JPH03219877A - 水素細菌由来チトクロームc遺伝子 - Google Patents
水素細菌由来チトクロームc遺伝子Info
- Publication number
- JPH03219877A JPH03219877A JP4806590A JP4806590A JPH03219877A JP H03219877 A JPH03219877 A JP H03219877A JP 4806590 A JP4806590 A JP 4806590A JP 4806590 A JP4806590 A JP 4806590A JP H03219877 A JPH03219877 A JP H03219877A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cytochrome
- sequence
- gene
- dna
- yeast
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 13
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 title claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 title claims description 8
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 5
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 34
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 27
- 108020002206 Cytochrome c552 Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 6
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 abstract description 36
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 25
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 13
- 241000605325 Hydrogenobacter thermophilus Species 0.000 abstract description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 6
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 6
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 101000916041 Homo sapiens Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 101000947508 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Cytochrome c isoform 1 Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 3
- 231100000299 mutagenicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000007886 mutagenicity Effects 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 3
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 3
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102100028991 Cytochrome c1, heme protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000726355 Homo sapiens Cytochrome c Proteins 0.000 description 2
- 101000578940 Homo sapiens PDZ domain-containing protein MAGIX Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102100028326 PDZ domain-containing protein MAGIX Human genes 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 108010039340 cytochrome C5 Proteins 0.000 description 2
- 108010043199 cytochrome c(3) Proteins 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- -1 promoters Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OWEFQTXQEHYDEJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropanal diphosphono hydrogen phosphate Chemical compound OCC(O)C=O.OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O OWEFQTXQEHYDEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101150059484 CycT gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 108010007529 Cytochromes c2 Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 101100096502 Danio rerio spring gene Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 102000010750 Metalloproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100096504 Mus musculus Spring1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100426090 Rattus norvegicus Trim9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 101100096505 Xenopus laevis spring1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical class N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002090 carbon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000027721 electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は高度好熱性絶対独立栄養性水素細菌であるヒド
ロゲノバクター サーモフィラス(Hydrogeno
bacter thermophilus)由来のチト
クロームC−552蛋白質をコードする遺伝子および該
遺伝子を用いたC−552の製造方法に関するものであ
る。
ロゲノバクター サーモフィラス(Hydrogeno
bacter thermophilus)由来のチト
クロームC−552蛋白質をコードする遺伝子および該
遺伝子を用いたC−552の製造方法に関するものであ
る。
(従来の技術)
チトクロームCは生体内でチトクロームオキシダーゼ、
レダクターゼなどの酸化還元酵素と速やかに電子のやり
とりをしている。この電子の授受はヘム鉄の酸化還元反
応に基づいている。最近、チトクロームCを中心とした
金属蛋白質について、こうした電子移動反応を応用的に
発展させる研究が始まっている(例えば、J、 Rom
isch et al、。
レダクターゼなどの酸化還元酵素と速やかに電子のやり
とりをしている。この電子の授受はヘム鉄の酸化還元反
応に基づいている。最近、チトクロームCを中心とした
金属蛋白質について、こうした電子移動反応を応用的に
発展させる研究が始まっている(例えば、J、 Rom
isch et al、。
Eur、 J、 Biochem、、 164.111
.1987) 。その将来的な展望は生物の素材、素子
をまねた新素材、すなわちバイオチップの開発である。
.1987) 。その将来的な展望は生物の素材、素子
をまねた新素材、すなわちバイオチップの開発である。
従来の半導体素子では得られなかった生物学的な新しい
機能が期待されているのであるが、たとえば、生体分子
機能を有する触媒電極の作製が期待されている。現時点
では溶液中でチトクロームCを金属電極表面に並べて電
子伝達を行う研究がなされている(H,A、O,Hil
l et al、 J、 Electroanal、
Chem、、 217、141.1987)。この電子
伝達にはヘムC近傍のりジン残基の正電荷が重要である
といわれている(MJ、 Eddowes、 J、 A
m、 Chem、 Soc、、 101.7113、1
979)。
機能が期待されているのであるが、たとえば、生体分子
機能を有する触媒電極の作製が期待されている。現時点
では溶液中でチトクロームCを金属電極表面に並べて電
子伝達を行う研究がなされている(H,A、O,Hil
l et al、 J、 Electroanal、
Chem、、 217、141.1987)。この電子
伝達にはヘムC近傍のりジン残基の正電荷が重要である
といわれている(MJ、 Eddowes、 J、 A
m、 Chem、 Soc、、 101.7113、1
979)。
C−552は、アミノ酸配列の結果からりジン残基を多
く含み、さらに蛋白質全般からみても特異的に等電点が
高いことから、それらのりジン残基の多くは分子表面に
位置すると思われる(Y、 5anb。
く含み、さらに蛋白質全般からみても特異的に等電点が
高いことから、それらのりジン残基の多くは分子表面に
位置すると思われる(Y、 5anb。
ngi et al、 J、 Bacteriol、
1?1.65.1989) 。こうした理由から、C−
552は電子伝達を効率よく行うことかでき、電極素子
として用いる上で優れている。またC−552は報告さ
れているチトクロームCの中で最も低分子量であること
から、電極表面に接触する密度も高くなる点も優れた点
である。
1?1.65.1989) 。こうした理由から、C−
552は電子伝達を効率よく行うことかでき、電極素子
として用いる上で優れている。またC−552は報告さ
れているチトクロームCの中で最も低分子量であること
から、電極表面に接触する密度も高くなる点も優れた点
である。
さらに、通常のチトクロームCは80℃前後で変性する
が、C−552はきわめて熱安定性が高<120℃でも
変性しない。この点は他のチトクロームCにはない優れ
た特徴である(Y、 Sanbongi et al、
JBacteriol、 1?1.65.1989)
。
が、C−552はきわめて熱安定性が高<120℃でも
変性しない。この点は他のチトクロームCにはない優れ
た特徴である(Y、 Sanbongi et al、
JBacteriol、 1?1.65.1989)
。
またウマ由来のチトクロームCは、心筋梗塞、脳出血な
どの脳血管障害、−酸化炭素中毒症、肺疾患による呼吸
困難などの組織酸素欠乏状態に起因する諸症状の改善に
対して有効である。C−552は分子量が小さく、安定
性が優れていることがら医薬としても優れていると思わ
れる。
どの脳血管障害、−酸化炭素中毒症、肺疾患による呼吸
困難などの組織酸素欠乏状態に起因する諸症状の改善に
対して有効である。C−552は分子量が小さく、安定
性が優れていることがら医薬としても優れていると思わ
れる。
C−552は、ヒドロゲノバクター サーモフィラスの
細胞のペリプラズム画分に存在する蛋白質で、その発現
レベルはかなり大きいと推定されている(Y、 San
bongi et al、 J、 Bacteriol
、 171651989)。したがって、C−552の
発現を制御しているプロモーター、ターミネータ−、シ
グナルペプチドは、効率よく機能していると考えられ、
これらの構造を知ることも有意義である。
細胞のペリプラズム画分に存在する蛋白質で、その発現
レベルはかなり大きいと推定されている(Y、 San
bongi et al、 J、 Bacteriol
、 171651989)。したがって、C−552の
発現を制御しているプロモーター、ターミネータ−、シ
グナルペプチドは、効率よく機能していると考えられ、
これらの構造を知ることも有意義である。
また、C−552は食品等の変異原性を低下せしめるた
めにも有用である。食品、特にコーヒー飲料は突然変異
原性を有する場合があり、その突然変異原性は、ペルオ
キシダーゼを添加することにより消失させることができ
る(特開昭60−62945号)。しかし、従来知られ
ているペルオキシダーゼでは、耐熱性が不十分で娶り、
高温(例えば、80℃以上)において、または長い時間
(例えば、24時間以上)において活性を保持できるも
のは知られていないので、コーヒー飲料の製造に用いる
場合、実用上の問題があった。
めにも有用である。食品、特にコーヒー飲料は突然変異
原性を有する場合があり、その突然変異原性は、ペルオ
キシダーゼを添加することにより消失させることができ
る(特開昭60−62945号)。しかし、従来知られ
ているペルオキシダーゼでは、耐熱性が不十分で娶り、
高温(例えば、80℃以上)において、または長い時間
(例えば、24時間以上)において活性を保持できるも
のは知られていないので、コーヒー飲料の製造に用いる
場合、実用上の問題があった。
一方、チトクロームCには、ペルオキシダーゼ活性があ
ることが知られている。本発明における水素細菌チトク
ロームCは、前述のように、極めて熱に対して安定性を
有し、かつ、ペルオキシダーゼ活性を高温で、長時間保
持することができる。従って、コーヒー飲料の変異原性
を消失させるうえで、本発明におけるチトクロームCを
用いることは非常に有用である。
ることが知られている。本発明における水素細菌チトク
ロームCは、前述のように、極めて熱に対して安定性を
有し、かつ、ペルオキシダーゼ活性を高温で、長時間保
持することができる。従って、コーヒー飲料の変異原性
を消失させるうえで、本発明におけるチトクロームCを
用いることは非常に有用である。
また、過酸化水素は、細胞毒性や発癌性を有することが
既に知られている。これに本発明におけるチトクローム
Cを用いれば、過酸化水素を通常よりも過酷な条件下で
長時間処理することにより分解し続けられるので、細胞
毒性や発癌性の低減に有用である。
既に知られている。これに本発明におけるチトクローム
Cを用いれば、過酸化水素を通常よりも過酷な条件下で
長時間処理することにより分解し続けられるので、細胞
毒性や発癌性の低減に有用である。
以上に述べたようにC−552は、優れた物性を持った
蛋白質であるが、ヒドロゲノバクター サーモフィラス
は、水素を利用する絶対独立栄養細菌であり、培養は水
素、酸素、二酸化炭素の混合ガスを培地中に通気し、約
70℃で培養する。本菌は有機物を資化せず、代わりに
水素を必要とするが、水素ガスは引火性の強いガスであ
るので大量に培養するのは危険を伴う。また、70℃を
維持するのはコストが高くつく。一方、C−552遺伝
子を得、組換えDNAの手法により培養の容易な宿主中
で発現させることによりC−552を発現できれば、有
用なC−552をよりたやすく、大量に得ることが出来
る。C−552のアミノ酸配列は前述のように公知では
あるが、1)原核生物のチトクロームC遺伝子には、蛋
白質をコードする配列の他にシグナルペプチドのコード
配列があり、チトクロームCの生合成に重要な役割を担
っているが、C−552のアミノ酸配列からこのシグナ
ルペプチドの配列を予想することはできず、遺伝子の塩
基配列を決定することが必須である、2)蛋白質のアミ
ノ酸配列の分析結果にはしばしば誤りがありうるので、
C−552の遺伝子の塩基配列を決定して初めて、正確
な構造を知ることが出来る、3)アミノ酸配列から遺伝
子の塩基配列を類推することができるが、コドンの縮重
の問題から遺伝子の配列を1通りに決定できず、人為的
に合成したDNA配列ではしばしば発現に不都合を生じ
る、といった問題を解決するためにはC−552の遺伝
子を得て、その塩基配列を決定する必要がある。
蛋白質であるが、ヒドロゲノバクター サーモフィラス
は、水素を利用する絶対独立栄養細菌であり、培養は水
素、酸素、二酸化炭素の混合ガスを培地中に通気し、約
70℃で培養する。本菌は有機物を資化せず、代わりに
水素を必要とするが、水素ガスは引火性の強いガスであ
るので大量に培養するのは危険を伴う。また、70℃を
維持するのはコストが高くつく。一方、C−552遺伝
子を得、組換えDNAの手法により培養の容易な宿主中
で発現させることによりC−552を発現できれば、有
用なC−552をよりたやすく、大量に得ることが出来
る。C−552のアミノ酸配列は前述のように公知では
あるが、1)原核生物のチトクロームC遺伝子には、蛋
白質をコードする配列の他にシグナルペプチドのコード
配列があり、チトクロームCの生合成に重要な役割を担
っているが、C−552のアミノ酸配列からこのシグナ
ルペプチドの配列を予想することはできず、遺伝子の塩
基配列を決定することが必須である、2)蛋白質のアミ
ノ酸配列の分析結果にはしばしば誤りがありうるので、
C−552の遺伝子の塩基配列を決定して初めて、正確
な構造を知ることが出来る、3)アミノ酸配列から遺伝
子の塩基配列を類推することができるが、コドンの縮重
の問題から遺伝子の配列を1通りに決定できず、人為的
に合成したDNA配列ではしばしば発現に不都合を生じ
る、といった問題を解決するためにはC−552の遺伝
子を得て、その塩基配列を決定する必要がある。
(発明が解決しようとする課題)
本発明は、C−552遺伝子および該遺伝子を有するプ
ラスミド、該プラスミドにより形質転換された組換え宿
主細胞、及び該宿主細胞を培養してC−552を製造す
る方法を提供する。
ラスミド、該プラスミドにより形質転換された組換え宿
主細胞、及び該宿主細胞を培養してC−552を製造す
る方法を提供する。
C−552はシグナルペプチドをともなって生合成され
るので、本発明によればこのシグナルペプチドも一緒に
用いて酵母や大腸菌等の大量培養に適する宿主中で蛋白
質の分泌生産を行うことが可能である。C−552は菌
体の中でかなり高いレベルで発現していると思われ、高
発現を担っているC−552のプロモーター領域やター
ミネータ−領域の構造も有用であろう。とくにこれらの
シグナルペプチドやプロモーターは高温で正常に機能す
るという特徴を持っている。従って、これらは例えば高
温で生育する生物で蛋白質を発現させるときに有用であ
ろう。
るので、本発明によればこのシグナルペプチドも一緒に
用いて酵母や大腸菌等の大量培養に適する宿主中で蛋白
質の分泌生産を行うことが可能である。C−552は菌
体の中でかなり高いレベルで発現していると思われ、高
発現を担っているC−552のプロモーター領域やター
ミネータ−領域の構造も有用であろう。とくにこれらの
シグナルペプチドやプロモーターは高温で正常に機能す
るという特徴を持っている。従って、これらは例えば高
温で生育する生物で蛋白質を発現させるときに有用であ
ろう。
また原核生物のチトクロームCのアミノ酸配列は真核生
物のチトクロームCのアミノ酸配列とは相同性か低く、
多様性に富んでいる(Dickerson 。
物のチトクロームCのアミノ酸配列とは相同性か低く、
多様性に富んでいる(Dickerson 。
5cientific American、 242.
137.1980)。C−552は原核生物の典型的な
チトクロームCであり、C552が発現すれば他の原核
生物のチトクロームCも発現すると思われる。このよう
なチトクロームCの例として、硫酸還元菌のチトクロー
ムC3が挙げられる。
137.1980)。C−552は原核生物の典型的な
チトクロームCであり、C552が発現すれば他の原核
生物のチトクロームCも発現すると思われる。このよう
なチトクロームCの例として、硫酸還元菌のチトクロー
ムC3が挙げられる。
以上に述べたことを目的として、C−552遺伝子のク
ローニングと構造解析、及び酵母および大腸菌での発現
を行った。
ローニングと構造解析、及び酵母および大腸菌での発現
を行った。
(課題を解決するための手段)
本発明者らは、遺伝子組換えDNA技術を用いてC−5
52の遺伝子を単離し、構造遺伝子、シグナル配列、プ
ロモーター、およびターミネータ−領域の塩基配列を決
定した。
52の遺伝子を単離し、構造遺伝子、シグナル配列、プ
ロモーター、およびターミネータ−領域の塩基配列を決
定した。
すなわち、本発明は、ヒドロゲノバクター サーモフィ
ラスC−552をコードしているDNA配列、そのシグ
ナル配列、プロモーター、ターミネータ−の配列、これ
らを含有するプラスミド及び該プラスミドにより形質転
換された宿主細胞を提供するものである。それらの配列
は後に詳述する各図面に記載されている。なお、本明細
書中でアミノ酸配列または塩基配列に関して、「実質的
に同一な配列」という表現を用いた場合は、自然界で通
常起こりうる、表現型に影響を及ぼさない程度のアミノ
酸の置換、削除および/または挿入を含む変異配列を意
味する。
ラスC−552をコードしているDNA配列、そのシグ
ナル配列、プロモーター、ターミネータ−の配列、これ
らを含有するプラスミド及び該プラスミドにより形質転
換された宿主細胞を提供するものである。それらの配列
は後に詳述する各図面に記載されている。なお、本明細
書中でアミノ酸配列または塩基配列に関して、「実質的
に同一な配列」という表現を用いた場合は、自然界で通
常起こりうる、表現型に影響を及ぼさない程度のアミノ
酸の置換、削除および/または挿入を含む変異配列を意
味する。
C−552蛋白質をコードする遺伝子は例えば次のよう
にして得ることが出来る。すなわち、既に知られている
蛋白質のアミノ酸配列から推察される遺伝子の塩基配列
に基づきオリゴヌクレオチドを2つ合成し、これをプロ
ーブとしてC−552の遺伝子のクローニングを行った
。ヒドロゲノバクターサーモフィラス菌体より得た染色
体DNAをいくつかの制限酵素で消化後、サザンブロッ
テイングし、合成オリゴヌクレオチドを用いてハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの結
果、プローブは染色体DNAを制限酵素HindllI
で消化して得られた2、5kbのDNA断片と強くハイ
ブリダイズした。この断片を回収後、pBR327のH
ind111部位にサブクローニングし、大腸菌を形質
転換した。形質転換株からプラスミドを得て、先はどの
プローブを用いて同様にハイブリダイゼーションを行い
、プローブとハイブリダイズするDNAをもつ形質転換
株を得た。
にして得ることが出来る。すなわち、既に知られている
蛋白質のアミノ酸配列から推察される遺伝子の塩基配列
に基づきオリゴヌクレオチドを2つ合成し、これをプロ
ーブとしてC−552の遺伝子のクローニングを行った
。ヒドロゲノバクターサーモフィラス菌体より得た染色
体DNAをいくつかの制限酵素で消化後、サザンブロッ
テイングし、合成オリゴヌクレオチドを用いてハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの結
果、プローブは染色体DNAを制限酵素HindllI
で消化して得られた2、5kbのDNA断片と強くハイ
ブリダイズした。この断片を回収後、pBR327のH
ind111部位にサブクローニングし、大腸菌を形質
転換した。形質転換株からプラスミドを得て、先はどの
プローブを用いて同様にハイブリダイゼーションを行い
、プローブとハイブリダイズするDNAをもつ形質転換
株を得た。
この形質転換株は、BindIIIで切り出される2゜
5kbのDNAを含むプラスミドを持っていた。このプ
ラスミドの制限酵素処理とその消化物のサザンハイブリ
ダイゼーションを繰り返した結果、合成した2種のプロ
ーブはAcc IとPstlで切り出される1、1kb
のDNA断片とハイブリダイズした。この断片を大腸菌
でのクローニング用プラスミドpUc19(宝酒造)の
Pstl、 AccI部位にサブクローニングしたプラ
スミドを調製し、このプラスミドを鋳型に、合成ヌクレ
オチドをブライマーとして用いて塩基配列の決定を行っ
た。その結果、C−552の翻訳領域、シグナル配列、
プロモーター、ターミネータ−領域の塩基配列が明らか
になった(第2A図〜第2E図を参照)。
5kbのDNAを含むプラスミドを持っていた。このプ
ラスミドの制限酵素処理とその消化物のサザンハイブリ
ダイゼーションを繰り返した結果、合成した2種のプロ
ーブはAcc IとPstlで切り出される1、1kb
のDNA断片とハイブリダイズした。この断片を大腸菌
でのクローニング用プラスミドpUc19(宝酒造)の
Pstl、 AccI部位にサブクローニングしたプラ
スミドを調製し、このプラスミドを鋳型に、合成ヌクレ
オチドをブライマーとして用いて塩基配列の決定を行っ
た。その結果、C−552の翻訳領域、シグナル配列、
プロモーター、ターミネータ−領域の塩基配列が明らか
になった(第2A図〜第2E図を参照)。
次に、C−552の酵母での発現を行った。発現用ベク
ターに組み込むため、C−552遺伝子の終止コドン(
第2A図の472〜474番目のTAA)の直後に、部
位特異的に変異をおこさしめる方法にて制限酵素5a1
1部位を作製し、さらに、開始コドン(第2A図の17
8〜180番目のATG)の直前に制限酵素EcoRI
部位を作製するか、またはシグナル配列(第2A図の1
7878番目〜231番目のC)の直後にEcoRr部
位と開始コドンATGを同様の方法にて作製した。こう
して用意された2種の変異DNAの一方は、挿入された
二つの制限部位の間にc−552の翻訳領域を有し、そ
して他方は該領域をそのシグナル配列とともに有してい
る。これら2種のDNAからEcoRIと5ailで切
り出されるDNA断片を酵母の発現ベクターにつなぎこ
んだ。このプラスミドを、イソ−1チトクロームC遺伝
子cyc tを欠損してい、るために乳酸を炭素源にし
て増殖できない酵母の株XS−30−2B八CYCIに
導入したところ、何れの変異DNAで形質転換した酵母
も乳酸を炭素源として生育するようになった。これは、
C−552が酵母のイソ−1チトクロームCの代わりに
酵母の電子伝達系で機能したことを示している。換言す
れば、C−552がヘムCを持つ形で酵母内で発現した
ことになる。酵母が、原核生物のしかも分子量が異なり
、アミノ酸配列の相同性の低いC−552を発現できた
ことは予想外のことである。酵母はC−552のみなら
ず、原核生物、真核生物のあらゆるチトクロームC(例
えばチトクロームC3,チトクロームC2を発現できる
と予想される。
ターに組み込むため、C−552遺伝子の終止コドン(
第2A図の472〜474番目のTAA)の直後に、部
位特異的に変異をおこさしめる方法にて制限酵素5a1
1部位を作製し、さらに、開始コドン(第2A図の17
8〜180番目のATG)の直前に制限酵素EcoRI
部位を作製するか、またはシグナル配列(第2A図の1
7878番目〜231番目のC)の直後にEcoRr部
位と開始コドンATGを同様の方法にて作製した。こう
して用意された2種の変異DNAの一方は、挿入された
二つの制限部位の間にc−552の翻訳領域を有し、そ
して他方は該領域をそのシグナル配列とともに有してい
る。これら2種のDNAからEcoRIと5ailで切
り出されるDNA断片を酵母の発現ベクターにつなぎこ
んだ。このプラスミドを、イソ−1チトクロームC遺伝
子cyc tを欠損してい、るために乳酸を炭素源にし
て増殖できない酵母の株XS−30−2B八CYCIに
導入したところ、何れの変異DNAで形質転換した酵母
も乳酸を炭素源として生育するようになった。これは、
C−552が酵母のイソ−1チトクロームCの代わりに
酵母の電子伝達系で機能したことを示している。換言す
れば、C−552がヘムCを持つ形で酵母内で発現した
ことになる。酵母が、原核生物のしかも分子量が異なり
、アミノ酸配列の相同性の低いC−552を発現できた
ことは予想外のことである。酵母はC−552のみなら
ず、原核生物、真核生物のあらゆるチトクロームC(例
えばチトクロームC3,チトクロームC2を発現できる
と予想される。
また、前述のC−552をコードしているDNAを大腸
菌の発現ベクターにつなぎ、大腸菌を形質転換したうち
、「シグナルペプチドをもたないC−552をコードし
ているDNAを有する」形質転換株は、C−552を発
現しており、この形質転換株から得た組換えC−552
蛋白質は、ヒドロゲノバクター サーモフィラス由来の
C−552と同様の優れた性質を有していた。
菌の発現ベクターにつなぎ、大腸菌を形質転換したうち
、「シグナルペプチドをもたないC−552をコードし
ているDNAを有する」形質転換株は、C−552を発
現しており、この形質転換株から得た組換えC−552
蛋白質は、ヒドロゲノバクター サーモフィラス由来の
C−552と同様の優れた性質を有していた。
ここで決定した塩基配列を利用すれば、組換えC−55
2を製造したり、あるいは、プロモーターなどを利用し
て高温で蛋白質を生産したりできる。
2を製造したり、あるいは、プロモーターなどを利用し
て高温で蛋白質を生産したりできる。
また組換え酵母を培養することにより、優れた特徴を持
つC−552を大量に、容易に得ることができる。以下
に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。実験の手
順は特に記述しない限り、ManiatisらのMo1
ecular Cloning (Cold Spr
ing Harb。
つC−552を大量に、容易に得ることができる。以下
に本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。実験の手
順は特に記述しない限り、ManiatisらのMo1
ecular Cloning (Cold Spr
ing Harb。
r、 1982)によった。
(1)ヌクレオチドプローブの合成
既に決定したC−552のアミノ酸配列のうち、7番目
から15番目までのアミノ酸配列、Gln−Lys−G
ly−Cys−Met−Ala−Cys−)1is−A
sp−に基づいてオリゴヌクレオチドを合成した。第1
図に示したような2本の177−のオリゴヌクレオチド
、プローブ1(5°TGTATGGCNTGTCATG
A 3°)、プローブ2(5“CAGAAGGGNTG
TATGGC3’)をベックマン社のDNA合成装置S
ystem−1により合成した。ここでNはG、A、T
。
から15番目までのアミノ酸配列、Gln−Lys−G
ly−Cys−Met−Ala−Cys−)1is−A
sp−に基づいてオリゴヌクレオチドを合成した。第1
図に示したような2本の177−のオリゴヌクレオチド
、プローブ1(5°TGTATGGCNTGTCATG
A 3°)、プローブ2(5“CAGAAGGGNTG
TATGGC3’)をベックマン社のDNA合成装置S
ystem−1により合成した。ここでNはG、A、T
。
Cの4種のうちのいずれかの塩基を意味する。合成した
ヌクレオチドはベックマン社の推奨する方法で精製した
。
ヌクレオチドはベックマン社の推奨する方法で精製した
。
(2)ヒドロゲノバクター サーモフィラスの染色体D
NAの調製 本菌の染色体DNAを以下のようにして精製した。培養
した菌体2gを20m1のSTE緩衝液(20%サッカ
ロース、10mM Tris−HCI pH8,0
,1mMEDTA)に懸濁後、80mgのリゾチームを
加えて37℃で10分間保持した。これに終濃度50μ
g/mlになるようにプロテイナーゼKを添加し、37
℃で30分間保持した。次に10%SDSを終濃度0.
5%になるように添加し、さらにプロテイナーゼKを1
00μg/mlになるように加えた後、37℃で30分
間保持した。さらに10%SDSを終濃度2%になるよ
うに添加した後、50℃で60分間保持した。
NAの調製 本菌の染色体DNAを以下のようにして精製した。培養
した菌体2gを20m1のSTE緩衝液(20%サッカ
ロース、10mM Tris−HCI pH8,0
,1mMEDTA)に懸濁後、80mgのリゾチームを
加えて37℃で10分間保持した。これに終濃度50μ
g/mlになるようにプロテイナーゼKを添加し、37
℃で30分間保持した。次に10%SDSを終濃度0.
5%になるように添加し、さらにプロテイナーゼKを1
00μg/mlになるように加えた後、37℃で30分
間保持した。さらに10%SDSを終濃度2%になるよ
うに添加した後、50℃で60分間保持した。
この液に等量のフェノール/クロロフォルム(Mani
atis、 Mo1ecular Cloning)を
加え、穏やかにかくはんした後に遠心分離し、上層を回
収した。この操作を3回繰り返した。これに倍量のエタ
ノールを加えて、遠心してDNAを沈澱として回収した
。
atis、 Mo1ecular Cloning)を
加え、穏やかにかくはんした後に遠心分離し、上層を回
収した。この操作を3回繰り返した。これに倍量のエタ
ノールを加えて、遠心してDNAを沈澱として回収した
。
このDNAを10m1のTE緩衝液(10mM Tr
is−HCIpH8,0,1mM EDTA)に懸濁
し、RNaseを終濃度20μg/mlになるように添
加し、37℃で30分間保持した後、TE緩衝液に透析
して、染色体DNA溶液として以下の実験に用いた。
is−HCIpH8,0,1mM EDTA)に懸濁
し、RNaseを終濃度20μg/mlになるように添
加し、37℃で30分間保持した後、TE緩衝液に透析
して、染色体DNA溶液として以下の実験に用いた。
(3)サザンハイブリダイゼーション
常法によりサザンハイプリダイゼーションを行った。得
られた染色体DNA断片を制限酵素HindllIで消
化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブ
レンHybond−N (アマジャム社)にサザンプロ
ットした。プロットしたメンブレンを(γ−”P) A
TPでラベルしたプローブ1.2を用いてハイブリダイ
ゼーションを行った。ハイブリダイゼーションしたメン
ブレンをフィルムに感光させ、オートラジオグラムを得
た。
られた染色体DNA断片を制限酵素HindllIで消
化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブ
レンHybond−N (アマジャム社)にサザンプロ
ットした。プロットしたメンブレンを(γ−”P) A
TPでラベルしたプローブ1.2を用いてハイブリダイ
ゼーションを行った。ハイブリダイゼーションしたメン
ブレンをフィルムに感光させ、オートラジオグラムを得
た。
オートラジオグラムの結果、2.5kbの断片と両プロ
ーブが特異的にハイブリダイズしたことが分かった。従
って、C−552の遺伝子はこのDNA断片中に存在し
ていることが分かった。
ーブが特異的にハイブリダイズしたことが分かった。従
って、C−552の遺伝子はこのDNA断片中に存在し
ていることが分かった。
(4)サブクローニング
2.5kbのHindIII消化断片を含むアガロース
ゲル部分を切り出し、常法によりDNAを回収した。
ゲル部分を切り出し、常法によりDNAを回収した。
他方、大腸菌のベクターとして広く用いられているpB
R327をHind I I Iで消化後、常法に従っ
てアルカリフォスファターゼ処理し、フェノール/クロ
ロフォルム抽出を行った。このDNA断片と先はどの2
、5kbのDNA断片を常法どおりライゲースにより
結合させ、大腸菌)IBIOI株を形質転換した。
R327をHind I I Iで消化後、常法に従っ
てアルカリフォスファターゼ処理し、フェノール/クロ
ロフォルム抽出を行った。このDNA断片と先はどの2
、5kbのDNA断片を常法どおりライゲースにより
結合させ、大腸菌)IBIOI株を形質転換した。
159株の形質転換株か得られたので、先述のプローブ
を用いてコロニーハイブリダイゼーションの手法にて、
スクリーニングを行った。その結果、11個の陽性クロ
ーンを得た。
を用いてコロニーハイブリダイゼーションの手法にて、
スクリーニングを行った。その結果、11個の陽性クロ
ーンを得た。
11個の陽性クローンを2ml培養し、常法に従いプラ
スミドDNAを得た。このDNAをHindlllで消
化後、サザンハイブリダイゼーションを行った。
スミドDNAを得た。このDNAをHindlllで消
化後、サザンハイブリダイゼーションを行った。
その結果2種のプローブとハイブリダイズする1つのプ
ラスミドを得て、pT135とした。pT135を用い
て、制限酵素消化とサザンハイプリダイゼーションを繰
り返した結果、1.1kbのAcc’−PstI断片が
両プローブとハイブリダイズした。
ラスミドを得て、pT135とした。pT135を用い
て、制限酵素消化とサザンハイプリダイゼーションを繰
り返した結果、1.1kbのAcc’−PstI断片が
両プローブとハイブリダイズした。
このDNA断片をAce IとPstlで消化したpU
c19とライゲーションし、大腸菌HBIOIを形質転
換した。得られたプラスミドをpUHTc135とした
。
c19とライゲーションし、大腸菌HBIOIを形質転
換した。得られたプラスミドをpUHTc135とした
。
なお、該プラスミドにより形質転換された大腸菌はEs
cherichia colt SAM 1306と命
名され、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第10546号(FERM P−10546)として寄
託されたが、平成2年2月1日にブタベスト条約上の寄
託に移管され、FEJ?M BP−2748の寄託番号
が付与された。
cherichia colt SAM 1306と命
名され、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第10546号(FERM P−10546)として寄
託されたが、平成2年2月1日にブタベスト条約上の寄
託に移管され、FEJ?M BP−2748の寄託番号
が付与された。
(5)塩基配列の決定
プラスミドpUHTc135を常法どおり得た。このプ
ラスミドを鋳型にして、スクリーニングに用いたプロー
ブ2およびリバースプライマー(宝酒造)をブライマー
にして、2末鎖グイデオキシシークエンス法を行い、C
−552の遺伝子配列を決定した。2重鎖ダイデオキシ
シークエンス法の詳細は例えば高浪らの続生化学実験講
座、遺伝子研究法I(東京化学同人)に示されている。
ラスミドを鋳型にして、スクリーニングに用いたプロー
ブ2およびリバースプライマー(宝酒造)をブライマー
にして、2末鎖グイデオキシシークエンス法を行い、C
−552の遺伝子配列を決定した。2重鎖ダイデオキシ
シークエンス法の詳細は例えば高浪らの続生化学実験講
座、遺伝子研究法I(東京化学同人)に示されている。
決定できた塩基配列中(第2A図)には、C−552の
シグナルペプチドをコードする領域、プロモーター領域
およびターミネータ−領域も含まれていた。
シグナルペプチドをコードする領域、プロモーター領域
およびターミネータ−領域も含まれていた。
シグナル領域も含めた翻訳領域は、開始コドンATG
(第2A図、178〜180番目)から翻訳が始まり終
止コドンTAA(第2A図、472〜474番目)で翻
訳が終了する、98アミノ酸をコードしていた。
(第2A図、178〜180番目)から翻訳が始まり終
止コドンTAA(第2A図、472〜474番目)で翻
訳が終了する、98アミノ酸をコードしていた。
すでに決定されているC−552のアミノ酸配列は19
番目のアスパラギン(第2八図中、Nで示されている)
から始まっており、このアスパラギン以後の配列はC−
552の配列と完全に一致した(第2D図)。アミノ末
端より前の18番目までのアミノ酸配列はC−552に
は含まれない配列で、C−552が細胞のベリプラズマ
画分に存在することから、C−552をベリプラズマ画
分に移行させるためのシグナルペプチドとして機能して
いるものと考えられる(第2C図)。また翻訳領域のG
C含量が高いことが特徴的である。
番目のアスパラギン(第2八図中、Nで示されている)
から始まっており、このアスパラギン以後の配列はC−
552の配列と完全に一致した(第2D図)。アミノ末
端より前の18番目までのアミノ酸配列はC−552に
は含まれない配列で、C−552が細胞のベリプラズマ
画分に存在することから、C−552をベリプラズマ画
分に移行させるためのシグナルペプチドとして機能して
いるものと考えられる(第2C図)。また翻訳領域のG
C含量が高いことが特徴的である。
5°非翻訳領域には、原核生物のプロモーターとして知
られている一35領域1−10領域及びSD領領域対応
する塩基配列が存在している。したがって、この部分が
C−552のプロモーターである(第2B図)。また、
3′非翻訳領域にはCAGCGGATTACATCTG
という回文様配列が存在しており、これがC−552の
転写等の終了に寄与しているターミネータ−であると考
えられる(第2E図)。
られている一35領域1−10領域及びSD領領域対応
する塩基配列が存在している。したがって、この部分が
C−552のプロモーターである(第2B図)。また、
3′非翻訳領域にはCAGCGGATTACATCTG
という回文様配列が存在しており、これがC−552の
転写等の終了に寄与しているターミネータ−であると考
えられる(第2E図)。
実施例2 C−552遺云 の 母による発現実施例
1で得たC−552の遺伝子を用いて酵母での発現を行
った。酵母での異種のチトクロームCの発現については
、特開平1−37291号に詳しく記載されており、C
−552の発現についても同様の方法において行った。
1で得たC−552の遺伝子を用いて酵母での発現を行
った。酵母での異種のチトクロームCの発現については
、特開平1−37291号に詳しく記載されており、C
−552の発現についても同様の方法において行った。
部位特異的に変異を起こす方法は、バイオラド社のミュ
ータジェネシスキットによった。ここで用いた合成ヌク
レオチドは、アプライドバイオシステムズ社の39OA
DNA合成装置にて合成した。
ータジェネシスキットによった。ここで用いた合成ヌク
レオチドは、アプライドバイオシステムズ社の39OA
DNA合成装置にて合成した。
プラスミドpUHTc135をHindrlIとxba
rで消化して得られるl 、 IkbのDNA断片をM
13mp19のHindIIIとXbalによる消化物
とライゲーションし、大腸菌MV119(1に形質転換
した。ホワイトプラークを成す形質転換株から、−本鎖
DNAを調製した。この−本鎖DNAに、合成ヌクレオ
チドA249 (5°CGCCCCGTCGACTTA
CTTTAT3°)をアニールさせ、バイオラド社のミ
ュータジェネシスキソトを用いて部位特異的な変異を起
こさせた。この操作によりC−552遺伝子の終止コド
ンの3°側に制限酵素5a11部位が生じる。
rで消化して得られるl 、 IkbのDNA断片をM
13mp19のHindIIIとXbalによる消化物
とライゲーションし、大腸菌MV119(1に形質転換
した。ホワイトプラークを成す形質転換株から、−本鎖
DNAを調製した。この−本鎖DNAに、合成ヌクレオ
チドA249 (5°CGCCCCGTCGACTTA
CTTTAT3°)をアニールさせ、バイオラド社のミ
ュータジェネシスキソトを用いて部位特異的な変異を起
こさせた。この操作によりC−552遺伝子の終止コド
ンの3°側に制限酵素5a11部位が生じる。
次にこの組換えM13ファージの1本鎖DNAを鋳型に
して合成ヌクレオチドA237 (5°TGTTCAT
TCATGAATTCGGCAAAG3 ’ )とA2
38 (5°TCTTCATGAATTCTACCTC
3°)でそれぞれ同様に変異を起こさせた。A237の
変異はC−552のシグナルペプチドの直後にEcoR
1部位を作製すると同時に開始コドンであるATGを挿
入するためのものである。この変異を持つ組換え2本鎖
M13DNAをM2S−12とした。A238の変異は
C−552の開始コドンATGの直前にEcoR1部位
を作製するためのもので、この変異を持つ組換え2本鎖
M13DNAをM2S−11とした。両者の挿入部分の
配列を常法に従い決定し、予期した通りの変異が起こっ
ていることを確認した。また、C−552遺伝子の配列
に異常が生じていないことも確認した。
して合成ヌクレオチドA237 (5°TGTTCAT
TCATGAATTCGGCAAAG3 ’ )とA2
38 (5°TCTTCATGAATTCTACCTC
3°)でそれぞれ同様に変異を起こさせた。A237の
変異はC−552のシグナルペプチドの直後にEcoR
1部位を作製すると同時に開始コドンであるATGを挿
入するためのものである。この変異を持つ組換え2本鎖
M13DNAをM2S−12とした。A238の変異は
C−552の開始コドンATGの直前にEcoR1部位
を作製するためのもので、この変異を持つ組換え2本鎖
M13DNAをM2S−11とした。両者の挿入部分の
配列を常法に従い決定し、予期した通りの変異が起こっ
ていることを確認した。また、C−552遺伝子の配列
に異常が生じていないことも確認した。
pYHcclol (特開平1−37291号参照)は
酵母と大腸菌のシャトルベクターであり、かつ酵母での
発現ベクターである。このプラスミドは工業技術院微生
物工業技術研究所にFERM P−9475の寄託番号
で寄託されたが、平成2年2月23日にブタベスト条約
上の寄託に移管され、FERM BP−2767の寄託
番号が付与された。このプラスミドにおいてはヒトチト
クロームC遺伝子が酵母のグリセルアルデヒド3燐酸デ
ヒドロゲナーゼ(GPD) フoモーターにより転写さ
れる。このヒトチトクロームC遺伝子の代わりに、C−
552の遺伝子を導入し酵母中で転写、発現させる目的
で以下のように行った。M2S−11,M2S−12を
それぞれEcoRIと5ailで切り出されるC−55
2遺伝子を含むDNA断片と、pYHcclolのEc
oRIと5alTで切り出される約8kbのDNA断片
をライゲーションし、大腸菌HBIOIに形質転換した
。得られた目的のプラスミドをそれぞれpYHTCll
、pYHTc12とした。両者は共i:c−552遺伝
子を含むが、前者はシグナル配列を含んでいる点で後者
と異なっている。これらのプラスミドの造成過程の概略
を第3図に示す。
酵母と大腸菌のシャトルベクターであり、かつ酵母での
発現ベクターである。このプラスミドは工業技術院微生
物工業技術研究所にFERM P−9475の寄託番号
で寄託されたが、平成2年2月23日にブタベスト条約
上の寄託に移管され、FERM BP−2767の寄託
番号が付与された。このプラスミドにおいてはヒトチト
クロームC遺伝子が酵母のグリセルアルデヒド3燐酸デ
ヒドロゲナーゼ(GPD) フoモーターにより転写さ
れる。このヒトチトクロームC遺伝子の代わりに、C−
552の遺伝子を導入し酵母中で転写、発現させる目的
で以下のように行った。M2S−11,M2S−12を
それぞれEcoRIと5ailで切り出されるC−55
2遺伝子を含むDNA断片と、pYHcclolのEc
oRIと5alTで切り出される約8kbのDNA断片
をライゲーションし、大腸菌HBIOIに形質転換した
。得られた目的のプラスミドをそれぞれpYHTCll
、pYHTc12とした。両者は共i:c−552遺伝
子を含むが、前者はシグナル配列を含んでいる点で後者
と異なっている。これらのプラスミドの造成過程の概略
を第3図に示す。
これら2種のプラスミドで、酵母XS−30−2BΔC
YC1(Mat a、trpl、 his3. u
ra3. 1eu2゜cyc l : : LEU2
)を形質転換した。トリプトファンの合成能を回復した
形質転換株とXS−30−2BΔCYCIについて、必
要な栄養素(ヒスチジン、ウラシル、必要ならばトリプ
トファン)を添加したYNEL培地(067% Dif
co yeast nitrogen base、 0
.05%Difco yeast extract、
2%乳酸ナトリウム)での増殖を調べた。すなわち、Y
NED培地(YNEL培地の乳酸ナトリウムの代わりに
2%ぶどう糖を含む)で前培養した後、YNEL培地に
1%植菌し、増殖を660nIの吸光度の変化で追跡し
た。結果を第4図に示した。XS−30−2BΔCMC
Iは、電子伝達系蛋白質であるイソ−1チトクロームC
をコードしているCYClを欠損しているので、非発酵
性炭素源である乳酸を資化できず、YNEL培地では増
殖しなかった。
YC1(Mat a、trpl、 his3. u
ra3. 1eu2゜cyc l : : LEU2
)を形質転換した。トリプトファンの合成能を回復した
形質転換株とXS−30−2BΔCYCIについて、必
要な栄養素(ヒスチジン、ウラシル、必要ならばトリプ
トファン)を添加したYNEL培地(067% Dif
co yeast nitrogen base、 0
.05%Difco yeast extract、
2%乳酸ナトリウム)での増殖を調べた。すなわち、Y
NED培地(YNEL培地の乳酸ナトリウムの代わりに
2%ぶどう糖を含む)で前培養した後、YNEL培地に
1%植菌し、増殖を660nIの吸光度の変化で追跡し
た。結果を第4図に示した。XS−30−2BΔCMC
Iは、電子伝達系蛋白質であるイソ−1チトクロームC
をコードしているCYClを欠損しているので、非発酵
性炭素源である乳酸を資化できず、YNEL培地では増
殖しなかった。
ところが、pYIM237.またはpYIM238で形
質転換した株は第4図に示したように、乳酸を資化して
生育した。これは、異種の蛋白質であるC−552が酵
母において、発現し、電子伝達系の1成分として機能し
たことを示す。したがって、この組換え酵母を培養すれ
ば酵母菌体からC−552を得ることができる。
質転換した株は第4図に示したように、乳酸を資化して
生育した。これは、異種の蛋白質であるC−552が酵
母において、発現し、電子伝達系の1成分として機能し
たことを示す。したがって、この組換え酵母を培養すれ
ば酵母菌体からC−552を得ることができる。
次に、形質転換株すなわちXS−30−2BΔCYCI
(pYHTCll)とXS−30−2B八CYC1(
pYHTc12)を培養シタ。
(pYHTCll)とXS−30−2B八CYC1(
pYHTc12)を培養シタ。
炭素源として2%ぶどう糖と15%乳酸ナトリウムを含
むパークホルダー培地(BurkholderSArn
、J、Bot、30.206.1943) 400m1
で、よく攪はんして30℃で培養した。対照のため、X
S−30−28とXS−30−2BΔCYC1も同様の
条件で培養した。集菌後、ジャーマンらの方法(She
rman et al、、 J、 Biol、 Che
m243、5446.1968)により、酵母を2ml
の水と1mlの酢酸エチルに懸濁し、室温で一晩振とう
した。遠心分離して水層を回収し、この画分のチトクロ
ームC含量と蛋白量を定量した。チトクロームC量は還
元型吸収スペクトルを分光光度計(日立22OA)で測
定し、550nmの分子吸光係数277mMを利用して
定量した。蛋白定量はピアス社のBCA蛋白定量キット
を用いた。XS−30−2BΔCYCIのチトクローム
C含量は蛋白質1mgあたり0,075nmoleであ
ったが、pYHTcllによる形質転換株のチトクロー
ムC含量は蛋白質1mgあたり0.48nmole、
pYHTcl2による形質転換株のチトクロームC含量
は蛋白質1mgあたり0.40nmoleであった。p
YHTcl 1.pYl(TC12による形質転換株は
XS−30−28八CYCIよりチトクロームC含量か
高いので、C−552が発現したと考えられる。
むパークホルダー培地(BurkholderSArn
、J、Bot、30.206.1943) 400m1
で、よく攪はんして30℃で培養した。対照のため、X
S−30−28とXS−30−2BΔCYC1も同様の
条件で培養した。集菌後、ジャーマンらの方法(She
rman et al、、 J、 Biol、 Che
m243、5446.1968)により、酵母を2ml
の水と1mlの酢酸エチルに懸濁し、室温で一晩振とう
した。遠心分離して水層を回収し、この画分のチトクロ
ームC含量と蛋白量を定量した。チトクロームC量は還
元型吸収スペクトルを分光光度計(日立22OA)で測
定し、550nmの分子吸光係数277mMを利用して
定量した。蛋白定量はピアス社のBCA蛋白定量キット
を用いた。XS−30−2BΔCYCIのチトクローム
C含量は蛋白質1mgあたり0,075nmoleであ
ったが、pYHTcllによる形質転換株のチトクロー
ムC含量は蛋白質1mgあたり0.48nmole、
pYHTcl2による形質転換株のチトクロームC含量
は蛋白質1mgあたり0.40nmoleであった。p
YHTcl 1.pYl(TC12による形質転換株は
XS−30−28八CYCIよりチトクロームC含量か
高いので、C−552が発現したと考えられる。
そこで、これらの酢酸エチル抽出画分をSDSポリアク
リルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンプロットを行っ
た後、抗水素細菌C−552を用いて、C−552の発
現を検討した。この方法は、たとえば、今堀ら、純生化
学実験講座、蛋白質の化学、東京化学同人(1987)
に示されている。その結果、pYHTcl2による形質
転換株の抽出画分には抗C−552抗体と反応するバン
ドが見られた。その分子量は、天然のC−552と一致
した(第6A図)。
リルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンプロットを行っ
た後、抗水素細菌C−552を用いて、C−552の発
現を検討した。この方法は、たとえば、今堀ら、純生化
学実験講座、蛋白質の化学、東京化学同人(1987)
に示されている。その結果、pYHTcl2による形質
転換株の抽出画分には抗C−552抗体と反応するバン
ドが見られた。その分子量は、天然のC−552と一致
した(第6A図)。
実施例3 C−552の 菌によるpYHTcll
及びpYHTcl2をそれぞれEcoRlと5ailで
消化して得られるC−552遺伝子含むDNA断片を市
販の大腸菌の発現ベクターであるpKK223−3(フ
ァルマシア社)をEcoRI と5ailで消化したも
のとライゲーションした。こうして得られた目的のプラ
スミドは、C−552遺伝子が大腸菌のtacプロモー
ターで制御される。一連のプラスミド構築の過程を第5
図に示した。pYHTc11由来のものをpKHCll
、そしてpYHTc12由来のものをpKHcl2とし
た。
及びpYHTcl2をそれぞれEcoRlと5ailで
消化して得られるC−552遺伝子含むDNA断片を市
販の大腸菌の発現ベクターであるpKK223−3(フ
ァルマシア社)をEcoRI と5ailで消化したも
のとライゲーションした。こうして得られた目的のプラ
スミドは、C−552遺伝子が大腸菌のtacプロモー
ターで制御される。一連のプラスミド構築の過程を第5
図に示した。pYHTc11由来のものをpKHCll
、そしてpYHTc12由来のものをpKHcl2とし
た。
さらに、pKHcl2をBam)II とSca lで
消化して得られるDNA断片のうち、C−552遺伝子
を含む断片を回収した。これとpUcII8(宝酒造)
をBamHI とHincIIで消化したDNA断片を
連結し、得られたプラスミドをpUK812とした。こ
れらのプラスミドの構築には宿主大腸菌としてJM10
9を用いた。
消化して得られるDNA断片のうち、C−552遺伝子
を含む断片を回収した。これとpUcII8(宝酒造)
をBamHI とHincIIで消化したDNA断片を
連結し、得られたプラスミドをpUK812とした。こ
れらのプラスミドの構築には宿主大腸菌としてJM10
9を用いた。
形質転換体、JM109(pKHcll)、 JM10
9(pKHcl2)、JM109(pllに812)を
L培地にて2−培養後、1.21の硝酸塩を含む培地(
1%ぶどう糖、0.08%硝酸ナトリウム、50mM炭
酸1ナトリウム、0.01%硫酸マグネシウム、0.7
%リン酸1カリウム、0.05%クエン酸3ナトリウム
、0,1%硫酸アンモニウム、1μg/−チアミン、1
2μMモリブデン酸アンモニウム、1μMセレン酸、1
2mMクエン酸e、0.5%バクトベプトン、pH7、
0)に1wi植菌し、37℃で24時間、静置培養した
。またこの際、必要に応じて最終濃度0 、5mMのイ
ソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPT
G)を発現誘導剤として加えた。培養後、集菌して、以
下の実験に供した。
9(pKHcl2)、JM109(pllに812)を
L培地にて2−培養後、1.21の硝酸塩を含む培地(
1%ぶどう糖、0.08%硝酸ナトリウム、50mM炭
酸1ナトリウム、0.01%硫酸マグネシウム、0.7
%リン酸1カリウム、0.05%クエン酸3ナトリウム
、0,1%硫酸アンモニウム、1μg/−チアミン、1
2μMモリブデン酸アンモニウム、1μMセレン酸、1
2mMクエン酸e、0.5%バクトベプトン、pH7、
0)に1wi植菌し、37℃で24時間、静置培養した
。またこの際、必要に応じて最終濃度0 、5mMのイ
ソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPT
G)を発現誘導剤として加えた。培養後、集菌して、以
下の実験に供した。
菌体の破砕物をSDSポリアクリルアミドゲルにて電気
泳動し、ウェスタンプロットの後、抗C−552抗体を
用いて、C−552の検出を行った。その結果を第6B
図に示した。即ち、調べたJM109、JM109(p
KHcll、−IPTG)、JM109(pKHcll
、 +IPTG)、JM109(pKHcl2.−IP
TG)、JM109(pKHcl2. +IPTG)の
うちJM109(pKHcl2 、÷IPTG)だけに
天然のC−552と同じ位置に特異的なバンドが観察さ
れた。この結果から、大腸菌においてC−552蛋白が
発現していることがわかる。ここでは、C−552のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子を含むpKHcl
1による形質転換株においては、抗体と反応するものが
みられなかったのに対し、シグナルペプチドを含まない
遺伝子を含むpKHcl2による形質転換株においての
み発現がみられるという予想外の結果が得られた。また
、JM109(pKHcl2.+ IPTG)の培養菌
株を分画し、C−552の細胞内での局在性を調べたと
ころ、C−552は細胞質に存在していた。
泳動し、ウェスタンプロットの後、抗C−552抗体を
用いて、C−552の検出を行った。その結果を第6B
図に示した。即ち、調べたJM109、JM109(p
KHcll、−IPTG)、JM109(pKHcll
、 +IPTG)、JM109(pKHcl2.−IP
TG)、JM109(pKHcl2. +IPTG)の
うちJM109(pKHcl2 、÷IPTG)だけに
天然のC−552と同じ位置に特異的なバンドが観察さ
れた。この結果から、大腸菌においてC−552蛋白が
発現していることがわかる。ここでは、C−552のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子を含むpKHcl
1による形質転換株においては、抗体と反応するものが
みられなかったのに対し、シグナルペプチドを含まない
遺伝子を含むpKHcl2による形質転換株においての
み発現がみられるという予想外の結果が得られた。また
、JM109(pKHcl2.+ IPTG)の培養菌
株を分画し、C−552の細胞内での局在性を調べたと
ころ、C−552は細胞質に存在していた。
次にC−552の発現レベルを調べるために、前述のよ
うに培養した菌体をフレンチプレスにて破砕後、可溶性
画分の蛋白量及びチトクロームC量を測定した。JM1
09(pKHc12、+ IPTG) 、JM109(
pUK812. + IPTG)のC−552含量は全
蛋白質の約0.4%であった。
うに培養した菌体をフレンチプレスにて破砕後、可溶性
画分の蛋白量及びチトクロームC量を測定した。JM1
09(pKHc12、+ IPTG) 、JM109(
pUK812. + IPTG)のC−552含量は全
蛋白質の約0.4%であった。
次に、JM109(pUK812. + IPTG)の
菌体から公知の方法(Y、 Sanbongi et
al、、 J、 Bactertol、、17165、
1989)により組み換えC−552を精製した。
菌体から公知の方法(Y、 Sanbongi et
al、、 J、 Bactertol、、17165、
1989)により組み換えC−552を精製した。
実施例4 えチトクロームC−552の性精製した
C−552の吸収スペクトル、熱安定性、酵素学的性質
は天然のC−552と一致した。以下に精製したC−5
52の性質について述べる。
C−552の吸収スペクトル、熱安定性、酵素学的性質
は天然のC−552と一致した。以下に精製したC−5
52の性質について述べる。
えチトクロームCC−552の性
精製した組換えチトクロームC−552の還元型吸収ス
ペクトルを測定した結果を天然型のチトクロームC−5
52のそれと比較して第7図に示した。両者の吸収スペ
クトルは一致した。チトクロームCの吸収スペクトルは
、その分子構造を反映することは公知であり、したがっ
て、組み換えチトクロームC−552は、そのアミノ末
端にメチオニン残基をもつにもかかわらす、天然のチト
クロームC−552と同じ構造をしていることがわかる
。
ペクトルを測定した結果を天然型のチトクロームC−5
52のそれと比較して第7図に示した。両者の吸収スペ
クトルは一致した。チトクロームCの吸収スペクトルは
、その分子構造を反映することは公知であり、したがっ
て、組み換えチトクロームC−552は、そのアミノ末
端にメチオニン残基をもつにもかかわらす、天然のチト
クロームC−552と同じ構造をしていることがわかる
。
さらに組み換えチトクロームC−552の構造を調べる
ためにそのCD(円二色性)を測定した。CDを測定す
ることにより、蛋白質分子の二次構造を推定することが
できる。チトクロームC−552を50μgodとなる
ように10mM Kl(2PO,−NaOH(pH’1
.o)に溶解し、210 nmから250 nmのCD
スペクトルをJASCOautomatic reco
rding spectropolarimeter
Model J−20(日本分光)を使用して測定した
。また、チトクロームC溶液を120℃、10分間オー
トクレーブした後、室温に戻し、CDスペクトルを測定
した。結果を第8図に示した。図中Aはオートクレーブ
前、Bはオートクレーブ後のCDスペクトルである。第
8図から、組み換えC−552と天然C−552は同じ
構造をしていること、並びに組み換えC−552も天然
C−552もオートクレーブ処理により、構造が変化し
ないことがわかる。したがって、組み換え法により生産
したC−552は、その熱安定性という産業上好都合な
性質を保持していることが分かった。ちなみに、ウマチ
トクロームCは、オートクレーブ後のCDスペクトルが
顕著に変化しており、変性してしまったことがわかる。
ためにそのCD(円二色性)を測定した。CDを測定す
ることにより、蛋白質分子の二次構造を推定することが
できる。チトクロームC−552を50μgodとなる
ように10mM Kl(2PO,−NaOH(pH’1
.o)に溶解し、210 nmから250 nmのCD
スペクトルをJASCOautomatic reco
rding spectropolarimeter
Model J−20(日本分光)を使用して測定した
。また、チトクロームC溶液を120℃、10分間オー
トクレーブした後、室温に戻し、CDスペクトルを測定
した。結果を第8図に示した。図中Aはオートクレーブ
前、Bはオートクレーブ後のCDスペクトルである。第
8図から、組み換えC−552と天然C−552は同じ
構造をしていること、並びに組み換えC−552も天然
C−552もオートクレーブ処理により、構造が変化し
ないことがわかる。したがって、組み換え法により生産
したC−552は、その熱安定性という産業上好都合な
性質を保持していることが分かった。ちなみに、ウマチ
トクロームCは、オートクレーブ後のCDスペクトルが
顕著に変化しており、変性してしまったことがわかる。
実施例5 えチトクロームCのアミノ 配■丘
組み換えC−552のアミノ末端のアミノ酸配列をアプ
ライド バイオシステムズ社の気相法シークエンサーに
て決定した。その結果、以下の配列を有していた: Met−Asn−Glu−Gin−Leu−Ala−L
ys−Gin−Lys−Glyこの配列はアミノ末端に
メチオニン残基が付加されていることを除けば、天然の
C−552のアミノ末端配列と一致した。メチオニン残
基の付加によっても、C−552の産業上好ましい性質
は損なわれていなかったので、ここに記載した方法によ
って、組み換えC−5’52を大量に、安価に製造でき
るようなったと考えられる。なお、ここで使用したプロ
モーター、大腸菌宿主などは、−例であり、他のプロモ
ーターや宿主を用いても、発現は可能である。
ライド バイオシステムズ社の気相法シークエンサーに
て決定した。その結果、以下の配列を有していた: Met−Asn−Glu−Gin−Leu−Ala−L
ys−Gin−Lys−Glyこの配列はアミノ末端に
メチオニン残基が付加されていることを除けば、天然の
C−552のアミノ末端配列と一致した。メチオニン残
基の付加によっても、C−552の産業上好ましい性質
は損なわれていなかったので、ここに記載した方法によ
って、組み換えC−5’52を大量に、安価に製造でき
るようなったと考えられる。なお、ここで使用したプロ
モーター、大腸菌宿主などは、−例であり、他のプロモ
ーターや宿主を用いても、発現は可能である。
(発明の効果)
以上のようにして、ヒドロゲノバクター サーモフィラ
スC−552遺伝子のクローニングと塩基配列の決定を
行った。さらに、この遺伝子を酵母の発現ベクターにつ
ないで、乳酸を資化できない酵母に導入したところ、乳
酸の資化能が回復し、チトクロームC量も上昇したので
、C−552が酵母で発現した。したがって、C−55
2を組換えDNAの手法を用いて大量かつ容易に得るこ
とができる。また、酵母は真核生物のチトクロームCの
みならず、それとは構造が似ていない原核生物のチトク
ロームCをも発現できる。
スC−552遺伝子のクローニングと塩基配列の決定を
行った。さらに、この遺伝子を酵母の発現ベクターにつ
ないで、乳酸を資化できない酵母に導入したところ、乳
酸の資化能が回復し、チトクロームC量も上昇したので
、C−552が酵母で発現した。したがって、C−55
2を組換えDNAの手法を用いて大量かつ容易に得るこ
とができる。また、酵母は真核生物のチトクロームCの
みならず、それとは構造が似ていない原核生物のチトク
ロームCをも発現できる。
また、大腸菌の発現ベクターを用いると、大腸菌でも組
換えC−552を発現させることができた。
換えC−552を発現させることができた。
大腸菌が生産する組換えC−552は、ヒドロゲノバク
ター サーモフィラスの生産するC−552と実質的に
同一であり、産業上好ましい性質を保持していた。同様
にして、他の宿主生物を用いても、組換えC−552の
生産は可能と思われる。
ター サーモフィラスの生産するC−552と実質的に
同一であり、産業上好ましい性質を保持していた。同様
にして、他の宿主生物を用いても、組換えC−552の
生産は可能と思われる。
また、高温でも機能できるという特徴をもつそのプロモ
ーター、ターミネータ−、シグナルペプチドの構造が解
明された。
ーター、ターミネータ−、シグナルペプチドの構造が解
明された。
第1図は、C−552遺伝子をスクリーニングするため
の合成プローブの配列を対応するアミノ酸配列および可
能性のあるコドンとともに示した図であり、 第2A−1図および第2A−2図は、C−552遺伝子
の塩基配列を、プロモーター配列、シグナル配列、ター
ミネータ−配列も含めて示す一連の図であり、 第2B図は、C−552遺伝子のプロモータ一部分の塩
基配列を、その−35,−10およびSD配列に下線を
付けて示した図であり、 第2C図は、C−552のシグナル配列およびそれをコ
ードする遺伝子の配列を示す図であり、第2D図は、C
−552の翻訳領域とそれをコードする遺伝子の配列を
示す図であり、 第2E図は、C−552のターミネータ−の塩基配列を
回文構造をなす部分に下線を付けて示した図であり、 第3図は、C−552の酵母での発現に用いたプラスミ
ドの造成について概略を示した図であり、第4図は、乳
酸を炭素源としたときのC−552遺伝子を発現してい
る酵母の増殖を示したグラフであり、 第5図は、C−552の大腸菌での発現に用いたプラス
ミドの造成について概略を示した図であり、第6A図お
よび第6B図は、それぞれ酵母中で発現させたC−55
2および大腸菌中で発現させたC−552を、抗C−5
52抗体を用いて検出した結果を示す電気泳動写真であ
り、 第7A図および第7B図は、それぞれ天然型のチトクロ
ームC−552および組換えチトクロームC−552の
還元型吸収スペクトル図であり、第8A図、第8B図お
よび第8C図は、それぞれ天然型のチトクロームC−5
52、組換えチトクロームC−552およびウマ心筋チ
トクロームCのCDスペクトル図である。 アミノ酸配列 可能性のあるコ プローブ1 プローブ2 7 10
15−C1n−Lys−Gl y−
Cys−Me t−Al a−Cys−Hi 5−A5
p−F:/ CARAARGGN TGY A
TG GCN TGY CAY GAY5’
TGT ATG GCN TGT CAT
GA 3”5’ CAG AAG GGN
TGT ATG GC3゜N: A。 C2 G またはT、 R:AまたはG、 Y:Cまたは
T茅 4 国 地(晦 間 (晴間) Ptac : tacy’υを−ター 6 N 、) 9 4 5 す1ケレー・\ C−夕52 ハしY C,r、 Xδ−3)−2β x、s’−3つ−2B pY!−7こt7+ノータ゛−1′−+)メツYHC/
2 リーグ−(−) ′ 手トクν−ム ニータジ 2、7 M / i、’ ” (デjXET7t、41
M)j pRHCill?Tコ(−) +1 グ
ーζ十)A、、、KHCIお、′ρTG(す ”Y7A凹 %f3A図 第8Bズ 第8C雪 第7B凹 燻 (nm) 600 、!;50 波 −t(nm) 00
の合成プローブの配列を対応するアミノ酸配列および可
能性のあるコドンとともに示した図であり、 第2A−1図および第2A−2図は、C−552遺伝子
の塩基配列を、プロモーター配列、シグナル配列、ター
ミネータ−配列も含めて示す一連の図であり、 第2B図は、C−552遺伝子のプロモータ一部分の塩
基配列を、その−35,−10およびSD配列に下線を
付けて示した図であり、 第2C図は、C−552のシグナル配列およびそれをコ
ードする遺伝子の配列を示す図であり、第2D図は、C
−552の翻訳領域とそれをコードする遺伝子の配列を
示す図であり、 第2E図は、C−552のターミネータ−の塩基配列を
回文構造をなす部分に下線を付けて示した図であり、 第3図は、C−552の酵母での発現に用いたプラスミ
ドの造成について概略を示した図であり、第4図は、乳
酸を炭素源としたときのC−552遺伝子を発現してい
る酵母の増殖を示したグラフであり、 第5図は、C−552の大腸菌での発現に用いたプラス
ミドの造成について概略を示した図であり、第6A図お
よび第6B図は、それぞれ酵母中で発現させたC−55
2および大腸菌中で発現させたC−552を、抗C−5
52抗体を用いて検出した結果を示す電気泳動写真であ
り、 第7A図および第7B図は、それぞれ天然型のチトクロ
ームC−552および組換えチトクロームC−552の
還元型吸収スペクトル図であり、第8A図、第8B図お
よび第8C図は、それぞれ天然型のチトクロームC−5
52、組換えチトクロームC−552およびウマ心筋チ
トクロームCのCDスペクトル図である。 アミノ酸配列 可能性のあるコ プローブ1 プローブ2 7 10
15−C1n−Lys−Gl y−
Cys−Me t−Al a−Cys−Hi 5−A5
p−F:/ CARAARGGN TGY A
TG GCN TGY CAY GAY5’
TGT ATG GCN TGT CAT
GA 3”5’ CAG AAG GGN
TGT ATG GC3゜N: A。 C2 G またはT、 R:AまたはG、 Y:Cまたは
T茅 4 国 地(晦 間 (晴間) Ptac : tacy’υを−ター 6 N 、) 9 4 5 す1ケレー・\ C−夕52 ハしY C,r、 Xδ−3)−2β x、s’−3つ−2B pY!−7こt7+ノータ゛−1′−+)メツYHC/
2 リーグ−(−) ′ 手トクν−ム ニータジ 2、7 M / i、’ ” (デjXET7t、41
M)j pRHCill?Tコ(−) +1 グ
ーζ十)A、、、KHCIお、′ρTG(す ”Y7A凹 %f3A図 第8Bズ 第8C雪 第7B凹 燻 (nm) 600 、!;50 波 −t(nm) 00
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、下式( I ): 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ( I ) で表される高度好熱性チトクロームC−552(以下C
−552と略す)をコードするDNA、及びそのプロモ
ーター、ターミネーターの塩基配列またはこれと実質的
に同一な塩基配列。 2、下式( I a): 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ( I a) で表される、高度好熱性チトクロームC−552をその
リーダー配列とともにコードするDNAの塩基配列また
はこれと実質的に同一な塩基配列。 3、下式( I b): 【遺伝子配列があります】 で表される、高度好熱性チトクロームC−552をコー
ドするDNAの塩基配列またはこれと実質的に同一な塩
基配列。 4、式( I )の塩基配列を染色体中に含む、ヒドロゲ
モナスサーモフィラスの染色体DNAからAcc I と
Pst I で切り出される約1.1kbのDNA断片。 5、高度好熱性絶対独立栄養性水素細菌であるHydr
ogenobacterthermophilusのチ
トクロームC−552のシグナルのアミノ酸配列及びそ
れをコードするDNA。 6、次式: 【遺伝子配列があります】 で表される請求項第5記載のDNAまたはこれと実質的
に同一なDNA。 7、請求項第1、2または3項記載のC−552の遺伝
子の全部または一部を含むプラスミド。 8、請求項第1、2または3項記載のC−552の遺伝
子の全部または一部を含むプラスミドにより形質転換さ
れた組換え宿主細胞。 9、酵母または大腸菌である、請求項第8項記載の組換
え宿主細胞。 10、請求項第8または9項記載の宿主細胞を培養し、
その培養菌体からC−552を採取することを特徴とす
る、C−552の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4806590A JP2995070B2 (ja) | 1989-02-28 | 1990-02-28 | 水素細菌由来チトクロームc遺伝子 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1-47427 | 1989-02-28 | ||
JP4742789 | 1989-02-28 | ||
JP4806590A JP2995070B2 (ja) | 1989-02-28 | 1990-02-28 | 水素細菌由来チトクロームc遺伝子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03219877A true JPH03219877A (ja) | 1991-09-27 |
JP2995070B2 JP2995070B2 (ja) | 1999-12-27 |
Family
ID=26387587
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4806590A Expired - Lifetime JP2995070B2 (ja) | 1989-02-28 | 1990-02-28 | 水素細菌由来チトクロームc遺伝子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2995070B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010251533A (ja) * | 2009-04-16 | 2010-11-04 | Sony Corp | 分子素子、撮像素子、光センサーおよび電子機器 |
-
1990
- 1990-02-28 JP JP4806590A patent/JP2995070B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010251533A (ja) * | 2009-04-16 | 2010-11-04 | Sony Corp | 分子素子、撮像素子、光センサーおよび電子機器 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2995070B2 (ja) | 1999-12-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2988678B2 (ja) | 組み換え系におけるグルコースオキシダアーゼの産生 | |
Skinner et al. | Phospholipid transfer activity is relevant to but not sufficient for the essential function of the yeast SEC14 gene product. | |
KR100316347B1 (ko) | 대장균엔테로톡신ⅱ신호펩티드의변형체와인체성장호르몬의융합단백질을발현하는재조합미생물및그를이용한인체성장호르몬의제조방법 | |
JP3878207B2 (ja) | osmB プロモータで制御される発現プラスミド | |
JP4836017B2 (ja) | 糸状菌由来グルコースデヒドロゲナーゼを組換え体で高発現するための方法 | |
US5612196A (en) | Human serun albumin, preparation and use | |
HU204097B (en) | Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species | |
Takemura et al. | Induction by ethanol of alcohol dehydrogenase activity in Acetobacter pasteurianus | |
JP2571119B2 (ja) | 細胞膜結合型アルデヒド脱水素酸素の構造遺伝子、これを含むプラスミド、形質転換した酢酸菌及び酢酸発酵法 | |
JPH03504561A (ja) | 組換えヒトインターロイキン‐3およびその変異たんぱく質の生産および精製 | |
Lodi et al. | Carbon catabolite repression in Kluyveromyces lactis: isolation and characterization of the KINLD gene encoding the mitochondrial enzyme D-lactate ferricytochrome c oxidoreductase | |
WO2011078351A1 (ja) | 分泌シグナル配列およびこれを利用したタンパク質発現系 | |
JPH03219877A (ja) | 水素細菌由来チトクロームc遺伝子 | |
EP0558024B1 (en) | Novel vector having promoter that is inducible by methanol and/or glycerol | |
JP4157314B2 (ja) | 酢酸耐性遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 | |
Tully et al. | Characterization of cytochromes c550 and c555 from Bradyrhizobium japonicum: cloning, mutagenesis, and sequencing of the c555 gene (cycC) | |
JP3949734B2 (ja) | プロテアーゼ阻害剤の生産方法 | |
JPH08196281A (ja) | 水生成型nadhオキシダーゼをコードするdna | |
Feger et al. | Identification of regulatory residues of the yeast adenylyl cyclase. | |
US5459046A (en) | Cytochrome C gene derived from hydrogen bacterium | |
CN108473542B (zh) | 遗传修饰的酵母细胞和改进的用于生产凝块特异性链激酶的方法 | |
KR0134997B1 (ko) | 스트렙토키나제 발현 미생물 및 그를 이용한 스트렙토키나제의 제조방법 | |
JPH07507439A (ja) | 酵母での蛋白質発現用人工プロモーター | |
JP3330670B2 (ja) | アルケンモノオキシゲナーゼ、これをコードする遺伝子及び形質転換微生物並びにアルケンのエポキシ化方法 | |
Mulder et al. | Involvement of the N-and C-terminal domains of Mycobacterium tuberculosis KatG in the protection of mutant Escherichia coli against DNA-damaging agents |