DE69016494T2 - Peptid mit einer Aktivität gegen Metastasen. - Google Patents
Peptid mit einer Aktivität gegen Metastasen.Info
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Description
- Laminin ist ein Basalmembran-spezifisches Glykoprotein, das bei der Förderung der Zellhaftung, Migration, Vermehrung, des Neuritauswuchses und der Differenzierung aktiv ist. Vgl. Timpl, R.H. et al., J. Biol. Chem, 254:9933 (1979), Engel, J.E. et al., J. Mol. Biol. 150:97 (1981) und Kleinman, H.K. et al., J. Cell. Biochem. 27:317 (1985). Laminin weist zahlreiche biologische Aktivitäten auf, einschließlich der Förderung der Haftung, Migration, des Wachstums und der Differenzierung bestimmter Zellen, vgl. Graf, J. et al., Cell 48:989 (1987). Laminin ist aus 3 Ketten, A, B1 und B2, zusammengesetzt. Die drei Ketten bilden eine kreuzartige Form.
- Maligne Zellen mit Lamininrezeptoren an ihren Oberflächen binden sich und haften leichter an Laminin als normale Zellen. Maligner Zellbefall involviert das Binden an Laminin und die Verwendung spezieller Mechanismen, einschließlich der Erzeugung proteolytischer Enzyme und der Bewegung der Zellen in normales Gewebe hinein. Dieses Verfahren involviert den Abbau der Basalmembran.
- Peptide, von denen gezeigt wurde, daß sie eine Inhibierung der Metastasierung von Tumorzellen aufweisen, umfassen das Pentapeptid Tyrosin-Isoleucin-Glycin-Serin-Arginin, wie in der Europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 0278781, Iwamoto, Y. et al., Science 238:1132 (1987) und Graf, J. et al., Biochemistry, 26:6896 (1987) geoffenbart. Es wäre wünschenswert, andere wirksame Peptide zu entdecken, welche die Tumorzellausbreitungsfähigkeit durch Hemmung der Zellhaftung an Laminin hemmen können.
- Es wurde gefunden, daß ein Peptid mit der Formel:
- AcYIGSR
- oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz hievon eine antimetastasierende Wirkung aufweist. Das Peptid blockiert die Zellhaftung und die Melanomzellkolonialisierung. Das Peptid sollte beim Blockieren der Haftung und der Metastasierung einer Vielfalt von Zelltypen, einschließlich Brustkarzinom, Epidermiskarzinom, Muskellinienmelanom, Epidermislinien-Neuroblastom x Gliom, Chondrozyten, Hautfibroblasten vom Menschen, Rinder- Osteoblasten und Fibrosarkom, wirksam sein.
- Die einbuchstabigen Symbole "Y", "I", "G", "S" und "R" beziehen sich auf die Aminosäuren L-Tyrosin, L-Isoleucin, L- Glycin, L-Serin bzw. L-Arginin. "Ac" bedeutet Acetyl (CH&sub3;)- -). Nicht-toxische pharmazeutische Salze können durch Umsetzung des Peptids mit anorganischen oder organischen Säuren hergestellt werden. Die resultierenden Salze behalten die biologische Aktivität des Peptids bei. Beispiele für gute Säuren sind Salzsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Weinsäure und Essigsäure.
- Das Peptid dieser Erfindung tritt in Wechselwirkung mit den Lamininrezeptoren einer malignen Zelle, so daß sie sich nicht an Laminin binden kann, wodurch die Bindung der malignen Zelle an Laminin blockiert und die destruktive Ausbreitungsfähigkeit der malignen Zelle inhibiert wird. Das Peptid der Erfindung wirkt durch Blockieren der Zellhaftung und Blockieren der Lamininvermittelten Haftung.
- Das Peptid der Erfindung wird mittels des klassischen Festphasensyntheseverfahrens von Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), wie von Stewart und Young (Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe (1984), Pierce Chemical Company, Rockford, 11. beschrieben), synthetisiert. Die Acylierung erfolgt auf einem Amidharz durch Zugabe von Essigsäureanhydrid in einem geeigneten Lösungsmittel. Beispiele für geeignete Lösungsmittel schließen Aceton, Dioxan und Methylenchlorid mit ein.
- Das Peptid der Erfindung kann in einer Vielfalt therapeutischer und pharmazeutischer Anwendungen in bezug auf maligne Tumorzellen verwendet werden. Typischerweise wird das Peptid als pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Träger umfaßt, verabreicht. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann mittes jedes der bekannten Verfahren, wie in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eaton, PA, 16. Ausgabe, 1980 beschrieben, hergestellt werden. Träger können steriles Wasser, Kochsalzlösung und gepufferte Kochsalzlösung, einschließlich Puffer wie Phosphat oder Acetat, Natriumchlorid oder Saccharose als Druckeinstellmittel, und Antioxidantien, wie Ascorbinsäure, oder jegliche akzeptable Kombinationen davon, umfassen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann in verschiedenen Formen vorliegen, wie Tabletten und Lösungen, und auf verschiedenen Wegen, einschließlich oralem, nasalem und parenteralem (einschließlich intravenösem, intramuskulärem, subkutanem und intraperitonealem) Weg verabreicht werden. Der Dosisbereich wird in Abhängigkeit von Variablen, wie dem Alter, Gewicht, Zustand des Patienten und dem Verabreichungsweg variieren. Typischerweise ist der Dosisbereich von 0,001 bis 100 mg aktive Substanz pro Kilogramm Körpergewicht. Vorzugsweise ist der Bereich von 0,01 bis 50 mg aktive Substanz pro kg Körpergewicht.
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen spezielle Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung.
- Das Tyrosin-Isoleucin-Glycin-Serin-Arginin (YIGSR-NH&sub2;)Peptid wird mittels des klassischen Festphasensyntheseverfahrens von Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-54 (1963), wie von Stewart und Young (Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe (1984) Pierce Chemical Co., Rockford, Il. beschrieben,) auf einem automatisierten Model Applied Biosystems Synthesizer synthetisiert, wobei Methylbenzhydroxylamin (Methyl-BHA)-Harz (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) verwendet wird. Die Acylierung des Peptids erfolgt (auf dem Harz) durch Zugabe eines 10-fachen molaren Überschusses (in bezug auf den freien Amino- Terminus des Peptids) von Essigsäureanhydrid (Pierce Chemical Co.) in Methylenchlorid während 30 min bei Raumtemperatur. Entschützung und Freisetzung der Peptide aus der Festphasen- Trägermatrix erfolgt durch Behandlung des geschützten Peptids auf dem Harz mit wasserfreiem HF enthaltend 10% Anisol während 1-2 Stunden bei 0ºC. Die Entschützungsreagentien werden durch Extraktion mit Ethylacetat entfernt, das Peptid in 30% wässeriger Essigsäure gelöst, und die Lösung wird durch einen Sinterglas (grob)-Buechner-Trichter zur Entfernung des Harzes filtriert.
- HT-1080-Zellen von Fibrosarkom des Menschen (Rasheed, S. et al. Cancer (Philadelphia) 33:1027 (1974) werden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, gehalten. Nachdem die Zellen zu 80% Konfluenz gewachsen sind, werden sie mit 0,02 M Phosphatpuffer, pH 7,4 ohne Ca²&spplus; und Mg²&spplus; gewaschen und niit einer Lösung von 0,025% Trypsin plus 0,025% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; GIBCO) losgelöst. Die Zellen werden dann mittels Niedriggeschwindigkeitszentrifugation pelletisiert und in Eagle's minimalem essentiellem Medium (EMEM), enthaltend 0,02% Rinderserumalbumin (BSA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) re-suspendiert. Zellhaftungstests werden wie in Klebe, R.J. Nature (London) 250:248 (1974) beschrieben, auf Gewebskultur-Kunststoffsubstraten durchgeführt, indem 16 mm Falcon Gewebskultur- Vertiefungen (Fisher Scientific Co., Pittsburg, PA) verwendet werden, die mit verschiedenen Peptiden oder mit Laminin in 1 ml EMEM, enthaltend 0,02% BSA 1 oder 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert werden. Zellen (10&sup5; in 0,1 ml) werden in die Vertiefungen gegeben, und die Lösung wird eine weitere Stunde lang bei 37ºC in 95% Luft und 5% CO&sub2; inkubiert. Danach werden die Vertiefungen 3 mal mit 1 ml Phosphat-gepuf ferter Kochsalzlösung (PBS) zur Entfernung nicht anhaftender Zellen gespült. Anhaftende Zellen werden mit Trypsin behandelt und elektronisch gezählt (Coulter, ZBI). Die Haftungstests werden in Anwesenheit von Cycloheximid (25 mg/ml) durchgeführt, um die Produktion von endogenen Haftungsproteinen auf ein Minimum zu reduzieren. Jedes Peptid wird in Duplikatschalen getestet, und jeder Test wird 6 mal wiederholt. Die Variation zwischen Proben bei verschiedenen Tests ist < 15%.
- Um die Inhibition der Haftung an Laminin durch die Peptide zu testen, werden bakteriologische Petri-Schalen (35 mm) mit 5 mg Laminin überzogen, welches man über Nacht auf die Schalen mit Luft antrocknen läßt. Vor der Zugabe der Zellen werden verschiedene Konzentrationen des Peptids, das in serumfreiem EMEM, enthaltend 0,05% BSA, gelöst ist, jeder Schale zugegeben. Der Haftungstest wird dann wie oben beschrieben durchgeführt. Jede Schale enthielt ein Endvolumen von 1,0 ml, und jeder Test wird doppelt durchgeführt, wobei jedes Peptid neunmal getestet wird. Zellhaftungstests in vitro zeigen, wie in Fig. 1 gezeigt, daß das Peptid der Erfindung eine Zelladhäsionsaktivität besitzt.
- B16F10-Melanomzellen, erhalten von 1.3. Fidler, M.D., Anderson Hospital, Houston, TX, werden unter Standard- Kulturbedingungen vermehrt. Der Lungentumorkolonialisierungstest erfolgt wie in Fidler, 1.3., Nature (London) (New Biol) 242:148 (1973) beschrieben. Peptide werden zu 5 mg/ml in PBS gelöst und sterilfiltriert. Die Suspension von B16F10-Zellen (5 x 10&sup5;) in 0,1 ml DMEM wird mit 0,1 ml des Peptids (oder 0,1 ml PBS in Kontrolle) gemischt, 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann in die Schwanzvene syngenetischer weiblicher CS7BL/6-Mäuse (Jackson Labs., Bar Habor, Maine) mit einem Alter von 6 Wochen injiziert. Jede Behandlungs- und Kontrollgruppe besteht aus acht Mäusen. Drei Wochen nach den Injektionen werden die Mäuse getötet, und die Anzahl der Lungentumoren auf der Oberfläche der Lunge wird gezählt. Fig. 2 zeigt daß AcYIGSR-NH&sub2;, das Peptid der Erfindung, mindestens doppelt so wirksam ist wie YIGSR-NH&sub2;.
- Obwohl die Erfindung in bezug auf spezielle Modifikationen beschrieben worden ist, sollen die Details derselben nicht als Einschränkungen ausgelegt werden, denn es ist offensichtlich, daß verschiedene Äquivalente, Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Umfang derselben abzugehen, und solche äquivalente Ausführungsformen sollen hier miteingeschlossen sein.
Claims (13)
1. Peptid der Formel:
AcYIGSR-NH&sub2;
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz hievon.
2. Peptid nach Anspruch 1 mit der Formel:
AcYIGSR-NH&sub2;
3. Peptid nach Anspruch 1, welches ein pharmazeutisch
akzeptables Salz des Peptids der Formel:
AcYIGSR-NH&sub2;
ist.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche einen
pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine therapeutisch
wirksame Menge eines Peptids der Formel
AcYIGSR-NH&sub2;
oder eines pharmazeutisch akzeptalben Salzes davon umfaßt.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, in welcher
das Peptid die Formel
AcYIGSR-NH&sub2;
hat.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das
Peptid ein pharmazeutisch akzeptables Salz des Peptids der
Formel:
AcYIGSR-NH&sub2;
ist.
7. Peptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, zur
Verwendung als Medikament für therapeutische und pharmazeutische
Anwendungen bei bösartigen Tumorzellen.
8. Peptid nach Anspruch 7 zur Verwendung bei einem Verfahren
zur Metastaseninhibierung, welches die Verabreichung einer
wirksamen Menge eines Peptids der Formel:
AcYIGSR-NH&sub2;
oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes hievon umfaßt.
9. Peptid nach Anspruch 8, wobei das Peptid die Formel:
AcYIGSR-NH&sub2;
hat.
10. Peptid nach Anspruch 8, wobei das Peptid ein
pharmazeutisch akzeptables Salz des Peptids der Formel
AcYIGSR-NH&sub2;
ist.
11. Peptid nach Anspruch 8, wobei das Peptid als
pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird, welche einen
pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
12. Peptid nach Anspruch 11, wobei die pharmazeutische
Zusammensetzung ein Peptid der Formel
AcYIGSR-NH&sub2;
umfaßt.
13. Peptid nach Anspruch 11, wobei die pharmazeutische
Zusammensetzung ein pharmazeutisch akzeptables Salz des Peptids
der Formel
AcYIGSR-NH&sub2;
umfaßt.
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