JPH03191777A - 核酸の生物学的不活性化法 - Google Patents
核酸の生物学的不活性化法Info
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Abstract
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Description
生物により汚染されている物質(残留発酵液、水洗液な
ど)は容器に集められ天然の細菌、酵母又は腐生性カビ
による自己消化及び/又は計画的汚染により分解される
。
タンパク質、多糖類、抗生物質、アミノ酸、ビタミン、
アルコール)を得るため使用が増加している。現在では
異種生物中でタンパク質を生成させることが分子生物学
的技術により可能である。この関係で微生物、植物、動
物及びヒト遺伝子を各々の場合能の宿主細胞で発現する
ことが可能である。今日タンパク質合成のため圧倒的に
使用されているのはエシェリキア・コリ(Escher
ichia coli)、バチルス・サブチリス(Ba
cillus 5ubtilis)及びストレプトミセ
ス・リビダンス(Streptow+yces 1iv
idans)のような細菌及びサツカロミセス・セレビ
シェ−(Saccharo+ayces cerevi
siae) 、ピキア・パストリス(pichiB p
astoris)及びクルイ7エロミセス・ラクチス(
K1uyveroo+yces 1actis)のよう
な酵母である。しかしながら動物細胞、例えばモルモッ
ト卵細胞(CHO細胞〕、マウス細胞例えば(C127
i細胞〕及びヒト細胞も異種遺伝子発現に使用される。
らこれらにより近代的制御技術により合成を制御するこ
とができるからである。生成物は細胞から得られるか又
は培養液中に分泌される。
して天然及び同種核酸(DNAとRNA)のみならず、
宿主細胞のゲノムに組み込まれた組換えプラスミドDN
A又は外来DNAを含むことがすべての製造法に共通し
ている。これまでこの組み換えDNAの環境への放出の
可能な危険性を評価することは困難を伴ってのみ可能で
あった。
の国の関係当局上施設(例えば、ドイツ連邦共和国、ベ
ルリン連邦保険局、生物学的安全性に関する中央委員会
(ZKBS) (FederalRepublic
or Germany the Centra
l Co+uaitteefor Blologic
al 5afety(ZKBS)of the Fed
eralBoard of Health in Be
rlin))から発されており、それは環境への可能性
のある危険に対する予防措置として通常は液体である廃
棄物質、従って製造工程の後に存在する核酸のすべての
不活性化を求めている。
きる。これは大量のエネルギーを必要とし、従って経費
的に厳しい方法である。
パーカルボン酸、アルカリ金属過酸化物又はアルカリ金
属パーオキソモノスルフェートの存在下で加熱処理する
ことにより化学的に不活性化する方法を提言している。
法も他の化学的方法もいずれも使用者の健康に潜在的な
危険を与え、及び/又は残留する最終生成物は環境に有
害であるという欠点を持つ。両方法において、適当な化
学物質の添加により比較的低い温度(例えば80℃)で
核酸の完全な不活性化を達成することが可能である。
供する。これらの方法は有効であり、費用効率的であり
環境的に受諾可能である。それらは特異的酵素(ヌクレ
アーゼ、すなわちDNアーゼ及びRNアーゼ)による核
酸の分解、及びこれらの酵素の特に培養液又は廃水に存
在するか又は添加した微生物による形成に基づく。
含む)を動物細胞の溶解により放出することができる発
酵液と廃水を用いて実施した。
水洗液など)を容器に集め、室温で撹拌しながらある時
間計画的にインキュベートする方法が記述されている。
物分泌による放出)は組換えプラスミドDNAを含むD
NAを短時間に完全に分解することができる。廃水捕集
容器を不完全にからにすることは微生物群がそれらの構
成を保持することを意味する。それらは容器を再び廃水
で満たした場合、廃水が利用可能なエネルギー源例えば
DNAを含んでいると更に増殖してDNアーゼを分泌す
ることができる。
はヌクレアーゼにより完全に分解され、廃水の加熱又は
化学的不活性化を必要としない。又、微生物は廃水捕集
容器から組換えDNAを取り込まず、従ってDNアーゼ
活性の不存在下では廃水中で必然的に安定な組換えDN
Aは上述の微生物中で発現も複製もしないことも認め
tこ 。
素導入、培養液の撹拌及び他の手段のような通常の発酵
条件を伴わなくても起こる。
実現するため、廃水を例えば通常の室温より高い温度で
発酵させることが可能である。
水外で増殖させ、濃縮した形で廃水に添加してインキュ
ベーション段階前にDNアーゼ活性を増加させることも
できる。
ーン化し、更に所望の生成物に発現させて、生産工程の
間にもDNアーゼを形成させ分泌させて、次いで培養液
法に廃水中の遊離DNAを分解することも可能である。
ある。この方法においては、DNアーゼを遊離のタンパ
ク質分子として、又は別の担体物質もしくは微小担体の
いずれかに結合させた固定化酵素として適用することが
でき、それら自身を細胞発酵に使用することができる。
半減期、基質特異性、至適pHなどの点で種々な性質を
持つ広範囲のスペクトルのDNアーゼが核酸分解のため
存在することを可能にする。
素的分解は核酸不活性化の物理的又は化学的方法を上回
る利点を持つ。これらの方法は薬剤を使用する人と環境
に対して受入れられない薬剤を必要としない。これらの
方法はかなり経費効率がよく、労働集約的な点がより少
なく、妨害の影響をより受けにくく、また作業者の保護
の点で例えば加熱特に高圧加熱による核酸の不活性化よ
りかなり信頼性が高い。微生物は組換えDNAを取り込
むことがなく、従って組換えDNAの複製又は発現のい
ずれも起こることがない。反対に、組換えDNAは完全
に代謝される。すなわち組換えDNAはこの方法により
その微生物群組成が通常のバイオトープ又は浄化プラン
トのバイオマスと本質的に異ならない天然のバイオマス
に変換される。
るRNアーゼ及び/又はDNアーゼに露出することから
なる核酸を不活性化する方法に関する。好ましい方法で
は無菌条件下で発酵中に放出されるヌクレアーゼ及び/
又は非無菌的条件下で発酵後に微生物により放出される
ヌクレアーゼを使用する。特に好ましい方法では精製し
たヌクレアーゼ又はヌクレアーゼ放出微生物、特にブタ
ペスト条約により第DSM 5650号としてジャーマ
ン・ミクロオルガニズム・コレクション(German
Microorganism Co11ection
)に寄託されている腐生性カビAW 13の添加を伴う
。
o+oyces l1lacinus)と同定された上
述の腐生性カビAW 13自身に関し、前記カビはその
種の他の核酸分泌株も含む。
通常の製造プラントに関する。「古典的」原理に基づく
製造プラントは発酵槽、廃水捕集槽及び殺菌プラントか
らなる。発酵液中の細胞成分と担体物質は沈降により分
離する。次いで上澄液を抜き出し、濾過して清澄にする
。
製工程にかけ、一方面体成分、すなわちフィルターの細
胞と担体残渣を焼却により廃棄する。精製工程からの廃
液は廃液捕集槽に移送する。培養液を抜き出した後細胞
と担体沈降物は水道水と共に排出し、廃液捕集槽に移送
する。次いで発酵槽を水道水で満たし、120℃に20
分間加熱する。80℃に冷却後、この水を同様に廃液捕
集槽に移送する。発酵槽を更に洗浄することにより発生
する追加の廃液は同様に廃液捕集槽に移送する。このよ
うにして廃液捕集槽中の廃液はEPO精製工程及び発酵
槽の洗浄による廃液で構成される。発酵槽の洗浄に水道
水を使用しているのですべての廃水混合物は動物細胞に
とって非生理的な状態を示す。廃水捕集槽中の液体が特
定の水準まで到達すると廃水を30分間撹拌し、次いで
殺菌槽にポンプ移送する。
に保つ。次いで不活性化しI;廃水を80℃に冷却し、
次に10倍量の水道水と混合し、下水道に廃棄する。
DNAの分解 動物細胞の発酵中連続的な細胞の死があり、その結果核
酸とタンパク質が放出される。組換えDNAを使用する
製造工程において、発酵中及び発酵後の組換えDNAの
所在を監視することが重要である。本発明者等はpCE
SプラスミドDNA(欧州特許願第267678号参照
)を含み、EPOを生産するマウスセルライン3T1の
発酵の培養上澄液中のDNA含量は極めて低い(< 1
100p/ l112)ことを見出した。更に研究した
結果、これらの細胞の発酵の培養上澄液はDNアーゼ活
性を含むことが明らかになった。天然のDNアーゼ活性
は極めて高いので、培養上澄液中のlθμ9・pCES
DNA/m12が室温で6時間のインキュベーション後
完全に分解されることが可能であった(図参照)。これ
がサザンプロットハイプリダイゼーションにより培養上
澄液中にさえ大きさが14.3kbのpCESプラスミ
ド分子も他のより小さい断片も検出されなかった理由で
ある。
た発酵プラントから発生するすべての廃水は、現在法令
と当局の要求により廃水補集槽に集め、次いで不活性化
プラントで高圧加熱する。これには補集槽の約30%又
はそれ以上が満たされた後、毎時最小の時間範囲で高圧
殺菌用殺菌プラントにポンプ輸送することが必要である
。しかしながら、補集槽は不完全にしかからにならず、
廃水の約lθ〜20%が残留する。次いでこの廃水は導
入される新しい廃水と混合される。発酵の培養上澄液に
おける(実施例1参照)と同様なりNA分解試験を廃水
補集槽の試料についても実施した。再び、各々の場合に
おいて少なくともlOμ9のDNA/rtrQ/6時間
のDNアーゼ活性が認められた。
能のあるE、 coli細菌中の形質転換能に激しい
減少が認められ(2XIO″クロ一ン/μg・DNA)
、廃水の組成により完全に除くことができる(表参照)
。
り、細胞から放出することができる。
相当する。
阻害することができる。EDTAは液体のDNアーゼの
生物学的活性に必須の二価荷電イオンを捕獲してキレー
トを形成する。このことがEDTAが存在しても例えば
M g 2+及びZn”+の濃度が十分であることに注
意しなければならない理由である。
Aを単離し分析した。DNAが細胞タンパク質により比
較的保護される断片中においても、断片のみが検出され
、完全なpcEsプラスミド分子を検出することはでき
なかった。
いので、廃水中の微生物の蓄積の可能性を研究した。3
0℃でLB寒天でインキュベーションした場合微生物数
(コロニー形成単位)は10s/rtrQであり、測定
可能な微生物数はYPD寒天でl O’ / ra (
l及びYNB寒天で10”であることが認められた。
動するが、先きに測定した値は廃水中の有機物質が貧弱
な培養条件下(無撹拌、無通気)でかつ洗浄剤添加の場
合においてもかなりの微生物が確実に増殖するために十
分であることを示した。
製することが可能か否かを研究した。
ってもpCESプラスミド又はその断片が検出されなか
った。
次にDNアーゼを分泌することができる微生物の廃水か
らの分離を試みた。廃水の0.01.0.05及び0.
1tiQをへらでLB寒天(混合物1)とYPD寒天(
混合物2)に塗り広げ、30℃にインキュベートした。
培地中で廃水からDNアーゼ活性を持つ微生物を蓄積す
る試みも行った。
h H,0を添加してlooOmQにする LB培地 トリプトン 10g 酵母エキス 5g NaCa 5g Hloを添加して1000鱈にする YPD培地 ペプトン 209 酵母エキス 109 グルコース 2h H,Oを添加して10100Oにする このDNA培地を1raQの廃水と混合し、30℃で4
日間インキュベートした。培地は混濁し、顕微鏡下で種
々の微生物が確認された。この混合物から0.Ol及び
0.05m<2の試料を除き、LB寒天にへらで塗り広
げた(混合物3)。すべての混合物で微生物を分離し、
それを純粋培養とすることができた。
3、AW4、AW5、AW8、AW9混合物2 (YP
D寒天):AWlo、AWII%AW12、AW13混
合物3 (DNA培地):AW6、AW7実施例 4 純粋培養にした7つの微生物の確認 風なるコロニーモルフオオロジーと色を持つ13の微生
物を純粋培養にした。それらのすべてはYPD又はLB
培地の寒天平板上で発育した。分離株AWIOは黒い気
菌糸のカビであり、YPD及びLB液体培養で発育せず
、それ以上研究しなかった。分離株AVlSAW2、A
W4、AW6及びAW 12は最初に研究した後、それ
らが明らかに種々な培地で発育する際DNアーゼを分泌
しなかったので廃棄した。分離株AW3は同様に液体培
養でDNアーゼを分泌しなかったが、ネガチブ対照とし
て以後の実験に含めた。
黄色 AW5 : 無色 AW7 : 白色、光沢あり AW8 : オレンジ色 AWII: ベージュ色 YPD培地に30℃で発育した一分離株の光学顕微鏡A
W3 :細菌、球菌様、細胞は凝集してクラスターとな
る 実験A: 培養上澄液 0−Oh(2 により中鎖を形成、分岐形態もとる AW7 :細菌、球菌様、生育してクラスターになり、
AW3とAW5より大 AW8 :細菌、球形ないし卵形細胞、増殖してクラス
ター形成 AWII:大きい酵母状細胞、円形、単一又は二連、分
岐せず 実施例 5 分泌したDNアーゼの検出 300瀧(+のエルレンマイヤーフラスコ中で30肩a
のLB培地又はYPD培地に8つの分離株を植菌し、3
0℃、120rpn+でインキュベートした。70時間
インキュベーション後、細胞を遠心沈殿し、上澄液のD
NA活性を測定した。
1m12実験B: 培養上澄液 0
−08m12ラムダDNA(0,5it9/m(2)
0.015m<20.03iti2の試料を0
,6.10及び16時間後採取し、0.005m(lの
5TOP混液(100■M EDTA、 20%シュク
ロース、指示1c七してブロモフェノールブルー)と混
合し、−20℃で凍結し、次いで0.8%アガロースゲ
ルで90Vで3時間分画した(実験A)、実験Bでは分
析用試料を0.8及び24時間後に採取した。
、AW8、All l及びAl113の培養上澄液で検
出された。ある場合、DNアーゼ活性はLB培地又はY
PD培地で培養した場合具なった。例えば、分離株AW
6はYPD培地で培養した場合LB培地で培養した場合
より多量のDNアーゼを分泌した。これとは反対に、分
離株8はLB培地で培養した場合の方がより多量のDN
アーゼを分泌した。一方、分離株AW3は上述の実験条
件でLB培地又はYPD培地のいずれで発育した場合も
DNアーゼ活性は検出されなかった。最高のDNアーゼ
活性は与えられた条件下で分離株AW13で検出された
。LB及びYPD培地でこの微生物は環状プラスミドD
NA及び線状ラムダDNAを短時間に完全に分解するこ
とができるDNアーゼ(一つ又は複数)を多量に分泌し
た。
株AW13はDNアーゼをYPD及びLB培地で発育す
る場合のみならず、EPOの生産で生成する廃水中でも
生産する。
レーブ殺菌し、50μQの2日培養のAW13培養(Y
PDで発育)を植菌した。24時間後と96時間後に1
m(2の培養液を除き、遠心分離し、上澄液のDNアー
ゼ活性をプラスミドDNAとラムダDNAを基質として
試験した。実験計画は実施例5に記述した通りである。
ンキュベートした。AW13が発育した廃水は高いDN
アーゼ活性を含んでいた。
胞の発酵プラントからの廃水中で室温で10μ9のpC
ES DNAをインキュベーションした後の1100p
と同等のDNAの形質転換 EDTA無添加で1分間 6100 13300
10800EDTA添加で1分間 6742
10020 9600EDTA無添加で6時間
10 2 134EDTA添加で6時
間 6100 6000 9000600 200 100 pCESプラスミドDNAのlOμ9の試料を1111
2の廃水に添加し、EDTA (2mM)添加又は無添
加で室温で1分間又は6時間インキュベートした。次い
でlOμQを除き、E、 coli DH5株の受容能
のある細菌中に形質転換した。種々な試料(1−4)は
異なる組成の廃水を異なる水準に満たした捕集槽から採
取した廃水に相当する。
槽た。次いで1OuQを除き、アガロースゲル上で分画
した。ゲルをニトロセルローズへプロットし、pCES
プラスミドの800塩基対(bp)の放射能ラベルした
断片をハイブリダイズし、次いで露出した。X線フィル
ムのシグナルを定量的に評価し、インキュベージタン時
間に対してプロットした。
スミドDNAを室温で捕集槽からの廃水中でインキュベ
ートした場合のpCESプラスミドDNAの経時的変化
を表すものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)自己消化及び/又は分泌により放出されるRNアー
ゼ及び/又はDNアーゼに露出することからなる核酸特
に組換え核酸の不活性化法。 2)無菌条件下で発酵中に放出されるRNアーゼ及び/
又はDNアーゼを使用する請求項1記載の方法。 3)非無菌条件下で発酵後微生物により放出されるRN
アーゼ及び/又はDNアーゼを使用する請求項1記載の
方法。 4)精製したRNアーゼ及び/又はDNアーゼを添加す
る請求項1記載の方法。 5)担体物質に固定化した精製したRNアーゼ及び/又
はDNアーゼを添加する請求項1記載の方法。 6)活性ヌクレアーゼは細胞培養に使用する微小担体に
固定化された酵素として含まれる請求項5記載の方法。 7)使用する遺伝的に変更した宿主細胞は発酵前ヌクレ
アーゼをコードする遺伝子で形質変換又はトランスフェ
クションされる請求項2記載の方法。 8)予め純粋培養し、外部で増殖したRNアーゼ及び/
又はDNアーゼ放出微生物を添加する請求項1記載の方
法。 9)寄託番号第DSM5650号の微生物AW13をD
Nアーゼ分泌のために使用する請求項8記載の方法。 10)ジャーマン・ミクロオルガニズム・コレクション
(GermanMicroorganismColle
ction)に第DSM5650号で寄託されている微
生物AW13。 11)核酸分解のためヌクレアーゼを分泌するペシロミ
セス・リラシヌス(Paecilomyceslila
cinus)株の使用。 12)核酸分解のためペシロミセス・リラシヌス株、特
にDSM5650株が分泌するヌクレアーゼの使用。
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