力的组的496例的人男性患者具有的核苷酸的差别。
图3与图2同样表示鱼精蛋白-2的基因组DNA序列、用于PCR扩增和序列分析的引物。
具体实施方式
本发明的小鼠***形成基因组(MSGs)是由各基因转录的mRNA合成的cDNA分别含有序列1-89碱基序列的全部89基因的集合。
cDNA可以通过上述(a)～(c)那样的克隆方法、或通过这些方法组合进行特定。这些方法无论哪一个都是众所周知的方法，只要是同行不必进行过多实验等就可以进行。例如、方法(c)的扣除法的操作的基本程序在一般的教科书(Current Protocol in Molecular Biology1：5.8.9-5.9.20，Green Publishing Associate andWilley-Interscience，1987～)都有例示。即、(i)从具有全部分化阶段的***的成熟小鼠、例如35日龄小鼠的***提取、纯化总RNA序列和mRNA后、合成相对于该mRNA的cDNA，做成cDNA文库，另外，(ii)从***还未分化的未成熟小鼠、例如17日龄小鼠的***提取、纯化总RNA序列和mRNA，对该mRNA用例如生物素进行标记。然后，(iii)在上述cDNA文库和浓度过量的生物素标记mRNA之间进行杂交，这两者形成的杂化体和残存的过量的生物素标记mRNA通过与抗生物素蛋白的凝集反应除去，做成扣除cDNA文库。然后，(iv)通过使用例如17日龄和35日龄两小鼠的总RNA序列的northern blotting从上述扣除cDNA文库中有选择地克隆只与35日龄小鼠的总RNA序列进行特异反应的cDNA，可以得到MSG克隆。而上述的cDNA文库和扣除cDNA文库无论哪一个都是将cDNA***载体、进行连接后、然后把他们转移到宿主大肠杆菌，以得到转化体的方式做成，之后的cDNA的扩增、制备和筛选都变得容易了。
本发明的MSGs也可以定义为根据利用上述方法特定的cDNA克隆的碱基序列信息(序列1-89)合成的寡核苷酸探针进行杂交的基因组DNA片段。杂交是在将盐浓度、有机溶剂浓度和温度等调整到一定范围的“严格的条件”下进行的。
这样特定的MSGs的基因DNA(基因组DNA)可以通过使用上述的探针，对克隆到BAC(Bacterial Artificial Chromosome)载体、粘粒载体或噬菌体载体等的小鼠基因组DNA文库进行筛选、分离。而分离的基因组DNA片段也可以用作通过例如荧光原位杂交(FISH)用于诊断染色体异常的探针。
而得到的MSGs的克隆cDNAs的碱基序列的决定通过众所周知的方法进行，通常、使用以双脱氧法(Sanger法)为基本的循环测序法(Current Protocol in Molecular Biology，1：7.4A.12-7.4A.13)进行。该循环测序法的优点在于可以对PCR扩增的多核苷酸直接测序，例如可以使用市售Thermo Sequenase fluorescent labelled primercycle sequencing kit[Amasham公司(美国)生产]和LC4000自动测序仪[LI-COR生产]进行。
另外也可以利用众所周知的方法对属于MSGs的各基因的基因组DNA或来自mRNA的多核苷酸(DNA片段或RNA片段)进行纯化。这样纯化的多核苷酸可以用作例如毒性试验等中的被检验对象。
另外，这些多核苷酸或上述的cDNA也可以在同源基因的检测和克隆中使用。即、例如通过使用序列1-89的碱基序列的同源性检索，可以检测MSGs相同的小鼠以外的动植物基因，例如人基因组DNA中的相同碱基序列。同源性检索中，可以使用DDBJ(http://www.ddjb.nig.ac.jp/)、NCBI(http://www.ncbi.nim. nih.gov/)等提供的基因资料库。同源基因已知有全长碱基序列、EST(expression sequence tags)、STS(sequence tagged sites)、GSS(genome survey sequence)、SNP(single nucleotide polymorphism)等形式。另外，这些同源基因例如可以从人染色体DNA直接(通过使用从人的***或白血球等的染色体提取、制备的DNA)、或通过作为本发明提供的探针使用的杂交、使用PCR引物进行的RT-PCR等进行筛选、克隆。
本发明的DNA片段组是属于上述MSGs组的各基因DNA、或属于上述cDNA组的各cDNA的连续10～99个碱基的碱基片段(有义链或反义链)的集合。这些DNA片段，例如，可以用作用于对基因MSGs的突变进行检测的杂交分析中的探针。另外，也可以作为用于生殖毒性试验或不育症的基因诊断用微阵列制作的探针使用。
这些DNA片段也可以通过常规方法合成、制备，或根据场合不同，也可以通过适当的限制性内切酶切上述的多核苷酸或cDNA制备。
本发明的一组引物组是用于对上述的基因MSGs或cDNA进行PCR扩增的合成寡核苷酸的集合，通过使用这些引物组的PCR可以检测MSGs的各基因的表达异常或突变。
这些引物组可以根据序列1-89的碱基序列，经由设计、合成和纯化的各工序制备。另外，PCR成功与否很大程度上依赖于引物设计和与此有关的诸条件的设定，所以在最适引物的制备中需要各种各样的创意办法和试行。作为引物设计的注意点如下所示。引物的大小(碱基数)考虑到满足与模板DNA间的特异的退火，15-40个碱基合适、优选15-30个碱基。但是在进行LA(long accurate)PCR场合时，至少要30个碱基才有效果。要想使由有义链(5’末端侧)和反义链(3’末端侧)构成的1组或1对(两条链)引物相互间不退火，在避免两引物间的互补序列的同时，也要避免为防止引物内发卡结构的形成的自己互补序列。另外，为了确保与模板DNA的稳定结合，使GC含量为约50％，不要使引物内GC-rich或AT-rich不均。由于退火温度与Tm(meltingtemperature)有关，为了获得特异性高的PCR产物，选定Tm值在55-65℃相互近似的引物。还需要留意要将PCR中使用的引物的最终浓度调整到约0.1～约1μM等。也可以使用引物设计用的市售软件，例如OligoTM[National Bioscience Inc.(美国)生产]、GENETYX[软件开发(株)(日本)生产]等。另外，在本发明中，提供1组以上用于对序列1-89的各个cDNA碱基序列内的各cDNA进行PCR扩增的2个寡核苷酸组。
本发明的微阵列(DNA芯片)其特征是作为探针在基板上备有1个以上上述的cDNA、或cDNA的连续10～99个碱基的碱基片段。而cDNA最好是备有2个以上、或5个以上。这样的微阵列可以是在基板上直接合成DNA片段的微阵列，也可以是将DNA片段点印到用结合DNA那样的材料包被的基板上形成的微阵列。
本发明的***形成多肽组可以通过从小鼠细胞中分离的方法，以及根据序列90-167的氨基酸序列通过化学合成制备肽的方法等获得，另外通过使用cDNA等多核苷酸的基因重组法也可以大量获得。即，将cDNA或其ORF区***到体外转录用的表达载体或适合于大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞或酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等真核细胞的各个细胞的表达载体，由通过体外转录或经表达载体转化的转化体细胞大量获得MSGs编码的多肽。转化体细胞可以通过利用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法等众所周知的方法将重组载体导入细胞制备。另外，在由转化细胞的培养物分离纯化多肽时，可以使用众所周知的方法(例如、通过尿素等改性剂或表面活性剂进行处理、超音波处理、酶消化、盐析或溶剂沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点电泳、离子交换层析、疏水性层析、亲和层析、反相层析等)。另外，本发明的多肽中还包括与其它任意蛋白质融合的融合蛋白质。例如、与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或绿色荧光蛋白质(GFP)的融合蛋白质等。另外，在细胞中表达的蛋白质有时翻译后，在细胞内受到各种修饰。因此，被修饰的蛋白质也包括在本发明内。作为这样的翻译后修饰，如N末端蛋氨酸的去除、N末端乙酰化、付加糖链、被细胞内蛋白酶限定分解、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、磷酸化等。
这样得到的多肽作为例如用于抗体制作的免疫原，或者用作用于开发不育症的治疗药的靶分子等。
本发明的抗体组是识别上述MSGs多肽的多克隆抗体或单克隆抗体的集合。该抗体组通过研究在***中的MSGs多肽或其突变体的表达，作为用于进行毒性试验和基因诊断的材料等是有用的。该抗体包括所有的可与MSGs多肽的抗原表位结合的全体分子、以及Fab、F(ab’)2、Fv片段等。这样的抗体例如为多克隆抗体时，可以用上述的MSGs多肽或其部分肽用作抗原，对动物进行免疫后、由血清中获得。或者，通过注射或基因枪将上述表达载体导入动物的筋肉或皮肤后，通过采集血清制作。作为动物可以使用小鼠、大小鼠、兔、山羊、鸡等。通过使从免疫的动物的脾脏采集的B细胞与骨髓瘤融合，制作杂交瘤，可以产生单克隆抗体。
接下来，本发明的毒性试验、突变原性试验和基因诊断的方法可以通过例如以下(A)～(I)实施。
(A)ED(体内)检测：
例如，使用在ED疑似物质经口服给药后饲养的小鼠、豚小鼠、猴等实验动物，从其白血球或组织细胞等提取、纯化染色体DNA(上述的Current Protocol in Molecular Biology 1：2.2.1-2.2.3)后，使用该DNA，通过使用例如上述引物组的PCR对与MSGs同源的实验动物DNA进行扩增，制备检体DNA，决定碱基序列，对该检体和正常基因DNA之间的同源性进行检索。根据该检索结果得到的两者间的碱基序列和氨基酸序列的差别，可以进行对实验动物DNA中的突变，该突变引起的表达异常以及氨基酸取代进行解析的基因诊断。对此，可以使用例如市售同源性检索用软件(上述的DDBJ和NCBI提供的同源性检索程序、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等)。另外同源性检索的留意点记载于例如文献(Current Protocol in Molecular Biology 1：7.7.12-7.7.15)中。另外使用由上述动物的各脏器(特别是***或***)提取的RNA，就MSGs通过用Northern botting、RT-PCR法、微阵列法等对mRNA的表达量的变化进行检测，可以判定疑似物质是否是ED。
(B)ED(体外)检测：
例如，使用将ED疑似物质添加到培养基，混合、培养的细胞、四膜虫、海胆受精卵、微生物等，在通过镜检检测培养下的形态学异常(例如、细胞***的异常、细胞改性等)同时，与上述(A)同样，由上述培养物中制备与MSGs同源的基因DNA(检体DNA)，进行其同源性检索，通过研究突变的发生和通过Northern blotting、RT-PCR法等研究表达量的变化，可以判定疑似物质是否是ED。而作为培养细胞等，也可以使用由克隆了本发明的MSGs的各多核苷酸(cDNA)的表达载体转化得到的转化体。
(C)突变原性试验和毒性试验：
在检体中使用开发中的新药或环境污染的疑似化学品，可以与上述(A)、(B)同样进行。
(D)对生殖的影响(体内)试验：
在检体中使用开发中的新药或环境污染的疑似化学品，可以与上述(A)、(B)同样进行。
(E)对生殖的影响(体外)试验：
构建***连接了MSG基因(cDNA等的多核苷酸)的表达载体，将该载体移入宿主制作转化体。将该转化体在有开发中的新药或环境污染的疑似化学品存在下进行培养，可以通过判定该表达产物的量，或功能是正常，还是异常进行该试验。例如，使Calmegin基因表达，对得到的Calmegin作为伴侣分子的功能的异常进行检测。另外通过使用这样的表达载体，可以对抑制或促进该表达能力或表达物活性的物质进行检测、检索。
(F)实验动物的制作：
为了进行MSGs和其同源基因的体内功能解析，可以制作这些基因的敲除(knock out)动物。另外，为了对这些基因的调节基因座位及其活性，和基因产物在个体中的功能进行解析，可以制作转基因动物。这样的实验动物使得用于***的基因治疗和予防的药品、医疗技术的开发和避孕药开发中的前临床试验成为可能。
(G)使用通过MSG导入形成的转化体的试验：
与上述(F)同样，构建检体基因DNA的表达载体，制作他的转化体。然后在对该表达产物的功能的异常进行检测的同时，通过同源性检索就检体DNA的突变和其突变引起的氨基酸取代进行解析。通过对由此得到的两结果进行对比分析，可以给出表达产物的功能和突变之间的相关性。
(H)通过PCR扩增DNA：
通过使用本发明引物的PCR，以置于各种各样的实验条件下的动物或培养细胞的DNA作为模板，可以对这些DNA进行扩增。而PCR的基本程序如上述的文献(Current Protocol in Molecular Biology1：15.0.1-15.3.8)所述。而通过PCR扩增的实验组DNA和其片段或限制性内切酶片段可以用于SSCP(single strand conformationpolymorphism)、RFLP(restriction fragment length polymorphism)、EST、STS、GSS、SNP等解析、或SAGE(serial analysis of geneexpression)中。例如，可以用作聚丙烯酰胺电泳的检体，DNA微阵列或DNA芯片的探针，也可以用作通过标记进行杂交用的探针。
以下就本发明的人男性不育基因突变进行说明。
本发明的Scot-t突变多核苷酸是在序列168的DNA序列中含有
第129位t取代为c；
第870位t取代为g；
第1071位c取代为t；以及
第1667位t取代为c
中任一个的1以上的多核苷酸或其互补序列。
该Scot-t突变多核苷酸例如可以以下面所述的Scot-t突变寡核苷酸作为探针，对从男性不育者的总mRNA制备的cDNA文库进行筛选、分离。另外也可以通过使用下面叙述的发明的引物组，以男性不育者的mRNA作为模板的RT-PCR进行分离。或者，通过使用市售的突变试剂盒等将上述的碱基取代导入野生型Scot-t cDNA获得。得到的cDNA通过例如PCR(Polymerase Chain Reaction)法、NASBN(Nucleic acidsequence based amplification)法、TMA(Transcription-mediatedamplification)法和SDA(Strand Displacement Amplification)法等通常进行的基因扩增法可以进行扩增。
在本发明的男性不育诊断方法中可以使用本发明的Scot-t突变多核苷酸。另外，也可以作为用于在基因工程中制作下面所述发明的Scot-t突变多肽的材料使用。
本发明的Scot-t突变寡核苷酸是上述的Scot-t突变多核苷酸的一部分，是由含有各个突变位点的连续10～99个碱基的DNA序列构成的寡核苷酸或其互补序列。
该Scot-t突变寡核苷酸可以通过众所周知的方法化学合成制作。另外也可以通过适当的限制性内切酶切断Scot-t突变多核苷酸等方法制作。
另外，该Scot-t突变寡核苷酸也可以用于本发明的男性不育诊断方法中。或者，也可以作为用于通过基因工程制作Scot-t突变寡肽的材料使用。
本发明的Scot-t突变基因组多核苷酸是与Scot-t突变多核苷酸或Scot-t突变寡核苷酸或与他们的互补序列在严格条件下杂交的来自人染色体DNA的多核苷酸(基因组DNA)。这里的所谓严格(stringent)的条件是上述的多核苷酸或寡核苷酸与来自染色体的基因组DNA的有选择的而且可检测的特异结合的条件。严格条件是由盐浓度、有机溶剂(例如甲酰胺)、温度、以及其它众所周知的条件定义的。即，减少盐浓度，或增加有机溶剂浓度，或使杂交温度上升，严格性(stringency)增加。例如，严格的盐浓度通常NaCl约在750mM以下以及柠檬酸三钠约为75mM以下，优选NaCl约为500mM以下和柠檬酸三钠约为50mM以下，最优选是NaCl约为250mM以下和柠檬酸三钠约为25mM以下。严格的有机溶剂浓度甲酰胺约为35％以上、约为50％以上最优选。严格的温度条件约30℃以上，更优选约37℃以上、最优选约42℃以上。作为其它条件，杂交时间、洗涤剂(例如SDS)的浓度、以及载体DNA是否存在等，通过对这些条件进行组合，可以设定各种各样的严格性。作为一个优选的方式，在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS的条件下，于30℃的温度进行杂交。作为更优选的方式，在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺、100μg/ml的改性鲑***DNA的条件下，于37℃的温度进行杂交。作为最优选的方式，在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺、200g/ml的改性鲑***DNA的条件下，于42℃的温度进行杂交。另外，杂交后的洗涤条件也影响严格性。该洗涤条件也由盐浓度和温度定义，由于盐浓度的减少和温度的上升增加洗涤的严格性。例如，用于洗涤的严格的盐条件，优选NaCl约为30mM以下和柠檬酸三钠约3mM以下，最优选NaCl约15mM以下和柠檬酸三钠约1.5mM以下。用于洗涤的严格的温度条件约25℃以上、更优选约42℃以上更好、最优选约68℃以上。作为一个优选的方式，在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS的条件下，于25℃的温度进行洗涤。作为更优选的方式，如在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS的条件下，于42℃的温度下进行洗涤。作为最优选的方式，如在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS的条件下，于68℃的温度下进行洗涤。
该Scot-t突变基因组多核苷酸，例如以Scot-t突变寡核苷酸为探针，可以通过以上那样的严格杂交和洗涤处理，对由男性不育者的染色体DNA制备的基因组文库进行筛选、分离。
该Scot-t突变基因组多核苷酸可以作为例如本发明的诊断方法中的检测对象。
本发明的Scot-t引物组是用于对上述发明的Scot-t突变多核苷酸、由Scot-t突变基因组多核苷酸和其互补序列构成的双链多核苷酸、或由Scot-t突变基因组多核苷酸转录的mRNA进行PCR扩增的引物组。而这些引物组，一方的寡核苷酸引物由至少含有序列168(Scot-t cDND)的1处核苷酸突变位点的连续15～45nt、优选是连续15～30nt的DNA序列或其互补序列构成的。另一方引物可以做成序列168的各突变位点的5’侧或3’侧的任意的连续DNA序列或其互补序列。
这些引物组可以根据含有各个突变位点的序列168，通过众所周知的DNA合成法制作。另外，在引物的端部也可以付加接头序列等。另外，在序列设计中，也可以使用市售的软件，例如OligoTM[NationalBioscience Inc.(美国)生产]、GENETYX[软件开发(株)(日本)生产]等。
本发明的Scot-t引物组可以在本发明的男性不育诊断方法等中使用。
本发明的鱼精蛋白-2突变多核苷酸是在序列173(鱼精蛋白-2cDNA)中第248位的c取代为t的序列。
本发明的鱼精蛋白-2突变寡核苷酸、突变基因组多核苷酸、鱼精蛋白-2引物组可以象与Scot-t有关的上述发明同样操作获得和使用。
本发明的Scot-t突变多肽直至上述发明的Scot-t突变多肽都是突变基因组多核苷酸的表达产物，是具有在序列169的氨基酸序列中，含有
第38位Leu取代为Pro；
第285位Leu取代为Arg；以及
第352位Thr取代为Met；
中任一个的1个以上的多肽。
即，这些Scot-t突变多肽由于在上述发明Scot-t突变多核苷酸中的错义突变，正常(野生型)多肽(序列169)的氨基酸象上述那样进行突变。
本发明的鱼精蛋白-2突变多肽是上述发明鱼精蛋白-2突变多核苷酸的表达产物，是由序列174氨基酸序列的第1-49位的氨基酸序列构成的短链多肽。即，该多肽是通过鱼精蛋白-2突变多核苷酸的第248位的一个碱基取代(c取代为t)，第50位的谷氨酸密码子突变为终止密码子，而以后的蛋白质编码区没有表达形成的短链多肽。
这些突变多肽可以通过众所周知的方法从男性不育者的生物体样品中进行分离的方法，根据含有各个突变氨基酸残基的序列169或174的氨基酸序列，通过化学合成制备肽的方法、或使用上述发明的突变多核苷酸(突变cDNA)通过重组DNA技术进行生产的方法等获得。这些突变多肽，例如可以用作本发明的男性不育诊断方法的检查对象。
本申请的突变寡肽作为上述发明的各个突变多肽的一部分，是具有含有各个氨基酸突变的连续5-30个氨基酸的氨基酸序列的寡肽。这些突变寡肽可以通过按照所定氨基酸序列进行化学合成的方法、或用适当的蛋白酶对上述的突变多肽进行消化的方法等制作。这些寡肽，例如，可以作为用于制作本发明的抗体的抗原使用。
本发明的抗突变Scot-t抗体、抗突变鱼精蛋白-2抗体、抗鱼精蛋白-2抗体是以上述发明的寡肽作为抗原制作的多克隆抗体或单克隆抗体，包括所有可与本发明的突变多肽的抗原表位结合的全体分子、以及Fab、F(ab′)2、Fv片段等。这样的抗体可以与MSGs发明中说明的抗体同样做成。而这些抗体可以特异识别上述的突变多肽，可以在本发明的诊断方法等中使用。
本发明的诊断方法是对被检验者是否是男性不育进行诊断的方法。即、从被检验者的生物体样品分离染色体DNA，当在该DNA中存在上述发明的突变基因组多核苷酸时，判定该被检验者为男性不育的高危者。被检验者可以为不育男性、或母方的亲属中有男性不育者的男儿等，但并不限定于这些人。突变多核苷酸的检测可以通过对他们进行直接测序的方法进行，但优选以下的方法。
在第1个方法中，对从被检验者分离的染色体DNA或其mRNA和上述发明的Scot-t突变多核苷酸和/或鱼精蛋白-2突变多核苷酸、或各个突变寡核苷酸在严格的条件下是否杂交进行检测。当被检验者含有与男性不育有关的基因突变时，染色体DNA或其mRNA和突变多核苷酸或突变寡核苷酸在严格的条件下也可进行杂交。杂交可以通过众所周知的方法检测，例如、使用本发明的DNA探针或DNA芯片可以简便、而且高精度地进行。作为使用标记DNA探针的杂交法，具体来说可以采用例如Allele-specific Oligonucleotide Probe法、OligonucleotideLigation Assay法、Invader法等众所周知的方法。而DNA芯片可以是在基板上直接合成突变多核苷酸和/或突变寡核苷酸的芯片，或将寡核苷酸点印到用可结合核苷酸的那样的材料包被的基板上的芯片。然后，将标记的被检验样品DNA和基板上的寡核苷酸有无杂交作为指标，可以鉴定被检验样品DNA中核苷酸突变。
在第2个优选的方法中，以从被检验者分离的染色体DNA或mRNA为模板，使用上述发明的引物组，检测在进行PCR时有无PCR产物。当被检验者含有与男性不育有关的基因突变时，可以得到被引物组规定的多核苷酸的PCR产物。PCR或RT-PCR可以通过众所周知的方法进行。核苷酸突变的检测除了对PCR产物进行直接测序的方法之外，也可以通过例如PCR-SSCP法、PCR-CFLP法、PCR-PHFA法等进行。另外也可以采用Rolling Circle Amplification法、Primer Oligo Base Extension法等众所周知的方法。
本发明的其它男性不育诊断方法申请当由被检验者分离的生体样品中存在上述发明的Scot-t突变多肽和/或鱼精蛋白-2突变多肽时，判定该被检验者为男性不育的高危者。多肽的检测可以通过各种各样的众所周知方法进行，使用抗突变Scot-t抗体，对Scot-t突变多肽进行检测的方法是优选的方法之一。另外，是将抗突变鱼精蛋白-2抗体、抗鱼精蛋白-2抗体(由序列7的第50-91位、或序列8的相1-11位的氨基酸序列构成的寡肽作为抗原制作的抗体)组合使用的方法。即，对于短链的鱼精蛋白-2突变多肽，抗突变鱼精蛋白-2抗体反应，但以长链的鱼精蛋白-2多肽作为抗原做成的抗鱼精蛋白-2抗体不反应。
使用以上抗体的诊断方法，特别是通过使用本发明中的标记抗体，可以进行简便而且高精度的检测。标记可以使用酶、放射性同位素或荧光色素。酶转换数(turnover number)越大，与抗体的结合就越稳定，只要是满足使引物特异着色等条件，没有特别的限制，可以使用通常EIA中使用的酶，例如、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖-6-磷酸化脱水素酶、苹果酸脱氢酶等。另外也可以使用酶抑制物质或辅酶等。这些酶和抗体的结合可以通过马来酰亚胺化合物等交联剂的众所周知的方法进行。作为引物可以根据使用的酶的种类使用众所周知的物质。例如作为酶使用过氧化物酶时，可以使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，而作为酶使用碱性磷酸酶时，可以使用对硝基酚等。作为放射性同位素，可以使用在125I或3H等通常RIA中使用的同位素。作为荧光色素，可以使用异硫氰酸酯荧光素(FITC)或四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)等在通常荧光抗体法使用的荧光色素。使用酶时，加入经酶作用分解发色的引物，通过利用光学手段测定引物的分解量求酶活性，将酶活性换算为结合抗体量，从与标准值的比较算出抗体量。在使用放射性同位素时，通过闪烁计数器等测定放射性同位素发出的放射线量。而在使用荧光色素时，可以通过组合了荧光显微镜的测定装置测定荧光量。另外，还优选使用利用1次抗体和标记化2次抗体的夹层法(sandwich method)(作为标记使用酶时的“ELISA法”)也很好。
实施例
以下、给出实施例和利用例对本发明的方式以及构成和效果进行具体说明，但本申请发明并不限定于这些例子。
实施例1
小鼠全(total)RNA的制备
从以下2组小鼠(C57BL/6)、17日龄小鼠19只、以及35日龄5只分别摘出***，按照组别收集到瓶帽中，然后向瓶帽中添加50ml的5.5M GTC溶液(ph 7.5；5.5M硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠2H2O、0.5％(W/V)sodium lauryl sarconate、和0.2M 2-巯基乙醇)后、通过带有18G注射针的注射器，破碎细胞。然后，低速离心，取其上清，除去沉淀的细胞碎片。从收集的50ml上清各取25ml移注到加入了14ml的CsTFA(三氟乙酸铯)液的2个管后、进行超离心(25,000rpm、15℃、24小时)。通过将超离心沉淀的RNA溶解于600μl的4.4M GTC溶液/管后，进行乙醇沉淀。沉淀RNA溶解于TE[10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA]后、通过再度乙醇沉淀回收，得到上述17日龄和35日龄两组小鼠的各总RNA。
实施例2
小鼠mRNA[Poly(A)+]的制备
用70％(V/V)乙醇对实施例1得到乙醇沉淀状态的2只管(2组)的总RNA分别洗涤后，添加500μl的上述TE/管，进行溶解，于65℃下加热5分钟，于冰上急冷。然后加入500μl的1M NaCl/管后，加到预先用TE/NaCl(TE∶1M NaCl＝1∶1)平衡的寡(dT)纤维素柱[Type3；Collabotrative Research社(美国)生产]，用8ml的上述TE/NaCl洗涤各个柱后，各用0.5ml的TE进行洗脱、分级。对该级分合计进行5次，取各级分的一部分，与BtBr(溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓)混合后，采用在UV照射下确认荧光放射的第2级分作为mRNA级分。对于该第2级分，再度重复进行65℃、加热5分钟至柱分级的上述操作。对得到的级分进行乙醇沉淀后、用70％(V/V)乙醇洗涤，溶解于10μl的TE中。取其一部分，用吸光光度计进行定量。
实施例3
35日龄小鼠***的cDNA文库的做成
通过以下(1)～(6)所述步骤做成。
(1)第1条链的合成(单链、ss-cDNA的制备)：
秤取7μg的实施例2得到的35日龄小鼠mRNA，添加蒸馏水配成全量7.5μl，于65℃下加热5分钟后，进行冰冷。然后添加以下试剂并混合：2.5μl的10×第1链缓冲液(1st strand buffer)[500mMTris-HCl(pH 8.3)、750mM KCl、30mM MgCl2]、2.5μl的0.1M DTT(二硫苏糖醇)、1.5μl的第1链甲基核苷酸混合物(10mM dATP、dGTP和dTTP；以及5mM 5-甲基-dCTP)、1μl(1.6μg)的连接引物(linkerprimer)[(GA)10ACGCGTCGACTCGAGCGGCCGCGGACCG(T)18]、0.5Ml的RNase抑制剂、以及7.5μl的H2O。然后于室温下放置10分钟，进行退火后，加2μl的逆转录酶[(株)生化学工业(日本)制]，于37℃下反应40分钟。接下来，添加2μl的Super Script[BRL社(美国)生产]并混合后、于50℃下反应40分钟，得到一条链的第1条链(ss-cDNA)。
(2)第2条链的合成(双链、ds-cDNA的制备)：
于冰上向上述(1)得到的第1条链液中添加以下试剂并混合：20μl的10×第2链缓冲液(2nd strand buffer)[188mM Tris-HCl(pH 8.3)、906mM KCl、46mM MgCl2]、7.5μl的0.1M DTT、3μl的第2链核苷酸混合物(10mM dATP、dGTP和dTTP；以及25mM 5-甲基-dCTP)、和135μl的H2O。将上述混合液进行5分钟冰冷后、加入1.5μl(2单位)的RNase H和6μl(50单位)的大肠杆菌DNA聚合酶I并混合，于16℃下反应180分钟。反应结束后、用200μl的苯酚/氯仿(水饱和苯酚∶氯仿＝1∶1混合)、和氯仿依次提取cDNA，溶解于30μl的1/10TE中，得到第2条链(ds-cDNA)。
(3)平末端化(平末端ds-cDNA的制备)：
向30μl上述(2)ds-cDNA溶液中添加以下试剂并混合：10×T4 DNA聚合酶缓冲液[500mM Tris-HCl(pH 8.3)、100mM MgCl2、500mM NaCl、100mM DTT]、2.5mM dNTP mixture、1μl(10单位)的T4 DNA聚合酶、以及54μl的H2O；总量为100μl。然后于37℃下反应30分钟(严格控制时间)后、用100μl的前述的苯酚/氯仿、和氯仿依次提取cDNA，溶解于20μl的1/10TE，得到平末端的ds-cDNA。
(4)衔接头的连接：
向4μl的上述(3)的平末端化ds-cDNA溶液中添加以下试剂并混合，进行5分钟冰冷：2μl的10×连接酶缓冲液[500mM Tris-HCl(pH8.3)、70mM MgCl2、10mM DTT]、2μl的10mM ATP、1μl(0.35μg)的衔接头、以及9.5μl的H2O；总量为18.5μl。而上述衔接头是BamHI(Bgl II)_Sma I[d(GATCCCCGGG)][(株)宝酒造(日本)制]和pSma I linker[d(pCCCGGG)][(株)宝酒造(日本)制]的1∶1(W/W)的混合物，用缓冲液[10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、10mM MgCl2]溶解制备成浓度为0.35μg/μl的溶液。然后添加1.5μl(4单位)的T4连接酶并混合，于8℃下反应过夜后、于70℃下加热处理30分钟，于15,000rpm、4℃下离心5秒间，将离心上清作为衔接头连接ds-cDNA。
(5)ds-cDNA的限制性内切酶片段的制备和利用Spin柱分级：
向上述(4)的衔接头连接ds-cDNA溶液中分别添加27μl的Not I缓冲液[278mM NaCl、8mM MgCl2、1.8mM DTT、0.01％(W/V)BSA(牛血清白蛋白)、0.018％(W/V)Triton X-100]、和3μl的Not I(10单位)，进行混合，于37℃下反应150分钟。反应结束后，添加5μl的10×STE[1M NaCl、100mM Tris-HCl(pH 8.3)、10mM EDTA(pH 8.0)]、和10μg的tRNA，进行混合，然后上到10μl/柱、Chroma Spin柱[Clontech社(美国)生产]，于4℃、1,800rpm下离心5分钟，收集离心管底的限制性内切酶片段的级分。然后，用等量的苯酚/氯仿、以及氯仿依次提取后，补充10μg tRNA，加蒸馏水，将全量调到250μl。然后不进行乙醇沉淀，而是用70％(V/V)乙醇洗后，通过稍微干燥获得衔接头连接ds-cDNA的限制性内切酶(Not I/Bgl II)片段。
(6)ds-cDNA限制性内切酶片段向载体的***连接：
将以下试剂添加到上述(5)的ds-cDNA限制性内切酶(Not I/BglII)片段的轻度干燥物后进行混合，于冰上冷却5分钟：3μl的上述10×连接酶缓冲液、3μl的10mM ATP、1μl(1μg)的质粒载体pAP3neo(限制性内切酶Not I/Bgl II裂解)、以及22μl的H2O。然后添加1μl(4单位)的T4 DNA连接酶，进行混合，于12℃下反应过夜后，于70℃下加热30分钟。然后用苯酚/氯仿、和氯仿依次进行提取后，用20μl的TE溶解，获得***了ds-cDNA的质粒载体溶液。然后，使用该溶液全量，通过电穿孔将ds-cDNA***质粒载体转移到作为感受态细胞的大肠杆菌中。得到的转化体作为35日龄小鼠***的cDNA文库，供下面的实验4中的扣除文库的做成用。
实施例4
小鼠的扣除文库的作成
按照以下所述的(1)～(5)步骤，通过杂交从实验例3得到的35日龄小鼠***的cDNA文库(A)中去除在17日龄小鼠***中的表达基因(mRNA:B)做成扣除文库。要将从单倍体细胞出现前开始过量表达的基因都扣除，杂交中A和B的反应量比采用A∶B＝1∶40。
(1)35日龄小鼠***cDNA文库的单链化：
将实验3的(6)得到的cDNA文库的转化体(大肠杆菌)于4ml的SOC[2％(W/V)Bacto-胰化胨、0.5％(w/V)酵母提取物、10mM NaCl、2.5mMKCl、以及20mM葡萄糖]培养基中在37℃下培养1小时后，将其移到100ml的LB/Amp[1％(W/V)Bacto-tryptone、0.5％(W/V)酵母提取物、0.5％(W/V)NaCl、50μg/μl氨苄西林]培养基，再于37℃下培养4小时30分，对cDNA进行扩增。将得到的100ml培养液中的50ml移注到另外的容器中，添加1ml辅助噬菌体(R408；2×1012pfu(噬斑形成单位)/ml)，于37℃下培养10小时。而剩下的50ml培养液直接于37℃下培养后、通过添加最终浓度为7％(V/V)的DMSO并混合下进行冷冻保存。培养结束后、经离心除菌，将收集的上清用孔径0.2μm的滤膜过滤，完全除去大肠杆菌碎片，然后向该培养滤液50ml中添加以下试剂并混合：5ml的Dnase I溶液[0.1M Tris-HCl(pH7.5)、以及0.1MMgCl2]、和5μl的Dnae I。使该混合液于37℃下反应30分钟后，向该总量的1/4量中添加20％(W/V)PEG(聚乙二醇；溶剂为2.5M NaCl)并混合，于室温下再反应20分钟。然后经10,000rpm、4℃、10分钟的超离心收集噬菌体，舍弃上清，完全除去PEG后，用400μl的TE使噬菌体悬浮。向悬浮液中添加25μl的蛋白酶K溶液(由2mg的蛋白酶K、800μl的TE、和200μl的甘油构成的溶液)、以及4μl的10％(W/V)SDS(十二烷基硫酸钠)并混合，于42℃下反应1小时。反应结束后、依次用苯酚、苯酚/氯仿、和氯仿进行提取，再进行乙醇沉淀，用70％(V/V)乙醇洗涤后，将沉淀用100μl的TE溶解，取其一部分用紫外分光器进行定量。
(2)17日龄小鼠***mRNA的生物素化：
向加有实验例2得到的40μg的17日龄小鼠***mRNA的管中加蒸馏水，总量配成20μl，在暗室中向该溶液加入30μl的生物素(光探针生物素(photoprobe biotin)1μg/μl水溶液)[VectorLaboratories社(美国)生产]并混合，用移液管充分吸吐后，打开管盖置于冰上，通过从管的上方10cm照射20分钟水银灯(BHRF100/110v/60W)进行标记。标记完了后，添加50μl的0.1M TE(pH 9.5)，用移液管充分吸吐后、加入100μl的水饱和丁醇，除去过量的生物素。再依次进行添加100μl的氯仿，除去丁醇，然后乙醇沉淀，用70％(V/V)乙醇洗后、溶解于20μl的蒸馏水。再度重复上述的标记操作，最终溶解于10μl的蒸馏水中，做成生物素化mRNA水溶液。
(3)杂交：
将以下试剂添加到PCR管中并混合，注意不要混入气泡：1.5μl(0.5μg)的上述(1)制备的ss-cDNA、5μl(20μg)的(2)中得到的生物素化mRNA、12.5μl的2×HB[80％(W/V)甲酰胺、100mM HEPES、2mM EDTA、以及0.2％(W/V)SDS；使用时制备]、2.5μl的2M NaCl、以及1μl的Poly A(1μg/μl水溶液)[Pharmacia(瑞典)生产]、2.5μl的蒸馏水；总量为25μl。使该溶液于65℃下反应10分钟后、再于42℃下反应43小时进行杂交。
(4)通过与抗生物素蛋白反应回收ss-cDNA：
将上述(3)的25μl反应液移到另一个管中，然后向管中添400μl的SB[50mM HEPES(pH 7.5)、2mM BDTA、和500mM NaCl]、以及10μg的链(霉)抗生物素蛋白[Gibco BRL(美国)生产]并混合，于室温下反应5分钟后、用400μl的苯酚/氯仿(1∶1等量混合)提取没有杂交的ss-cDNA。再度重复从上述的抗生物素蛋白添加至苯酚/氯仿提取的操作后，再进行氯仿提取，用微孔滤膜回收纯化ss-cDNA。然后，溶解于30μl的1/10TE后，将其中的15μl取到另一个管中(剩下的保存在-20℃下)，通过10分钟的真空干燥(不完全干燥)进行浓缩。
再重复2次从上述的杂交直至真空干燥的操作。第2次和第3次杂交时的组成如下：上述经真空干燥浓缩的ss-cDNA、5μl(10μg)的生物素化mRNA、12.5μl的2×HB、2.5μl的2M NaCl、以及1μl的poly A、加蒸馏水使总量变为25μl。另外从第2次杂交得到的30μlss-cDNA中取15μl供第3次杂交用，剩下的保存在-20℃下。
(5)ss-cDN的双链化：
向上述(4)中得到的15μl的ss-cDNA溶液中添加15μl的PNK反应混合物并混合，于65℃下反应10分钟。而PNK反应混合物通过使以下组合物在37℃下反应30分钟制备：1μl的双链形成用引物寡核苷酸、3μl的10×连接缓冲液[500mM Tris-HCl(pH 7.5)、70mM MgCl2、以及10mM DTT]、3μl的10mM rATP、2μl的PNK(T4多核苷酸激酶；10单位/μl)[(株)Toyobo(日本)生产]、以及加入21μl蒸馏水将总量调到30μl。反应结束后，冷却至室温后，向这30μl的反应液添加以下的试剂并混合，再于65℃下反应1小时：5μl的10×BcaBESTBuffer[(株)Takara(日本)生产]、10μl的1mM dNTP、0.5μl的单链DNA结合蛋白(2.1μg/μl)[USB社(美国)生产]、2μl的BcaBEST DNA聚合酶[(株)Takara(日本)生产]、以及加3μl的蒸馏水将总量调到50μl。反应结束后，依次进行100μl的苯酚/氯仿、以及氯仿提取，通过微孔滤膜过滤回收纯化ds-cDNA，然后用20μl的TE溶解。将其中的一部分通过电穿孔移入到大肠杆菌(XL-1 Bleu)中，进行转化。由此得到的转化体作为扣除文库、即MSG候补cDNA文库，供MSG的克隆用。
实施例5
MSG的克隆
在从实验例4做成的保有扣除文库的MSG候补cDNA的转化体的培养液中与实验例4的(1)所述同样操作制备的ss-cDNA与实验例1中得到的17日龄和35日龄的两小鼠***的总RNA之间进行Northernbotting，对只在35日龄小鼠检测到信号的cDNA进行筛选，并收集。结果得到合计79个MSG克隆。另外加上通过单克隆抗体、多克隆抗体克隆的克隆，得到总计89个MSG克隆。
实施例6
MSG克隆DNA的碱基序列的决定
通过对实施例5中得到的MSG文库的各转化体分别进行培养，对MSG克隆/载体扩增后的各载体(质粒)用碱法提取、纯化。然后，依据双脱氧法(Sanger法)，通过使用在载体内设定的引物的循环测序法，决定实施例1得到的合计89个MSG克隆的各cDNA的测序。序列1-89给出了该结果。
实施例7
ED对MGS的作用的研究
使用小鼠对由于给予作为环境中放出的ED的模型之一，具有***作用的DES引起的MSG基因表达的变化进行研究。
向8周龄C57BL/6雄小鼠每日二次进行腹腔内注射DES，二日后取出两***，对其中的一个进行组织观察，从另一个提取RNA，对基因表达水平进行比较。
材料：小鼠：8周龄C57BL/6雄小鼠
给予DES浓度和只数：
1：无处理(2只)
2：在玉米油中0μg DES(2只)
3：在玉米油中1μg DES(2只)
4：在玉米油中10μg DES(2只)
5：在玉米油中50μg DES(3只)
实验时间表：
在第1天，将无处理或溶解在20μl玉米油的各量的DES进行腹腔内注射。第3天，与第1天进行同样处理。第4天取出***。对其中一个进行Buan固定、石蜡包埋后、进行HE染色、组织观察。对另一个用Trizol提取RNA，通过Northern杂交比较基因表达水平。
解析的基因：OAZt(鸟氨酸脱羧酶抗发酵酶-t，Ornithindecarboxylase antizyme-t)：序列50
结果：
形态上没有检测到明显变化。然而，在对***细胞特异表达的基因OAZt进行Northern杂交时，结果表明个体差异非常大，总体上看，处理组一方水平低。
OAZ-t是表示单倍体***细胞特异表达的基因，表明其表达开始受DES抑制。尽管进行了在形态上几乎没有看到异常那样的低浓度短期间DES处理，但在基因表达水平检测到差异表明本发明方法可以充分作为***对雄性生殖细胞的影响的个体水平上的高灵敏度检测***来利用。
实施例8
小鼠haspin的功能解析
haspin(序列81)是***细胞特异表达的蛋白激酶，含有以激酶结构域为首的各种各样的功能结构域(核转运信号肽、亮氨酸拉链、转录因子样构造)，认为与多样性的***细胞功能有关，在***形成中起着重要的作用。另外，也了解到如果使haspin基因在培养细胞中表达，该蛋白质可转运到核内，细胞增殖在G1期停止(J.Biol.Cem.274，17049-17057，1999)。
就该haspin阐明如下。
hapsin敲除小鼠的解析：
选择使用胸苷激酶(TK)基因和新霉素(neo)抗性，破坏ES细胞的hapsin基因，通过从该ES细胞做成小鼠胚，做成haspin基因缺损(haspin KO)小鼠。该KO小鼠个体虽然可正常发育成长，但雄小鼠表现出不育，雌小鼠表现出生育能力。虽然***形成没有明显障碍，也可以产生形态上看不到异常的***，但确认由于功能不全，表现出雄性不育。
hapsin基因的表达调控区的解析：
使用在haspin基因上游的192碱基结合了GFP基因的报告基因，做成转基因(TG)小鼠。该TG小鼠的解析结果，由于GFP在单倍体***细胞特异表达，所以确认由该192个碱基构成的区是对haspin基因的特异表达进行调控的启动子。
与hapsin分子相互作用的蛋白质的解析
由酵母2杂化体系的实验结果表明与Haspin分子进行相互作用的***内蛋白质至少存在8种。这些蛋白质通过与人(Mol.Hum.Reprod.7，211-218.2001)、小鼠haspin相互作用，对***形成起着重要的作用。
由这些结果考虑到了如下的应用。即，由于通过haspin的基因缺损确认引起雄性不育，
1)可能是由于haspin自身的功能障碍、或进行相互作用的蛋白质的功能障碍引起雄性不育。
2)通过抑制haspin和其它分子之间发生的相互作用可能引起不育。
3)通过抑制haspin的核转运可能引起不育。
即，发明者在与haspin进行相互作用的分子中，发现负责该特异的核转运的蛋白质(输入蛋白α)，由于该输入蛋白α的功能障碍阻碍haspin的核转运，可能使hapsin功能缺损。
4)通过抑制haspin的激酶活性的抑制剂可能引起不育。
即，到目前为止，已经开发了各种各样的对激酶的特异抑制剂，对象haspin那样特异性高的激酶的特异抑制剂的开发的可能性增高。
另外，如上所述那样的被特定的hapsin启动子只在单倍体***细胞中特异表达，通过在体细胞对该启动子进行活化，也可以控制异常增殖的细胞的增殖。启动子的活化可以通过对其起作用的特异的转录因子或通过该基因的导入进行。或者通过对该转录因子的基因表达进行活化等方法进行。
实施例9
采用小鼠检测ED
连续200天经口给予10日龄小鼠(雄)ED(Bisphenol A等)疑似检体，进行饲养，不管是否观察到其生殖功能、行动、或外观有无异常，使用RNA提取试剂盒(例如TOLIzol：GIBCO BRL社)和DNA提取试剂盒(例如DNAzol BD试剂：オリエンタル酵母(日本))从该饲养小鼠的***提取细胞RNA和染色体DNA后，RNA通过Northern blot研究其表达水平的变化，DNA通过实施例5中得到的PCR引物进行***形成基因的扩增。通过这样操作，不能扩增的情形判定为在该基因中存在大的突变。在可进行扩增时，对该扩增DNA片段直接进行测定序列，或用识别切断特异的DNA碱基序列的内切核酸酶进行片段化后，进行琼脂糖凝胶电泳，或聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过对SSCP、RFLP、EST、STS、GSS、和SNP进行解析，检测突变。检测到突变的DNA片段再决定其碱基序列后，通过计算机解析，判定该突变是否是多态性，或是在基因的调节、复制和转录的过程中产生了异常，是否给翻译物(蛋白质)的功能带来大的障碍。通过这些RNA和DNA的变化进行ED检测。
实施例10
人Scot-t基因和鱼精蛋白基因的解析
1.方法
1-1.被检验者和基因组DNA的提取
在Scot-t基因的分析中，根据***学将合计255例男性不育患者分为以下多个组。152例(60％)为非闭塞性的无***症，72例(28％)为重度的***减少症(由0.1到3×106细胞/ml)、27例(11％)为***运动性低的、4例(2％)为***数、形态以及运动没有异常的自发性不育症。对照组以可生殖的男性261例(看过妇产科医院已怀孕过的妻子的丈夫)为对象。
在鱼精蛋白基因的分析中，根据***学将合计258例的不育患者分为以下多个组。153例(59％)为非闭塞性的无***症、73例(28％)为重度的***减少症(***数不满5×106细胞/ml)、28例(11％)为***运动性低的无力***症、4例(2％)为***数、形态以及运动没有异常的自发性不育症。作为对照组，与上述同样用健康正常者270例为对象。
通过使用蛋白酶和酚的众所周知的方法(Sambrook and Maniatis，in Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1989)提取、使用上述的各不育患者和健常者的基因组DNA。
1-2.人Scot-t基因组DNA中的突变鉴定
由于在人Scot-t的编码区的中央部存在具有缺失19bp(从745位到762位的18个核苷酸和隔着15个核苷酸的778位的1个核苷酸)的假基因(Tanaka H，et al.Mol Human Reprod 2001；8：16-23)，制作包括该缺失区在内的2种PCR引物，要使假基因不能扩增。即，在5′半边的扩增中使用位于推定转录开始部位上游的25个寡核苷酸(tgctctgtgacgcgcggcccgaggc：序列176)和从770位至745位的26个寡核苷酸(cctccacgatctcttccacctccacc：序列177)、741位至764位的24个寡核苷酸(cggtggaggtggaagagatcgtgg：序列183)、以及位于h-Scot-t基因的推定转录单元下游的25个寡核苷酸(tccattcctcaccactgcacacctg：序列178)(图1参照)。
可以使用覆盖h-Scot-t基因的左半边和右半边的2种PCR扩增片段对除去位于中央部周边的内部引物序列(730-764)周边的35个核苷酸的h-Scot-t的DNA全序列进行决定(图1)。
1-3.重组h-Scot-t cDNA的各种SNP型的基因导入和琥珀酰CoA转移酶活性分析
使用CaPO4，对转染各cDNA 72小时后，溶解HEK293细胞，将各个细胞溶解液(5mg蛋白质)经使用HPLC的层析处理，分离外源性SCOT-t和内源性SCOT-s，进行酶活性分析。琥珀酰CoA转移酶活性的标准化使用来自用抗SCOT-t抗体的Western blotting信息通过浓度计评价的h-SCOT-t蛋白质的相对量进行。
SCOT酶活性通过在文献(Marcondes，S.，et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98，7146-7151)的记载中加上若干修正后的方法进行。即，将分析混合液的内容做成50mM Tris-HCl(pH8.5)、0.2mM琥珀酰CoA、5mM乙酰乙酸锂、5mM MgCl2、5mM碘乙酰胺和h-SCOT-t级分。SCOT活性通过分光光度分析的测定可以通过测定313nm处乙酰乙酰-CoA吸収进行。蛋白质浓度的测定通过Bradford方法，使用牛血清清蛋白作为标准物质进行。
1-4.鱼精蛋白-1和-2基因组DNA的突变鉴定
基因组DNA通过使用蛋白酶和酚的众所周知方法从血液分离。构建2种在5′和3′侧面区两方的聚合酶链式反应(PCR)引物组，对这些鱼精蛋白的基因组DNA进行扩增。就鱼精蛋白-1(Domenjoud，L.et al.(1990)Genomics，8，127-133)来说，对于5′引物使用从转录开始部位上游的-42至-19为止的24个寡核苷酸(P1A；cccctggcatctataacaggccgc：序列179)，而对于3′引物使用从规范聚A附加信号AATAAA的下游492至515为止的24个寡核苷酸(P1B；tcaagaacaaggagagaagagtgg：序列180)。就鱼精蛋白-2(Domenjoud，L.et al.(1990)Genomics，8，127-133)来说，对于5′引物，使用从+49至+72为止的24个寡核苷酸(P2A；ctccagggcccactgcagcctcag：序列181)、对于3′引物使用从625至648为止的24个寡核苷酸(P1B；gaattgctatggcctcacttggtg：序列182)进行PCR扩增。通过该引物设定，可以对鱼精蛋白-1和-2基因的-42至515为止的557个的多核苷酸(序列170)和从49至648为止的599个的多核苷酸(序列173)分别进行扩增(图2)。而PCR条件如下；在鱼精蛋白-1实验中，每一循环为96℃下改性(45秒)、66℃下退火(45秒)、以及72℃下延伸(1分)，共进行40循环，在鱼精蛋白-2实验中，每一个循环为98℃下改性(10秒)、68℃下退火(45秒)、以及72℃下延伸(45秒)，共进行40循环。用SUPREC PCR Spin柱(Takara，Siga，Japan)进行PCR扩增的片段的纯化，进行热循环序列分析(ABI，CA，USA)。DNA序列的决定使用同样的PCR引物进行。
2.结果
2-1.人Scot-t DNA的序列分析
通过上述1-2所述PCR引物的设定，不扩增假基因DNA而只对真的Scot-t基因组DNA进行扩增，对有不育危险性的男性和证明有生殖能力的对照男性进行比较。
比较结果发现了表2中所示的4个位置的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism：SNP)，在不育患者255例和作为对照的证明有生殖能力的志愿者261例合计516例的男性中，1个位置存在于3′非编码区(t1667c)，其它的位置存在于编码区，诱导第38、285以及352位的氨基酸变化(图1)。位于共有线粒体靶序列结构域内部的38位氨基酸(L38P)的t129c SNP在可生殖的对照组和不育患者中，观察到各有94％(246例)和96％(246例)是主要的纯合亮氨酸型(t/t)、5.4％(14例)和2.7％(7例)为杂合(t/c)、而0.4％(1例)和0.8％(2例)为稀有的纯合，成为向脯氨酸(c/c)变化的氨基酸变化的原因。位于285位氨基酸(L285R)的t870g SNP在可生殖的对照组和不育患者中，观察到分别有80％(208例)和80％(204例)是主要的纯合亮氨酸型(t/t)、19％(50例)和15％(39例)为杂合(t/g)、而1.1％(3例)和4.7％(12例)为SNP的稀有型的纯合(g/g)、成为向精氨酸(g/g)变化的氨基酸变化的原因。位于352位氨基酸(T352M)的c1071t SNP在正常对照组和不育男性中观察到分别有96％(250例)和93％(238例)为主要的纯合亮氨酸型(c/c)、3.1％(8例)和4.3％(11例)为杂合(c/t)、而0.8％(2例)和2.4％(6例)为稀有型的纯合(c/c)，成为由苏氨酸(c/c)到蛋氨酸(t/t)的氨基酸变化的原因。在3个位置区，引起氨基酸变化的纯合SNPs的表达率与可生殖的对照组相比，不育患者组一方显示出由2至4倍的有意义高值。另外在3′非编码区中发现非常有趣的SNP(t1667c)。在正常对照组和不育男性组中，分别为80％(206例)和80％(200例)为主要的t型纯合(t/t)、19％(49例)和15％(38例)为杂合(c/t)、而1.2％(3例)和4.8％(12例)为c型的稀有纯合(t/t)。这些稀有的纯合事例全是二重SNPs，在正常的可生殖对照组(3例男性)和不育患者(12例男性)两方中，在t870g的各个基因型都是稀有g型纯合，在不育病例中只看到1例例外(以上表示在表3、表4中)。
表3
对255例的不育男性的临床调查的背景和h-Scot-t基因中的突变(SNPs)
*病例总数：250例(无***症为147例)
*病例总数：258例
表4
在不育和证明有生殖能力的亲代中的编码区中3个位置的SNPs和非编码区中1个位置的SNP表达率
2-2.含有SNPs的重组h-SCOT-t的琥珀酰CoA转移酶活性
为了研究SNPs对h-SCOT-t酶活性的影响，使保有发生氨基酸取代的3个位置的SNPs的重组蛋白质在HEK293细胞中表达，在体外进行琥珀酰CoA转移酶活性分析。位于t129c(L38P)和c1392t(T352M)的稀有型SNPs无论哪一个都表现出与主要型SNPs同样水平的酶活性。作为对照位于T870G(L285R)的稀有型(g/g)SNP与主要型比较，体外约一半左右酶活性都减少了(表5)。该结果表明h-SCOT-t的琥珀酰CoA转移酶活性是男性不育的前提条件，使酶活性减少的SNPs中存在着成为男性不育原因的成分。
表5
使用带有SNPs的重组h-Scot-t cDNA进行转化的HEK293细胞内部的琥珀酰CoA转移酶活性
各分析各进行3次。
2-3.人鱼精蛋白-1 DNA的序列分析
通过PCR扩增的557bp DNA片段包括由204至294的91个核苷酸构成的内含子((序列170、图2)。通过对557bp DNA片段的序列分析进行各引物内部的509bp中的SNPs的鉴定(图2)。由于所有DNA样品几乎扩增等量的PCR产物，确认在引物序列区中都不含有SNPs。以男性不育患者为对象对SNP的表达率进行评价，与证明有生殖能力的志愿者的情形比较。在合计528例的男性被检验者(不育患者258例和具有生殖能力的志愿者270例)中，在5个位置发现SNPs，其中4个位置存在于133、160、320和321位的编码区，1个位置存在于431位的3′未翻译区(图2和表6)。观察到的SNPs全都没有引起氨基酸变化(沉寂突变)。处于a133g、c160g和g320a的3个位置的SNPs和处于14和46位的氨基酸的SNP(图2)都是主要纯合和杂合，没有看到稀有纯合SNPs(表6)。在位于47位氨基酸的其它的c321a SNP中，在不育症和具有生殖能力的对照组中，分别有56.6％(146例)和47.8％(129例)是纯合主要型c/c，34.5％(89例)和43.3％(117例)为杂合(c/a)、而8.9％(23例)和8.9％(24例)为纯合稀有型(a/a)SNP。3′非编码区的a431g SNP以及这些SNP无论哪一个都没有发生氨基酸变化，在不育症患者中与证明有生殖能力的志愿者相比，发生率没有表现出有意高(表6：表6中的核苷酸位置对应于图2的核苷酸位置)。
表6
不育或确认有生殖能力的亲代中鱼精蛋白-1和-2基因中的SNPs的表达率
*3′非编码区
**内含子
***Ter：终止密码子s(tag)
2-3.人鱼精蛋白-2DNA的序列分析
通过对599bp的DNA片段(序列173)的序列分析对各引物内部的551bp中的SNPs进行鉴定(图3)。所有PCR经琼脂糖凝胶电泳研究，由于扩增几乎等量的DNA，所以确认引物序列区不含有SNPs。其中，在鱼精蛋白-2基因的599个核苷酸中观察到3个位置的SNPs，1个位置存在于外显子中，2个位置存在于内含子内(图3)。248位核苷酸中1个位置的杂合SNP由c变为t，谷氨酰胺变为了终止密码子，这只在153例的无***症患者中的1例不育症患者观察到，270例可生殖的对照组中没有看到(表6)。该变化即使是半接合状态，也可能与无***症的原因有关。另外在内含子内部发现g398c和a473c 2个位置的SNPs。对于g398c，在不育症和可生殖的对照组中，分别有57.4％(148例)和47.0％(127例)为主要型的纯合、34.1％(88例)和43.7％(118例)为杂合(g/c)、而8.5％(22例)和8.9％(24例)是稀有纯合(c/c)型。而在1例对照组中观察到作为g/a型的不同的杂合SNP的存在。而对于另一个a473c的SNP，在不育症和可生殖的对照组中，分别有56.6％(146例)和47.0％(127例)为主要型的纯合、34.9％(90例)和43.7％(118例)为杂合、而8.5％(22例)和9.3％(25例)是c型的稀有纯合型。这些内含子SNPs在不育症的亲代中的表达率相对于证明有生殖能力的志愿者没有有意义差别(表6)。
产业上利用可能性
就象以上详细说明的那样，本申请发明提供小鼠的***形成基因(MSG)89克隆、以及这些MSGs的全长cDNA碱基序列。另外本发明提供以MSGs的表达异常和突变为指标的基因诊断和毒性试验、突变原性试验方法。这些试验方法，具体来说，可以在分子水平进行直接使用***的基因DNA的基因诊断、环境中放出的微量化学物质对性分化以及生殖细胞分化的影响的环境毒性、另外具有生殖毒性和突变原性的物质对生物体的影响，特别是对表现出生殖细胞特异表达的基因组的影响的解析。另外，本发明在存在诱发***数减少或生殖功能障碍等的危险性的ED的检测和测定、以及与ED有关的全球的环境评价中也有贡献。此外，在以致畸性检测为目的的以往的“对生殖的影响”试验中，追加新的“对MSGs的突变原性”检定，对于用于保证药品和化学品等的安全性的国际标准的提高具有很大的贡献。
另外本申请发明提供成为遗传性男性不育的原因的Scot-t基因突变和鱼精蛋白-2基因突变。还提供以这些基因突变、以及伴随着基因突变引起的突变多肽等作为检查对象的男性不育诊断方法。
Claims (2)
1.多核苷酸，其序列或其互补序列是序列168第870位t取代为g和/或第1667位t取代为c所构成的序列。
2.多肽，其序列是序列169第285位Leu取代为Arg所构成的序列。
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