JPH03167287A - 水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法 - Google Patents
水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法Info
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- JPH03167287A JPH03167287A JP30729389A JP30729389A JPH03167287A JP H03167287 A JPH03167287 A JP H03167287A JP 30729389 A JP30729389 A JP 30729389A JP 30729389 A JP30729389 A JP 30729389A JP H03167287 A JPH03167287 A JP H03167287A
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、水溶性高分子化合物を共存させることを特徴
とするエクオリンの増感発光法に関する． ［従来の技術とその問題点］ 発光蛋白エクオリンは、発光オワンクラゲより単離され
たカルシウム結合蛋白質で、自然界においては蛋白部分
のアポエクオリンと、基質部分のセレンテラジンが、分
子状酸素を介して複合体を形成している．この複合体に
カルシウムが結合することにより発光する．この発光を
利用してカルシウム濃度を測定できる． 本発明者は組換えＤＮＡの手法を用いて、発光オワンク
ラゲより７ポエクオリンのｃＤＮ＾をクローニングし、
その一次構造を明らかにした（特開昭６１−１３５．５
８１１），次いで、とのｃＤＮ＾を利用して大腸菌を宿
主とし、その菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生
産に成功し（特開昭１１２−１７１，ＵＳ、特間昭６３
−１０２，８９５） 、その精製法を確立した（特開平
１ −１３２，３９７） ．さらに、機能遺伝子と結合
したエクオリン遺伝子を作製し、その融合蛋白質の生産
に戒功し（特開昭６４−３９，９９０，特願昭６３−３
０８．４２４）、その精製法を確立した （特願平１
−６９，８６２）．そして、これらのエクオリン及びそ
の融合蛋白を用いた金属検出法及び免疫測定法を開発し
た（特開昭８２−２８１ ．９４２、特願平１ −７４
，７４２）．本発明は、水溶性高分子化合物によるエク
オリンの増感発光法に関する報告である． ところで、エクオリンの有用性は当業者に周知であり、
エクオリンの発光を利用して、各種物質を検出すること
ができる，すなわち、免疫測定法やＤＮ＾ブロープ、バ
イオセンサーなどのあらゆる測定検出系に応用できるも
のであり、上述した機能から診断薬等の検査薬として有
用であることが予測される． 本発明者は上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果、
水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法を開
発することができた．以上の説明から明らかなように、
本発明の目的はエクオリンをより超高感度な測定法に応
用するための発光増感技術を堤供することである．
とするエクオリンの増感発光法に関する． ［従来の技術とその問題点］ 発光蛋白エクオリンは、発光オワンクラゲより単離され
たカルシウム結合蛋白質で、自然界においては蛋白部分
のアポエクオリンと、基質部分のセレンテラジンが、分
子状酸素を介して複合体を形成している．この複合体に
カルシウムが結合することにより発光する．この発光を
利用してカルシウム濃度を測定できる． 本発明者は組換えＤＮＡの手法を用いて、発光オワンク
ラゲより７ポエクオリンのｃＤＮ＾をクローニングし、
その一次構造を明らかにした（特開昭６１−１３５．５
８１１），次いで、とのｃＤＮ＾を利用して大腸菌を宿
主とし、その菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生
産に成功し（特開昭１１２−１７１，ＵＳ、特間昭６３
−１０２，８９５） 、その精製法を確立した（特開平
１ −１３２，３９７） ．さらに、機能遺伝子と結合
したエクオリン遺伝子を作製し、その融合蛋白質の生産
に戒功し（特開昭６４−３９，９９０，特願昭６３−３
０８．４２４）、その精製法を確立した （特願平１
−６９，８６２）．そして、これらのエクオリン及びそ
の融合蛋白を用いた金属検出法及び免疫測定法を開発し
た（特開昭８２−２８１ ．９４２、特願平１ −７４
，７４２）．本発明は、水溶性高分子化合物によるエク
オリンの増感発光法に関する報告である． ところで、エクオリンの有用性は当業者に周知であり、
エクオリンの発光を利用して、各種物質を検出すること
ができる，すなわち、免疫測定法やＤＮ＾ブロープ、バ
イオセンサーなどのあらゆる測定検出系に応用できるも
のであり、上述した機能から診断薬等の検査薬として有
用であることが予測される． 本発明者は上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果、
水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法を開
発することができた．以上の説明から明らかなように、
本発明の目的はエクオリンをより超高感度な測定法に応
用するための発光増感技術を堤供することである．
本発明は，下記（１）〜（４）の構成を有する．（１）
エクオリン及びその誘導体を用いる発光法において水溶
性高分子化合物を共存させることを特徴とする増感発光
法． （２）水溶性高分子化合物として合成高分子化合物、天
然高分子物質若しくは修飾高分子化合物を用いる前記第
１項に記載の増感発光法．《３）合成高分子化合物とし
てポリエチレングリコール若しくはポリビニルアルコー
ル、天然高分子物質として多糖類若しくは蛋白質、修飾
高分子化合物として多糖類誘導体を用いる前記第１項に
記載の増感発光法． （４）エクオリン誘導体が変異エクオリン、半合成エク
オリン若しくは半合成変異エクオリンである前記第１項
に記載の増感発光法． 本発明の構成と効果につき以下に詳述する．本発明は水
溶性高分子化合物の触媒効果と増感効果によるエクオリ
ンの増感発光法であり、たとえば後述の実施例に示す方
法で行うことができる． 本発明の方法に関連する、ジオキセタン類とは、′ｓ１
図に示すような四員環ペルオキシド構造を有する化合物
で、セレンテラジンとは、第２図に示すような構造を有
する化合物で、エクオリンとは、第３図に示すような構
造を有する複合体で、エクオリン誘導体とは、アポエク
オリン部分が変異アポエクオリンに置換した変異エクオ
リン、セレンテラジン部分がセレンテラジン誘導体に置
換した半合成エクオリンやその両方ともが置換した半合
成変異エクオリンである．また、水溶性高分子化合物と
しては、後述第１表に示す化合物等があげられる． 本発明を添付図面及び表にて説明すると，第１図は、ジ
オキセタン類の構造を示したもので、１がジオキセタン
の基本骨格の構造を示し、２〜５がジオキセタン類発光
体の一例である．第２Ｃは、セレンテラジンの構造を示
す．第３図は、：クオリンの複合体を模式的に示したも
のである，第４．５図は、ポリエチレングリコール（
ＰＥＧ共存下におけるエクオリン再生の時間経過を追鶴
した結果である．′Ｍ６図は、再生エクオリンの興安定
性の時間経過を追跡した結果である．第７０は、エクオ
リンの発光、再生のメカニズムを力す． 後述第１表は、水溶性高分子化合物、後述第二表は蛍光
物質の分類や代表例を示したものでｊる．第３表は、水
溶性高分子化合物共存下にお６：るエクオリンの増感発
光の時間経過を追跡した泰果である． ☆ ’Ｍ１表 （種々の水溶性高分子化合物） 》 帛 ａ η ５ ト Ｓ 第２表 （種々の蛍光物′ｘ） 注． Ｎ８Ｄ： ’Ｊ−ニトロベンゾフラザン誘導体，ＳＢＤ
： ７−スルホニルベンゾフラザン誘導体エクオリン若
しくはエクオリン誘導体を水溶性高分子化合物と共存さ
せる方法は、次のとおりである． エクオリンとしては、アポエクオリンをセレンテラジン
と所定の条件で混合し反応させた再生エクオリン若しく
は天然エクオリンを使用する．セレンテラジンを反応さ
せる場合の好ましい反応条件は、４℃， Ｉｓ〜２０時
間である．得られたエクオリン及びエクオリン誘導体は
、第１表に例示されるような水溶性高分子化合物と所定
の条件で混合して、本発明に使用する発光剤とする．該
発光剤とＣａ”との混合による発光量の測定は公知方法
に従う． 上述のようにして得られた本発明の増感発光法を用いる
ことにより、より微量な物質を超高感度に欅出及び測定
することが可能となると考えられｋ． まｋ１第７図に示すように、エクオリンの発光は、ジオ
キセタン中間体の開裂に起因することから、セレンテラ
ジン及びジオキセタン類の化学発光においても水溶性高
分子化合物による増感効果が期待できると考えられる．
さらに、これらの発光の増感効果は蛍光物質の共存によ
り、より増大すると予測される． ［発明の効果］ 本発明のエクオリンの増感発光に関する方法の有用性は
、当業者に自明である．また、適当な蛍光物質を共存せ
しめることにより、エクオリンの発光の増感が可能にな
る．このような物質は、当業者に周知である， 上記の開示により、当業者は、特許請求された本発明を
実施できる．しかし、この技術の理解を増すために、本
発明に重要なエクオリンの増感発光に使われる手順を実
施例によって明らかにする． ［実施例］ 実施例１［ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共存下
におけるエクオリン再生の時間経過］特開昭６１−２４
９，０９８に記載の生産法により生産し、特願昭６２−
２９１ ４４０に記載の精製法により精製し、ざらにシ
リカ系のコスモシル１０Ｃ４ （１０ｘ１５０ｍｍ）カ
ラムにて、０．１％トリフルオロ酢酸、水一アセトニト
リル系にて２０〜８０％のアセトニトリル勾配をかけ分
離したアボエクオリン絹製標品を以下の実験に使用した
．アボエクオリン（１０ｎｌ／μＡ）水溶液ＳＯμｊｌ
， ２００ａＭ Ｔｒｌｓ ＨＣＩ（ｐＨ７．６）１
００■Ｍ ＥＤＴＡバッファ−５０μＡ１セレンテラジ
ン（２００■ｇ／ｍＡ）メタノール溶液５μ℃、２−メ
ルカブトエタノール５μ４１， ＰＥ０４０００（２０
％）水溶液適当量、最後に水で５００μ℃とした． 混合後、氷水、２５℃、３７℃にてインキエベートした
．適当な時間ごとにｌＯμＡ分取し、キュベツ｝−
（ＩＯＸ ７５自■）に移し、ルくフォトメーター（Ｔ
Ｄ４０００，ラボサイエンス社）にセットした後、３０
ｍＭ ＣａＣ１ｔ． ３０ｍＭ Ｔｒｌｓ ＨＣＩ（ｐ
Ｈ７．６）水溶液を１００μ℃添加し、その発光量を測
定した．その結果を第４．５図に示す． 氷水中の場合では、ＰＥＧを含まない系ではｌＯ時間後
に再生が完了し、その後、２６．５時間後まで、エクオ
リン活性の低下は認められなかった（第４図は２２時間
までしか示していない）．無添加系に比べ、ＰＥＧ添加
系（０．４〜１０％）では１０時間後以降にもエクオリ
ン活性の上昇が認められ、再生が完了しえていないよう
じ思われた．また、その傾向はＰＥＧ濃度が増すほど顕
著にあらわれ、ＰＥＧ共存がエクオリン再生に障害とな
っていると考えられた． しかし、非常に興味深いことに、０．４％及び１％ＰＥ
Ｇ添加系では、無添加系のエクオリン活性値を全ての時
間（ここでは３０分から２２時間まで）において、上回
っており、無添加系と比較して、２２時間後では０．４
％添加系で１．６倍、１％添加系で １．７倍のエクオ
リン活性を達成した．以上のことから、ＰＥＧの共存は
、エクオリンの再生を若干妨げるが、エクオリンの発光
そのものを増すことが明らかとなった．このことは、無
添加系でエクオリンを再生し、再生完了後、ＰＥＧを添
加し、発光反応を行なわせることにより、短時間で、発
光増加の最大の効果が得られることを意味する． ２５℃の場合では、３〜４時間をピークとして、エクオ
リン活性の低下が全ての系において確認された．これは
基質セレンテラジンの熱分解に起因すると考えられる．
しかし、氷水の場合と同様に、０．４％及び１％ＰＥＧ
添加系において、無添加系と比較して、エクオリン活性
の増加が認められた． 以上のことから、エクオリンの再生は氷水より２５℃の
方が速いが、同時に平行して、基質セレンテラジンの分
解が速く進むため，全てのアポエクオリンが再生される
にまで至っていないことがわかり、基質セレンテラジン
をより過剰に共存させることにより、室温にても十分な
エクオリンの再生が可能であることを躇示する．このこ
とは、エクオリンを検査薬などに応用する際に重要なこ
ととなる． ３７℃の場合では、エクオリン活性は、セレンテラジン
の分解反応が極めて速いため、２時間後には全ての系に
おいて、Ｏとなった．このことは、エクオリンの再生温
度は、あまり上げることができないことを意味し、応用
面から考えると室温が妥当な線と考えられた． 実施例２［再生エクオリンの温度安定性］実施例１で再
生したＰＥＧ無添加系の再生エクオリン（０℃にて２２
．５時間再生した）を氷水、２５℃、３７℃にインキュ
ベートしｋ．適当な時間にエクオリン活性を実施例１と
同様にして測定した．その結果を第６図に示す．２５℃
で幻理した時、３．５時間で６０％にエクオリン活性が
低下した．さらに３７℃処理においては、１時間後で全
く活性がなかった．このことは、再生エクオリンが温度
上昇で分解されたことを意味する．逆に言えば、再生エ
クオリンは、低温下（０〜４℃程）安定である．事実、
再生が完了してから２６．５時間、氷水中では安定であ
った． 実施例３［水溶性高分子共存下におけるエクオリン増感
発光の時間経過］ アポエクオリン（１０ｎｇ／μぶ）水溶液５０μ℃、２
００ｓＭ 丁ｒ１ｓ ＨＣＩ（１）Ｈ７．６） １０
０＋ｓＭ ＥＤＴ＾パッファ一５０μｌ１セレンテラジ
ン（２００ｍｇ／■℃》メタノール液５μぶ、２−メル
カブトエタノール５μぶ、最後に水で５００μ角とした
．混合後、４℃にて２６時間インキエベートした．５０
μ１ずつ別のチューブに分取し、それぞれのチューブに
デキストリン．デキストラン，牛血清アルブミン（８Ｓ
Ａ）， ＰＥＧ８ＱＱＱ，ＰＥＧ４０００の各種潰度の
水溶液５０ｔｉ１を添加し、混合した後、氷水中でイン
キエベートした．適当な時間ごとにｌＯμｌサンプリン
グし、キエベット（ｌＯＸ７ｓ量園》に移し、ルミフォ
トメーター （丁Ｄ４０００）にセットした後、３０ｓ
Ｍ ＣａＣｌ．， ３０ｍＭ ＴｒｌｓＨＣＩ （＋）
Ｈ７．６）水溶液を１００μｌ添加し、発光量（エクオ
リン活性）を測定した．その結果を第３表に示した． デキストラン以外の水溶性高分子化合物の共存において
、 １．２〜１．９倍の増感効果が得られ、１５時間後
でもエクオリンが安定に保たれていることがわかった．
また、無添加の系では、エクオリンの分解が徐々に進行
し、１５時間後では２８％にまでエクオリン活性の低下
が生じた．このことは、氷水中で、再生開始より４１時
間で約３割にエクオリン活性が低下したことを意味し、
無添加系では再生時間が２０数時間からエクオリン活性
の低下が生じることがわかる．しかし、デキストラン以
外の水溶性高分子化合物の共存系では４１時間後でも、
エクオリンは分解を起こさず、安定に保たれていること
がわかる． 以上のように、水溶性高分子化合物をエクオリンの生物
発光系に共存させることにより、エクオリン発光の増強
と、エクオリンの安定な維持が可能になる．
エクオリン及びその誘導体を用いる発光法において水溶
性高分子化合物を共存させることを特徴とする増感発光
法． （２）水溶性高分子化合物として合成高分子化合物、天
然高分子物質若しくは修飾高分子化合物を用いる前記第
１項に記載の増感発光法．《３）合成高分子化合物とし
てポリエチレングリコール若しくはポリビニルアルコー
ル、天然高分子物質として多糖類若しくは蛋白質、修飾
高分子化合物として多糖類誘導体を用いる前記第１項に
記載の増感発光法． （４）エクオリン誘導体が変異エクオリン、半合成エク
オリン若しくは半合成変異エクオリンである前記第１項
に記載の増感発光法． 本発明の構成と効果につき以下に詳述する．本発明は水
溶性高分子化合物の触媒効果と増感効果によるエクオリ
ンの増感発光法であり、たとえば後述の実施例に示す方
法で行うことができる． 本発明の方法に関連する、ジオキセタン類とは、′ｓ１
図に示すような四員環ペルオキシド構造を有する化合物
で、セレンテラジンとは、第２図に示すような構造を有
する化合物で、エクオリンとは、第３図に示すような構
造を有する複合体で、エクオリン誘導体とは、アポエク
オリン部分が変異アポエクオリンに置換した変異エクオ
リン、セレンテラジン部分がセレンテラジン誘導体に置
換した半合成エクオリンやその両方ともが置換した半合
成変異エクオリンである．また、水溶性高分子化合物と
しては、後述第１表に示す化合物等があげられる． 本発明を添付図面及び表にて説明すると，第１図は、ジ
オキセタン類の構造を示したもので、１がジオキセタン
の基本骨格の構造を示し、２〜５がジオキセタン類発光
体の一例である．第２Ｃは、セレンテラジンの構造を示
す．第３図は、：クオリンの複合体を模式的に示したも
のである，第４．５図は、ポリエチレングリコール（
ＰＥＧ共存下におけるエクオリン再生の時間経過を追鶴
した結果である．′Ｍ６図は、再生エクオリンの興安定
性の時間経過を追跡した結果である．第７０は、エクオ
リンの発光、再生のメカニズムを力す． 後述第１表は、水溶性高分子化合物、後述第二表は蛍光
物質の分類や代表例を示したものでｊる．第３表は、水
溶性高分子化合物共存下にお６：るエクオリンの増感発
光の時間経過を追跡した泰果である． ☆ ’Ｍ１表 （種々の水溶性高分子化合物） 》 帛 ａ η ５ ト Ｓ 第２表 （種々の蛍光物′ｘ） 注． Ｎ８Ｄ： ’Ｊ−ニトロベンゾフラザン誘導体，ＳＢＤ
： ７−スルホニルベンゾフラザン誘導体エクオリン若
しくはエクオリン誘導体を水溶性高分子化合物と共存さ
せる方法は、次のとおりである． エクオリンとしては、アポエクオリンをセレンテラジン
と所定の条件で混合し反応させた再生エクオリン若しく
は天然エクオリンを使用する．セレンテラジンを反応さ
せる場合の好ましい反応条件は、４℃， Ｉｓ〜２０時
間である．得られたエクオリン及びエクオリン誘導体は
、第１表に例示されるような水溶性高分子化合物と所定
の条件で混合して、本発明に使用する発光剤とする．該
発光剤とＣａ”との混合による発光量の測定は公知方法
に従う． 上述のようにして得られた本発明の増感発光法を用いる
ことにより、より微量な物質を超高感度に欅出及び測定
することが可能となると考えられｋ． まｋ１第７図に示すように、エクオリンの発光は、ジオ
キセタン中間体の開裂に起因することから、セレンテラ
ジン及びジオキセタン類の化学発光においても水溶性高
分子化合物による増感効果が期待できると考えられる．
さらに、これらの発光の増感効果は蛍光物質の共存によ
り、より増大すると予測される． ［発明の効果］ 本発明のエクオリンの増感発光に関する方法の有用性は
、当業者に自明である．また、適当な蛍光物質を共存せ
しめることにより、エクオリンの発光の増感が可能にな
る．このような物質は、当業者に周知である， 上記の開示により、当業者は、特許請求された本発明を
実施できる．しかし、この技術の理解を増すために、本
発明に重要なエクオリンの増感発光に使われる手順を実
施例によって明らかにする． ［実施例］ 実施例１［ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共存下
におけるエクオリン再生の時間経過］特開昭６１−２４
９，０９８に記載の生産法により生産し、特願昭６２−
２９１ ４４０に記載の精製法により精製し、ざらにシ
リカ系のコスモシル１０Ｃ４ （１０ｘ１５０ｍｍ）カ
ラムにて、０．１％トリフルオロ酢酸、水一アセトニト
リル系にて２０〜８０％のアセトニトリル勾配をかけ分
離したアボエクオリン絹製標品を以下の実験に使用した
．アボエクオリン（１０ｎｌ／μＡ）水溶液ＳＯμｊｌ
， ２００ａＭ Ｔｒｌｓ ＨＣＩ（ｐＨ７．６）１
００■Ｍ ＥＤＴＡバッファ−５０μＡ１セレンテラジ
ン（２００■ｇ／ｍＡ）メタノール溶液５μ℃、２−メ
ルカブトエタノール５μ４１， ＰＥ０４０００（２０
％）水溶液適当量、最後に水で５００μ℃とした． 混合後、氷水、２５℃、３７℃にてインキエベートした
．適当な時間ごとにｌＯμＡ分取し、キュベツ｝−
（ＩＯＸ ７５自■）に移し、ルくフォトメーター（Ｔ
Ｄ４０００，ラボサイエンス社）にセットした後、３０
ｍＭ ＣａＣ１ｔ． ３０ｍＭ Ｔｒｌｓ ＨＣＩ（ｐ
Ｈ７．６）水溶液を１００μ℃添加し、その発光量を測
定した．その結果を第４．５図に示す． 氷水中の場合では、ＰＥＧを含まない系ではｌＯ時間後
に再生が完了し、その後、２６．５時間後まで、エクオ
リン活性の低下は認められなかった（第４図は２２時間
までしか示していない）．無添加系に比べ、ＰＥＧ添加
系（０．４〜１０％）では１０時間後以降にもエクオリ
ン活性の上昇が認められ、再生が完了しえていないよう
じ思われた．また、その傾向はＰＥＧ濃度が増すほど顕
著にあらわれ、ＰＥＧ共存がエクオリン再生に障害とな
っていると考えられた． しかし、非常に興味深いことに、０．４％及び１％ＰＥ
Ｇ添加系では、無添加系のエクオリン活性値を全ての時
間（ここでは３０分から２２時間まで）において、上回
っており、無添加系と比較して、２２時間後では０．４
％添加系で１．６倍、１％添加系で １．７倍のエクオ
リン活性を達成した．以上のことから、ＰＥＧの共存は
、エクオリンの再生を若干妨げるが、エクオリンの発光
そのものを増すことが明らかとなった．このことは、無
添加系でエクオリンを再生し、再生完了後、ＰＥＧを添
加し、発光反応を行なわせることにより、短時間で、発
光増加の最大の効果が得られることを意味する． ２５℃の場合では、３〜４時間をピークとして、エクオ
リン活性の低下が全ての系において確認された．これは
基質セレンテラジンの熱分解に起因すると考えられる．
しかし、氷水の場合と同様に、０．４％及び１％ＰＥＧ
添加系において、無添加系と比較して、エクオリン活性
の増加が認められた． 以上のことから、エクオリンの再生は氷水より２５℃の
方が速いが、同時に平行して、基質セレンテラジンの分
解が速く進むため，全てのアポエクオリンが再生される
にまで至っていないことがわかり、基質セレンテラジン
をより過剰に共存させることにより、室温にても十分な
エクオリンの再生が可能であることを躇示する．このこ
とは、エクオリンを検査薬などに応用する際に重要なこ
ととなる． ３７℃の場合では、エクオリン活性は、セレンテラジン
の分解反応が極めて速いため、２時間後には全ての系に
おいて、Ｏとなった．このことは、エクオリンの再生温
度は、あまり上げることができないことを意味し、応用
面から考えると室温が妥当な線と考えられた． 実施例２［再生エクオリンの温度安定性］実施例１で再
生したＰＥＧ無添加系の再生エクオリン（０℃にて２２
．５時間再生した）を氷水、２５℃、３７℃にインキュ
ベートしｋ．適当な時間にエクオリン活性を実施例１と
同様にして測定した．その結果を第６図に示す．２５℃
で幻理した時、３．５時間で６０％にエクオリン活性が
低下した．さらに３７℃処理においては、１時間後で全
く活性がなかった．このことは、再生エクオリンが温度
上昇で分解されたことを意味する．逆に言えば、再生エ
クオリンは、低温下（０〜４℃程）安定である．事実、
再生が完了してから２６．５時間、氷水中では安定であ
った． 実施例３［水溶性高分子共存下におけるエクオリン増感
発光の時間経過］ アポエクオリン（１０ｎｇ／μぶ）水溶液５０μ℃、２
００ｓＭ 丁ｒ１ｓ ＨＣＩ（１）Ｈ７．６） １０
０＋ｓＭ ＥＤＴ＾パッファ一５０μｌ１セレンテラジ
ン（２００ｍｇ／■℃》メタノール液５μぶ、２−メル
カブトエタノール５μぶ、最後に水で５００μ角とした
．混合後、４℃にて２６時間インキエベートした．５０
μ１ずつ別のチューブに分取し、それぞれのチューブに
デキストリン．デキストラン，牛血清アルブミン（８Ｓ
Ａ）， ＰＥＧ８ＱＱＱ，ＰＥＧ４０００の各種潰度の
水溶液５０ｔｉ１を添加し、混合した後、氷水中でイン
キエベートした．適当な時間ごとにｌＯμｌサンプリン
グし、キエベット（ｌＯＸ７ｓ量園》に移し、ルミフォ
トメーター （丁Ｄ４０００）にセットした後、３０ｓ
Ｍ ＣａＣｌ．， ３０ｍＭ ＴｒｌｓＨＣＩ （＋）
Ｈ７．６）水溶液を１００μｌ添加し、発光量（エクオ
リン活性）を測定した．その結果を第３表に示した． デキストラン以外の水溶性高分子化合物の共存において
、 １．２〜１．９倍の増感効果が得られ、１５時間後
でもエクオリンが安定に保たれていることがわかった．
また、無添加の系では、エクオリンの分解が徐々に進行
し、１５時間後では２８％にまでエクオリン活性の低下
が生じた．このことは、氷水中で、再生開始より４１時
間で約３割にエクオリン活性が低下したことを意味し、
無添加系では再生時間が２０数時間からエクオリン活性
の低下が生じることがわかる．しかし、デキストラン以
外の水溶性高分子化合物の共存系では４１時間後でも、
エクオリンは分解を起こさず、安定に保たれていること
がわかる． 以上のように、水溶性高分子化合物をエクオリンの生物
発光系に共存させることにより、エクオリン発光の増強
と、エクオリンの安定な維持が可能になる．
第１〜７図は、本発明の説明図である．第１図は、ジオ
キセタンの化学構造を示す．第２図は、セレンテラジン
の化学構造を示す．第３図はエクオリンの構造を模式的
に示したものである． 第４図および第５図はＰＥＧ共存下におけるエクオリン
再生の時間経過を追跡した結果である．第６図は、再生
エクオリンの熱安定性の時間経過を追跡した結果を示す
． 第７図はエクオリンの発光、再生のメカニズムを示す． 以上
キセタンの化学構造を示す．第２図は、セレンテラジン
の化学構造を示す．第３図はエクオリンの構造を模式的
に示したものである． 第４図および第５図はＰＥＧ共存下におけるエクオリン
再生の時間経過を追跡した結果である．第６図は、再生
エクオリンの熱安定性の時間経過を追跡した結果を示す
． 第７図はエクオリンの発光、再生のメカニズムを示す． 以上
Claims (4)
- （１） エクオリン及びその誘導体を用いる発光法にお
いて水溶性高分子化合物を共存させることを特徴とする
増感発光法。 - （２） 水溶性高分子化合物として合成高分子化合物、
天然高分子物質若しくは修飾高分子化合物を用いる特許
請求の範囲第１項に記載の増感発光法。 - （３） 合成高分子化合物としてポリエチレングリコー
ル若しくはポリビニルアルコール、天然高分子物質とし
て多糖類若しくは蛋白質、修飾高分子化合物として多糖
類誘導体を用いる特許請求の範囲第１項に記載の増感発
光法。 - （４） エクオリン誘導体が変異エクオリン、半合成エ
クオリン若しくは半合成変異エクオリンである特許請求
の範囲第１項に記載の増感発光法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30729389A JPH03167287A (ja) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | 水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30729389A JPH03167287A (ja) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | 水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03167287A true JPH03167287A (ja) | 1991-07-19 |
Family
ID=17967392
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30729389A Pending JPH03167287A (ja) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | 水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03167287A (ja) |
-
1989
- 1989-11-27 JP JP30729389A patent/JPH03167287A/ja active Pending
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