RU2733834C1 - Artificial ectos_sc2 gene encoding an ectodomain of the sars-cov-2 coronavirus s glycoprotein with a c-terminal trimerization domain, a recombinant plasmid pstem-rvsv-ectos_sc2, which provides expression of the artificial gene, and a recombinant strain of vesicular stomatitis virus rvsv-ectos_sc2, used to create a vaccine against sars-cov-2 coronavirus - Google Patents
Artificial ectos_sc2 gene encoding an ectodomain of the sars-cov-2 coronavirus s glycoprotein with a c-terminal trimerization domain, a recombinant plasmid pstem-rvsv-ectos_sc2, which provides expression of the artificial gene, and a recombinant strain of vesicular stomatitis virus rvsv-ectos_sc2, used to create a vaccine against sars-cov-2 coronavirus Download PDFInfo
- Publication number
- RU2733834C1 RU2733834C1 RU2020125810A RU2020125810A RU2733834C1 RU 2733834 C1 RU2733834 C1 RU 2733834C1 RU 2020125810 A RU2020125810 A RU 2020125810A RU 2020125810 A RU2020125810 A RU 2020125810A RU 2733834 C1 RU2733834 C1 RU 2733834C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cov
- sars
- coronavirus
- ectos
- glycoprotein
- Prior art date
Links
- PHICBFWUYUCFKS-UHFFFAOYSA-N C(CC1)CC11CCCC1 Chemical compound C(CC1)CC11CCCC1 PHICBFWUYUCFKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N CC1CCCC1 Chemical compound CC1CCCC1 GDOPTJXRTPNYNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
Abstract
Description
Изобретение относится к искусственному гену, кодирующему эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантной плазмиде, обеспечивающей экспрессию указанного искусственного гена и рекомбинантному штамму вируса везикулярного стоматита, экспрессирующему антигены коронавируса SARS-CoV-2, индуцирующему специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2 и используемому для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и может быть использовано в биотехнологии, молекулярной биологии, генетической инженерии и медицине.The invention relates to an artificial gene encoding an ectodomain of the glycoprotein S of the SARS-CoV-2 coronavirus with a C-terminal trimerizing domain, a recombinant plasmid providing the expression of said artificial gene and a recombinant strain of vesicular stomatitis virus, expressing coronavirus 2 antigens SARS-CoV-2, inducing immunity the answer to SARS-CoV-2 and used to create a vaccine against the SARS-CoV-2 coronavirus and can be used in biotechnology, molecular biology, genetic engineering and medicine.
Известно решение по патенту (US, 20190062785A1, МПК A61K 39/215, А61K39/205; C12N15/86, опубл. 28.02.2019 г.), где описана вакцина на основе рекомбинантного вируса бешенства, которая обеспечивает защиту против бешенства и тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV). Транскрипционная кассета локализована в межгенном регионе N и P, что гарантирует высокий уровень экспрессии трансгена за счет особенностей организации генома рабдовирусов. В патенте раскрыты основные существующие подходы дизайна целевых коронавирусных иммуногенов/антигенов, такие как полноразмерный гликопротеин S, вариант с усеченным цитоплазматическим доменом (Δ19), а также рецептор-связывающий домен RBD с трансмембранным регионом и цитоплазматическим доменом вируса бешенства.Known patent solution (US, 20190062785A1, IPC A61K 39/215, A61K39 / 205; C12N15 / 86, publ. 02/28/2019), which describes a vaccine based on a recombinant rabies virus, which provides protection against rabies and severe acute respiratory syndrome (SARS-CoV). The transcriptional cassette is located in the intergenic region N and P, which guarantees a high level of transgene expression due to the peculiarities of the organization of the rhabdovirus genome. The patent discloses the main existing approaches for the design of target coronavirus immunogens / antigens, such as the full-length S glycoprotein, the variant with the truncated cytoplasmic domain (Δ19), and the RBD receptor-binding domain with the transmembrane region and the cytoplasmic domain of the rabies virus.
Однако использование данного вектора осложнено остаточной нейровирулентностью и возможными побочными эффектами. В тоже время использование функционального гликопротеина S коронавирусов в качестве иммуногена может привести к созданию рекомбинантного вируса бешенства, обладающего двойной тропностью за счет экспонированных вирусных гликопротеинов. Недостатком данного решения также является использование антигенов вируса SARS-CoV, что, вероятно, не позволит сформировать противовирусный иммунитет против нового коронавируса SARS-CoV-2.However, the use of this vector is complicated by residual neurovirulence and possible side effects. At the same time, the use of functional glycoprotein S of coronaviruses as an immunogen can lead to the creation of a recombinant rabies virus, which has double tropism due to exposed viral glycoproteins. The disadvantage of this solution is also the use of antigens of the SARS-CoV virus, which probably will not allow the formation of antiviral immunity against the new SARS-CoV-2 coronavirus.
Известно иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С’-конце гена (RU, 2720614, МПК A61K 39/215; A61P 31/12, опубл. 12.05.2020 г.), или последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита, или последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1, или их комбинации.Known immunobiological agent for the prevention of diseases caused by the virus of severe respiratory syndrome SARS-CoV-2 based on recombinant human adenovirus 5th serotype or recombinant human adenovirus 26th serotype, containing optimized for expression in mammalian cells sequence of protective antigen S of SARS-CoV virus -2 with a deletion of 18 amino acids at the C'-end of the gene (RU, 2720614, IPC A61K 39/215; A61P 31/12, publ. 05/12/2020), or the sequence of the complete protective antigen S of the SARS-CoV-2 virus and the sequence of the Fc fragment from human IgG1, or the sequence of the receptor binding domain of the protein S of the SARS-CoV-2 virus with the sequence of the leader peptide of the virus, or the sequence of the receptor-binding domain of the protein S of the SARS-CoV-2 virus with the transmembrane domain of the glycoprotein of the vesicular stomatitis virus, or the sequence of the receptor-binding domain of the protein S of the SARS-CoV-2 virus with the sequence leader th peptide and the sequence of the Fc fragment from human IgG1, or a combination thereof.
Однако показано, что использование векторов на основе циркулирующих в человеческой популяции агентов (аденовирусы, герпесвирусы, респираторно-синцитиальный вирус и т.д.) может быть осложнено наличием специфического иммунитета против вируса «дикого типа», в результате чего не будет происходить достаточного продуктивного инфицирования клеток рекомбинантным вирусом, и как следствие, не будет эффективно обеспечена экспрессия целевого трансгена.However, it has been shown that the use of vectors based on agents circulating in the human population (adenoviruses, herpes viruses, respiratory syncytial virus, etc.) can be complicated by the presence of specific immunity against the "wild-type" virus, as a result of which there will not be sufficient productive infection cells with a recombinant virus, and as a result, the expression of the target transgene will not be efficiently provided.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является решение по патенту (CN, 111088283A, МПК A61K 39/215; A61P 31/14; C12N 15/86; опубл. 01.05.2020 г.), где предложены вирусные векторы на основе аттенуированного вируса везикулярного стоматита, в котором химерный ген гетерологичного антигена локализован между генами G и L. В патенте также раскрываются классические подходы дизайна целевых коронавирусных иммуногенов/антигенов (кодон-оптимизация, полноразмерный S (Spike), RBD). В патенте раскрывается подход получения химерных поверхностных гликопротеинов вируса везикулярного стоматита, с целью индукции иммунитета на коронавирусный компонент.The closest analogue (prototype) is the solution under the patent (CN, 111088283A, IPC A61K 39/215; A61P 31/14; C12N 15/86; publ. 05/01/2020), where viral vectors based on attenuated vesicular stomatitis virus are proposed , in which the chimeric gene of the heterologous antigen is localized between genes G and L. The patent also discloses classical approaches to the design of targeted coronavirus immunogens / antigens (codon optimization, full-length S (Spike), RBD). The patent discloses an approach to obtain chimeric surface glycoproteins of the vesicular stomatitis virus in order to induce immunity to the coronavirus component.
Недостатком данного решения является дизайн иммуногенов в виде N- и C-концевых слитых белков, что может сказаться на фолдинге коронавирусных антигенных компонентов и инфекционном титре рекомбинантного вируса. Предлагаемая строгая локализация трансгена в геноме вируса (между генами G и L, фактически 5-ая транскрипционная кассета, начиная с 3’-конца генома), не позволяет в полной мере контролировать транскрипционный уровень трансгена. Также важным недостатком является использование небольшого фрагмента (RBD) гликопротеина S для индукции противовирусного иммунитета, в то время как размер полноразмерного гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 ~1200 а.о., на поверхности вирионов который организован в виде гомотримеров.The disadvantage of this solution is the design of immunogens in the form of N- and C-terminal fusion proteins, which can affect the folding of coronavirus antigenic components and the infectious titer of the recombinant virus. The proposed strict localization of the transgene in the genome of the virus (between genes G and L, in fact, the 5th transcriptional cassette, starting from the 3'-end of the genome) does not allow full control of the transcriptional level of the transgene. Another important disadvantage is the use of a small fragment (RBD) of glycoprotein S for the induction of antiviral immunity, while the size of the full-length glycoprotein S of the SARS-CoV-2 coronavirus is ~ 1200 amino acids, which is organized in the form of homotrimers on the surface of virions.
Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке новых рекомбинантных вакцин от коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2).Thus, in the prior art, there is an urgent need for the development of new recombinant vaccines against coronavirus infection COVID-19 (SARS-CoV-2).
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Целью заявленного изобретения является создание рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, обеспечивающего экспрессию антигенов коронавируса SARS-CoV-2, и индуцирующего специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2.The aim of the claimed invention is to provide a recombinant vesicular stomatitis virus that provides expression of SARS-CoV-2 coronavirus antigens and induces a specific immune response to SARS-CoV-2.
Техническим результатом является повышение уровня экспрессии трансгена, улучшение фолдинга и обеспечение синтеза полноразмерного эктодомена гликопротеина S SARS-CoV-2 заявляемым рекомбинантным вирусом.The technical result is to increase the level of transgene expression, improve folding and ensure the synthesis of the full-length ectodomain of the SARS-CoV-2 glycoprotein S by the claimed recombinant virus.
Указанный технический результат достигается созданием искусственного гена, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, кодирующего искусственный белок-иммуноген, представляющий собой эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом, представленная в SEQ ID NO:1 длиной 3723 п.н.The specified technical result is achieved by creating an artificial gene used to create a vaccine against the SARS-CoV-2 coronavirus, encoding an artificial immunogen protein, which is an ectodomain of the glycoprotein S of the SARS-CoV-2 coronavirus with a C-terminal trimerizing domain, presented in SEQ ID NO: 1
Указанный технический результат достигается также созданием рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-EctoS_SC2, используемой для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, имеющей молекулярную массу 1,07⋅107 дальтон, размер 17369 п.н. и содержащей в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2 целевой ген по п. 1, кодирующий искусственный белок-иммуноген EctoS_SC2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 длиной 1240 а.к.о. и находящийся под контролем вирусного промотора в новой транскрипционной кассете в 3’-конце генома, обеспечивающего его экспрессию в клетках млекопитающих, состоящая из следующих фрагментов:The specified technical result is also achieved by creating a recombinant plasmid pStem-rVSV-EctoS_SC2, used to create a vaccine against coronavirus SARS-CoV-2, having a molecular weight of 1.07 × 10 7 daltons, size 17369 bp. and containing, in accordance with the physical and genetic map shown in FIG. 2, the target gene according to claim 1, encoding an artificial immunogen protein EctoS_SC2 having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 1240 a.a. and under the control of a viral promoter in a new transcriptional cassette at the 3'-end of the genome, providing its expression in mammalian cells, consisting of the following fragments:
- ORI - (ORI, origin of replication) точка начала репликации плазмидного вектора pUC (координаты 16543-17131 п.н.);- ORI - (ORI, origin of replication) point of origin of replication of the plasmid vector pUC (coordinates 16543-17131 bp);
- AmpR - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость трансформантов E.coli к селективному антибиотику ампициллину (координаты 15512-16372 п.н.);- AmpR - β-lactamase gene providing resistance of E. coli transformants to the selective antibiotic ampicillin (coordinates 15512-16372 bp);
- T7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага T7, необходимая для транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 166-183 п.н.);- T7 promoter - the nucleotide sequence of the T7 bacteriophage promoter required for transcription of the antigenomic RNA sequence of the recombinant vesicular stomatitis virus (coordinates 166-183 bp);
- T7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага T7, необходимая для терминации транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 15284-15390 п.н.);- T7 terminator - the nucleotide sequence of the T7 bacteriophage terminator, which is necessary for terminating the transcription of the antigenomic RNA sequence of the recombinant vesicular stomatitis virus (coordinates 15284-15390 bp);
- HDV-Rbz - нуклеотидная последовательность рибозима HDV, которая после транскрибирования отщепляется с формированием аутентичной 3’-концевой некодирующей последовательности (координаты 15197-15279 п.н.);- HDV-Rbz - the nucleotide sequence of the HDV ribozyme, which, after transcription, is cleaved with the formation of an authentic 3'-terminal non-coding sequence (coordinates 15197-15279 bp);
- N - открытая рамка считывания гена N (нуклеопротеин) (координаты 4012-5280 п.н.);- N - open reading frame of the N gene (nucleoprotein) (coordinates 4012-5280 bp);
- P - открытая рамка считывания гена P (фосфопротеин) (координаты 5344-6141 п.н.);- P - open reading frame of the P gene (phosphoprotein) (coordinates 5344-6141 bp);
- L - открытая рамка считывания гена L (РНК-зависимая РНК-полимераза) (координаты 8768-15097 п.н.);- L - open reading frame of the L gene (RNA-dependent RNA polymerase) (coordinates 8768-15097 bp);
- VSV-G - открытая рамка считывания гликопротеина G (координаты 7134-8669 п.н.);- VSV-G - open reading frame of glycoprotein G (coordinates 7134-8669 bp);
- T4 fibritin foldon (Fd) trimerization domains - бета-пропеллерный тримеризующий домен фибритина бактериофага T4, обеспечивающий формирование гомотримеров эктодомена S SARS-CoV-2 (координаты 3878-3976 п.н.);- T4 fibritin foldon (Fd) trimerization domains - beta-propeller trimerizing domain of fibritin of bacteriophage T4, which ensures the formation of homotrimers of the ectodomain S SARS-CoV-2 (coordinates 3878-3976 bp);
- Spike protein - эктодомен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 254-3868 п.н.);- Spike protein - ectodomain of glycoprotein S (Spike) SARS-CoV-2 (coordinates 254-3868 bp);
- Receptor-binding domain (RBD) - рецептор-связывающий домен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 1208-1876 п.н.).- Receptor-binding domain (RBD) - receptor-binding domain of the S (Spike) glycoprotein SARS-CoV-2 (coordinates 1208-1876 bp).
Указанный технический результат достигается также созданием штамма rVSV-EctoS_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, полученный с использованием рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-EctoS_SC2 по п. 2, обеспечивающего синтез коронавирусного антигена (тримеризованный эктодомен гликопротеина S SARS-CoV-2), используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 и депонированного в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под № V-982.The specified technical result is also achieved by creating a strain rVSV-EctoS_SC2 of the recombinant vesicular stomatitis virus, obtained using the recombinant plasmid pStem-rVSV-EctoS_SC2 according to claim 2, providing the synthesis of coronavirus antigen (trimerized ectodomain of the glycoprotein S 2 vaccine used) against the SARS-CoV-2 coronavirus and deposited in the State Collection of pathogens of viral infections, rickettsioses of the FBSI SSC VB "Vector" of Rospotrebnadzor under No. V-982.
Существенными отличиями от прототипа, обеспечивающими достижение технического результата, являются:Significant differences from the prototype, ensuring the achievement of the technical result, are:
1. Оптимизация искусственного гена посредством нормализации кодонного состава и исключение из последовательности элементов, оказывающих негативное влияние на уровень экспрессии и стабильности мРНК;1. Optimization of an artificial gene by normalizing the codon composition and excluding elements from the sequence that have a negative effect on the level of expression and stability of mRNA;
2. Локализация трансгена в новой транскрипционной кассете в 3’-конце генома вируса везикулярного стоматита, что обеспечивает наибольший уровень экспрессии в рабдовирусного генома;2. Localization of the transgene in a new transcriptional cassette at the 3'-end of the genome of the vesicular stomatitis virus, which provides the highest level of expression in the rhabdovirus genome;
3. Использование бета-пропеллерного тримеризующего домена фибритина бактериофага T4, обеспечивающего формирование гомотримеров эктодомена S SARS-CoV-2 с нативной конформацией;3. Use of the beta-propeller trimerizing domain of fibritin of bacteriophage T4, which ensures the formation of homotrimers of the S SARS-CoV-2 ectodomain with native conformation;
4. Использование полноразмерного эктодомена S SARS-CoV-2, что позволяет индуцировать полноценный иммунный ответ на вневирионные антигенные компоненты вирусного гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2.4. The use of the full-length ectodomain S SARS-CoV-2, which makes it possible to induce a full-fledged immune response to the non-virionic antigenic components of the viral glycoprotein S of the SARS-CoV-2 coronavirus.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Сущность заявленного изобретения поясняется чертежами. На фиг. 1 приведена схема клонирования нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих конструкционные варианты эктодомена гликопротеина S в плазмидном векторе для обратной генетики вируса везикулярного стоматита pStem-rVSV_ng. На фиг. 2 изображена схема конструкции рекомбинантной плазмиды pStem-rVSV-EctoS_SC2, используемой для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2. На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) искусственного гена, кодирующего эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом.The essence of the claimed invention is illustrated by drawings. FIG. 1 shows a scheme for cloning the nucleotide sequences of genes encoding constructive variants of the ectodomain of glycoprotein S in a plasmid vector for reverse genetics of the vesicular stomatitis virus pStem-rVSV_ng. FIG. 2 shows a diagram of the construction of the recombinant plasmid pStem-rVSV-EctoS_SC2 used to create a vaccine against the SARS-CoV-2 coronavirus. FIG. 3 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the artificial gene encoding the ectodomain of the glycoprotein S of the SARS-CoV-2 coronavirus with a C-terminal trimerizing domain.
На фиг. 4 приведена аминокислотная последовательность секретируемого эктодомена гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом (SEQ ID NO:2).FIG. 4 shows the amino acid sequence of the secreted ectodomain of the S (Spike) glycoprotein SARS-CoV-2 with a C-terminal trimerizing domain (SEQ ID NO: 2).
Дизайн искусственного гена и получение рекомбинантной плазмиды. Первым этапом создания рекомбинантного вируса везикулярного стоматита для создания вакцины стал дизайн целевого антигена/иммуногена. Согласно литературным данным, наиболее перспективными вирусными компонентами, для индукции протективного иммунитета, являются поверхностный трансмембранный гликопротеин S (Spike), а также нуклеопротеин N. Artificial gene design and recombinant plasmid production. The first step in creating a recombinant vesicular stomatitis virus to create a vaccine was the design of the target antigen / immunogen. According to the literature, the most promising viral components for the induction of protective immunity are surface transmembrane glycoprotein S (Spike), as well as nucleoprotein N.
В ходе проведенного биоинформатического анализа опубликованных полногеномных нуклеотидных последовательностей вируса SARS-CoV-2 (референс последовательность GenBank: NC_045512.2), а также фрагментарных нуклеотидных последовательностей, кодирующих гликопротеин S, подтверждена относительная стабильность аминокислотных последовательностей целевых антигенов.The bioinformatic analysis of the published whole genome nucleotide sequences of the SARS-CoV-2 virus (reference sequence GenBank: NC_045512.2), as well as fragmentary nucleotide sequences encoding glycoprotein S, confirmed the relative stability of the amino acid sequences of the target antigens.
Важно отметить, что нативный вирусный гликопротеин S представлен трансмембранным триммером, с сигналами удержания в ER/Гольджи в C-концевом фрагменте белка. С использованием онлайн инструментов SignalIP-5.0 и TMHMM был локализован эктодомен гликопротеина S, по гомологии с гликопротеином S SARS-CoV выделен рецептор-связывающий домен (RBD), с фланкирующими регионами, необходимыми для корректного фолдинга домена. Согласно литературным данным, иммунизация животных рекомбинантным гликопротеином S родственных коронавирусов (SARS-CoV, MERS-CoV и др.), или конструкциями, обеспечивающими его экспрессию, приводит к индукции специфических вируснейтрализующих антител (Kun Li et al., 2020). It is important to note that the native viral glycoprotein S is represented by a transmembrane trimmer, with retention signals in the ER / Golgi at the C-terminal fragment of the protein. Using the online tools SignalIP-5.0 and TMHMM, the ectodomain of glycoprotein S was localized, the receptor-binding domain (RBD) was isolated by homology with the glycoprotein S SARS-CoV, with flanking regions necessary for correct folding of the domain. According to the literature, immunization of animals with the recombinant S glycoprotein of related coronaviruses (SARS-CoV, MERS-CoV, etc.), or constructs that ensure its expression, leads to the induction of specific virus neutralizing antibodies (Kun Li et al., 2020).
Следовательно, экспрессия эктодомена гликопротеина S посредством рекомбинантного вируса в составе вакцины будет индуцировать синтез вирусспецифических антител к SARS-CoV-2. В изобретении предложена оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая эктодомен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2. Оптимизация синтетических конструкций, кодирующих полноразмерный гликопротеин S SARS-CoV была проведена посредством нормализации кодонного состава и исключения из последовательностей элементов, оказывающих негативное влияние на уровень экспрессии или стабильность мРНК. Нуклеотидные последовательности искусственных генов были химически синтезированы и использованы для получения рекомбинантных конструкций для обратной генетики репликационно-компетентного вируса везикулярного стоматита.Consequently, the expression of the ectodomain of glycoprotein S by the recombinant virus in the vaccine will induce the synthesis of virus-specific antibodies to SARS-CoV-2. The invention provides an optimized nucleotide sequence encoding the ectodomain of the glycoprotein S (Spike) SARS-CoV-2. Optimization of synthetic constructs encoding the full-length SARS-CoV glycoprotein S was carried out by normalizing the codon composition and excluding from the sequences elements that negatively affect the level of expression or stability of mRNA. Nucleotide sequences of artificial genes were chemically synthesized and used to obtain recombinant constructs for reverse genetics of the replication-competent vesicular stomatitis virus.
Вирус везикулярного стоматита использован в качестве вектора в силу безопасности, широкого клеточного тропизма, а также из-за отсутствия предсуществующего иммунитета у большинства людей, что является необходимым требованием для проведения эффективной иммунизации. Показано, что использование векторов на основе других циркулирующих в человеческой популяции агентов (аденовирусы, герпесвирусы, респираторно-синцитиальный вирус и т.д.) может быть осложнено наличием специфического иммунитета против вируса «дикого типа», в результате чего не будет происходить продуктивного инфицирования клеток рекомбинантным вирусом и, как следствие, не будет обеспечена экспрессия целевого трансгена. Важным свойством, позволяющим рекомендовать рабдовирусы в качестве вакцинных вирусных векторов, является высокий титр накопления в перевиваемых культурах клеток (до 1010 ТЦД50/мл), а также относительно низкие иммунизирующие дозы (105 - 107 ТЦД50). Показано также, что рекомбинантные вирусы везикулярного стоматита, экспрессирующие гликопротеины гетерологичных вирусов (Эбола, Марбург, Ласса и т.д.) обеспечивают формирование протективного иммунитета в отношении широкого круга инфекционных заболеваний.Vesicular stomatitis virus has been used as a vector because of its safety, wide cellular tropism, and the lack of preexisting immunity in most people, which is a prerequisite for effective immunization. It has been shown that the use of vectors based on other agents circulating in the human population (adenoviruses, herpes viruses, respiratory syncytial virus, etc.) can be complicated by the presence of specific immunity against the wild-type virus, as a result of which there will be no productive cell infection recombinant virus and, as a consequence, the expression of the target transgene will not be provided. An important property that allows rhabdoviruses to be recommended as vaccine viral vectors is a high accumulation titer in transplanted cell cultures (up to 10 10 TCD 50 / ml), as well as relatively low immunizing doses (10 5 - 10 7 TCD 50 ). It has also been shown that recombinant vesicular stomatitis viruses expressing glycoproteins of heterologous viruses (Ebola, Marburg, Lassa, etc.) provide the formation of protective immunity against a wide range of infectious diseases.
Изобретение также представляет собой штамм рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащий оптимизированную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:1) искусственного гена, кодирующего искусственный белок-иммуноген, представляющий собой тримеризованный эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2.The invention also provides a recombinant vesicular stomatitis virus strain containing an optimized nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of an artificial gene encoding an artificial immunogen protein, which is a trimerized ectodomain of the SARS-CoV-2 coronavirus glycoprotein S.
Способ индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2, предусматривает:The method of inducing specific immunity to SARS-CoV-2 includes:
1) 1-, 2- или 3-кратное введение в организм человека или животного одного, двух или более иммуногенных композиций на основе заявляемого штамма рекомбинантного вируса везикулярного стоматита.1) 1-, 2- or 3-fold introduction into the human or animal organism of one, two or more immunogenic compositions based on the inventive strain of the recombinant vesicular stomatitis virus.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.The implementation of the invention is confirmed by the following examples.
Пример 1. Получение конструкционного варианта эктодомена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2. Example 1. Obtaining a constructive variant of the ectodomain of the glycoprotein S of the SARS-CoV-2 coronavirus.
Прототипом для дизайна синтетической конструкции вариантов гликопротеина S, выступала аминокислотная последовательность, кодируемая геном S (Spike), представленным в депонированной полногеномной последовательности вируса SARS-CoV-2 (GenBank: NC_045512). Химерный синтетический иммуноген представляет собой секретируемый эктодомен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом (SEQ ID NO:2). При экспрессии данного варианта в эукариотических клетках происходит синтез и необходимые посттрансляционные модификации эктодомена гликопротеина S. За счет тримеризующего домена эктодомен EctoS_SC2 организуется в гомотример, формируя тем самым нативную конформационную структуру антигена. Тримеризованный коронавирусный антиген транспортируется в межклеточное пространство, где происходит захват антигенпрезентирующими клетками (АПК), что приводит к индукции иммунного ответа, в том числе, на конформационные антигенные детерминанты. Благодаря локализации искусственного гена EctoS_SC2 в 3’-конце генома обеспечивается наибольший уровень экспрессии трансгена с рабдовирусного генома.The prototype for the design of a synthetic construct of glycoprotein S variants was the amino acid sequence encoded by the S (Spike) gene presented in the deposited genome-wide sequence of the SARS-CoV-2 virus (GenBank: NC_045512). The chimeric synthetic immunogen is a secreted ectodomain of the S (Spike) glycoprotein SARS-CoV-2 with a C-terminal trimerizing domain (SEQ ID NO: 2). When this variant is expressed in eukaryotic cells, the synthesis and the necessary post-translational modifications of the ectodomain of glycoprotein S occur. Due to the trimerizing domain, the ectodomain EctoS_SC2 is organized into a homotrimer, thereby forming the native conformational structure of the antigen. The trimerized coronavirus antigen is transported into the intercellular space, where it is captured by antigen presenting cells (APC), which leads to the induction of an immune response, including to conformational antigenic determinants. Due to the localization of the artificial gene EctoS_SC2 at the 3 'end of the genome, the highest level of expression of the transgene from the rhabdovirus genome is provided.
Пример 2. Получение генетической конструкции. Example 2. Obtaining a genetic construct.
Для получения генетической конструкции эктодомена гликопротеина S был рассчитан оптимизированный искусственный ген с нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO:1, фиг. 3). Оптимизация гена была направлена на нормализацию кодонного состава искусственного гена и исключения из последовательностей элементов, оказывающих негативное влияние на уровень экспрессии или стабильность мРНК.To obtain the genetic construct of the glycoprotein S ectodomain, an optimized artificial gene with a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1, Fig. 3) was calculated. The optimization of the gene was aimed at normalizing the codon composition of the artificial gene and excluding from the sequences elements that have a negative effect on the level of expression or stability of mRNA.
Нуклеотидные последовательности генов были получены методом химического синтеза ЗАО «Биокад» и ЗАО «Евроген».Nucleotide sequences of genes were obtained by the method of chemical synthesis of ZAO Biocad and ZAO Evrogen.
Для получения рекомбинантного вируса везикулярного стоматита ген EctoS_SC2, кодирующий конструкционный вариант эктодомена гликопротеина S, был клонирован в плазмидном векторе для обратной генетики вируса везикулярного стоматита pStem-rVSV_ng. Схема клонирования приведена на фиг. 1. Направленное клонирование проведено по сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикций EagI и MluI, располагающихся в полилинкере новой транскрипционной кассеты в 3’-конце геномной кДНК последовательности. Для этого 1,5 мкг плазмидной ДНК pStem-rVSV_ng гидролизовали эндонуклеазами рестрикции EagI и MluI (NEB) в буфере CutSmart при 37 °C 1 час, после чего вносили 2 е.а. рекомбинантной щелочной фосфатазы креветок (rSAP) (NEB), необходимой для предотвращения «самолигирования» вектора, с инкубацией при 37 °C 1 час. Продукты гидролиза разделяли методом электрофореза, фрагменты ДНК, соответствующие гидролизованному вектору (~13650 п.н.), выделяли из агарозного геля с использованием коммерческого набора QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Нуклеотидную вставку, кодирующую целевой трансген EctoS_SC2, возможно подготовить посредством постановки гидролиза клонировочной плазмиды, амплификацией нуклеотидных последовательностей в LAMP или ПЦР, либо любым другим методом, доступным исследователю. Клонирование может быть проведено любым из существующих методов (лигирование, метод Гибсона, гомологической рекомбинации и др.), при этом в целевом трансгене должен присутствовать старт-кодон (ATG) в оптимальном фланкирующем контексте (консенсусная последовательность Козак; GCCACC). На фиг. 1 представлена схема направленного клонирования трансгена, с формированием транскрипционной кассеты. Для этого 1 мкг гидролизованного вектора pStem-rVSV_ng/EagI-MluI смешивали с гидролизованным по EagI и MluI фрагментом ДНК трансгена EctoS_SC2 в эквимолярном соотношении, добавляли реакционный буфер и T4 ДНК лигазу. После инкубации при 20 °C 1 час, лигазную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E.coli. Скрининг клонов-трансформантов проводили с использованием методов ПЦР и рестрикционного анализа рекомбинантных плазмид.To obtain a recombinant vesicular stomatitis virus, the EctoS_SC2 gene encoding a constructive variant of the glycoprotein S ectodomain was cloned into the pStem-rVSV_ng plasmid vector for reverse genetics of vesicular stomatitis virus. The cloning scheme is shown in FIG. 1. Directional cloning was performed at the recognition sites of restriction endonucleases EagI and MluI, located in the polylinker of the new transcriptional cassette at the 3'-end of the genomic cDNA sequence. For this, 1.5 μg of plasmid DNA pStem-rVSV_ng was hydrolyzed with restriction endonucleases EagI and MluI (NEB) in CutSmart buffer at 37 ° C for 1 hour, after which 2 u.a. were added. recombinant shrimp alkaline phosphatase (rSAP) (NEB), necessary to prevent the "self-ligation" of the vector, with incubation at 37 ° C for 1 hour. The hydrolysis products were separated by electrophoresis, DNA fragments corresponding to the hydrolyzed vector (~ 13650 bp) were isolated from the agarose gel using a commercial QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions. The nucleotide insert encoding the target transgene EctoS_SC2 can be prepared by setting up the hydrolysis of the cloning plasmid, amplifying the nucleotide sequences in LAMP or PCR, or by any other method available to the researcher. Cloning can be performed by any of the existing methods (ligation, Gibson method, homologous recombination, etc.), while the target transgene must contain a start codon (ATG) in an optimal flanking context (Kozak consensus sequence; GCCACC). FIG. 1 shows a scheme of directed cloning of a transgene, with the formation of a transcription cassette. For this, 1 μg of the hydrolyzed vector pStem-rVSV_ng / EagI-MluI was mixed with the DNA fragment of the EctoS_SC2 transgene hydrolyzed according to EagI and MluI in an equimolar ratio, reaction buffer and T4 DNA ligase were added. After incubation at 20 ° C for 1 hour, the ligase mixture was used to transform competent E. coli cells. Screening of transformant clones was performed using PCR methods and restriction analysis of recombinant plasmids.
Корректность нуклеотидных последовательностей плазмидных конструкций подтверждена секвенированием по Сэнгеру. Получена генетическая конструкция, кодирующая нуклеотидную последовательность конструкционного варианта антигена SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1, фиг. 3).The correctness of the nucleotide sequences of the plasmid constructs was confirmed by Sanger sequencing. A genetic construct was obtained that encodes the nucleotide sequence of the constructive variant of the SARS-CoV-2 antigen (SEQ ID NO: 1, Fig. 3).
Рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2 имеет молекулярную массу 1,07⋅107 дальтон, размер 17369 п.н. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 2 целевой искусственный ген по п. 1, кодирующий искусственный белок-иммуноген EctoS_SC2 - эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 (фиг. 4) длиной 1240 а.к.о. и находящийся под контролем вирусного промотора в новой транскрипционной кассете в 3’-конце генома, обеспечивающего его экспрессию в клетках млекопитающих и состоящая из следующих фрагментов:The recombinant plasmid pStem-rVSV-EctoS_SC2 has a molecular weight of 1.07⋅10 7 daltons, a size of 17369 bp. and contains, in accordance with the physical and genetic map shown in FIG. 2, the target artificial gene according to claim 1, encoding the artificial immunogen protein EctoS_SC2 - the ectodomain of the glycoprotein S of the SARS-CoV-2 coronavirus, having the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 (Fig. 4) 1240 a.a. and under the control of a viral promoter in a new transcriptional cassette at the 3'-end of the genome, providing its expression in mammalian cells and consisting of the following fragments:
- ORI - (ORI, origin of replication) точка начала репликации плазмидного вектора pUC (координаты 16543-17131 п.н.);- ORI - (ORI, origin of replication) point of origin of replication of the plasmid vector pUC (coordinates 16543-17131 bp);
- AmpR - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость трансформантов E.coli к селективному антибиотику ампициллину (координаты 15512-16372 п.н.);- AmpR - β-lactamase gene providing resistance of E. coli transformants to the selective antibiotic ampicillin (coordinates 15512-16372 bp);
- T7 promoter - нуклеотидная последовательность промотора бактериофага T7, необходимая для транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 166-183 п.н.);- T7 promoter - the nucleotide sequence of the T7 bacteriophage promoter required for transcription of the antigenomic RNA sequence of the recombinant vesicular stomatitis virus (coordinates 166-183 bp);
- T7 terminator - нуклеотидная последовательность терминатора бактериофага T7, необходимая для терминации транскрипции антигеномной последовательности РНК рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (координаты 15284-15390 п.н.);- T7 terminator - the nucleotide sequence of the T7 bacteriophage terminator, which is necessary for terminating the transcription of the antigenomic RNA sequence of the recombinant vesicular stomatitis virus (coordinates 15284-15390 bp);
- HDV-Rbz - нуклеотидная последовательность рибозима HDV, которая после транскрибирования отщепляется с формированием аутентичной 3’-концевой некодирующей последовательности (координаты 15197-15279 п.н.);- HDV-Rbz - the nucleotide sequence of the HDV ribozyme, which, after transcription, is cleaved with the formation of an authentic 3'-terminal non-coding sequence (coordinates 15197-15279 bp);
- N - открытая рамка считывания гена N (нуклеопротеин) (координаты 4012-5280 п.н.);- N - open reading frame of the N gene (nucleoprotein) (coordinates 4012-5280 bp);
- P - открытая рамка считывания гена P (фосфопротеин) (координаты 5344-6141 п.н.);- P - open reading frame of the P gene (phosphoprotein) (coordinates 5344-6141 bp);
- L - открытая рамка считывания гена L (РНК-зависимая РНК-полимераза) (координаты 8768-15097 п.н.);- L - open reading frame of the L gene (RNA-dependent RNA polymerase) (coordinates 8768-15097 bp);
- VSV-G - открытая рамка считывания гликопротеина G (координаты 7134-8669 п.н.);- VSV-G - open reading frame of glycoprotein G (coordinates 7134-8669 bp);
- T4 fibritin foldon (Fd) trimerization domains - бета-пропеллерный тримеризующий домен фибритина бактериофага T4, обеспечивающий формирование гомотримеров эктодомена S SARS-CoV-2 (координаты 3878-3976 п.н.);- T4 fibritin foldon (Fd) trimerization domains - beta-propeller trimerizing domain of fibritin of bacteriophage T4, which ensures the formation of homotrimers of the ectodomain S SARS-CoV-2 (coordinates 3878-3976 bp);
- Spike protein - эктодомен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 254-3868 п.н.);- Spike protein - ectodomain of glycoprotein S (Spike) SARS-CoV-2 (coordinates 254-3868 bp);
- Receptor-binding domain (RBD) - рецептор-связывающий домен гликопротеина S (Spike) SARS-CoV-2 (координаты 1208-1876 п.н.).- Receptor-binding domain (RBD) - receptor-binding domain of the S (Spike) glycoprotein SARS-CoV-2 (coordinates 1208-1876 bp).
Пример 3. Получение репликационно-компетентного штамма rVSV-EctoS_SC2 вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антиген SARS-CoV-2. Example 3. Obtaining a replication-competent strain of vesicular stomatitis virus rVSV-EctoS_SC2 expressing the SARS-CoV-2 antigen.
Выделение плазмидной ДНК генетической конструкции для обратной генетики вируса везикулярного стоматита, кодирующего антигены SARS-CoV-2, выполнено с использованием коммерческого набора QIAGEN Plasmid Maxi Kit, согласно инструкции производителя.Isolation of plasmid DNA of the genetic construct for reverse genetics of the vesicular stomatitis virus encoding SARS-CoV-2 antigens was performed using the commercial QIAGEN Plasmid Maxi Kit, according to the manufacturer's instructions.
Получение репликационно-компетентного вируса везикулярного стоматита проведено с использованием методов обратной генетики в перевиваемой линии клеток Vero и/или 4647 (коллекция культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора). Для этого монослой клеточной культуры (конфлюентность 90%) трансфецировали с использованием липофектамина 3000 (Thermo Scientific, США) полученной генетической плазмидной конструкцией pStem-rVSV-EctoS_SC2 совместно с хелперными плазмидами pStem-vN, pStem-vP, pStem-vL обеспечивающими экспрессию белковой репликативной машинерии вируса везикулярного стоматита (N, P и L), а также ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7. Количество каждой из плазмидных конструкций составило: pStem-N - 0,25 мкг; pStem-P - 0,25 мкг; pStem-L - 1,0 мкг; pStem-T7 - 1,5 мкг; pStem-rVSV-EctoS_SC2 (конструкционный вариант) - 2 мкг. Через сутки производили смену питательной среды на поддерживающую с 2% фетальной сыворотки крови, с последующим культивированием 48-72 часа в CO2-инкубаторе (5% CO2; 37 °C; влажная атмосфера). При оптической микроскопии по истечению срока культивирования отмечали полную деструкцию монослоя клеток. Вируссодержащую культуральную жидкость рекомбинантного вируса собирали, осветляли посредством центрифугирования (10 мин при 10 тыс об/мин), аликвотировали и хранили до использования при минус 80 °C.Generation of replication-competent vesicular stomatitis virus was carried out using reverse genetics methods in a transplantable cell line Vero and / or 4647 (collection of cell cultures of the Federal State Budgetary Scientific Institution SSC VB Vector of Rospotrebnadzor). For this, a cell culture monolayer (90% confluence) was transfected using Lipofectamine 3000 (Thermo Scientific, USA) with the obtained genetic plasmid construct pStem-rVSV-EctoS_SC2 in conjunction with the helper plasmids pStem-vN, pStem-vP, pStem-vL providing the expression of protein replication vesicular stomatitis virus (N, P and L), as well as DNA-dependent RNA polymerase of bacteriophage T7. The amount of each of the plasmid constructs was: pStem-N - 0.25 μg; pStem-P 0.25 μg; pStem-L - 1.0 μg; pStem-T7 - 1.5 μg; pStem-rVSV-EctoS_SC2 (constructional option) - 2 μg. A day later, the culture medium was changed to a supporting one with 2% fetal blood serum, followed by cultivation for 48-72 hours in a CO 2 incubator (5% CO 2 ; 37 ° C; humid atmosphere). Optical microscopy showed complete destruction of the cell monolayer at the end of the cultivation period. The virus-containing culture fluid of the recombinant virus was collected, clarified by centrifugation (10 min at 10 thousand rpm), aliquoted and stored at minus 80 ° C until use.
Штамм идентифицирован в ФБУН ГНЦ ВБ Вектор» Роспотребнадзора в апреле 2020 г. и депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-982.The strain was identified at the FBSI SSC VB Vector of Rospotrebnadzor in April 2020 and deposited in the State collection of causative agents of viral infections, rickettsioses of the FBSI SSC VB Vector of Rospotrebnadzor under number V-982.
Инфекционную активность рекомбинантного вируса везикулярного стоматита оценивали при постановках классических вирусологических методов титрования в чувствительную культурах клеток Vero и/или 4647, с выражением в 50 % тканевых цитопатических дозах (ТЦД50), либо в бляшкообразующих единицах (БОЕ). При изучении культуральных свойств установлено, что полученный рекомбинантный вирус сохранил основные свойства исходного штамма вируса везикулярного стоматита (клеточная чувствительность, характер цитопатического действия, оптимальные параметры культивирования и др.).The infectious activity of the recombinant vesicular stomatitis virus was assessed when performing classical virological titration methods in sensitive cell cultures Vero and / or 4647, expressed in 50% tissue cytopathic doses (TCID 50 ), or in plaque-forming units (PFU). When studying the cultural properties, it was found that the resulting recombinant virus retained the basic properties of the original vesicular stomatitis virus strain (cellular sensitivity, the nature of cytopathic action, optimal cultivation parameters, etc.).
Титр накопления в культуре клеток Vero рекомбинантного штамма вируса везикулярного стоматита, кодирующий нуклеотидную последовательность антигена SARS-CoV-2 (SEQ ID NO:2) составил - 3,67 ± 0,12 lg ТЦД50/мл.The titer of accumulation in the culture of Vero cells of the recombinant strain of the vesicular stomatitis virus encoding the nucleotide sequence of the SARS-CoV-2 antigen (SEQ ID NO: 2) was 3.67 ± 0.12 lg TCD 50 / ml.
Пример 4. Подтверждение наличия гена EctoS_SC2, кодирующего антиген SARS-CoV-2, в составе генома заявляемого штамма rVSV-EctoS_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита. Example 4. Confirmation of the presence of the EctoS_SC2 gene, encoding the SARS-CoV-2 antigen, in the genome of the inventive rVSV-EctoS_SC2 strain of the recombinant vesicular stomatitis virus.
Подтверждение наличия и экспрессии искусственного гена EctoS_SC2, кодирующего антиген (тримеризованный эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2), проводили в полимеразной цепной реакции совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Выделение РНК из образцов культуральных сред, полученных после инфицирования монослоя клеток Vero рекомбинантным вирусом везикулярного стоматита, проводили с использованием набора реагентов «Рибо-преп» (Интерлабсервис, Россия) согласно инструкции производителя. Для оценки экспрессии и наличия трансгенов использовали специфические олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие открытую рамку считывания трансгена:The presence and expression of the artificial gene EctoS_SC2 encoding the antigen (trimerized ectodomain of the S glycoprotein SARS-CoV-2 coronavirus) was confirmed by polymerase chain reaction combined with reverse transcription (RT-PCR). Isolation of RNA from culture media samples obtained after infection of a monolayer of Vero cells with a recombinant vesicular stomatitis virus was performed using the Ribo-prep reagent kit (Interlabservice, Russia) according to the manufacturer's instructions. To assess the expression and presence of transgenes, specific oligonucleotide primers flanking the open reading frame of the transgene were used:
F-NCR (5’-ACGAAGACAAACAAACCATTATTATCATTAAAAGGC-3’) и R-VSV_1_seq (5’-TTGTGTTCTGCCCACTCTGT-3’).F-NCR (5'-ACGAAGACAAACAAACCATTATTATCATTAAAAGGC-3 ') and R-VSV_1_seq (5'-TTGTGTTCTGCCCACTCTGT-3').
Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием набора реагентов «обратная транскриптаза RNAscribe RT» (Биолабмикс, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Амплификацию фрагментов кДНК вируса везикулярного стоматита проводили с Phusion-полимеразы (NEB, США) в соответствии с инструкцией производителя. Продукты амплификации анализировали посредством электрофоретического разделения в агарозном геле и последующего окрашивания гелей рабочим раствором этидия бромида (0,5 мкг/мл). Корректность открытых рамок считывания трансгена EctoS_SC2 подтверждали секвенированием по Сэнгеру элюированных из агарозного геля целевых ампликонов.The first strand of cDNA was synthesized using the RNAscribe RT reverse transcriptase reagent kit (Biolabmix, Russia) in accordance with the manufacturer's instructions. Amplification of vesicular stomatitis virus cDNA fragments was performed with Phusion polymerase (NEB, USA) in accordance with the manufacturer's instructions. Amplification products were analyzed by electrophoretic separation in an agarose gel and subsequent staining of the gels with a working solution of ethidium bromide (0.5 μg / ml). The correctness of the open reading frames of the EctoS_SC2 transgene was confirmed by Sanger sequencing of the target amplicons eluted from the agarose gel.
Наличие и функциональная активность гена G, кодирующего поверхностный гликопротеин вируса везикулярного стоматита подтверждается секвенированием ампликонов трансгена по Сэнгеру, а также репродукцией рекомбинантного вируса в пермиссивных клеточных линиях (Vero, 4647, BHK-21/13 и т.д.) с культуральными свойствами, аналогичными «дикому типу» ВВС.The presence and functional activity of the G gene encoding the surface glycoprotein of the vesicular stomatitis virus is confirmed by sequencing of the transgene amplicons according to Sanger, as well as the reproduction of the recombinant virus in permissive cell lines (Vero, 4647, BHK-21/13, etc.) with cultural properties similar to To the "wild type" of the Air Force.
Дизайн и экспериментальные исследования штамма rVSV-EctoS_SC2 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, экспрессирующего антиген коронавируса SARS-CoV-2, и индуцирующего специфический иммунный ответ к SARS-CoV-2, а также иммуногенной композиции на его основе показывают возможность их использования в качестве кандидатного вакцинного препарата против коронавирусной инфекции COVID-19 (SARS-CoV-2). Вакцинные композиции могут включать приемлемые адъюванты, стабилизаторы, наполнители и заявляемый штамм рекомбинантного везикулярного стоматита, экспрессирующего антигены коронавируса SARS-CoV-2.Design and experimental studies of the rVSV-EctoS_SC2 strain of the recombinant vesicular stomatitis virus expressing the SARS-CoV-2 coronavirus antigen and inducing a specific immune response to SARS-CoV-2, as well as an immunogenic composition based on it, show the possibility of their use as a candidate vaccine preparation against coronavirus infection COVID-19 (SARS-CoV-2). The vaccine compositions may include suitable adjuvants, stabilizers, excipients, and the claimed strain of recombinant vesicular stomatitis expressing SARS-CoV-2 coronavirus antigens.
--->--->
Перечень последовательностейSequence listing
<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора)<110> Federal Budgetary Institution of Science "State Scientific Center of Virology and Biotechnology" Vector "of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Welfare (FBSI SSC VB" Vector "of Rospotrebnadzor)
<120> Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемого для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2<120> Artificial gene EctoS_SC2, encoding ectodomain of glycoprotein S of SARS-CoV-2 coronavirus with C-terminal trimerizing domain, recombinant plasmid pStem-rVSV-EctoS_SC2, providing expression of artificial gene and recombinant strain of stomatitis virus rSC2 against SARS-CoV-2 coronavirus
<160> SEQ ID NO 2<160> SEQ ID NO 2
<210> SEQ ID NO:1<210> SEQ ID NO: 1
<211> 3723<211> 3723
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220> <220>
<223> Нуклеотидная последовательность искусственного гена, кодирующая искусственный белок-иммуноген, представляющий собой эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом.<223> Nucleotide sequence of an artificial gene encoding an artificial immunogen protein, which is an ectodomain of the glycoprotein S of the SARS-CoV-2 coronavirus with a C-terminal trimerizing domain.
<400> 1<400> 1
ATGTTCGTGTTTCTGGTGCTGCTGCCTCTGGTGTCCAGCCAGTGTGTGAACCTGA 55
CCACAAGAACCCAGCTGCCTCCAGCCTACACCAACAGCTTTACCAGAGGCGTGTA 110
CTACCCCGACAAGGTGTTCAGATCCAGCGTGCTGCACTCTACCCAGGACCTGTTC 165
CTGCCTTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCCACGTGTCCGGCACCA 220
ATGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGGGTGTACTT 275
TGCCAGCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACACTG 330
GACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTCATCA 385
AAGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTCTACTATCACAA 440
GAACAACAAGAGCTGGATGGAAAGCGAGTTCCGGGTGTACAGCAGCGCCAACAAC 495
TGCACCTTCGAGTACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAGCAGG 550
GCAACTTCAAGAACCTGCGCGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAA 605
GATCTACAGCAAGCACACCCCTATCAACCTCGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTC 660
TCTGCTCTGGAACCCCTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTC 715
AGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCTGGCGATAGCAGCAGCGG 770
ATGGACAGCTGGTGCCGCCGCTTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTC 825
CTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGATTGTGCTCTGG 880
ATCCTCTGAGCGAGACAAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACCGTGGAAAAGGGCAT 935
CTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCC 990
AATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCT 1045
CTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGT 1100
GCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACC 1155
AAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGG 1210
GAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAA 1265
CTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAAC 1320
CTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGT 1375
CCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAG 1430
CACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTAC 1485
GGCTTTCAGCCCACAAATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGA 1540
GCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAA 1595
TCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGC 1650
GTGCTGACAGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAGCAGTTTGGCCGGGATA 1705
TCGCCGATACCACAGACGCCGTTAGAGATCCCCAGACACTGGAAATCCTGGACAT 1760
CACCCCTTGCAGCTTCGGCGGAGTGTCTGTGATCACCCCTGGCACCAACACCAGC 1815
AATCAGGTGGCAGTGCTGTACCAGGACGTGAACTGTACCGAAGTGCCCGTGGCCA 1870
TTCACGCCGATCAGCTGACACCTACATGGCGGGTGTACTCCACCGGCAGCAATGT 1925TTCACGCCGATCAGCTGACACCTACATGGCGGGTGTACTCCACCGGCAGCAATGT 1925
GTTTCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGAGCCGAGCACGTGAACAATAGCTAC 1980GTTTCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGAGCCGAGCACGTGAACAATAGCTAC 1980
GAGTGCGACATCCCCATCGGCGCTGGCATCTGTGCCAGCTACCAGACACAGACAA 2035 GAGTGCGACATCCCCATCGGCGCTGGCATCTGTGCCAGCTACCAGACACAGACAA 2035
ACAGCCCCAGACGGGCCAGATCTGTGGCCAGCCAGAGCATCATTGCCTACACAAT 2090
GTCTCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACTCCAACAACTCTATCGCTATCCCC 2145
ACCAACTTCACCATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGTCCATGACCAAGA 2200
CCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGATTCCACCGAGTGCTCCAACCT 2255
GCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGGATC 2310
GCCGTGGAACAGGACAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCT 2365
ACAAGACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAATTTCAGCCAGATTCTGCC 2420
CGATCCTAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAA 2475
GTGACACTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGATTGTCTGGGCGACA 2530
TTGCCGCCAGGGATCTGATTTGCGCCCAGAAGTTTAACGGACTGACAGTGCTGCC 2585
ACCACTGCTGACCGATGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCCGGC 2640
ACAATCACAAGCGGCTGGACATTTGGAGCTGGCGCCGCTCTGCAGATCCCCTTTG 2695
CTATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGAGTGACCCAGAATGTGCTGTA 2750
CGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAG 2805
GACAGCCTGAGCAGCACAGCAAGCGCCCTGGGAAAGCTGCAGGACGTGGTCAACC 2860
AGAATGCCCAGGCACTGAACACCCTGGTCAAGCAGCTGTCCTCCAACTTCGGCGC 2915
CATCAGCTCTGTGCTGAACGATATCCTGAGCAGACTGGACAAGGTGGAAGCCGAG 2970
GTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGGCTGCAGTCCCTGCAGACCTACGTTA 3025
CCCAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGAGATTAGAGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCAC 3080
CAAGATGTCTGAGTGTGTGCTGGGCCAGAGCAAGAGAGTGGACTTTTGCGGCAAG 3135
GGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCCCCTCACGGCGTGGTGTTTCTGC 3190
ACGTGACATACGTGCCCGCTCAAGAGAAGAATTTCACCACCGCTCCAGCCATCTG 3245
CCACGACGGCAAAGCCCACTTTCCTAGAGAAGGCGTGTTCGTGTCCAACGGCACC 3300
CATTGGTTCGTGACCCAGCGGAACTTCTACGAGCCCCAGATCATCACCACCGACA 3355
ACACCTTCGTGTCTGGCAACTGCGACGTCGTGATCGGCATTGTGAACAATACCGT 3410
GTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTAC 3465
TTTAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGATATCAGCGGAATCAATG 3520
CCAGCGTCGTGAACATCCAGAAAGAGATCGACCGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAA 3575
TCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGGAAGGGCAGCGGCTCTGGC 3630
GGAGGCTACATTCCCGAGGCTCCTAGAGATGGCCAGGCTTACGTTAGAAAGGACG 3685
GCGAATGGGTGCTGCTGAGCACATTTCTCGGAGGCTGA 3723
<210> SEQ ID NO:2<210> SEQ ID NO: 2
<211> 1240<211> 1240
<212> PRT<212> PRT
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220> <220>
<223> Аминокислотная последовательность секретируемого эктодомена гликопротеина S (Spike) коронавируса SARS-CoV-2 c С-концевым тримеризующим доменом, обеспечивающим независимый синтез коронавирусного антигена.<223> Amino acid sequence of the secreted ectodomain of the glycoprotein S (Spike) of the SARS-CoV-2 coronavirus with a C-terminal trimerizing domain providing independent synthesis of the coronavirus antigen.
<400> 2<400> 2
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLF 55
LPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTL 110
DSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANN 165
CTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGF 220
SALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTF 275
LLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFP 330
NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPT 385
KLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNN 440
LDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSY 495
GFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTG 550
VLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTS 605
NQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSY 660
ECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIP 715
TNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGI 770
AVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNK 825
VTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAG 880
TITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQ 935
DSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAE 990
VQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGK 1045
GYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGT 1100
HWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKY 1155
FKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKGSGSG 1210
GGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGG* 1240 GGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGG * 1240
<---<---
Claims (15)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020125810A RU2733834C1 (en) | 2020-07-28 | 2020-07-28 | Artificial ectos_sc2 gene encoding an ectodomain of the sars-cov-2 coronavirus s glycoprotein with a c-terminal trimerization domain, a recombinant plasmid pstem-rvsv-ectos_sc2, which provides expression of the artificial gene, and a recombinant strain of vesicular stomatitis virus rvsv-ectos_sc2, used to create a vaccine against sars-cov-2 coronavirus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020125810A RU2733834C1 (en) | 2020-07-28 | 2020-07-28 | Artificial ectos_sc2 gene encoding an ectodomain of the sars-cov-2 coronavirus s glycoprotein with a c-terminal trimerization domain, a recombinant plasmid pstem-rvsv-ectos_sc2, which provides expression of the artificial gene, and a recombinant strain of vesicular stomatitis virus rvsv-ectos_sc2, used to create a vaccine against sars-cov-2 coronavirus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2733834C1 true RU2733834C1 (en) | 2020-10-07 |
Family
ID=72927167
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020125810A RU2733834C1 (en) | 2020-07-28 | 2020-07-28 | Artificial ectos_sc2 gene encoding an ectodomain of the sars-cov-2 coronavirus s glycoprotein with a c-terminal trimerization domain, a recombinant plasmid pstem-rvsv-ectos_sc2, which provides expression of the artificial gene, and a recombinant strain of vesicular stomatitis virus rvsv-ectos_sc2, used to create a vaccine against sars-cov-2 coronavirus |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2733834C1 (en) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2738081C1 (en) * | 2020-10-14 | 2020-12-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Peptide immunogens and a vaccine composition against coronavirus infection covid-19 using peptide immunogens |
| RU2743962C1 (en) * | 2021-02-10 | 2021-03-01 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome coronavirus (sars-cov-2) in lyophilized form (versions) |
| RU2743963C1 (en) * | 2021-02-09 | 2021-03-01 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome coronavirus (sars-cov-2) in liquid form (versions) |
| RU2744274C1 (en) * | 2020-11-20 | 2021-03-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Monoclonal antibody to rdb fragment in composition of sars-cov-2 s protein |
| RU2745626C1 (en) * | 2020-12-05 | 2021-03-29 | Суворов Александр Николаевич | Method of creating a live vaccine against covid-19 based on the probiotic strain enterococcus faecium l3 and a live vaccine enterococcus faecium l3-pentf-covid-19 |
| RU2761879C1 (en) * | 2021-07-27 | 2021-12-13 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | VACCINE BASED ON AAV5 FOR THE INDUCTION OF SPECIFIC IMMUNITY TO THE SARS-CoV-2 VIRUS AND/OR THE PREVENTION OF CORONAVIRUS INFECTION CAUSED BY SARS-CoV-2 |
| RU2762962C1 (en) * | 2021-05-20 | 2021-12-24 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | ARTIFICIAL GENE N1NEW, ENCODING NUCLEOCAPSID PROTEIN OF CORONAVIRUS SARS-CoV-2, AND RECOMBINANT PLASMID PET-28A-N1NEW, PROVIDING EXPRESSION OF THE ARTIFICIAL GENE |
| CN114349868A (en) * | 2020-12-01 | 2022-04-15 | 中国医学科学院基础医学研究所 | Novel coronavirus S protein receptor binding domain fusion protein containing oligomerization structural domain and application thereof |
| RU2772905C1 (en) * | 2021-12-13 | 2022-05-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ЭС ДЖИ" (ООО "ЭС ДЖИ") | Recombinant plasmid pvbl-rbdomik providing synthesis and secretion of the recombinant receptor-binding domain (rbd) of the sars-cov-2 coronavirus line b.1.1.529 in mammalian cells. |
| US11547673B1 (en) | 2020-04-22 | 2023-01-10 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
| US11878055B1 (en) | 2022-06-26 | 2024-01-23 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110974950A (en) * | 2020-03-05 | 2020-04-10 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | Adenovirus vector vaccine for preventing SARS-CoV-2 infection |
| RU2720614C1 (en) * | 2020-04-23 | 2020-05-12 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Immunobiological agent and method of use thereof for inducing specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 (embodiments) |
| RU2723008C1 (en) * | 2020-05-19 | 2020-06-08 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for producing Chinese hamster ovary cell strain, being a producer of recombinant SARS-CoV-2 virus protein RBD, Chinese hamster ovary cell strain, producer of recombinant SARS-CoV-2 protein RBD, method for producing recombinant SARS-CoV-2 virus protein RBD, test system for enzyme immunoassay of human serum or plasma, and use thereof |
| CN111358953A (en) * | 2020-03-25 | 2020-07-03 | 上海市公共卫生临床中心 | Vaccine vector for efficiently inducing humoral immune response of organism, preparation method and application thereof |
-
2020
- 2020-07-28 RU RU2020125810A patent/RU2733834C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110974950A (en) * | 2020-03-05 | 2020-04-10 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | Adenovirus vector vaccine for preventing SARS-CoV-2 infection |
| CN111358953A (en) * | 2020-03-25 | 2020-07-03 | 上海市公共卫生临床中心 | Vaccine vector for efficiently inducing humoral immune response of organism, preparation method and application thereof |
| RU2720614C1 (en) * | 2020-04-23 | 2020-05-12 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Immunobiological agent and method of use thereof for inducing specific immunity against the severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 (embodiments) |
| RU2723008C1 (en) * | 2020-05-19 | 2020-06-08 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for producing Chinese hamster ovary cell strain, being a producer of recombinant SARS-CoV-2 virus protein RBD, Chinese hamster ovary cell strain, producer of recombinant SARS-CoV-2 protein RBD, method for producing recombinant SARS-CoV-2 virus protein RBD, test system for enzyme immunoassay of human serum or plasma, and use thereof |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Data Basa GenBank: MT380725.1 27.04.2020 Найдено в интернет [найдено 22.09.2020]. * |
| Data Basa GenBank: MT380725.1 27.04.2020 Найдено в интернет [найдено 22.09.2020]. Data Basa GenPept: PDB: 7BYR_APDB: 7BYR_A 22.07.2020 Найдено в интернет [найдено 22.09.2020]. * |
| Data Basa GenPept: PDB: 7BYR_APDB: 7BYR_A 22.07.2020 Найдено в интернет [найдено 22.09.2020]. * |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11925694B2 (en) | 2020-04-22 | 2024-03-12 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
| US11547673B1 (en) | 2020-04-22 | 2023-01-10 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
| RU2783313C1 (en) * | 2020-08-28 | 2022-11-11 | Акционерное общество "БИОКАД" | VACCINE BASED ON AAV5 FOR INDUCTION OF SPECIFIC IMMUNITY TO SARS-CoV-2 VIRUS AND/OR PREVENTION OF CORONAVIRUS INFECTION CAUSED BY SARS-CoV-2 |
| WO2022081042A1 (en) * | 2020-10-14 | 2022-04-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Vaccine composition against coronavirus covid-19 infection |
| RU2738081C1 (en) * | 2020-10-14 | 2020-12-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Peptide immunogens and a vaccine composition against coronavirus infection covid-19 using peptide immunogens |
| RU2744274C1 (en) * | 2020-11-20 | 2021-03-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Monoclonal antibody to rdb fragment in composition of sars-cov-2 s protein |
| CN114349868B (en) * | 2020-12-01 | 2023-12-08 | 中国医学科学院基础医学研究所 | Novel coronavirus S protein receptor binding domain fusion protein containing oligomerization structural domain and application thereof |
| CN114349868A (en) * | 2020-12-01 | 2022-04-15 | 中国医学科学院基础医学研究所 | Novel coronavirus S protein receptor binding domain fusion protein containing oligomerization structural domain and application thereof |
| RU2745626C1 (en) * | 2020-12-05 | 2021-03-29 | Суворов Александр Николаевич | Method of creating a live vaccine against covid-19 based on the probiotic strain enterococcus faecium l3 and a live vaccine enterococcus faecium l3-pentf-covid-19 |
| RU2743963C1 (en) * | 2021-02-09 | 2021-03-01 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome coronavirus (sars-cov-2) in liquid form (versions) |
| RU2743962C1 (en) * | 2021-02-10 | 2021-03-01 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome coronavirus (sars-cov-2) in lyophilized form (versions) |
| WO2022245258A1 (en) * | 2021-05-20 | 2022-11-24 | Федеральное Государственное Унитарное Предприятие "Санкт-Петербургский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток И Предприятие По Производству Бактерийных Препаратов" Федерального Медико- Биологического Агентства | Artificial gene n1new for encoding the nucleocapsid protein of the coronavirus sars-cov-2, and recombinant plasmid pet-28a-n1new for expressing said artificial gene |
| RU2762962C1 (en) * | 2021-05-20 | 2021-12-24 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | ARTIFICIAL GENE N1NEW, ENCODING NUCLEOCAPSID PROTEIN OF CORONAVIRUS SARS-CoV-2, AND RECOMBINANT PLASMID PET-28A-N1NEW, PROVIDING EXPRESSION OF THE ARTIFICIAL GENE |
| RU2776484C1 (en) * | 2021-07-02 | 2022-07-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины" (ФГБНУ "ИЭМ") | Recombinant dna ensuring production of the recombinant protein cov1 exhibiting immunogenic properties against sars-cov-2 virus |
| RU2761879C1 (en) * | 2021-07-27 | 2021-12-13 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | VACCINE BASED ON AAV5 FOR THE INDUCTION OF SPECIFIC IMMUNITY TO THE SARS-CoV-2 VIRUS AND/OR THE PREVENTION OF CORONAVIRUS INFECTION CAUSED BY SARS-CoV-2 |
| RU2772904C1 (en) * | 2021-12-13 | 2022-05-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ЭС ДЖИ" (ООО "ЭС ДЖИ") | Recombinant plasmid pvbl-rbddelta providing synthesis and secretion of the recombinant receptor-binding domain (rbd) of the sars-cov-2 coronavirus line b.1.617.2 in mammalian cells |
| RU2772905C1 (en) * | 2021-12-13 | 2022-05-26 | Общество с ограниченной ответственностью "ЭС ДЖИ" (ООО "ЭС ДЖИ") | Recombinant plasmid pvbl-rbdomik providing synthesis and secretion of the recombinant receptor-binding domain (rbd) of the sars-cov-2 coronavirus line b.1.1.529 in mammalian cells. |
| RU2784655C1 (en) * | 2021-12-31 | 2022-11-29 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | METHOD FOR DETERMINING THE ACTIVITY OF NEUTRALISING ANTIBODIES AGAINST SARS-CoV-2 IN THE SERUM OR PLASMA OF PEOPLE WITH PAST CASES OF COVID-19 OR VACCINATED WITH PREVENTIVE VACCINES AGAINST THE NOVEL CORONAVIRUS INFECTION COVID-19 USING A SET OF ENZYME IMMUNOASSAY REAGENTS CONTAINING A RECOMBINANT RECEPTOR-BINDING DOMAIN (RBD) OF SURFACE GLYCOPROTEIN S OF CORONAVIRUS SARS-CoV-2 AND RECOMBINANT HUMAN RECEPTOR ACE2 |
| US11878055B1 (en) | 2022-06-26 | 2024-01-23 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2733834C1 (en) | Artificial ectos_sc2 gene encoding an ectodomain of the sars-cov-2 coronavirus s glycoprotein with a c-terminal trimerization domain, a recombinant plasmid pstem-rvsv-ectos_sc2, which provides expression of the artificial gene, and a recombinant strain of vesicular stomatitis virus rvsv-ectos_sc2, used to create a vaccine against sars-cov-2 coronavirus | |
| RU2733832C1 (en) | Artificial gene stbl_rbd_trm_sc2, coding a bicistronic structure formed by the sars-cov-2 coronavirus glycoprotein s receptor-binding domain sequences, transmembrane region, p2a-peptide and glycoprotein g vsv, recombinant plasmid pstem-rvsv-stbl_rbd_trm_sc2, providing expression of artificial gene, and a recombinant strain of vesicular stomatitis virus rvsv-stbl_rbd_trm_sc2, used to create a vaccine against sars-cov-2 coronavirus | |
| CN112618707B (en) | SARS-CoV-2 coronavirus vaccine and its preparation method | |
| CN107921117B (en) | HPV vaccine | |
| Weiss et al. | Coronavirus pathogenesis | |
| von Messling et al. | The hemagglutinin of canine distemper virus determines tropism and cytopathogenicity | |
| RU2733831C1 (en) | Artificial gene coding a bicistronic structure formed by receptor-binding domain sequences of the glycoprotein s of the sars-cov-2 coronavirus, p2a-peptide and glycoprotein g vsv, recombinant plasmid pstem-rvsv-stbl_rbd_sc2, providing expression of artificial gene, and a recombinant strain of vesicular stomatitis virus rvsv-stbl_rbd_sc2, used to create a vaccine against sars-cov-2 coronavirus | |
| KR101279636B1 (en) | Replication-deficient RNA viruses as vaccines | |
| KR20220154114A (en) | Vaccines and their use for inducing an immune response against SARS-CoV2 | |
| AU2020244533B2 (en) | Recombinant RSV with silent mutations, vaccines, and methods related thereto | |
| CN115058452A (en) | CMV vaccines | |
| Dhanwani et al. | Recombinant tri-segmented pichinde virus as a novel live viral vaccine platform | |
| JP2004531232A (en) | Influenza virus with enhanced transcription and replication capabilities | |
| CN113430178B (en) | Recombinant influenza virus strain expressing II type herpes simplex virus protein and preparation method and application thereof | |
| KR950001993B1 (en) | Production of specific polypeptide in virally infected insect cells | |
| CN111479926A (en) | Simian adenovirus vector with two expression cassettes | |
| CN110951778B (en) | CDV-3 strain infectious cDNA clone of canine distemper virus, construction method and application thereof | |
| US20080267992A1 (en) | Sars Virus Vaccine with Adenovirus Carrier and Preparation Method Thereof, and Use of Sars Virus S Gene for Preparation of Vaccine | |
| Karlsson et al. | Live viral vectors: Semliki Forest virus | |
| US20230331782A1 (en) | Compositions and Methods for Reducing Risk of Vaccine-Enhanced Disease | |
| JP2011507515A (en) | Method for packaging a reproduction-deficient vesicular stomatitis virus vector | |
| RU2326943C1 (en) | Method of preparation of recombinant adenovirus of birds for vaccination against birds flu virus h5n1 | |
| Mühlebach et al. | Development of Entry-Targeted Oncolytic Measles Viruses | |
| JP2005065596A (en) | Proliferation potency-deficient rabies virus | |
| WO2001019968A1 (en) | Recombinant eggs and gene cloning and expression vectors based on avian adenoviruses |