JPH03167287A - 水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法 - Google Patents
水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法Info
- Publication number
- JPH03167287A JPH03167287A JP30729389A JP30729389A JPH03167287A JP H03167287 A JPH03167287 A JP H03167287A JP 30729389 A JP30729389 A JP 30729389A JP 30729389 A JP30729389 A JP 30729389A JP H03167287 A JPH03167287 A JP H03167287A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aequorin
- water
- molecular compound
- luminescence
- polymer compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 38
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 title abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 14
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 18
- 238000002796 luminescence method Methods 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 12
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims description 4
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical group C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 16
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 16
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 8
- BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N Dioxetane Chemical class C1COO1 BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010041089 apoaequorin Proteins 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 5
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000000891 luminescent agent Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical group 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000005979 thermal decomposition reaction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は、水溶性高分子化合物を共存させることを特徴
とするエクオリンの増感発光法に関する. [従来の技術とその問題点] 発光蛋白エクオリンは、発光オワンクラゲより単離され
たカルシウム結合蛋白質で、自然界においては蛋白部分
のアポエクオリンと、基質部分のセレンテラジンが、分
子状酸素を介して複合体を形成している.この複合体に
カルシウムが結合することにより発光する.この発光を
利用してカルシウム濃度を測定できる. 本発明者は組換えDNAの手法を用いて、発光オワンク
ラゲより7ポエクオリンのcDN^をクローニングし、
その一次構造を明らかにした(特開昭61−135.5
811),次いで、とのcDN^を利用して大腸菌を宿
主とし、その菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生
産に成功し(特開昭112−171,US、特間昭63
−102,895) 、その精製法を確立した(特開平
1 −132,397) .さらに、機能遺伝子と結合
したエクオリン遺伝子を作製し、その融合蛋白質の生産
に戒功し(特開昭64−39,990,特願昭63−3
08.424)、その精製法を確立した (特願平1
−69,862).そして、これらのエクオリン及びそ
の融合蛋白を用いた金属検出法及び免疫測定法を開発し
た(特開昭82−281 .942、特願平1 −74
,742).本発明は、水溶性高分子化合物によるエク
オリンの増感発光法に関する報告である. ところで、エクオリンの有用性は当業者に周知であり、
エクオリンの発光を利用して、各種物質を検出すること
ができる,すなわち、免疫測定法やDN^ブロープ、バ
イオセンサーなどのあらゆる測定検出系に応用できるも
のであり、上述した機能から診断薬等の検査薬として有
用であることが予測される. 本発明者は上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果、
水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法を開
発することができた.以上の説明から明らかなように、
本発明の目的はエクオリンをより超高感度な測定法に応
用するための発光増感技術を堤供することである.
とするエクオリンの増感発光法に関する. [従来の技術とその問題点] 発光蛋白エクオリンは、発光オワンクラゲより単離され
たカルシウム結合蛋白質で、自然界においては蛋白部分
のアポエクオリンと、基質部分のセレンテラジンが、分
子状酸素を介して複合体を形成している.この複合体に
カルシウムが結合することにより発光する.この発光を
利用してカルシウム濃度を測定できる. 本発明者は組換えDNAの手法を用いて、発光オワンク
ラゲより7ポエクオリンのcDN^をクローニングし、
その一次構造を明らかにした(特開昭61−135.5
811),次いで、とのcDN^を利用して大腸菌を宿
主とし、その菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生
産に成功し(特開昭112−171,US、特間昭63
−102,895) 、その精製法を確立した(特開平
1 −132,397) .さらに、機能遺伝子と結合
したエクオリン遺伝子を作製し、その融合蛋白質の生産
に戒功し(特開昭64−39,990,特願昭63−3
08.424)、その精製法を確立した (特願平1
−69,862).そして、これらのエクオリン及びそ
の融合蛋白を用いた金属検出法及び免疫測定法を開発し
た(特開昭82−281 .942、特願平1 −74
,742).本発明は、水溶性高分子化合物によるエク
オリンの増感発光法に関する報告である. ところで、エクオリンの有用性は当業者に周知であり、
エクオリンの発光を利用して、各種物質を検出すること
ができる,すなわち、免疫測定法やDN^ブロープ、バ
イオセンサーなどのあらゆる測定検出系に応用できるも
のであり、上述した機能から診断薬等の検査薬として有
用であることが予測される. 本発明者は上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果、
水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法を開
発することができた.以上の説明から明らかなように、
本発明の目的はエクオリンをより超高感度な測定法に応
用するための発光増感技術を堤供することである.
本発明は,下記(1)〜(4)の構成を有する.(1)
エクオリン及びその誘導体を用いる発光法において水溶
性高分子化合物を共存させることを特徴とする増感発光
法. (2)水溶性高分子化合物として合成高分子化合物、天
然高分子物質若しくは修飾高分子化合物を用いる前記第
1項に記載の増感発光法.《3)合成高分子化合物とし
てポリエチレングリコール若しくはポリビニルアルコー
ル、天然高分子物質として多糖類若しくは蛋白質、修飾
高分子化合物として多糖類誘導体を用いる前記第1項に
記載の増感発光法. (4)エクオリン誘導体が変異エクオリン、半合成エク
オリン若しくは半合成変異エクオリンである前記第1項
に記載の増感発光法. 本発明の構成と効果につき以下に詳述する.本発明は水
溶性高分子化合物の触媒効果と増感効果によるエクオリ
ンの増感発光法であり、たとえば後述の実施例に示す方
法で行うことができる. 本発明の方法に関連する、ジオキセタン類とは、′s1
図に示すような四員環ペルオキシド構造を有する化合物
で、セレンテラジンとは、第2図に示すような構造を有
する化合物で、エクオリンとは、第3図に示すような構
造を有する複合体で、エクオリン誘導体とは、アポエク
オリン部分が変異アポエクオリンに置換した変異エクオ
リン、セレンテラジン部分がセレンテラジン誘導体に置
換した半合成エクオリンやその両方ともが置換した半合
成変異エクオリンである.また、水溶性高分子化合物と
しては、後述第1表に示す化合物等があげられる. 本発明を添付図面及び表にて説明すると,第1図は、ジ
オキセタン類の構造を示したもので、1がジオキセタン
の基本骨格の構造を示し、2〜5がジオキセタン類発光
体の一例である.第2Cは、セレンテラジンの構造を示
す.第3図は、:クオリンの複合体を模式的に示したも
のである,第4.5図は、ポリエチレングリコール(
PEG共存下におけるエクオリン再生の時間経過を追鶴
した結果である.′M6図は、再生エクオリンの興安定
性の時間経過を追跡した結果である.第70は、エクオ
リンの発光、再生のメカニズムを力す. 後述第1表は、水溶性高分子化合物、後述第二表は蛍光
物質の分類や代表例を示したものでjる.第3表は、水
溶性高分子化合物共存下にお6:るエクオリンの増感発
光の時間経過を追跡した泰果である. ☆ ’M1表 (種々の水溶性高分子化合物) 》 帛 a η 5 ト S 第2表 (種々の蛍光物′x) 注. N8D: ’J−ニトロベンゾフラザン誘導体,SBD
: 7−スルホニルベンゾフラザン誘導体エクオリン若
しくはエクオリン誘導体を水溶性高分子化合物と共存さ
せる方法は、次のとおりである. エクオリンとしては、アポエクオリンをセレンテラジン
と所定の条件で混合し反応させた再生エクオリン若しく
は天然エクオリンを使用する.セレンテラジンを反応さ
せる場合の好ましい反応条件は、4℃, Is〜20時
間である.得られたエクオリン及びエクオリン誘導体は
、第1表に例示されるような水溶性高分子化合物と所定
の条件で混合して、本発明に使用する発光剤とする.該
発光剤とCa”との混合による発光量の測定は公知方法
に従う. 上述のようにして得られた本発明の増感発光法を用いる
ことにより、より微量な物質を超高感度に欅出及び測定
することが可能となると考えられk. まk1第7図に示すように、エクオリンの発光は、ジオ
キセタン中間体の開裂に起因することから、セレンテラ
ジン及びジオキセタン類の化学発光においても水溶性高
分子化合物による増感効果が期待できると考えられる.
さらに、これらの発光の増感効果は蛍光物質の共存によ
り、より増大すると予測される. [発明の効果] 本発明のエクオリンの増感発光に関する方法の有用性は
、当業者に自明である.また、適当な蛍光物質を共存せ
しめることにより、エクオリンの発光の増感が可能にな
る.このような物質は、当業者に周知である, 上記の開示により、当業者は、特許請求された本発明を
実施できる.しかし、この技術の理解を増すために、本
発明に重要なエクオリンの増感発光に使われる手順を実
施例によって明らかにする. [実施例] 実施例1[ポリエチレングリコール(PEG)の共存下
におけるエクオリン再生の時間経過]特開昭61−24
9,098に記載の生産法により生産し、特願昭62−
291 440に記載の精製法により精製し、ざらにシ
リカ系のコスモシル10C4 (10x150mm)カ
ラムにて、0.1%トリフルオロ酢酸、水一アセトニト
リル系にて20〜80%のアセトニトリル勾配をかけ分
離したアボエクオリン絹製標品を以下の実験に使用した
.アボエクオリン(10nl/μA)水溶液SOμjl
, 200aM Trls HCI(pH7.6)1
00■M EDTAバッファ−50μA1セレンテラジ
ン(200■g/mA)メタノール溶液5μ℃、2−メ
ルカブトエタノール5μ41, PE04000(20
%)水溶液適当量、最後に水で500μ℃とした. 混合後、氷水、25℃、37℃にてインキエベートした
.適当な時間ごとにlOμA分取し、キュベツ}−
(IOX 75自■)に移し、ルくフォトメーター(T
D4000,ラボサイエンス社)にセットした後、30
mM CaC1t. 30mM Trls HCI(p
H7.6)水溶液を100μ℃添加し、その発光量を測
定した.その結果を第4.5図に示す. 氷水中の場合では、PEGを含まない系ではlO時間後
に再生が完了し、その後、26.5時間後まで、エクオ
リン活性の低下は認められなかった(第4図は22時間
までしか示していない).無添加系に比べ、PEG添加
系(0.4〜10%)では10時間後以降にもエクオリ
ン活性の上昇が認められ、再生が完了しえていないよう
じ思われた.また、その傾向はPEG濃度が増すほど顕
著にあらわれ、PEG共存がエクオリン再生に障害とな
っていると考えられた. しかし、非常に興味深いことに、0.4%及び1%PE
G添加系では、無添加系のエクオリン活性値を全ての時
間(ここでは30分から22時間まで)において、上回
っており、無添加系と比較して、22時間後では0.4
%添加系で1.6倍、1%添加系で 1.7倍のエクオ
リン活性を達成した.以上のことから、PEGの共存は
、エクオリンの再生を若干妨げるが、エクオリンの発光
そのものを増すことが明らかとなった.このことは、無
添加系でエクオリンを再生し、再生完了後、PEGを添
加し、発光反応を行なわせることにより、短時間で、発
光増加の最大の効果が得られることを意味する. 25℃の場合では、3〜4時間をピークとして、エクオ
リン活性の低下が全ての系において確認された.これは
基質セレンテラジンの熱分解に起因すると考えられる.
しかし、氷水の場合と同様に、0.4%及び1%PEG
添加系において、無添加系と比較して、エクオリン活性
の増加が認められた. 以上のことから、エクオリンの再生は氷水より25℃の
方が速いが、同時に平行して、基質セレンテラジンの分
解が速く進むため,全てのアポエクオリンが再生される
にまで至っていないことがわかり、基質セレンテラジン
をより過剰に共存させることにより、室温にても十分な
エクオリンの再生が可能であることを躇示する.このこ
とは、エクオリンを検査薬などに応用する際に重要なこ
ととなる. 37℃の場合では、エクオリン活性は、セレンテラジン
の分解反応が極めて速いため、2時間後には全ての系に
おいて、Oとなった.このことは、エクオリンの再生温
度は、あまり上げることができないことを意味し、応用
面から考えると室温が妥当な線と考えられた. 実施例2[再生エクオリンの温度安定性]実施例1で再
生したPEG無添加系の再生エクオリン(0℃にて22
.5時間再生した)を氷水、25℃、37℃にインキュ
ベートしk.適当な時間にエクオリン活性を実施例1と
同様にして測定した.その結果を第6図に示す.25℃
で幻理した時、3.5時間で60%にエクオリン活性が
低下した.さらに37℃処理においては、1時間後で全
く活性がなかった.このことは、再生エクオリンが温度
上昇で分解されたことを意味する.逆に言えば、再生エ
クオリンは、低温下(0〜4℃程)安定である.事実、
再生が完了してから26.5時間、氷水中では安定であ
った. 実施例3[水溶性高分子共存下におけるエクオリン増感
発光の時間経過] アポエクオリン(10ng/μぶ)水溶液50μ℃、2
00sM 丁r1s HCI(1)H7.6) 10
0+sM EDT^パッファ一50μl1セレンテラジ
ン(200mg/■℃》メタノール液5μぶ、2−メル
カブトエタノール5μぶ、最後に水で500μ角とした
.混合後、4℃にて26時間インキエベートした.50
μ1ずつ別のチューブに分取し、それぞれのチューブに
デキストリン.デキストラン,牛血清アルブミン(8S
A), PEG8QQQ,PEG4000の各種潰度の
水溶液50ti1を添加し、混合した後、氷水中でイン
キエベートした.適当な時間ごとにlOμlサンプリン
グし、キエベット(lOX7s量園》に移し、ルミフォ
トメーター (丁D4000)にセットした後、30s
M CaCl., 30mM TrlsHCI (+)
H7.6)水溶液を100μl添加し、発光量(エクオ
リン活性)を測定した.その結果を第3表に示した. デキストラン以外の水溶性高分子化合物の共存において
、 1.2〜1.9倍の増感効果が得られ、15時間後
でもエクオリンが安定に保たれていることがわかった.
また、無添加の系では、エクオリンの分解が徐々に進行
し、15時間後では28%にまでエクオリン活性の低下
が生じた.このことは、氷水中で、再生開始より41時
間で約3割にエクオリン活性が低下したことを意味し、
無添加系では再生時間が20数時間からエクオリン活性
の低下が生じることがわかる.しかし、デキストラン以
外の水溶性高分子化合物の共存系では41時間後でも、
エクオリンは分解を起こさず、安定に保たれていること
がわかる. 以上のように、水溶性高分子化合物をエクオリンの生物
発光系に共存させることにより、エクオリン発光の増強
と、エクオリンの安定な維持が可能になる.
エクオリン及びその誘導体を用いる発光法において水溶
性高分子化合物を共存させることを特徴とする増感発光
法. (2)水溶性高分子化合物として合成高分子化合物、天
然高分子物質若しくは修飾高分子化合物を用いる前記第
1項に記載の増感発光法.《3)合成高分子化合物とし
てポリエチレングリコール若しくはポリビニルアルコー
ル、天然高分子物質として多糖類若しくは蛋白質、修飾
高分子化合物として多糖類誘導体を用いる前記第1項に
記載の増感発光法. (4)エクオリン誘導体が変異エクオリン、半合成エク
オリン若しくは半合成変異エクオリンである前記第1項
に記載の増感発光法. 本発明の構成と効果につき以下に詳述する.本発明は水
溶性高分子化合物の触媒効果と増感効果によるエクオリ
ンの増感発光法であり、たとえば後述の実施例に示す方
法で行うことができる. 本発明の方法に関連する、ジオキセタン類とは、′s1
図に示すような四員環ペルオキシド構造を有する化合物
で、セレンテラジンとは、第2図に示すような構造を有
する化合物で、エクオリンとは、第3図に示すような構
造を有する複合体で、エクオリン誘導体とは、アポエク
オリン部分が変異アポエクオリンに置換した変異エクオ
リン、セレンテラジン部分がセレンテラジン誘導体に置
換した半合成エクオリンやその両方ともが置換した半合
成変異エクオリンである.また、水溶性高分子化合物と
しては、後述第1表に示す化合物等があげられる. 本発明を添付図面及び表にて説明すると,第1図は、ジ
オキセタン類の構造を示したもので、1がジオキセタン
の基本骨格の構造を示し、2〜5がジオキセタン類発光
体の一例である.第2Cは、セレンテラジンの構造を示
す.第3図は、:クオリンの複合体を模式的に示したも
のである,第4.5図は、ポリエチレングリコール(
PEG共存下におけるエクオリン再生の時間経過を追鶴
した結果である.′M6図は、再生エクオリンの興安定
性の時間経過を追跡した結果である.第70は、エクオ
リンの発光、再生のメカニズムを力す. 後述第1表は、水溶性高分子化合物、後述第二表は蛍光
物質の分類や代表例を示したものでjる.第3表は、水
溶性高分子化合物共存下にお6:るエクオリンの増感発
光の時間経過を追跡した泰果である. ☆ ’M1表 (種々の水溶性高分子化合物) 》 帛 a η 5 ト S 第2表 (種々の蛍光物′x) 注. N8D: ’J−ニトロベンゾフラザン誘導体,SBD
: 7−スルホニルベンゾフラザン誘導体エクオリン若
しくはエクオリン誘導体を水溶性高分子化合物と共存さ
せる方法は、次のとおりである. エクオリンとしては、アポエクオリンをセレンテラジン
と所定の条件で混合し反応させた再生エクオリン若しく
は天然エクオリンを使用する.セレンテラジンを反応さ
せる場合の好ましい反応条件は、4℃, Is〜20時
間である.得られたエクオリン及びエクオリン誘導体は
、第1表に例示されるような水溶性高分子化合物と所定
の条件で混合して、本発明に使用する発光剤とする.該
発光剤とCa”との混合による発光量の測定は公知方法
に従う. 上述のようにして得られた本発明の増感発光法を用いる
ことにより、より微量な物質を超高感度に欅出及び測定
することが可能となると考えられk. まk1第7図に示すように、エクオリンの発光は、ジオ
キセタン中間体の開裂に起因することから、セレンテラ
ジン及びジオキセタン類の化学発光においても水溶性高
分子化合物による増感効果が期待できると考えられる.
さらに、これらの発光の増感効果は蛍光物質の共存によ
り、より増大すると予測される. [発明の効果] 本発明のエクオリンの増感発光に関する方法の有用性は
、当業者に自明である.また、適当な蛍光物質を共存せ
しめることにより、エクオリンの発光の増感が可能にな
る.このような物質は、当業者に周知である, 上記の開示により、当業者は、特許請求された本発明を
実施できる.しかし、この技術の理解を増すために、本
発明に重要なエクオリンの増感発光に使われる手順を実
施例によって明らかにする. [実施例] 実施例1[ポリエチレングリコール(PEG)の共存下
におけるエクオリン再生の時間経過]特開昭61−24
9,098に記載の生産法により生産し、特願昭62−
291 440に記載の精製法により精製し、ざらにシ
リカ系のコスモシル10C4 (10x150mm)カ
ラムにて、0.1%トリフルオロ酢酸、水一アセトニト
リル系にて20〜80%のアセトニトリル勾配をかけ分
離したアボエクオリン絹製標品を以下の実験に使用した
.アボエクオリン(10nl/μA)水溶液SOμjl
, 200aM Trls HCI(pH7.6)1
00■M EDTAバッファ−50μA1セレンテラジ
ン(200■g/mA)メタノール溶液5μ℃、2−メ
ルカブトエタノール5μ41, PE04000(20
%)水溶液適当量、最後に水で500μ℃とした. 混合後、氷水、25℃、37℃にてインキエベートした
.適当な時間ごとにlOμA分取し、キュベツ}−
(IOX 75自■)に移し、ルくフォトメーター(T
D4000,ラボサイエンス社)にセットした後、30
mM CaC1t. 30mM Trls HCI(p
H7.6)水溶液を100μ℃添加し、その発光量を測
定した.その結果を第4.5図に示す. 氷水中の場合では、PEGを含まない系ではlO時間後
に再生が完了し、その後、26.5時間後まで、エクオ
リン活性の低下は認められなかった(第4図は22時間
までしか示していない).無添加系に比べ、PEG添加
系(0.4〜10%)では10時間後以降にもエクオリ
ン活性の上昇が認められ、再生が完了しえていないよう
じ思われた.また、その傾向はPEG濃度が増すほど顕
著にあらわれ、PEG共存がエクオリン再生に障害とな
っていると考えられた. しかし、非常に興味深いことに、0.4%及び1%PE
G添加系では、無添加系のエクオリン活性値を全ての時
間(ここでは30分から22時間まで)において、上回
っており、無添加系と比較して、22時間後では0.4
%添加系で1.6倍、1%添加系で 1.7倍のエクオ
リン活性を達成した.以上のことから、PEGの共存は
、エクオリンの再生を若干妨げるが、エクオリンの発光
そのものを増すことが明らかとなった.このことは、無
添加系でエクオリンを再生し、再生完了後、PEGを添
加し、発光反応を行なわせることにより、短時間で、発
光増加の最大の効果が得られることを意味する. 25℃の場合では、3〜4時間をピークとして、エクオ
リン活性の低下が全ての系において確認された.これは
基質セレンテラジンの熱分解に起因すると考えられる.
しかし、氷水の場合と同様に、0.4%及び1%PEG
添加系において、無添加系と比較して、エクオリン活性
の増加が認められた. 以上のことから、エクオリンの再生は氷水より25℃の
方が速いが、同時に平行して、基質セレンテラジンの分
解が速く進むため,全てのアポエクオリンが再生される
にまで至っていないことがわかり、基質セレンテラジン
をより過剰に共存させることにより、室温にても十分な
エクオリンの再生が可能であることを躇示する.このこ
とは、エクオリンを検査薬などに応用する際に重要なこ
ととなる. 37℃の場合では、エクオリン活性は、セレンテラジン
の分解反応が極めて速いため、2時間後には全ての系に
おいて、Oとなった.このことは、エクオリンの再生温
度は、あまり上げることができないことを意味し、応用
面から考えると室温が妥当な線と考えられた. 実施例2[再生エクオリンの温度安定性]実施例1で再
生したPEG無添加系の再生エクオリン(0℃にて22
.5時間再生した)を氷水、25℃、37℃にインキュ
ベートしk.適当な時間にエクオリン活性を実施例1と
同様にして測定した.その結果を第6図に示す.25℃
で幻理した時、3.5時間で60%にエクオリン活性が
低下した.さらに37℃処理においては、1時間後で全
く活性がなかった.このことは、再生エクオリンが温度
上昇で分解されたことを意味する.逆に言えば、再生エ
クオリンは、低温下(0〜4℃程)安定である.事実、
再生が完了してから26.5時間、氷水中では安定であ
った. 実施例3[水溶性高分子共存下におけるエクオリン増感
発光の時間経過] アポエクオリン(10ng/μぶ)水溶液50μ℃、2
00sM 丁r1s HCI(1)H7.6) 10
0+sM EDT^パッファ一50μl1セレンテラジ
ン(200mg/■℃》メタノール液5μぶ、2−メル
カブトエタノール5μぶ、最後に水で500μ角とした
.混合後、4℃にて26時間インキエベートした.50
μ1ずつ別のチューブに分取し、それぞれのチューブに
デキストリン.デキストラン,牛血清アルブミン(8S
A), PEG8QQQ,PEG4000の各種潰度の
水溶液50ti1を添加し、混合した後、氷水中でイン
キエベートした.適当な時間ごとにlOμlサンプリン
グし、キエベット(lOX7s量園》に移し、ルミフォ
トメーター (丁D4000)にセットした後、30s
M CaCl., 30mM TrlsHCI (+)
H7.6)水溶液を100μl添加し、発光量(エクオ
リン活性)を測定した.その結果を第3表に示した. デキストラン以外の水溶性高分子化合物の共存において
、 1.2〜1.9倍の増感効果が得られ、15時間後
でもエクオリンが安定に保たれていることがわかった.
また、無添加の系では、エクオリンの分解が徐々に進行
し、15時間後では28%にまでエクオリン活性の低下
が生じた.このことは、氷水中で、再生開始より41時
間で約3割にエクオリン活性が低下したことを意味し、
無添加系では再生時間が20数時間からエクオリン活性
の低下が生じることがわかる.しかし、デキストラン以
外の水溶性高分子化合物の共存系では41時間後でも、
エクオリンは分解を起こさず、安定に保たれていること
がわかる. 以上のように、水溶性高分子化合物をエクオリンの生物
発光系に共存させることにより、エクオリン発光の増強
と、エクオリンの安定な維持が可能になる.
第1〜7図は、本発明の説明図である.第1図は、ジオ
キセタンの化学構造を示す.第2図は、セレンテラジン
の化学構造を示す.第3図はエクオリンの構造を模式的
に示したものである. 第4図および第5図はPEG共存下におけるエクオリン
再生の時間経過を追跡した結果である.第6図は、再生
エクオリンの熱安定性の時間経過を追跡した結果を示す
. 第7図はエクオリンの発光、再生のメカニズムを示す. 以上
キセタンの化学構造を示す.第2図は、セレンテラジン
の化学構造を示す.第3図はエクオリンの構造を模式的
に示したものである. 第4図および第5図はPEG共存下におけるエクオリン
再生の時間経過を追跡した結果である.第6図は、再生
エクオリンの熱安定性の時間経過を追跡した結果を示す
. 第7図はエクオリンの発光、再生のメカニズムを示す. 以上
Claims (4)
- (1) エクオリン及びその誘導体を用いる発光法にお
いて水溶性高分子化合物を共存させることを特徴とする
増感発光法。 - (2) 水溶性高分子化合物として合成高分子化合物、
天然高分子物質若しくは修飾高分子化合物を用いる特許
請求の範囲第1項に記載の増感発光法。 - (3) 合成高分子化合物としてポリエチレングリコー
ル若しくはポリビニルアルコール、天然高分子物質とし
て多糖類若しくは蛋白質、修飾高分子化合物として多糖
類誘導体を用いる特許請求の範囲第1項に記載の増感発
光法。 - (4) エクオリン誘導体が変異エクオリン、半合成エ
クオリン若しくは半合成変異エクオリンである特許請求
の範囲第1項に記載の増感発光法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30729389A JPH03167287A (ja) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | 水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30729389A JPH03167287A (ja) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | 水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH03167287A true JPH03167287A (ja) | 1991-07-19 |
Family
ID=17967392
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP30729389A Pending JPH03167287A (ja) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | 水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH03167287A (ja) |
-
1989
- 1989-11-27 JP JP30729389A patent/JPH03167287A/ja active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Cleland et al. | Refolding and aggregation of bovine carbonic anhydrase B: quasi-elastic light scattering analysis | |
Nisonoff et al. | Heterogeneity and average combining constants of antibodies from individual rabbits | |
Omenn et al. | Modification of the single tryptophan residue of staphylococcal nuclease by a new mild oxidizing agent | |
Conrad et al. | Intramolecular transfer of excitation from trytophan to 1-dimethylaminonaphthalene-5-sulfonamide in a series of model compounds | |
Schmer et al. | The isolation and characterization of bovine factor VIII (antihemophilic factor) | |
JPH0534345A (ja) | 化学発光を利用する抗原・抗体の測定方法 | |
JPS63215962A (ja) | 電気化学的プロセスおよびその装置 | |
US20200256858A1 (en) | Modifiable Chemical Inducers of Proximity and Methods of Using the Same | |
JP4770462B2 (ja) | 蛍光蛋白質 | |
JPH09504505A (ja) | プテリン誘導体およびその製法と利用法 | |
SU946389A3 (ru) | Способ получени тромбиноподобных ферментов | |
Crisanti et al. | Characterization of the slow steps in the folding of the. alpha. subunit of tryptophan synthase | |
Rich et al. | The photophysical probe, 7‐azatryptophan, in synthetic peptides | |
Zander et al. | [5] Disulfide bond catalysts in Escherichia coli | |
Speer et al. | Activated human Hageman factor (XII) | |
Arai et al. | Fluorometric assay of tubulin-colchicine complex | |
JPS61501418A (ja) | 双特異性抗体決定子 | |
JPH03167287A (ja) | 水溶性高分子化合物によるエクオリンの増感発光法 | |
Mell et al. | Purification of dihydrofolate reductase via amethopterin-aminoethyl starch | |
Jacobson et al. | A colorimetric assay for carbodiimides commonly used in peptide synthesis and carboxyl group modification | |
ATE44621T1 (de) | Proteinkonjugate von penicillosaeure, ihre herstellung und verwendung. | |
Ingham et al. | The rates of dissociation and recombination of the subunits of human luteinizing hormone | |
Allen et al. | Polarographic Determination and Evidence for the Structure of Leucovorin1a | |
JPH03167288A (ja) | 界面活性剤によるエクオリンの増感発光法 | |
JPH03255959A (ja) | ポリマー |