JPH03221838A - 検体測定方法及び検体測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はサンプル中の個々の検体に光を照射し、散乱光
や蛍光等の光学的測定を行なうことで検体の解析や抗原
抗体反応の測定等を行なう検体検査方法及び装置に関す
る。

［従来の技術］ 従来の検体検査装置の一例としてフローサイトメータが
知られている。これはサンプル液中の血球細胞等の検体
を蛍光標識し、これら検体を光ビームが照射される被検
部に１個ずつ流して、その結果被検部から発生する散乱
光や蛍光等を波長選別することでこれらのパラメータを
個々の検体毎に測光し、多数の検体に関する測定パラメ
ータの統計的傾向から検体の解析を行なうものである。

これにより細胞のＤＮＡ解析や表面抗原の探索などが可
能となる。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、従来は複数色の蛍光を測光するのに各蛍
光毎に専用の光検出器を使用している。

これまでは赤色蛍光と緑色蛍光の２色、あるいはこれに
黄色蛍光を加えた３色を同時に測光する構成が一般的で
あったが、近年、更なる多色化の要望が高まり、新たな
蛍光材の開発も進んでいる。

これにより同時に使用する蛍光チャンネル数が増加する
と、それに応じて光検出器の数も増加してしまうことに
なる。即ち、光学配置が複雑化し、フォトマル等の高価
な光検出器が多数必要となってしまう問題点があった。

本発明は以上の課題を解決すへくなされたもので、光検
出器の数似上の異なる蛍光パラメータが得られる検体測
定方法及び装置の提供を目的とする。

［課題を解決するための手段］ 上述の課題を解決するための本発明は、サンプル中の検
体を蛍光標識する工程と、前記サンプル中の個々の検体
に光照射する工程と、前記光照射時に検体から発する光
、及び前記光照射時より所定時間の後の非照射時に検体
から発する蛍光を同一の光検出器を用いて時系列に測光
する工程を有することを特徴とする検体測定方法。

並びに、照射位置に光を照射する手段と、蛍光標識され
た個々の検体を前記照射位置に順次通過させる手段と、
前記照射位置の検体から発する光、及び前記照射位置よ
りも下流の所定の非照射位置の検体から発する蛍光を同
一の検出器を用いて時系列に測光する手段を有すること
を特徴とする検体測定装置である。

［実施例］ 以下、本発明の実施例を図面を用いて詳細に説明する。

第１図及び第２図は本発明の実施例の光学配置を示す。

適切な反応時間及び濃度に調整され、更に複数種の蛍光
試薬で同時に標識処理された血液やラテックス浮遊液等
のサンプル液と、生理食塩水や蒸留水等のシース液が用
意され、不図示の加圧機構によりこれら液体が加圧され
てフローセル３に導かれ、シースフロー原理によってフ
ローセル３内でサンプル液がシース液に包まれて細い流
れに収斂されてフローセル３内の流通部を通過する。こ
の時、サンプル液に含まれる検体である個々の細胞やラ
テックス等の被検粒子は分離されて１粒或いは１塊ずつ
紙面上方から下方に向は手順吹消れる。この被検粒子の
流れに対して、レーザ光源１（本実施例においては波長
３００ｎｍの紫外レーザ）から出射されたレーザ光が、
母線方向が各々流通部方向、流通部方向と直交した２枚
のシリンドリカルレンズからなる結像光学系２によって
任意の楕円形状に収斂され照射される。被検粒子に照射
される光ビームの形状は、一般には流れに対して直交す
る方向に長径を有する楕円形状であることが好ましい。

これは個々の被検粒子の流れの位置が流体中で若干変動
しても、被検粒子に均一の強度で光ビームが照射される
ようにするためである。

被検粒子に光ビームが照射されると散乱光が生じる。発
生する散乱光の内、光路前方方向に発する前方散乱光は
集光レンズ６、アパーチャア、光検出器８によって測光
される。アパーチャアの開口部は光照射位置４と共役に
配置され、照射位置４からの光のみが光検出器８に導か
れるようになっている。照射された強力な光ビームが直
接光検出器８に入射するのを防ぐため、光路中集光レン
ズ６の手前には光吸収性の微小なストッパ５が設けられ
、照射光源からの直接光、及び被検粒子を光透過した透
過光を除去するようになっている。これにより光照射位
置４から散乱された光のみを測光することができる。な
お、この構成では前方散乱光と共に蛍光も合わせた光強
度を測光することになるが、一般に前方散乱光強度に較
べて蛍光強度は極めて微弱であるので問題はない。勿論
、光検出器８の手前に散乱光波長を選択的に透過するバ
ンドパスフィルタを配置するようにしても良い。

また前記散乱光の内、レーザ光「袖及び被検粒子の流れ
にそれぞれ直交する側方方向に発する光は集光レンズ９
で集光される。集光された光はダイクロイックミラー１
０で反射され、散乱光の波長即ちレーザ光の波長（３０
０ｎｍ付近）を選択的に透過させるバンドパスフィルタ
１１、集光レンズ１３、アパーチャ１５を経て光検出器
１７にて側方散乱光が測光される。アパーチャ１５は図
のように光軸中心に開口部１５ａが設けられ、該開口部
１５ａは光照射位置４と共役関係になっており、光間用
位置４から発する散乱光のみが光検出器１７にて検出さ
れるようになっている。

また被検粒子から散乱光と共に発生ずる複数色の蛍光を
測光するため、集光レンズ９によって集光され、ダイク
ロイック主う−１０を通過した蛍光は、集光レンズ１４
、アパーチャ３ｏ、光検出器１８の組によって特定の波
長の蛍光が検出される。アパーチャ３０の詳細な構成は
第６図のようになっている。第６図において遮光性のア
パーチャ３０の中心部及びその近傍には２つの開口部３
０ａ、３Ｑｂが設けられている。各開口部３０ａ、３０
ｂにはそれぞれバンドパスフィルタ３１．３２が取付け
られており、各バンドパスフィルタは各々特定の波長の
蛍光のみを選択的に透過させる性質を有する。開口部３
０ａはアパーチャ３０の中心部に設けられ、こわよりも
やや」ニガに開口部３０ｂが設けらむている。ここで開
口部３０ａは光照射位置４と共役になっており、開口部
３０ｂは光照射位置４よりもやや下流位置と共役になっ
ている。すなわち開口部３０ａによって光照射位置４か
ら発する特定波長の蛍光を選択的に光検出器１８に導く
ようになっており、又、開口部３０ｂによって光照射位
置４よりも下流の非照射位置からの特定波長の蛍光のみ
を光検出器１８に導くようになっている。すなわち光検
出器１８ては時間をおいて時系列に２種類の蛍光の測光
出力パルスが得られるような構成となっていて、同一の
光検出器で２種類の蛍光パラメータが時系列的に得られ
る。

なおパン１〜バスフイルタ３１の特性を散乱光波長を選
択的に透過させるものとずれは、同一の光検出器１８で
側方散乱光強度を蛍光強度の２つの異なるパラメータが
得られる。この場合、散乱光と蛍光は強度差が大きいた
め、光検出器１８にはダイナミック１ノンジの広いもの
を使用するか、あるいはバンドパスフィルタ３１に光減
衰度の高いものを使用することが好ましい。

前記光検出器８．１７．１８の信号は、第３図に示すよ
うな信号処理部において処理される。前記光検出器８の
前方散乱光出力はパルス状の電気信号どしてトリガ回路
２１とアナログ処理回路２２に人力される。また光検出
器１７の側方散乱光出力及び光検出器１８の蛍光出力は
そわぞれアナログ処理回路２３及び２４に入力さ和る。

各アナログ処理回路においては信号パルスのピーク値や
積分値が検出される。トリガ回路２１に人力さかた前方
散乱光信号かある一定レベルを越えるど、すなわち光照
射位置に被検粒子がさしかかると、それに伴ってトリガ
信号がある一定の期間発生し、その信号はアナログ処理
回路２２とアナログ処理回路２３に人力される。各アナ
ログ処理回路にはサンプルホールド機能があり、ｌ・リ
ガ信号が発生している期間だけ人力信号が処理されるよ
うになっている。また前記トリガ回路２１からのトリガ
信号は蛍光用トリガ発生回路２５に人力され、該蛍光用
トリガ発生回路２５は散乱光の検出トリガ信号が発生し
ている間と、時間ｔ、からｔ２の間だけトリガ信号を２
回発生させ、その信号はアナログ処理回路２４に人力さ
れる。これにより粒子が光照射位置４を通過する際、及
びその後ｔ１からｔ２までの間、蛍光用光検出器１８の
信号を２回サンプリングすることかてきる。各アナログ
処理回路２２．２３．２４の出力はＡ／Ｄ変換回路２６
にてデジタル値に変換され、それぞれ前方散乱信号、側
方散乱信号、２色の蛍光信号としてメモリ２７に格納さ
れる。

以上のようにして多数の検体に関して得られメモリ２７
に記憶される測定パラメータに基づいて、演算回路２８
において検体解析の演算がなされ、その結果はＣＲＴや
プリンタ等の出力部２９に出力される。

次に第４図を用いて本発明の測定原理について説明する
。本発明では使用する蛍光色素として、通常使われる蛍
光寿命の短い蛍光色素と共に、蛍光寿命が通常の自家蛍
光等よりも長いもの両者を組合わせて選択する。あるい
は蛍光寿命の長いものを複数種選択する。第４図は光照
射により励起された蛍光の寿命曲線を示すグラフである
。横軸は経過時間で、被検部において被検粒子が光照射
された瞬間を時刻Ｏとする。又、縦軸は発生する蛍光量
である。図中、曲線１９は一般的に使用される蛍光色素
、あるいは細胞やゴミが自ら有する自家蛍光によるもの
で、励起されてから蛍光発生強度がＯになるまでの蛍光
寿命は、およそ１００ｎｓｅｃ程度である。これに対し
て曲線２０は本発明において使用する通常よりも寿命の
長い蛍光色素の寿命カーブてあり、例としてＥｕ３＋キ
レート物貿を蛍光色素として使用したものである。

この場合の蛍光寿命は１０００ｎｓｅｃ以上である。な
おこの蛍光寿命曲線は蛍光を励起するレーザ光強度が一
定であれはほぼ同形状の曲線となる。

時刻Ｏの瞬間に粒子が光照射されたとして、散乱光の発
生は瞬時に終了し、蛍光寿命の短い通常の蛍光色素も時
間ｔ１までには蛍光発生量がＯになる。第５図に示すア
パーチャ３０の開口部３０ａは光スポットが当たる光照
射位置４と共役に配置されており、この位置を流れる検
体からの特定波長の蛍光１９のみを選択的に光検出器に
導くようになっている。又、開口部３０ｂは光照射位置
４よりも若干下流の非照射位置と共役に配置されており
、この部分からの特定波長の蛍光２０のみ１ を光検出器に導くようになっている。換言すれば開口部
３０ｂでは粒子の流れ速度が一定と考えると第４図の時
間ｔ１からｔ２までの間の斜線部分の光だけを測光する
ようになっている。第４図から明らかなように、１．か
らｔ２の間は蛍光寿命の長いＥｕ３＋キレート物質の蛍
光のみが発生するので、目的蛍光以外の雑光である自家
蛍光や通常の蛍光色素、あるいは散乱光等の混入の影響
を受けずに純粋に目的蛍光強度を測定することができる
。

仮に被検粒子が蛍光寿命の長い例えばＥｕ３＋キレート
等の赤色蛍光色素、及び通常の蛍光寿命の緑色蛍光色素
の２種類の蛍光で二重染色されるものとすると、アパー
チャ３０の各バンドパスフィルタ３１．３２の特性は、
それぞれ緑色蛍光、赤色蛍光を選択的に透過させる特性
を有するものを選択する。このような構成において、被
検粒子が光照射位置を通過する毎に光検出器１８には緑
色蛍光、赤色蛍光がそれぞれ選択的に時系列に入射する
ことになり、１個の光検出器で２つの異なる２ 蛍光が測定てきる。この時、発光寿命の長いＥｕ”キレ
ートによる赤色蛍光は通常の蛍光が発生しない時間範囲
ｔ１〜ｔ２で測定されるため、雑光の混入を全く受ける
ことなく極めて正確な測定値が得られる。

なおｔｌからｔ２の間で測光する蛍光強度はピーク値で
は無いが、蛍光寿命曲線は蛍光を励起するレーザ光強度
が一定であればほぼ同形状の曲線であり、ピーク出力に
比例した値が得られるため特に問題とならない。必要で
あれはこの曲線の形状と時間１．．１２に基づいて測光
出力に補正係数を与えることでピーク出力を予測するこ
ともできる。この補正は光検出器１８で測光する際に検
出レベル変更器を設けても行なうようにしても良いし、
−旦メモリ２７に記憶された測定値を基に演算処理を行
なって補正するようにしても良い。

なお、以上の実施例においてアパーチャの開口の数は２
つには限らず、更に数を増やすことで同の検出器で更に
多くのパラメータを得るようにしても良い。この場合、
蛍光寿命の長い蛍光色素を複数種用意し、こわらを同時
に被検粒子に標識して、雑光の発生の後にこれらの蛍光
を時系列的に個別に検出することて、散乱光の影響を受
けない複数パラメータの蛍光強度を少ない光検出器で度
の測定で得ることができる。

［発明の効果］ 以上本発明によれば、蛍光寿命の時間差を利用すること
により、時系列に複数の異なる蛍光パラメータを兼用の
検出器で測光することができる。

これにより低コスト・コンバクＩ・な装置構成となる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図は本発明の実施例の装置の構成図、 第３図は実施例の装置の信号処理部のブロック図、 第４図は蛍光の寿命曲線のグラフと示ｖ図、第５図はア
パーチャの形状と測定時間との関係を示す図、 てあり、図中の主な符号は、 １・・・・レーザ光源、 ２・・・・結像光学系、 ３・・・・フローセル、 ４・・・・光照射位置、 ８．１７．１８・・・・光検出器、 １０・・・・ダイクロイックミラー １１．１２・・・・バンドパスフィルタ、７．１５．３
０・・・・アパーチャ、 １５ａ、３０ａ、３０ｂ・・・・アパーチャ開口部３１
．３２・・・・バンドパスフィルタ、Ｏ １゜ ２ 帽閣

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）サンプル中の検体を蛍光標識する工程と、 前記サンプル中の個々の検体に光照射する工程と、 前記光照射時に検体から発する光、及び前記光照射時よ
   り所定時間の後の非照射時に検体から発する蛍光を同一
   の光検出器を用いて時系列に測光する工程と、 を有することを特徴とする検体測定方法。
2. （２）照射位置に光を照射する手段と、 蛍光標識された個々の検体を前記照射位置に順次通過さ
   せる手段と、 前記照射位置の検体から発する光、及び前記照射位置よ
   りも下流の所定の非照射位置の検体から発する蛍光を同
   一の検出器を用いて時系列に測光する手段と、 を有することを特徴とする検体測定装置。
3. （３）前記検体の蛍光標識は、蛍光寿命の異なる第１、
   第２の蛍光色素で標識し、第１の蛍光を測光し、該第１
   の蛍光の発生の後に第２の蛍光を測光する請求項（１）
   又は（２）記載の検体測定方法又は検体測定装置。
4. （４）サンプル中の検体を蛍光寿命の異なる第１、第２
   の蛍光色素で標識する工程と、 前記サンプル中の個々の検体を単一の光ビームで光照射
   し、前記第１、第２の蛍光色素を励起する工程と、 検体からの発する第１、第２の蛍光を時系列に測光する
   工程と、 を有することを特徴とする検体測定方法。