JPH0319691A - Poliomyelitis virus as vector and orally administrable vaccine produced by the same - Google Patents
Poliomyelitis virus as vector and orally administrable vaccine produced by the sameInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、弱毒ボリオウィルス遺伝子に他種類のウイル
ス遺伝子を組み込んで得られる経口生ワクチンに関スる
。更に詳しくは本発明は経口生ウィルスポリオワクチン
として使用されてぃる弱毒ボリオウイルスのゲノムＲＮ
Ａに、他種ウィルス等の遺伝子を組み込むことによりポ
リオウィルスをベクターとして利用する新しいタイプの
ワクチンに関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to an oral live vaccine obtained by incorporating other types of viral genes into attenuated Boriovirus genes. More specifically, the present invention relates to the attenuated Boriovirus genome RN used as an oral live virus polio vaccine.
This relates to a new type of vaccine that utilizes poliovirus as a vector by incorporating genes from other viruses, etc. into A.
急性灰白髄炎（ポリオ）は世界的にしばしば大流行を起
こす重大な病気であった。１９５０年代に至り、病原体
であるポリオウィルスの組織培養による増殖法が発見さ
れて以来、このウィルスの研究が急速に進展した。その
結果、有効なワクチンの開発が相次いで成功し、我が国
でも弱毒ウイルスによる経口生ポリオワクチンの投与が
広範に実施され、ほぼ完璧なまでにポリオの制御が達威
された。この経口生ポリオワクチンは非常に完戒度の高
いワクチンであり、安全性、抗体陽転率が高い。その上
、被接種者が乳幼児であるので経口投与という接種法が
非常に歓迎されている。Acute poliomyelitis (poliomyelitis) is a serious disease that often causes outbreaks worldwide. Since the 1950s, when a method for propagating the pathogen poliovirus by tissue culture was discovered, research on this virus has progressed rapidly. As a result, effective vaccines have been successfully developed one after another, and in Japan, oral live polio vaccines using attenuated viruses have been widely administered, achieving almost complete control of polio. This oral live polio vaccine is a very well-prepared vaccine, and has a high safety and seroconversion rate. Moreover, since the recipients are infants, oral administration is highly welcomed.
ウイルスの感染性を保持したまま、他種ウイルス等の外
来性抗原遺伝子を組み込ませて生ウイルスワクチンとし
て使用するいわゆるウイルスヘクターに関しては、ワタ
シニアウイルスの場合が著名である。Regarding so-called virus hectors, which are used as live virus vaccines by incorporating foreign antigen genes from other viruses while retaining the infectivity of the virus, the case of cotton cilia virus is well known.
このウイルスベクターは製造法も確立され、科学的なデ
ータも多くの蓄積を見ているが、いまだに実用化には至
っていない。それにはＷＨＯによる天然痘の絶滅宣言お
よび種痘の廃止勧告にもとすく任意接種への行政的な切
り換え等の社会的な理由が先ず考えられる。本発明にお
いてはポリオウイルスベクタとして利用することに関し
ており、その基本的に意図することはワクシニアウイル
スの場合と同様で３
４
ある。しかしながら、ポリオワクチンでは、先進国にお
けるポリオの流行は殆ど見られなくなったにも係わらず
、現在のところ接種の緩和ということは全くなくこの意
味においてはベクターとして採用されるに当たっても非
常に有利であることが考えられる。Although the manufacturing method for this viral vector has been established and a large amount of scientific data has been accumulated, it has not yet been put into practical use. The first possible reason for this is social reasons, such as the administrative switch to voluntary vaccination in response to the WHO's declaration of smallpox extinction and the recommendation to abolish smallpox. The present invention relates to use as a poliovirus vector, and its basic intention is the same as in the case of vaccinia virus. However, despite the fact that there are almost no polio epidemics in developed countries, there is currently no relaxation of vaccination requirements for the polio vaccine, and in this sense it is very advantageous when used as a vector. It is possible that
ポリオウィルス（ワタシニアでも同様）をベクタとして
他種ウィルス等のワクチンにすることの利点は、疾患や
性質等が種々ある全ての病原体に対して理論的には同様
のワクチン製造が可能であり、安全性や有効性がベクタ
ーに用いたウィルス（ポリオやワタシニア）についての
み考慮されればよい。したがって、遺伝子の組み込みに
用いられた個々の病原体の危険性とかワクチン製造の困
難度等の問題が全て解消されてしまう。生ポリオワクチ
ンはこの点においては非常に優秀であり、安全性や有効
性では現行の多くのワクチンの中でも傑出した存在であ
る。The advantage of using poliovirus (same as cotton chinese) as a vector to make vaccines for other viruses is that it is theoretically possible to produce similar vaccines against all pathogens with various diseases and properties, and it is safe. It is only necessary to consider the nature and effectiveness of the virus used as a vector (poliomyelitis or cottontail). Therefore, all problems such as the danger of individual pathogens used for gene integration and the difficulty of vaccine production are eliminated. The live polio vaccine is excellent in this respect, and is outstanding among the many current vaccines in terms of safety and effectiveness.
それ故にベクターとして用いられた場合でもその効果は
非常に期待されると考えられる。Therefore, even when used as a vector, its effects are expected to be very promising.
Ｃ課題を解決するための手段〕
ウイルスがベクターとして組み換えＤＮＡ等の発現に使
われている例としてはワクシニアウィルス以外にも、ヘ
ルペスウイルス、ハキュロウィルス等がある。これらの
組み換えウィルスの作製には、組み換えを行うＤＮＡの
両端にウィルスと相同のＤＮＡ断片を結合させ、これを
無傷のウィルスＤＮＡとともに細胞内に取り込ませ相同
的遺伝子組み換えを起こさせることにより、組み換えウ
ィルスを作製するという方法が使われている。Means for Solving Problem C] In addition to vaccinia virus, examples of viruses being used as vectors to express recombinant DNA include herpesvirus, haculovirus, and the like. To create these recombinant viruses, DNA fragments homologous to the virus are ligated to both ends of the DNA to be recombined, and this is taken into cells together with intact viral DNA to cause homologous genetic recombination. A method is used to create .
本発明におけるポリオウィルスの場合には、ウィルスゲ
ノムＲＮＡそれ自体に感染性がある。さらにウイルスゲ
ノムＲＮＡ全長に相当するｃ．ＤＮＡプラスミッドも感
染性を持つことが発見され、回収されたポリオウイルス
中のゲノムＲＮＡが感染に用いたＣＤＮＡに完全に由来
していることが確認された。In the case of poliovirus in the present invention, the viral genome RNA itself is infectious. Furthermore, c.corresponding to the full length of viral genome RNA. It was discovered that DNA plasmids were also infectious, and it was confirmed that the genomic RNA in the recovered poliovirus was completely derived from the CDNA used for infection.
即ち、先に挙げたワタシニアウィルス等のＤＮＡウイル
スの場合には、ウィルスゲノムへの目的遺伝子の組み換
えはＤＮＡを感染させた細胞の中で行われたのに対して
、本発明のポリオウィルスでは、ｃＤＮＡのレベルで遺
伝子の組み換えを行っておけば、そのままの形で遺伝子
を組み換えられたポリオウィ５ 一
６
ルスが簡便に回収できるという利点がある。さらには、
ポリオウイルスのｃＤＮＡ部分の上流にファジＴ７等の
ＲＮＡ合成酵素が認識するプロモ−タを連結させること
により、試験管内でｃＤＮＡと相同のＲＮＡを大量に効
率良く合成し得る方法が確立され、本発明の実施がより
一層容易なものとなった。That is, in the case of DNA viruses such as the cotton sinia virus mentioned above, recombination of the target gene into the viral genome was carried out in cells infected with the DNA, whereas with the poliovirus of the present invention, If gene recombination is performed at the cDNA level, the gene-recombined poliovirus 5-6 virus can be easily recovered in its original form. Furthermore,
By linking a promoter recognized by RNA synthetase such as phage T7 upstream of the cDNA portion of poliovirus, a method has been established to efficiently synthesize large amounts of RNA homologous to cDNA in vitro, and the present invention implementation has become even easier.
即ち、本発明は経口生ポリオワクチンの接種法をそのま
ま利用して、ポリオウイルスの遺伝子中に他種ウイルス
等に由来する遺伝子を組み込むことによるそのウイルス
等に対する経口生ワクチンに関するものである。この場
合においては、ポリオウイルスは遺伝子を組み込まれた
多種ウイルス等に対ずるワクチンとして、被接種者への
経口投与、腸における増殖、抗原の発現、免疫の戒立等
に至るまでの役割を担うヘクターとして１動いているこ
とになる。That is, the present invention relates to a live oral vaccine against a polio virus by incorporating a gene derived from another virus into the gene of the polio virus by directly utilizing the oral live polio vaccine inoculation method. In this case, the poliovirus plays a role as a vaccine against various viruses that have incorporated genes, including oral administration to the recipient, multiplication in the intestine, antigen expression, and establishment of immunity. This means that he is moving 1 as Hector.
次に本発明において使用されるウイルスゲノムに欠｛員
ヲ持つｃＤＮＡ由来のポリオウイルスについて述べる。Next, the poliovirus derived from cDNA having a deletion in the viral genome used in the present invention will be described.
第１図にポリオウイルス遺伝子ＲＮＡの概念図を示す。FIG. 1 shows a conceptual diagram of poliovirus gene RNA.
先に述べた通り、遺伝子を組み換えられたキメラ型のポ
リオウイルス内に含まれるキメラ型のウイルスＲＮＡが
感染に用いたｃＤＮＡをそのまま反映するということは
、一方では遺伝子操作法により容易に遺伝子組み換えを
行い得るという利点となる。しかしながら、他方では組
み換えを行ない得る領域およびその長さ等に制約を受け
ることが予測される。ウイルスゲノムの領域においては
、５゛末端や３゛末端における非蛋白質暗号領域等はウ
イルスの増殖に重要な機能を果たしており、この部分の
改変は不適当である。また同様の理由で、第１図におけ
るＰ２、ｐ ３ｆｉＪｆ域の改変も不可能で、結局Ｐ１
のウイルス構成蛋白遺伝子領域の改変のみが許されると
いうことになる。As mentioned earlier, the fact that the chimeric viral RNA contained in the genetically modified chimeric poliovirus directly reflects the cDNA used for infection means that genetic modification can be easily carried out using genetic engineering methods. The advantage is that it can be done. However, on the other hand, it is predicted that there will be restrictions on the region where recombination can occur and its length. In the region of the viral genome, non-protein coding regions at the 5' and 3' ends play an important function in virus propagation, and it is inappropriate to modify these parts. For the same reason, it is also impossible to modify the P2 and p3fiJf regions in Figure 1, and in the end, P1
This means that only modifications to the viral component protein gene regions are permitted.
上記の如き考察より、まずポリオウイルスのキャプシド
蛋白質部分に相当する遺伝子領域において欠損部分を持
つｃＤＮＡプラスミッドの獲得を目標とした実験を行っ
た。その結果キャブシド蛋白Ｐｌｊｆｆ域内において約
８００塩基を欠損したｃＤＮＡプラス案ソドを分離する
とかできた。このｃＤＮＡの塩基配列を調べてみると、
ポリオウィルスの蛋白質の７
８
暗号枠が欠損領域の前後でずれることなく、開始部位か
らＰ２、Ｐ３の領域までの蛋白質合戒を行い得る配列と
なっていることが判明した。そこで、本発明者はこの欠
損ｃＤＮＡよりＴ７のＲＮＡ合成酵素等を用いてＲＮＡ
とした後に、ヒト培養細胞にヘルパーとして完全ポリオ
ウイルスと重感染を行うことにより欠損ウイルスゲノム
を保持したポリオウイルスの増殖に威功したのである。Based on the above considerations, we first conducted an experiment with the aim of obtaining a cDNA plasmid having a defective portion in the gene region corresponding to the poliovirus capsid protein portion. As a result, we were able to isolate a cDNA plus version with a deletion of approximately 800 bases within the Pljff region of the cabsid protein. When we examined the base sequence of this cDNA, we found that
It was found that the 78 coding frame of the poliovirus protein does not shift before and after the deletion region, and has a sequence that allows protein assembly from the start site to the P2 and P3 regions. Therefore, the present inventor used T7 RNA synthetase etc. to generate RNA from this defective cDNA.
After that, they succeeded in propagating poliovirus that retained the defective virus genome by co-infecting cultured human cells with a complete poliovirus as a helper.
なお、この欠損型ポリオウイルスのゲノムＲＮＡの欠損
部分は感染に用いた欠損のｃＤＮＡと完全に相同である
ことが塩基配列の決定実験で確認されている。It has been confirmed through nucleotide sequence determination experiments that the defective portion of the genomic RNA of this defective poliovirus is completely homologous to the defective cDNA used for infection.
欠損型のポリオウイルスＲＮＡは完全ポリオウイルスＲ
ＮＡより短いのでウィルスを超遠心による精製を行えば
欠損型ウイルスは容易に分離可能である。Deficient poliovirus RNA is complete poliovirus R
Since it is shorter than NA, defective viruses can be easily isolated by purifying the virus by ultracentrifugation.
またこの欠損ウイルスのみを細胞に大量に感染させると
、ウイルスの再生産は起こらないので子ウイルス増殖に
伴うポリオウィルスの神経毒性効果が全くない状態で外
来遺伝子の発現を起こさせることができる。Furthermore, when cells are infected with a large amount of this defective virus alone, virus reproduction does not occur, so foreign gene expression can occur without any neurotoxic effects of poliovirus associated with proliferation of child viruses.
次にキメラ型ポリオウイルスについて述べる。Next, we will discuss chimeric poliovirus.
キメラ型のポリオウイルスはこの欠損部分を補う形で他
種ウイルス等由来のＤＮＡやｃＤＮＡ等を結合させるこ
とにより作製される。その際欠損部位の前後におけるポ
リオウイルス遺伝子の蛋白質暗号と、組み込まれた他種
由来ＤＮＡ部分の蛋白質暗号の読み取り枠を一致させて
おくことが肝要である。発現させる目的でポリオウイル
スゲノム中に組み込ませる遺伝子のアミノ酸暗号枠を前
後のポリオウィルスの領域とで一致させることである。A chimeric poliovirus is produced by combining DNA or cDNA derived from other viruses to compensate for this defective part. At this time, it is important to match the protein code of the poliovirus gene before and after the deletion site with the reading frame of the protein code of the inserted DNA from other species. The goal is to match the amino acid coding frame of the gene to be integrated into the poliovirus genome for the purpose of expression with the preceding and following poliovirus regions.
このことにより作製されたキメラ型のポリオウイルスが
感染を起こした時に、組み込まれたＤＮＡ部分による蛋
白質の合成が前後のポリオウイルスの蛋白質に融合され
た状態で容易に発現されることが可能である。つまり、
過誤なく連結ができていれば組み込まれた遺伝子は容易
に発現する。即ち遺伝子を組み換えられたポリオウイル
スが遺伝子を組み込まれた他種ウィルス等に対するワク
チンとなり得る基盤はこの点において存在する。この考
察に基き、本発明は、まず第１図のＰＩ内の欠損部位に
外来の遺伝子を融合蛋白質が産生可能なように結合させ
たキメラ型のｃＤＮ９−
１０
Ａプラスごノドを作製し、Ｔ７等のＲＮＡ合戒酵素によ
りＲＮＡとして培養細胞に感染させてキメラ型のポリオ
ウイルスを回収する。結合させる外来の遺伝子の例とし
ては、活性マーカーとして測定が容易になし得るマーカ
ーに、更に対象となるワクチン抗原が挙げられ、それら
は例えば、クロラムフェニコルアセチル基転移酵素（Ｃ
ＡＴ） 、ヒトーα−インターフェロン（α−ＨＩＦＮ
）などが活性測定の容易なマーカーと、ウイルスワクチ
ンとして利用可能なＢ型肝炎ウイルス表面抗原、日本脳
炎ウィルス表面抗原などのウイルス抗原とが用いられる
。これら６こついては後記する実施例においてさらに詳
しく説明する。When the chimeric poliovirus created in this way causes infection, protein synthesis using the integrated DNA portion can be easily expressed in a state fused to the preceding and succeeding poliovirus proteins. . In other words,
If the linkage is successful without any errors, the inserted gene will be easily expressed. In other words, there is a foundation in this respect that genetically modified poliovirus can be used as a vaccine against other types of viruses in which genes have been incorporated. Based on this consideration, the present invention first created a chimeric cDN9-10A plus nod in which a foreign gene was linked to the defective site in PI shown in Figure 1 so that a fusion protein could be produced. A chimeric poliovirus is recovered by infecting cultured cells as RNA using an RNA synthesis enzyme such as the following. Examples of foreign genes to be bound include markers that can be easily measured as activity markers, as well as target vaccine antigens, such as chloramphenicyl acetyltransferase (C
AT), human α-interferon (α-HIFN
) and other markers whose activity can be easily measured, and virus antigens such as hepatitis B virus surface antigen and Japanese encephalitis virus surface antigen, which can be used as virus vaccines, are used. These six points will be explained in more detail in Examples to be described later.
本発明において用いられる各種ウイルス遺伝子の塩基配
列やｃＤＮＡ作製方法等々は既に知られている方法が使
用可能である。即ち、強毒マホニー株ポリオウイルスゲ
ノムＲＮＡの全塩基配列は喜多村ら（Ｎａｔｕｒｅ，２
９１：５４７ ５５３（１９８１））、Ｒａｃａｎｉ
ｅｌ ｌｏら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
，ＵＳＡ，７８：４８８７４８９１ （１９８１））
に、弱毒セイビン１株ポリオウイルスゲノムＲＮＡの全
塩基配列は野木ら〔Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ７９：５７９３−５７９７ （１９８２
））に、マホニー株の感染性ｃＤＮＡの作製および方法
については、Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏら〔Ｓｃｉｅｎｃｅ
．２１４：９１６−９１９ （１９８１））に、セイ
ビン１株の感染性ｃＤＮＡの作製については、小俣ら、
〔Ｇｅｎｅ，３２：１−１０ （１９８４））に、感染
性ポリオウイルスｃＤＮＡにＴ７等のＲＮＡ合［酵素の
認識するプロモーターを導入して試験管内で感染性を持
つポリオウイルスＲＮＡを合戒する方法についてはｖａ
ｎ ｄｅｒ Ｗｅｒｆら、（Ｐｒｏｃ，Ｎａ ｔ
］．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，８３ ：２３３（１
−２３３４．（１．９８６））に、ポリオウイルスゲノ
ムのＰｌｊｌ域に欠損を導入する方法は久下ら、 ＣＪ
，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９２：４７３４８７ （１
９８６））に記載されている。As the nucleotide sequences of various viral genes used in the present invention, cDNA production methods, etc., already known methods can be used. That is, the entire base sequence of the highly virulent Mahony strain poliovirus genome RNA was prepared by Kitamura et al. (Nature, 2
91:547 553 (1981)), Racani
el lo et al. (Proc. Natl, Acad. Sci.
, USA, 78:48874891 (1981))
The complete nucleotide sequence of the attenuated Sabin 1 strain poliovirus genome RNA was determined by Nogi et al. [Proc, Natl. Acad. S
ci. USA79:5793-5797 (1982
)) for the production and methods of infectious cDNA of the Mahony strain, see Racaniello et al. [Science
．． 214:916-919 (1981)), Omata et al.
[Gene, 32:1-10 (1984)] describes a method of combining infectious poliovirus cDNA with RNA such as T7 [a method of combining infectious poliovirus RNA in vitro by introducing a promoter recognized by the enzyme]. About va
der Werf et al. (Proc, Nat.
]. Acad. Sci. USA, 83:233(1
-2334. (1.986)), a method for introducing a deletion in the Pljl region of the poliovirus genome was described by Kuge et al., CJ
, Mol. Biol. , 192:473487 (1
986)).
本発明の中核となる他種ウィルス等の外来遺伝子１ １
−
１ ２〜
を組み込ませたポリオウイルスを作製するに際しては、
まず欠損型のウイルスゲノムＲＮＡでもポリオウイルス
を形或（きることがその前提条件となる。Foreign genes such as other viruses that are the core of the present invention 1 1
- When producing poliovirus incorporating 12~,
First, the prerequisite is that even a defective viral genome RNA can be used to kill poliovirus.
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れらに限定されるものではない。The present invention will be explained below with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
失嵐斑一上
ウイルスゲノムのＰｌｌｉ域に欠損を持ったポリオウイ
ルスの
前記久下らの論文には第１図６こおけるＰ １ ’６Ｍ
域の８１６塩基を欠損したセイビン１株由来のｃ ＤＮ
Ａを含むプラス旦ノドＰＶＳ （１）ＤＩ２１３の作製
について記載されている。この欠損部分を持つＰ１領域
を制限酵素のＢａｎｌｌにより約１、８ｋｂｐ （キロ
塩基対、以下ｋｂｐと称す）の断片として切り出し、全
く対応する部分を予め１３ａｎｆｆで除去しておいた感
染性を持ち完全長のポリオウイルスｃＤＮＡを含むプラ
スミッドｐＭＩ （Ｔ７）０にＴ４ＤＮＡリガーゼに
より連結させてＰ １ 領域に欠損部位を持ち他領域の
全てを含むプラスごソドｐＭｓ１（Ｔ７）１を調製した
。これらの操作手順を第２図に示した。The above-mentioned paper by Kuge et al. on a poliovirus with a deletion in the Plli region of the Ichijo virus genome shows P 1 '6M in Figure 1.6.
cDN derived from Sabin 1 strain with deletion of 816 bases in the region
The preparation of a positive dandelion PVS (1) DI213 containing A is described. The P1 region containing this defective part was cut out as a fragment of approximately 1.8 kbp (kilobase pairs, hereinafter referred to as kbp) using the restriction enzyme Banll, and the completely corresponding part was removed with 13anff. The plasmid pMI (T7)0 containing the long poliovirus cDNA was ligated with T4 DNA ligase to prepare a plasmid pMs1 (T7)1 having a deletion site in the P 1 region and containing all other regions. These operating procedures are shown in FIG.
ゲノム中に欠損部位を持つポリオウイルスを人工的に作
製するためにまず上記ｐＭｓ１ （Ｔ７）１を制限酵
素ＥＣ ＯＲ ＩまたはＰｖｕ Ｔで切断させておき、
Ｔ７ＲＮＡ合成酵素により欠損を持つポリオウイルスＲ
ＮＡを合成した。このＲＮＡ １〜５μｇをＶａｎ
ｄｅｒ Ｗｅｒｆらの方法に従いヒｌ− Ｈ ｅＬａ
細胞に５００μｇ／ｍ４のＤＥＡＥデキストランととも
に添加し、３７゜Ｃで２時間取り込ませた後にヘルパー
としてポリオウイルスを重感染させ、ウイルス増殖に伴
う細胞変或効果（Ｃ Ｐ Ｅ）の生ずるまで培養を行う
と培養液中に欠損型ゲノムＲＮＡを持つポリオウイルス
が産生された。この欠損型のウイルスは新しいＨｅＬａ
細胞を用いて継代培養を行うことによりそのヘルパーウ
イルスに対する量的な比率を増大させることが可能であ
った。このことは継代を３回行うことで早くも欠損ウイ
ルスが確認されることにより証明された。第３図に欠ｆ
ｆｉ Ｒ Ｎ Ａが回収されたことを完全長のウイルス
ＲＮＡと比較するアガロースゲル電気泳動により証明で
きる威績を１３
１４−
示した。In order to artificially create a poliovirus with a deletion site in its genome, first, the above pMs1 (T7)1 was cut with the restriction enzyme EC OR I or Pvu T.
Poliovirus R defective in T7 RNA synthetase
NA was synthesized. 1 to 5 μg of this RNA was
HeLa according to the method of der Werf et al.
Add DEAE dextran to cells at 500 μg/m4, incubate at 37°C for 2 hours, superinfect with poliovirus as a helper, and culture until cytopathic effect (CPE) associated with virus proliferation occurs. A poliovirus with defective genomic RNA was produced in the culture solution. This defective virus is a new HeLa virus.
By subculturing the cells, it was possible to increase the quantitative ratio to the helper virus. This was proven by the fact that defective viruses were confirmed as early as after three passages. Missing in Figure 3
The recovery of fi RNA was demonstrated by agarose gel electrophoresis compared to full-length viral RNA.
欠損部分を持つウイルスを大量に培養しておき（８Ｘ１
０’ ｃｅｌｌｓ）塩化セシウム（１．３３ｇ／ｃＪ．
２５゜Ｃ）の密度勾配で３３０００回転／分、４゜Ｃ、
１５時間の超遠心によりウイルス材料中に存在するヘル
パーのポリオウイルスを分離した。Culture a large amount of virus with the defective part (8X1
0' cells) cesium chloride (1.33 g/cJ.
33,000 revolutions/min, 4°C, with a density gradient of 25°C)
Helper poliovirus present in the viral material was isolated by ultracentrifugation for 15 hours.
この結果は第４図に示される。この図において試験管番
号の２５−３１ （フラクションＩ）、３２３６ （
フラクションＩｆ） 、３７−４４ （フラクション
ＩＩＩ）、とをプールしてそれぞれからウイルスＲＮＡ
を取り、それらをアガロースゲル電気泳動を行った結果
を第５図に示す。第５図に示すようにフラクションｍの
ＲＮＡがフラクションＩのヘルパーとして加えたポリオ
ウイルスＲＮＡよりも短くなっていることが判明した。The results are shown in FIG. In this figure, test tube numbers 25-31 (fraction I), 3236 (
Fractions If) and 37-44 (Fraction III) were pooled and viral RNA was extracted from each.
Figure 5 shows the results of agarose gel electrophoresis. As shown in FIG. 5, it was found that the RNA in fraction m was shorter than the poliovirus RNA added as a helper in fraction I.
また、このＲＮＡの欠損部分の近辺の塩基配列をプライ
マー伸張法による塩基配列決定法により調べると、最初
に用いたｐ １ ８Ｎ域に欠損を持つｃＤＮＡと全く相
同であることが確認された。Furthermore, when the nucleotide sequence in the vicinity of the deleted portion of this RNA was examined by nucleotide sequencing using the primer extension method, it was confirmed that it was completely homologous to the cDNA that was used initially and had a deletion in the p 1 8N region.
本実施例により欠損ゲノムを持ったポリオウイルスを人
工的に作製できた。これはウイルス粒子が形威されるに
当たっては完全なウイルスＲＮＡである必要はないとい
うことを意味しており、これにより他種遺伝子を組み込
ませたキメラ型のポリオウイルス作製の理論的な根拠力
ｑ＋ｉ立できた。In this example, it was possible to artificially create a poliovirus with a defective genome. This means that it is not necessary for the virus particles to be complete viral RNA in order to take shape. I was able to stand.
実施斑−１
ヒ１〜Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原遺伝子を
組み込ませたキメラ型のポリオウィルスの作Ｂ型肝炎ウ
イルス（ＨＢＶ）のウイルスゲノムは約３２００塩基対
の長さを持つ環状２本鎖ＤＮＡであり、そのａｄｒ株に
ついてゲノムＤＮＡのクロニングと全塩基配列の決定は
藤山ら、（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， Ｖ
ｏｌ １１、４６０１４．６１０（１９８３））に記
載されている。本発明者らは回報文に従ってＨＢＶａｄ
ｒ株の全ゲノムＤＮＡを含む組み換え体プラスごソドｐ
ＨＢ１を作製した。この｝ＴＢＶＤＮＡの表面抗原遺伝
子領域（Ｓｒｅｇｉｏｎ）の制限酵素地図を第６図に示
す。Plaque-1 Creation of a chimeric poliovirus incorporating surface antigen genes of human hepatitis B virus (HBV) The viral genome of hepatitis B virus (HBV) is circular with a length of approximately 3200 base pairs. It is a double-stranded DNA, and the cloning of the genomic DNA and determination of the complete base sequence for the adr strain were carried out by Fujiyama et al. (Nucl. Acids Res, V
ol 11, 46014.610 (1983)). In accordance with the circular, the inventors
Recombinant plus goso p containing the entire genomic DNA of r strain
HB1 was produced. A restriction enzyme map of the surface antigen gene region of this}TBV DNA is shown in FIG.
本実施例はこの地図において２種類の制限酵素ｘｈ１５
１６
０ＩとＳｐｅｌによって切り出される５５６塩基対の遺
伝子切片を、欠損を人工的に導入されたポリオウイルス
ｃＤＮＡプラスミッドに組め込む実験を行った。第７図
にその遺伝子断片についてのＤＮＡ塩基配列とそのアご
ノ酸配列を示す。In this example, an experiment was conducted in which a 556 base pair gene fragment excised from this map using two types of restriction enzymes, xh15 16 0I and Spel, was incorporated into a poliovirus cDNA plasmid into which a deletion had been artificially introduced. FIG. 7 shows the DNA base sequence and the agonoic acid sequence of the gene fragment.
先ず実施例１で作製されたｐＭｓ１ （Ｔ７）１の欠
損部位近辺に存在する制限酵素Ａｖａ ］部位に以下の
実験を容易にするためにＳａｃｌの合成ＤＮＡリンカー
を導入させたプラスξソドｐＭｓ１ （Ｔ７）Ｓｃを
作製した。Ｓａｃ１部位を導入された後のこの部位近辺
の塩基配列及び対応するアミノ酸暗号は下記の通りであ
る。First, a synthetic DNA linker of Sacl was introduced into the restriction enzyme Ava ] site present near the deletion site of pMs1 (T7)1 prepared in Example 1 in order to facilitate the following experiment. ) Sc was produced. The base sequence and the corresponding amino acid code near this site after the Sac1 site is introduced are as follows.
Ａｖａｌ Ｓａｃｌ Ａ
ｖａｌ５’ ＧＴＧＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＣＧ
ＡＧＶａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｇｌｕ上記したＳａｃ１部位に第７図に
示したＨＢＶａｄｒの表面抗原遺伝子ＸｈｏＩ 一Ｓｐ
ｅＩ間の断片をアミノ酸暗号枠がずれないように連結さ
せるため下記のような２種類のリンカーＤＮＡを合成し
た。Aval Sacl A
val5' GTGCCCGAGGAGCTCCCCG
AGVal Pro Glu Glu Leu
The HBVadr surface antigen gene XhoI-Sp shown in Figure 7 was inserted into the Sac1 site described above.
In order to link the fragments between eI without shifting the amino acid coding frame, two types of linker DNAs as shown below were synthesized.
Ｘｈｏｌ Ｓａｃｌ Ｘｈｏｌ
ＴＣＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣ
ＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＧＣＴ
Ｓｐｅｌ ＳａｃＩ
Ｓｐｅ ＩＣＴＡＧＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＡ
ＡＣＧＧＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＴＣ次にこのリ
ンカーＤＮＡをプラスミッドｐ Ｈ Ｂ １のＸｈｏｌ
及びＳｐｅ１部位にそれぞれ結合させた新たなプラスミ
ッドｐＨＢＸｈＳｐ １を作製した。Xhol
TCGAGCTGAGCTCAGC CGACTCGAGTCGAGCT Spel SacI
Spe ICTAGTGCCAGAGCTCTGGCA
ACGGTCTCGAGACCGTGATCThis linker DNA is then added to the Xhol of plasmid pHB1.
A new plasmid, pHBXhSp 1, was created in which the plasmid and Spe1 sites were respectively linked.
これによりＸｈｏｌ−ＳｐｅＴの遺伝子断片ぱＳａｃＩ
の切断により切り出し可能となった。予めＳａｃｌで切
断しておいたプラスミッドｐＭｓ１ （Ｔ７）Ｓｃに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、欠損を生してい
るポリオウイルスのｃＤＮＡＰ１コーディング領域にＨ
ＢＶａｄｒ表面抗原遺伝子の一部分を正しい方向に連結
されたキメラ型のプラスミッドｐＭ （Ｔ７）ＨＢＳＸ
ＳＩを樹立した。なお、反対方向に結合されたｐＭ （
Ｔ７）ＨＢＳＸＳ○も同時に分離された。以上の操作手
順を第８図に示す。As a result, the Xhol-SpeT gene fragment SacI
It became possible to cut out by cutting. Plasmid pMs1 (T7)Sc, which had been previously cut with Sacl, was ligated using T4 DNA ligase, and H was added to the defective poliovirus cDNAP1 coding region.
Chimeric plasmid pM (T7)HBSX in which part of the BVadr surface antigen gene is linked in the correct direction
SI was established. Note that pM (
T7) HBSXS○ was also isolated at the same time. The above operating procedure is shown in FIG.
１ ７一
１８
また２個所の連結部分における塩基配列と対応するアミ
ノ酸の暗号は次の通りである。1 7-18 The nucleotide sequences at the two joints and the corresponding amino acid codes are as follows.
Ｓａｃｌ
Ｐｏｌｉｏ 一− 一ＧＴＧＣＣＣＧＡＧＧＡＧＣＴ
ＣＡＧＣＶａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｕ Ｌｅｕ ＳｅｒＸｈｏ ］
ＴＣＧＡＧＧＡＣＴ− 一一一ＨＢＶ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ
ＳｅｒＳｐｅｌ
ＳａｃＩ
ＴＴＡＣＴＡＧＴＧＣＣＡＧＡＧＣＴＣＬｅｕ Ｌ
ｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｅ
ｕこれによりポリオウイルス領域と挿入されたＨ Ｂ
Ｖの領域を通してのアミノ酸暗号読み取り枠が一致して
いることが確認された。また同時に連結部分において蛋
白合戒の終了暗号（ＴＡＡ．．ＴＡＧ．．ＴＧＡ）が生
していないことも確認された。以下、実施例１に記載し
た場合と全く同様の操作を行ってキメラ型のポリオウイ
ルスＲＮＡ、そのＲＮＡをヘルパウイルスと培養細胞に
重感染させることによりＨＢＶの表面抗原遺伝子を含ん
だポリオウイルスを産生ＡＧＴ
Ｐｏｌｉｏ
した。Sacl Polio 1-1GTGCCCGAGGAGCT
CAGC Val Pro Glu Gl
u Leu SerXho] TCGAGGACT- 111HBV Ser Arg Thr
SerSpel
SacI TTACTAGTGCCAGAGCTCLeu L
eu Val Ser Glu Le
u This allows the poliovirus region and inserted H B
It was confirmed that the amino acid coding open reading frames throughout the V region were identical. At the same time, it was also confirmed that the termination code for protein aggregation (TAA..TAG..TGA) was not generated in the connected portion. Hereinafter, the same procedure as described in Example 1 was carried out to produce poliovirus containing the HBV surface antigen gene by co-infecting cultured cells with chimeric poliovirus RNA and the helper virus. I did AGT Polio.
実施例１と同様に産生されていると予測されるキメラ型
のポリオウイルス量のヘルパーウイルスに対する比率を
増大させるため、感染を受けた細胞がＣＰＥを生じた時
その培養液を新しい培養細胞に接種することによるウイ
ルスの継代を行った。Ｉ｛ Ｂ Ｖの表面抗原を含むポ
リオウイルスが形威されていることの確認のために、培
養液中のＨＢ表面抗原の測定をアボット社のキットを用
いて下記の手順で行った。In the same way as in Example 1, in order to increase the ratio of the amount of chimeric poliovirus predicted to be produced to the helper virus, when infected cells develop CPE, the culture solution was inoculated into new cultured cells. The virus was passaged by In order to confirm that the poliovirus containing the surface antigen of I{BV was present, the HB surface antigen in the culture solution was measured using an Abbott kit according to the following procedure.
その結果を第１表に示す。The results are shown in Table 1.
以下余白
１９
２０
第１表
（単位 ｃｐｍ）
即ち、マイクロタイターのウェルにＨＢｓ抗体結合のビ
ーズを入れ、検体（ウィルス培養液）、ＨＢＳ抗原の陰
性対照、陽性対照等を夫々２００μβずつ加える。４５
゜Ｃ、２時間（あるいは室温１６時間）後検体液を吸引
除去しビーズを水５ｍｆｆで２回洗浄する。＋２５
Ｉ標識ヒトＨＢＳ抗体液を２００μｌ各ウエルに加え４
５℃、１時間反応させ、１′ ■標識液を除去、ビーズ
を２回洗浄後ビーズに結合した放則能をガンマウエルシ
ンチレーションカウンタで測定した。Margins below: 19 20 Table 1 (unit: cpm) That is, HBs antibody-bound beads are placed in the wells of a microtiter, and 200 μβ of each sample (virus culture medium), HBS antigen negative control, positive control, etc. are added. 45
After 2 hours at °C (or 16 hours at room temperature), the sample liquid is removed by suction, and the beads are washed twice with 5 mff of water. +25
Add 200 μl of I-labeled human HBS antibody solution to each well.
The reaction was carried out at 5°C for 1 hour, the 1' label solution was removed, the beads were washed twice, and the free activity bound to the beads was measured using a gamma well scintillation counter.
陽性対照はＨＢＳ抗原２０ｎｇ／ｍｌ１２００μβを加
えた時の測定値１０４１０ｃｐｍであった。As a positive control, the measured value was 10410 cpm when 20 ng/ml 1200 μβ of HBS antigen was added.
第１表に示すようにＨＢＶの表面抗原遺伝子を正方向に
連結された感染細胞の継代にのみＨ Ｂ表面抗原陽性で
あり、その発現量は継代を重ねることにより増大してい
くことがわかる。As shown in Table 1, only infected cells in which the HBV surface antigen gene has been linked in the forward direction are positive for the HB surface antigen, and the expression level increases with repeated passages. Recognize.
本実施例により、キメラ型のポリオウイルスＲＮＡを細
胞にヘルパーとして完全なポリオウイルスとともに重感
染させるときキメラ型のポリオウイルス粒子が形成され
ること、及びそのウイルスゲノム中に挿入されている外
来性の遺伝子（本実施例においてはＨＢＶの表面抗原遺
伝子）が発現されていることが実証された。This example shows that chimeric poliovirus particles are formed when cells are co-infected with chimeric poliovirus RNA and a complete poliovirus as a helper, and that foreign particles inserted into the virus genome are It was demonstrated that the gene (in this example, the HBV surface antigen gene) was expressed.
本発明は以上説明したように、実施例１においてはＰｌ
領域に欠損を導入したポリオウイルスＲＮＡでもウイル
ス形威が可能であること、実施例２においては欠損部分
を補う形でＢ型肝炎ウイルスの表面抗原遺伝子を結合さ
せたキメラ型のポリオウイルス２ｌ
２２
ＲＮＡによるウイルス形成及びその外来遺伝子の発現が
生していることを示した。この場合においてはポリオウ
イルスは結合された外来遺伝子の発現を可能とさせたヘ
クターとして機能していることになり本発明の経口生ワ
クチンが生産されることが証明された。As explained above, in the present invention, in Example 1, Pl
Even poliovirus RNA with a deletion introduced into the region can cause viral infection. In Example 2, a chimeric poliovirus 2l22 RNA to which the surface antigen gene of hepatitis B virus was bound to compensate for the deletion region was used. It was shown that virus formation and the expression of foreign genes are possible. In this case, it was proven that the poliovirus functions as a hector that enables the expression of the bound foreign gene, and that the oral live vaccine of the present invention can be produced.
ポリオワクチンは弱毒株を用いた経口生ワクチンとして
ポリオの制御に強力な役割を果たしたが、病気の悲惨さ
とワクチンの有効性や安全性からみて今後も引き続き接
種されていく見込みが強い。本発明ではこのワクチンの
本体であるポリオウイルスをベクターとして活用するも
のであり、実際の利用に際しては当然本来のポリオワク
ヂンの経口接種と不可分となる。例えば本発明の実施例
２で示したＢ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子を導入され
たポリオウイルスを上記ポリオワクチンに混合すれば同
時に２種類のワクチン接種が可能となる。このことは単
にＢ型肝炎ウイルスに限定されることなくその他の各種
ウイルス等及びそれ以外の病原体に対する多価ワクチン
への可能性も大となる。The polio vaccine has played a powerful role in controlling polio as an oral live vaccine using a weakened strain, but given the severity of the disease and the effectiveness and safety of the vaccine, it is likely that vaccination will continue in the future. In the present invention, the poliovirus, which is the main body of this vaccine, is utilized as a vector, and in actual use, it is naturally inseparable from the original oral inoculation of polio vaccine. For example, if the poliovirus introduced with the hepatitis B virus surface antigen gene shown in Example 2 of the present invention is mixed with the above-mentioned polio vaccine, two types of vaccinations can be administered at the same time. This opens the possibility of developing multivalent vaccines not only for hepatitis B virus but also for various other viruses and other pathogens.
第１図はｐｌＶｉｉ域の８１６塩基対を欠損したセイビ
ン１株由来のｃＤＮＡを含むプラスミッドＰＶＳの作製
図、第２図はプラスミッドｐＭｓ１ （Ｔ７）１の操
作手順、第３図は欠ｆｆｊ４ Ｒ Ｎ Ａが回収された
ことを完全長のウイルスＲＮＡと比較するアガロースゲ
ル電気泳動図、第４図は欠損部分を持つウイルス材料中
に存在するヘルパーのポリオウイルスの分離結果、第５
図はウイルスＲＮＡのアガロースゲル電気泳動図、第６
図はＨＢＶＤＮＡの表面抗原遺伝子領域の制限酵素地図
、第７図はＤＮＡ塩基配列とそのアごノ酸配列、第８図
はポリオウイルスのｃＤＮＡＰＩコーディング領域にＨ
ＢＶＳＸａ ｄ ｒ表面抗原遺伝子の一部分を正しい方
向に結合させるキメラ型のプラスごソドｐＭ （Ｔ７）
ＨＢｓＸＳ１の操作手順である。
２９０ ３００Figure 1 shows the construction of a plasmid PVS containing cDNA derived from the Sabin 1 strain lacking 816 base pairs in the plVii region, Figure 2 shows the operating procedure for plasmid pMs1 (T7)1, and Figure 3 shows the deletion of ffj4R. An agarose gel electrophoresis diagram comparing the recovery of NA with full-length viral RNA; Figure 4 shows the results of isolation of helper poliovirus present in the virus material with the deleted portion; Figure 5
The figure is an agarose gel electrophoresis diagram of viral RNA, No. 6.
The figure shows a restriction enzyme map of the HBV DNA surface antigen gene region, Figure 7 shows the DNA base sequence and its agonoic acid sequence, and Figure 8 shows the restriction enzyme map of the poliovirus cDNA API coding region.
A chimeric positive pM (T7) that binds part of the BVSXa d r surface antigen gene in the correct direction.
This is the operating procedure of HBsXS1. 290 300
Claims (10)
ルス相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）よりポリオウイルスの構
成蛋白質領域等を人工的に欠損させて得られた組み換え
ＤＮＡプラスミッド構造物。(1) A recombinant DNA plasmid construct obtained by artificially deleting the constituent protein regions of poliovirus from poliovirus complementary DNA (cDNA) to poliovirus genome RNA.
である特許請求の範囲第１項記載の組み換えＤＮＡプラ
スミッド構造物。(2) The recombinant DNA plasmid construct according to claim 1, wherein the poliovirus is type 1 Mahony strain or Sabin strain.
補的ＤＮＡ部分がファージＴ７等のＲＮＡ合成酵素の認
識するプロモータに連結されていることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の組み換えＤＮＡプラスミッド
構造物。(3) The recombinant DNA plus according to claim 1, wherein the poliovirus complementary DNA portion in the DNA plasmid structure is linked to a promoter recognized by an RNA synthase such as phage T7. Mid structure.
ＮＡ合成酵素を作用させることにより得られる欠損部分
を持つポリオウイルスＲＮＡ。(4) Add R of phage T7 etc. to the DNA plasmid construct.
Poliovirus RNA with a defective portion obtained by the action of NA synthase.
イルスｃＤＮＡの欠損部分へ、他種ウイルスゲノム等あ
るいはメッセンジャーＲＮＡ等由来のＤＮＡあるいはｃ
ＤＮＡを結合させたキメラ型の組み換えＤＮＡプラスミ
ッド構造物。(5) DNA or cDNA derived from other virus genomes, messenger RNA, etc. is added to the defective portion of the poliovirus cDNA in the DNA described in claim 1.
A chimeric recombinant DNA plasmid structure with DNA attached.
ＮＡプラスミッド構造物にファージＴ７等のＲＮＡポリ
メレースを作用させることにより得られるキメラ型ポリ
オウイルスＲＮＡ。(6) Chime-type recombination D according to claim 5
Chimeric poliovirus RNA obtained by allowing an RNA polymerase such as phage T7 to act on an NA plasmid construct.
組み換えＤＮＡ構造物、あるいは欠損型、キメラ型のポ
リオウイルスＲＮＡをサルやヒト等の培養細胞に感染さ
せることにより得られる欠損型あるいはキメラ型のポリ
オウィルスワクチン。(7) Obtained by infecting cultured cells of monkeys, humans, etc. with the recombinant DNA constructs described in claims 1, 4, 5, and 6, or defective or chimeric poliovirus RNA. Deficient or chimeric poliovirus vaccine.
イルスを利用して生産される他種ウィルス等に対するワ
クチン。(8) A vaccine against other viruses produced using the chimeric poliovirus according to claim 7.
他種ウィルス等に対する経口ワクチン。(9) Oral vaccines against other viruses produced using poliovirus Sabin strain.
ＤＮＡプラスミッド、及び同第４項、第６項記載のポリ
オウイルスＲＮＡを利用して生産されるキメラ型のポリ
ウィルスによる他種ウィルス等に対する経口ワクチン。(10) Other species of chimeric polyviruses produced using the recombinant DNA plasmids set forth in claims 1 and 5 and the poliovirus RNA set forth in claims 4 and 6. Oral vaccines against viruses, etc.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1153529A JPH0319691A (en) | 1989-06-15 | 1989-06-15 | Poliomyelitis virus as vector and orally administrable vaccine produced by the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1153529A JPH0319691A (en) | 1989-06-15 | 1989-06-15 | Poliomyelitis virus as vector and orally administrable vaccine produced by the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0319691A true JPH0319691A (en) | 1991-01-28 |
Family
ID=15564518
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1153529A Pending JPH0319691A (en) | 1989-06-15 | 1989-06-15 | Poliomyelitis virus as vector and orally administrable vaccine produced by the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0319691A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5965124A (en) * | 1991-12-06 | 1999-10-12 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Replication-competent recombinant viral vaccines and method of producing same |
-
1989
- 1989-06-15 JP JP1153529A patent/JPH0319691A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5965124A (en) * | 1991-12-06 | 1999-10-12 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Replication-competent recombinant viral vaccines and method of producing same |
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