JPH032196A

JPH032196A - 抗転移活性を有するペプチド

Info

Publication number: JPH032196A
Application number: JP2119662A
Authority: JP
Inventors: Charles S Schasteen; チャールズ　スチーブン　スカスティーン
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1989-05-10
Filing date: 1990-05-09
Publication date: 1991-01-08
Also published as: US5039662A; ES2036513T1; DE69016494T2; GR3015239T3; ATE118016T1; EP0397635A1; DE69016494D1; EP0397635B1; DK0397635T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、抗転移活性を有するペプチドに関する。

［従来技術］ラミニンは、細胞癒着、移動、増殖、並びに神経突起の
成長及び分化を促進する基底膜特異的活性糖蛋白である
。チンプル　アール　エッチジェー、イー等ジャーナル
　オブ　モレキュラーバイオロジーＪ、　Ｍｏ１．　Ｂ
ｉｏｌ、　１５０　：９７（１９８１）及びフレインマ
ン　エッチ　ケ−（Ｋｌｅｉｎｍａｎ　Ｈ，Ｋ、　）等
ジャーナル　オブ　セルバイオケミストリー劉ユＣｅ１
１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２７　：３１７　（１９８５
）参照。ラミニンは、ある種の細胞の癒着、移動、増殖
、及び分化を促進することを含め多くの生物学的活性を
示す。グラフ　ジエ−（Ｇｒａｆ　Ｊ、）等の±正立）
４８　：９８９　（１９８７）参照。ラミニンはＡ、Ｂ
ｌ及びＢ２の３本の鎖からなっている。この３本の鎖は
、十字架状の形を作っている。

その表面にラミニン受容体を有する悪性細胞は、正常細
胞よりもより容易にラミニンに付着する。悪性細胞の侵
略は、ラミニンへの結合、及び蛋白質分解酵素の生産を
含め特異的な機構の使用、及び悪性細胞の正常組織への
移動を意味する。この過程は基底膜の分解を意味する。

欧州特許出願公告第０２７８７８１号、イワモト　ワイ
（Ｉｗａｍｏｔｏ、　Ｙ　）等サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ　）２３８　：１１３２（１９８７）及びグラフ　
ジエ−（Ｇｒａｆ、　Ｊ　）等バイオケミストリＵ勘±
凹当にΩ２６　：６８９６　（１９８７）に開示されて
いるように、腫瘍細胞の転移を阻害するとしてこれまで
示されて来たペプチドとしては、ペンタペプチド　チロ
シン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニンを
含む。ラミニンへの細胞付着を阻害することによって悪
性細胞転移を阻害することのできる他の有効なペプチド
を発見することが期待されている。

［課題を解決するための手段］式：％式％を有するペプチド又は薬学上許容できるその塩は、抗転
移活性を示すことを発見した。このペプチドは細胞付着
及びメラノーマ細胞のコロニー化を阻止する。このペプ
チドは、乳癌、表皮癌、筋線メラノーマ（ｍｕｓｃｌｅ
　１ｉｎｅ　ｍｅｌａｎｏｍａ　）、表皮線神経芽細胞
腫Ｘグリオマ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｌｉｎｅｎｅｕｒ
ｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｘ　ｇｌｉｏｍａ　）、軟骨細胞
、ヒト皮膚繊維芽細胞、ウシ骨芽細胞及びフィブロザル
コーマ（ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ　）を含め種々の細
胞の付着及び転移を阻止するのに有効である。

記号“Ｙ”Ｉ”Ｑｌ？　　１１３１１　１４　Ｒ４１は
、アミノ酸し−チロシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グリ
シン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニンをそれぞれ示す。

Ａｃは、アセチル　（ＣＨ３−Ｃ−）を示す。非毒性の
薬学上の塩は、ペプチドと無機又は有機の塩の反応によ
って製造してもよい。できた塩は、ペプチドの生物学的
活性を維持する。満足し得る酸の例は塩酸、硝酸、燐酸
、酒石酸及び酢酸である。

本発明のペプチドは、悪性細胞上のラミニン受容体に作
用し、悪性細胞がラミニンに結合できなくし、そのため
悪性細胞のラミニンへの結合を阻止し、悪性細胞の破壊
的侵食を阻止する。本発明のペプチドは、細胞付着及び
ラミニン媒介付着を阻止することにより作用する。

本発明のペプチドは、従来のメリフィールド（Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ　）の固体相合成性によって合成する［ジ
ャーナル　オブ　アメリカンケミカルソサイエティーＪ
、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、）　８５　：２１４
９　（１９６３）、スチュワート　アンド　ヤング（Ｓ
ｔｅｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ）固体相ペプチド合
成　２版（１９８４）イリノイ州ロックホード　ピルス
ケミカルカンパニ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ
ｏｍｐａｎｙ　）　］。アシル化は、適当な溶媒中で無
水酢酸を添加することによってアミド樹脂上で行う。適
当な溶媒の例は、アセトン、ジオキサン、メチレンクロ
ライドである。

本発明のペプチドは、悪性腫瘍細胞に関する種々の治療
上の及び薬物的適用に使用できる。

通常、このペプチドは、賦形剤を含む薬物組成物として
投与される。この薬物組成物は、レミントンの薬科学（
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　）メルク出版社、イートン、ペン
シルベニア州　１６版　１９８０に開示されているよう
に、知られているどのような方法で製造しても良い。賦
形剤としては、蒸留水、塩類溶液、又はリン酸塩若しく
は酢酸塩のような緩衝塩類を含む緩衝液、圧力調節剤と
しての塩化ナトリウム、又は蔗糖若しくはアスコルビン
酸のような酸化防止剤、又は許容し得るこれらの組み合
わせがある。この薬物組成物は、錠剤、溶液のような種
々の形態としてもよく、経口、経鼻、非経口（静脈注射
、筋肉内的に、皮下注射的に、腹腔内的を含む）種々の
経路で投与してもよい。投与量は患者の年齢、体重、状
況、投与経路のような変数により変わる。通常、投与量
１よ体重ＩＫｇ当たり有効物質０．００１から１００ｍ
ｇである。好ましくは、この量は体ｔＩＫｇ当たり有効
物質０．０１から５０ｍｇである。

［実施例１以下に、本発明の実施例を示す。

（実施例１）チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニ
ン（ＹＩＧＳＲ−ＮＨ２）ペプチドは、従来のメリフィ
ールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　）の固体相合成性によ
って、［ジャーナル　オブ　アメリカンケミカルソサイ
エティーＪ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　８５　
：２１４９　（１９６３）、スチュワート　アンド　ヤ
ング（Ｓｔｅｗａｒｔ　ａｎｄＹｏｕｎｇ　）固体相ペ
プチド合成　２版（１９８４）イリノイ州ロックホード
　ピルスケミカルカンパニ（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　）　］、自動モデルアプライド
バイオシステムシンセサイザー（Ｍｏｄｅｌ　Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ
　）を用いて、メチルベンズヒドロシルアミン（メチル
ＢＨＡ）樹脂（アプライドバイオシステム社、カルフォ
ルニア州、フォスター市）を使用して合成した。ペプチ
ドのアシル化を、メチレンクロライドに１０倍過剰モル
（ペプチドの遊離アミノ末端に関して）の無水酢酸（ピ
ルスケミカルカンパニ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　））を添加することによって３０
分間室温で行った。固体相支持体マトリックスからのペ
プチドのデプロテクション（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
　）及び解放（ｒｅｌｅａｓｅ　）は、保護されたペプ
チドを樹脂上で１０％アニソールを含む無水ＨＦにより
処理することによって達成した。

エチルアセテートで抽出することによってデブロテクシ
ゴン試薬を除去し、ペプチドを３０％水性酢酸で溶解し
、その溶液を焼結ガラス（粗目）入りブフナー漏斗によ
り濾過し、樹脂を除去した。

（実施例２）ヒト　フィブロザルコーマ（ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ
　）由来のＨＴ　−１０８０細胞［ラッシードエス（Ｒ
ａｓｈｅｅｄ、　８）等、キャンサーＣａｎｃｅｒ（フ
ィラデルフィア）３３：１０２７　（１９７４）］をダ
ルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　）の改良イーグル（Ｅａ
ｇｌｅ　）培地（ＤＭＥＭ）に維持した。この細胞が８
０％集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ　）に成育した後、
ｐＨ７，４でＣａ＋２及びＭｇ＋２なしの０．０２　Ｍ
リン酸塩緩衝液で洗浄し、０．０２５％トリプシンと０
．０２５％エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）の
溶液で分離した。この細胞をそれから低速遠心分離によ
り小球化し、０．０２％のウシ血清アルブミン［ＢＳＡ
、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏ、　）ミズリー州セントルイス１を含むイーグルの
最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｅ
ｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　）　（ＤＭＥＭ　）に再添
加した。クレーブ　アール　ジｘ−（Ｋｌｅｂｅ、　Ｒ
，Ｊ、）１二±＋　−ｎａｔｕｒｅ　２５０：２４８（
１９７４）ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ　）の記述に従って
、組織培養成形物質上で０．０２％ＢＳＡを含む１ｍｌ
ＥＭＥＭ中に種々のペプチドとともに、培養するか又は
、ラミニンとともに１ないし２時間３７°Ｃで、培養し
、１６ｍｍファルコン組織培養器（Ｆａｌｃｏｎ　ｔｉ
ｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｗｅｌｌ　）（フィッシャ
ーサイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅ　５ｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ　Ｃｏ、　）ペンシルベニア州、ピッツバーグ
）を使用して細胞付着試験を行った。細胞（０，１ｍＬ
あたり１０５）をウェル（ｗｅｌｌ）に加え、この溶液
を更に１時間３７°Ｃで９５％空気及び５％ＣＯ□中で
培養した。引き続いて、付着していない細胞を除去する
ために１ｍＬのリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）でウェルを３回
洗った。付着細胞をトリプシン処理し、計数した（クル
ターＺＢＩ　）。シクロヘキシイミド（２５ｍｇ　／　
ｍＬ　）の存在下付着試験を行い、内因性付着蛋白質の
生産を最小化した。各ペプチドにつき複数試験し、付着
試験は６反復した。

各試験でのサンプル間の変動は、１５％より少なかった
。ペプチドによるラミニンへの付着阻止試験を行うため
、細菌ペトリ皿（３５ｍｍ）を５ｍｇのラミニンで覆い
、−晩空気乾燥した。細胞の添加に先立って、０．０５
％ＢＳＡを含んだ無血清ＥＭＥＭ中に溶かした種々の濃
度のペプチドを冬服に添加した。付着試験をその後前記
した方法で行った。冬服の最終容量を１　ｍｌとし、各
ペプチドを９回試験し、各試験を反復して行った。図１
に示すように、試験管内細胞付着試験は、細胞付着活性
を有する本発明のペプチドを示す。

（実施例３）１、　Ｊ、　Ｆｉｄｌｅｒ（アイ　ジェー　フィドラー
）博士ご°テキサス州フユーストンアンダーソン病院（
ＡｎｄｅｒｓｏｎＨｏｓｐｉｔａｌ　）から提供された
Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ｍｅｌａｎｏｍａ　）細胞を
標準培養条件で増殖させた。肺がんコロニー化分析は、
１．　Ｊ、　Ｆｉｄｌｅｒ（アイ　ジェーフィドラー）
ネイチャ包帖四〇ロンドン　ニュバイオロジＣ（芭ユ回
±２４２　：　１４８　（１９７３）に記載の方法で行
った。ペプチドをＰＢＳ中に５　ｍｇ　／　ｍＬで溶が
し、フィルター殺菌した。０．１　ｍＬ　ＤＭＥＭ中の
Ｂ１６Ｆ１０細胞（５Ｘ１０５）のサスペンションを０
．１　ｍＬのペプチド（又は対称中の０．１　ｍＬ　Ｐ
ＢＳ　）に混合し、５分間室温で培養し、６週齢の同系
Ｃ５７ＢＬ　／　６雌マウス［ジャクソンラブズ　バー
ハーバ−マイン（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌｏｂｓ、、　Ｂａ
ｒ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｍａｉｎｅ　）］のテイル静脈に
注入した。各処置及び対照群は８匹のマウスで構成する
。注入の３週間後、マウスを殺し、肺表面の肺胞腫瘍の
数を計測した。第２図は、本発明のペプチドであるＡｃ
　ＹＩＧＳＲ−ＮＨ２は、ＹＩＧＳＲ−ＮＨ２の少なく
とも２倍有効であることを示す。

本発明を特定の例に関して開示したが、限定して解釈さ
れるべきではない。なぜなら、本発明の本質及び範囲か
う逸脱しない種々の均等手段、変更、及び修正が可能で
あることは明らかであるからである。そしてそのような
均等例は本発明に含まれると考える。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のペプチドによる細胞付着阻害活性を
示す。第２図は、本発明のペプチドによる生体内抗転移活性を
示す。

Claims

【特許請求の範囲】（１）式：ＡｃＹＩＧＳＲ−ＮＨ＿２を有するペプチド又は薬学上許容できるその塩。（２）式：ＡｃＹＩＧＳＲ−ＮＨ＿２を有する特許請求の範囲第１項記載のペプチド。（３）式：ＡｃＹＩＧＳＲ−ＮＨ＿２を有するペプチドの薬学上許容できる塩である特許請求
の範囲第１項記載のペプチド。（４）薬学上許容できる賦形剤及び治療上有効量の式：ＡｃＹＩＧＳＲ−ＮＨ＿２を有するペプチド又は薬学上許容できるその塩を含む薬
物組成物。（５）ペプチドが、式：ＡｃＹＩＧＳＲ−ＮＨ＿２を有する特許請求の範囲第４項記載の薬物組成物。（６）ペプチドが、式：ＡｃＹＩＧＳＲ−ＮＨ＿２を有するペプチドの薬学上許容できる塩である特許請求
の範囲第４項記載の薬物組成物。（７）有効量の式：ＡｃＹＩＧＳＲ−ＮＨ＿２を有するペプチド又は薬学上許容できるその塩を投与す
ることからなる転移を阻止する方法。（８）ペプチドが、式：ＡｃＹＩＧＳＲ−ＮＨ＿２を有する特許請求の範囲第７項記載の方法。（９）ペプチドが、式：ＡｃＹＩＧＳＲ−ＮＨ＿２を有するペプチドの薬学上許容できる塩である特許請求
の範囲第７項記載の方法。（１０）薬学上許容できる賦形剤を含む薬物組成物とし
てペプチドを投与する特許請求の範囲第７項記載の方法
。（１１）薬物組成物が、式：ＡｃＹＩＧＳＲ−ＮＨ＿２を有するペプチドからなる特許請求の範囲第１０項記載
の方法。（１２）薬物組成物が、式：ＡｃＹＩＧＳＲ−ＮＨ＿２を有するペプチドの薬学上許容できる塩からなる特許請
求の範囲第１１項記載の方法。