JPH03152465A - シュードウリジンの免疫学的測定方法，そのための測定試薬及び試薬キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はシュードウリジンに対するモノクローナル抗体
を用いた免疫学的測定方法、そのための測定試薬及び試
薬キットに関する。

［従来の技術］ 癌の診断や術後のモニタリングにおいて、患者の血清中
や尿中に増加する癌関連物質いわゆる腫瘍マーカーの測
定は欠かせぬものとなっている。

現在、測定されている腫瘍マーカーとしては、癌胎児性
抗原（ＣＥＡ）、免疫抑制酸性蛋白（ＩＡＰ）や、肝癌
特異的なαフェトプロティン（ＡＦＰ）あるいは肝癌特
異的な糖鎖抗原の一種であるＣ　Ａ　１９−９などがあ
げられる。

ところで、癌になると増加する物質、すなわちＨ瘍マー
カーと呼ばれている物質の中で、進行癌患者尿中に増加
するものとしてシュードウリジンが知られている。この
物質はトランスファー・リボヌクレイツクアシド（ｔ−
ＲＮＡ）の構成成分の１つであり、その増加の原因は、
癌組織におけるｔ−ＲＮＡのブレークダウン（ｂｒｅａ
ｋｄｏｗｎ）が正常組繊に比較し、充進しているためで
あるといわれているが、その増加のメカニズムの詳細に
ついては未解明である。

現在、このシュードウリジンの量を測定し、これから進
行症の存在を判定する試みがなされているが、シュード
ウリジンの定量は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）でおこなわれれるため、サンプルの前処理等が煩雑
であり、多検体を測定するには非常に長時間を要すると
いう欠点があった。

本発明者らは先に、簡便なシュードウリジンの測定法を
開発すべく、種々検討をおこなった結果、シュードウリ
ジンに対するモノクローナル抗体を新たに作成し、これ
を用いることにより、尿サンプルの前処理操作を行うこ
となく　ＥＬＩＳＡ法を応用した多検体同時測定方法を
実施することができ、測定の迅速化、簡素化がはかれる
ことを見出し特許出願した（特開昭６３−２２２６９９
号公報）。

し発明が解決しようとする課題］ その測定方法は、シュードウリジンと牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）との結合物を担体に固定化し、これに検体（
尿など）とシュードウリジンに対するモノクローナル抗
体とを添加し、担体上のシュードウリジンに結合したモ
ノクローナル抗体量を測定し、検体中のシュードウリジ
ンを特異的に測定する迅速かつサンプルの前処理操作の
ない簡便な優れた方法である。しかし、より経済的に、
かつより正確に測れる感度の高い方法が望まれていた。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、前記状況に鑑み、シュードウリジンを迅
速、簡便に特異的に測定し、かつ、より経済的に、より
正確に測定できるキットを開発すべく種々検討を行なっ
た結果、抗体を担体に固定し、標識抗原と検体中の抗原
とを溶液状態で競合させることにより前記問題を解決で
きることを見い出し本発明に到達した。

即ち、本発明は試料中のシュードウリジンを競合法で測
定するに際し、シュードウリジンに対するモノクローナ
ル抗体を不溶性担体に固定した固定化抗体と標識物質で
標識した標識シュードウリジンを用いることを特徴とす
るシュードウリジンの測定方法、そのための測定試薬お
よび試薬キットである。

本発明の測定方法は、特開昭６３−２２２６９９号公報
の測定方法、と競合法による方法である点で共通するが
、シュードウリジンに対する抗体を不溶性担体に固定化
し、検体と標識抗原とを溶液状態で競合させる点に特徴
がある。それ故、標識抗原の一定量を精度良く反応系に
添加することが可能となり、常に一定条件下で競合反応
を行なうことができるため、バラツキがより少なくなり
、より正確に測定することが可能となった。また、特開
昭６３−２２２６９９号公報では２種類の標識化試薬す
なわち酵素標識抗体とシュードウリジン標識ＢＳＡを必
要としたが、本発明では酵素ａ識シュードウリジンのみ
でよく、複雑な標識化反応工程を必要とする試薬を減ら
すことができ、より経済的に測定キットを作ることが可
能となった。

本発明で用いるシュードウリジンに対するモノクローナ
ル抗体は、シュードウリジンを特異的に認識するモノク
ローナル抗体であればよい６例えば、本発明者らが先に
出願した特開昭６３−２２２６９９号公報に記載した方
法によって調製することができる。

すなわち、まず、シュードウリジンを用いて動物を免疫
し、その動物の肺細胞を採取する。この工程において、
シュードウリジンはそれ単独よりはむしろ適当なキャリ
ア・プロティン（ＣａｒｒｉｅｒＰｒｏｔａｉｎ）と結
合させたのち、免疫原として用いる。

シュードウリジンとしては、例えば進行癌患者の尿中か
ら公知の方法、例えば市販されている標品を用いること
ができ、キャリア・プロティンとしては、ハプテン部分
を免疫担当細胞が認識することを可能にする目的で用い
られるプロティン、例えばキーホール・リンベット・ヘ
モシアニン、牛血清アルブミン等を用いることができる
。また、このシュードウリジンとキャリア・プロティン
を結合する方法としては、例えば、核酸塩基の糖部分を
過ヨウ素酸で酸化したのちキャリア・プロティンと結合
させる等の方法が挙げられる。更に、免疫動物としては
、マウス、ラット等が挙げられる。

次に得られた免疫動物の牌細胞を骨１１１Ｉｉｌ！！細
胞と融合し、ハイブリドーマを得る。＃Ｂ胞融合におい
ては、公知のポリエチレングリコールを用いる方法（Ｈ
ａｒｃ　５ｈｕｌｉａｎ、　Ｃ，Ｄ、旧ｄｅ　８　Ｇ、
に５ｈｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ２７６　、２６９−２７０
　（１９７８））　、例えばＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
Ｖｉｒｕｓを感染させて形質転換細胞を作成する方法（
Ｇ、に５ｈ＋ｅｒ　＆　Ｃ，Ｈｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａ
ｔｕｒｅ　２５６．４９５−４９７　（１９７５））　
、あるいは電気パルスによる方法（Ｊ、Ｖｉａｎｋｃｎ
＆　Ｕ、　２ｉｍｎｅｒｎａｎｎ、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ　１３７゜１１−１３　（１９８２））のいず
れを用いても良い、尚、ハイブリドーマのスクリーニン
グに当たっては、キャリア・プロティンに対する抗体産
生ハイブリドーマを除去するための工夫が必要である。

このためには、免疫に用いたキャリア・プロティンと異
なった種由来のプロティンをシュードウリジンに結合さ
せたものを抗原として用い、抗体産生ハイブリドーマの
スクリーニングを行う等の方法を用いることが望ましい
。

斯くして得られたハイブリドーマは、更に遊離の、シュ
ードウリジン及びウラシルで阻害されるか否か検討し、
シュードウリジンにより強く阻害され、ウリジン及びウ
ラシルで阻害されないか、あるいは極めて弱く阻害され
るものが選ばれ、以下常法によりクローニングして目的
の抗体を産生ずるハイブリドーマを得る。

このようにハイブリドーマを経由してモノクローナル抗
体を製造する際の、牌細胞とミエローマ細胞は、同一種
の動物からのものが好ましく、特にマウスＷｃ細胞とマ
ウス由来ミエローマ細胞が実用上に好適である。

このようにして選択したハイブリドーマ又は形質転換細
胞を培養して、所望の特異的モノクローナル抗体を生成
させる。クローニングによって選択された、シュードウ
リジンを認識する抗体を産生するハイブリドーマ又は形
質転換細胞は凍結して保存することができ、また、これ
を適当な方法で大量に培養することもできる。そして、
培養上清からシュードウリジンに特異的に結合するモノ
クローナル抗体を得ることができる。また、かかる細胞
を動物に移植して腫瘍化し、その腹水や血清から目的と
する抗体を得ることもできる。モノクローナル抗体の精
製は、アフィニティクロマトグラフィー等の方法によっ
て行なわれる。

本発明に用いられるシュードウリジンに対するモノクロ
ーナル抗体は、そのフラグメント、例えばＦ（ａｂ’）
２．　Ｆａｂ’、　Ｆａｃｂであってもよい。

Ｆ（ａｂ’）ｚ　、　Ｆａｂ”、　ＦａＣｂなどの抗体
の７ラグメントの調製は、モノクローナル抗体を公知の
方法で酵素処理等することによって得られる６例えば、
抗体をペプシン処理してＦ（ａｂ’）ｚを得、さらにこ
のフラグメントを還元処理してＦａｂ’を得ることがで
きる（＾、　Ｎ１５ＯｎＯｆｆ　ｅｔ　ａｌ　　、＾ｒ
ｃｈ、　　Ｂｉｏｃｈｅｎ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　８９．２３０（１９６０）　、　
Ｐ、Ｐａｒｈａｎ、　Ｊ。

Ｉｕｏｎｏｌ、、　１３１．２８９５（１９８３）等を
参照のこと）。

本発明の不溶性担体としては、ポリスチレン。

ポリエステル、ポリエチレン、ポリ１０ピレン。

＾ＢＳ　、ポリフッ化ビニル、ポリアミンメチルとニル
エーテル−マレイン酸共重合体、６−ナイロン。

６．６−ナイロンなどのプラスチック、アミノ酸重合体
、ガラス、シリカゲルなどがあげられる。

かかる不溶性担体の形状はビーズ、マイクロスフイア−
、スティック、試験管、フィルム、マイクログレートあ
るいはメンブレンなど特に限定されない、またその表面
は鏡面、粗面などどのような形態であってもよいが、例
えば、ビーズとして、中心線平均粗さ（Ｒａ）が１．５
μｍ以下である鏡面化されたビーズが、好ましく用いら
れる。

不溶性担体にかかる抗体を固定化する方法や手段は何ら
限定されるものではなく公知の方法や手段、例えば、不
溶性担体のアミノ基、カルボキシル基などと架橋剤を介
して不溶性担体と抗体とを共有結合させる方法、不溶性
担体のマトリックス中に固定する方法、生物学的親和性
を利用して固定する方法、例えば抗体に対する抗体ある
いはプロティンＡなどを担体に予め固定しておき、これ
に抗体を固定させる方法あるいは不溶性担体に物理吸着
させる方法などが挙げられる。なかでも物理吸着法が好
ましく用いられる。物理吸着法の一般的な操作法として
は、例えば、抗体溶液中に不溶性担体を浸漬して、４℃
で一晩又は室温で数時間反応させるという方法が用いら
れる。この場合、抗体溶液のｐＨは限定されるものでは
ないがｐＨ２，０〜４．５の抗体溶液中に不溶性担体を
浸漬して抗体を固定化すると、抗体活性を損わずに固定
することができ、中性付近のｐＨで固定した固定化抗体
よりも抗原結合能が強く最終的な測定感度を高めること
ができ有利に用いることができる。また、標識抗原の使
用量を低減させることもできる点も有利である。

かかる水溶液としては特に限定されないが緩衝液が好ま
しい４Ｍ衝液としてはグリシン−塩酸緩衝液、クエン酸
ナトリウム−塩酸緩衝液、フタール酸水素カリウムー塩
酸Ｉ！衝液、クエン酸−クエン酸カリウム緩衝液、クエ
ン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液。酢酸ナトリウム−塩
酸緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム４ＷｆｆＩ液、ベロナ
ールＭ街液などをあげることができる。なかでもｐＨ１
２，０〜４．５を満足できるものとして特に限定されな
いが、好ましくはクエン酸−リン酸二ナトリウムｗｔｆ
ｒ液である。緩衝液の塩濃度は０．１〜ＩＭの範囲で用
いられ、好ましくは０，１〜０６５Ｍの範囲である。

例えば物理的吸着法による場合、抗体溶液中の抗体等の
濃度及び固定時間等の条件は、抗体又は抗体フラグメン
トの種類によって異なるが、一般には１〜１００Ｍｇ　
／　ｍｌの溶液が用いられ、この溶液中に抗体を固定す
べき不溶性担体を浸漬し２〜８℃で１〜２４時間、又は
室温で数時間静置する。

静置が終わり抗体の固定化された不溶性担体は、例えば
、リン酸Ｍｆｌｌ液生理食塩水（ＰＢＳ）で数回洗浄し
た後、ウシ血清アルブミンの１％程度のＰＢＳ溶液（以
下、ＢＳＡ−ＰＢＳと略す）に室温で２〜１２時間又は
２〜８℃で一晩静置しＰＢＳで数回洗浄し、適当な緩衝
液に浸漬して保存するか、そのまま風乾するか、抗体の
失活を防ぐために蛋白や糖を含んだ溶液に浸漬してから
遠心分離して乾燥する方法がとられる。又、必要に応じ
て上記固定抗体を加熱処理することもできる。

本発明の測定方法に用いられる標識抗原の標識物質とし
ては、酵素、蛍光物質１発光物質及び放射性物質等を使
用するのが有利である。酵素としては、ペルオキシダー
ゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、蛍光物質とししてはフルオレッセインイソチオシ
アネート、フィコビリプロティン等、発光物質としては
イソルシノール、ルシゲニン等、そして放射性物質とし
１２５　　１３１　　１４　　３ ては　　Ｉ、Ｉ、Ｃ，Ｈ等を用いることができるが、こ
れらは例示したものに限らず、免疫学的測定方法に使用
し得るものであれば、他のものでも使用できる。好まし
くは酵素である。標識物質が酵素である場合には、その
活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いら
れる。

酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質と
してＨ２Ｏ２を用い、発色剤として２．２°−アジノジ
−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニ
ウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、０−フェ
ニレンジアミン、４−アミノアンチピリン、３，３°、
５，５°−テトラメチルベンジジン等、酵素にアルカリ
フォスファターゼを用いる場合は基質として０−ニトロ
フェニルフォスフェート等、酵素にβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼを用いる場合は基質としてフルオレセイン−ジー
（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、４−メチルウンベリ
フェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等を用いること
ができる。

また、ｆｉｔ（識化の方法は何ら限定されるものではな
く公知の方法、例えば核酸塩基の糖部分を過ヨウ素酸で
酸化したのちに標識物質のアミノ基と結合させるなどの
方法が挙げることができる。

次にこのようにして得られる測定試薬を用いて、試薬料
中のシュードウリジンを測定する方法について説明する
。

本発明はシュードウリジンに対するモノクローナル抗体
を不溶性担体に固定した固定化抗体と標識シュードウリ
ジンを用いて、競合法で測定する方法である。すなわち
、例えばチューブの中に試料、ｉｆシュードウリジン及
び固定抗体とを加え、試料中のシュードウリジンと標識
シューウリジンとを固定抗体と競合的に一定時間反応さ
せる０次いで試料と標識シュードウリジンとを除去する
ために洗浄し、固定抗体に結合した標識シュードウリジ
ンの標識物質量を測定する。標識物質が酵素の場合には
、洗浄後、更に酵素の基質と必要に応じて発色剤を加え
一定時間酵素反応を行った後停止液を加えて酵素反応を
停止させ、発色した溶液の吸光度を測定する。また、試
料中のシュードウリジンを標識シュードウリジンとモノ
クローナル抗体とをあらかじめ反応させ、次いでモノク
ローナル抗体と親和性を有する生物学的親和性物質、例
えば抗マウス抗体を固定化した不溶性担体を加え、不溶
性担体に結合した標識シュードウリジンの標識物質を測
定してもよい。

測定に際しての免疫反応温度条件は、構成要素である蛋
白質の性質を変性させず、かつ免疫反応を著しく抑制し
ない限り特に制限はないが、一般には５０℃以下、好ま
しくは約り℃〜４５℃程度の温反条件下に約５分から２
０時時間症を要して反応を行えばよい。

上記における免疫反応に用いられる溶媒としては反応に
悪影響を与えない［衝液が通常用いられる０例えばリン
酸緩衝液、トリス−塩酸［ｉ液。

酢酸緩衝液などのＩ）１１が６．０から８．０程度のも
のを用いるのが好ましい。

また本発明においては、必要に応じて免疫反応溶液中に
、ＢＳＡなどの蛋白質やシュクロースなどの糖預や界面
活性剤や防腐剤などを含んでもよ゛い、特に、免疫反応
溶液に分子量１．６万〜５．０万及び等電点１．０〜５
．０である蛋白質又はそれを含む混合物を存在せしめ、
これらの免疫反応溶液における最終濃度が０．０２〜０
．９重量％となるように調整すると、非特異的吸着が抑
制され、高感度が得られやすくなり好ましい、かかる蛋
白質又はそれを含む混合物は、本発明の免疫学的測定方
法に用いる試薬キットの他の一部を構成する免疫測定試
薬に免疫反応溶液中に前記所定の量となるように含有せ
しめることもできる。かかる蛋白質としては、―えばカ
ゼイン、ペプシン、オボグリコプロテイン、オロソムコ
イドなどがあげられる。このような混合物としては、例
えば主成分として前記タンパク質１０〜６０重量％、好
ましくは２０〜５０重量％、糖（例えば乳糖）３０〜８
０重量％、好ましくは４０〜６０重量％、その他脂肪（
例えば０．５〜２！ｉ量％）、灰分（例えば５〜１２重
量％）、水分（例えば２〜８重量％）などを含むことが
できる。このような混合物として典型的なのはスキムミ
ルクである。スキムミルクはタンパク質としてカゼイン
を含むものであるが、カゼインを単独で使用した場合に
比べて、スキムミルクは、免疫反応溶液中における分散
性が良く、非特異的吸着を低減させる効果が高く、温度
４℃における保存性が良い（沈澱が生じにくい）という
特徴を有する。なお、スキムミルクとしては、脱脂した
ミルクであれば、何の由来の乳でありも良く、−香典型
的なもののひとつとしては、市販されているＤ　ｉ　ｆ
ｃｏ社製のスキムミルクがある。

本発明はまた、試料中のシュードウリジンを競合法で測
定するための、（ａ）シュードウリジンに対するモノク
ローナル抗体を不溶性担体に固定化した固定化抗体試薬
と（ｂ）標識物質で標識化した標識シュードウリジンと
を含むことからなる測定試薬及び、かかる測定のための
前記測定試薬（ａ）。

（ｂ）とを含むことからなる試薬キットであって、前記
測定試薬（ａ）　、　（ｂ）以外にも（Ｃ）溶解剤、（
ｄ）洗浄剤、及び標識物質として酵素が用いられる場合
には（ｅ）酵素活性を測定するための基質及び反応停止
剤をも含むことができる。更にこれら試薬以外にも発色
剤等その池の公知の試薬が使用され得る。

本発明の試料としては、なんら限定されるものではない
が例えばヒトや動物の尿、血清、血漿などの体液や細胞
培養液などが挙げられる。

［発明の効果〕 本発明の方法は、シュードウリジンを迅速、簡便に高感
度で特異的に測定し、かつバラツキが少なく、添加回収
試験や希釈回収試験など実用上十分な性ｔｒｙ、を有し
、高精度に進行症などの有無を判定することができると
いう効果を有する。また、より経済的に試薬及びキット
を提供できる。

［実施例］ 次に実施例を挙げ、本発明を説明するが本発明はこれら
実施例に限定されるものではない。

実施例１ （１）　　固定化抗体の調製 シュードウリジンに対するモノクローナル抗体は、本発
明者らが先に出願した特開昭６３−２２２６９９号公報
の実施例１に記載した方法で得た。

このモノクローナル抗体を０．１８クエン酸−リン酸緩
衝液（ｐＨ３，０）に溶解した２０μｇ　／　ｍｌ溶液
の中にポリスチレンビーズ（イムノゲミカル社製Ｄ−７
．直径６．３鰭）を加え、４℃で１８時間浸漬靜装しな
、ビーズを０．ＯＩＨＰ　Ｂ　Ｓで洗浄後、１％Ｕ　Ｓ
　Ａ　−０，ＯＩＭ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ＤＨ７，２）溶液
に２５℃で２時間浸漬し、固定化抗体を得た。固定化抗
体は０．０１Ｍｔ−リスー塩酸ｌｌｌ衝液の中に浸漬し
、４°Ｃで保存した。

（２）標識抗原の調製 シュードウリジン１ＯＮを０．ＩＨＮ　ａ　Ｉ　Ｏａ水
溶液０．３ｍｌに溶解し、水冷下４０分間ｎ？装した。

１Ｍエチレングリコール水溶液３０μ！を加えて５分間
静置後、Ｋ２ｃｏ、水溶液でｐＨを９．０に調整した。

この溶液に西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ　）の
２０ｑ／ｍｌ水溶液１　ｍｌを加え、４℃で３０分間反
応させ、シュードウリジンにパーオキシダーゼを結合さ
せた。更に、ＮａＢＨ４で還元後、０．ＯＩＮ　Ｐ　Ｂ
　Ｓ中で透析し、高速液体クロマトグラフ　イー　（Ｔ
ｏｓｏｈ　ＴＳに−Ｇｅｔ　Ｇ３０００Ｓ−）でシュー
ドウリジン−ＨＲＰ複合体を分離・精製し、シュードウ
リジン１モルに対しＩＩ　ＲＰが０．８モル結合したｔ
ｌＲＰ標識化シュードウリジン（シュードウリジン濃度
６．９μｇ／ｍｌ）を得た。

（３）　　シュードウリジンの測定 シュードウリジンの２００．　１００．５Ｇ、　２０．
１０□５．２，１，０．５．０μｇ　／　ｍｌ溶液（０
，５％ＢＳＡ−０，０５Ｍ　ＰＢＳ）の２００μ！とＨ
ＲＰｉｌ識シュードウリジンを１％卵アルブミン−０，
５％ＢＳＡ−０，４％シュクロース−０，０ＩＮ　Ｆ　
Ｂ　Ｓ溶液（ｐ１１７゜２）で４００倍に希釈した溶液
２００μ！をプラスチックチューブに加え、更に、この
中に抗体固定化ビーズ１ケを加え、３７℃で６０分間反
応させた。生理食塩液で洗浄後、５１１８　Ｈ２０ｘと
　０．０４５％３，３°、５，５°−テトラメチルベン
ジジン・塩酸塩溶液の等量混合溶液４００μ！を加え、
３７℃で３０分間反応させた。その後、ＩＮＨ２３０４
１ｍｌを加えて反応を停止させ、４５０ｎ１１の吸光度
を測定した。その結果、第１図及び第１表に示したよう
にシュードウリジン濃度に依存して固定化抗体と標識化
抗原の反応が阻害され吸光度が低下し良好な検量線が得
られた。また、このときの測定値（ｎ＝２＞のバラツキ
（変動係数ＣＶ）は５％以下で良好であった。

第１表　シュードウリジン濃度と吸光度及び変動係数（
４）希釈回収性及び添加回収性の検討（ａに記載の方法
に従って、ヒト尿検体（Ａ〜Ｄ）を用いて希釈回収試験
と添加回収試験を行った。この場合、検体は０．５％Ｂ
ＳＡ−０，０５ＭＰＢＳ溶液で２０倍希釈して測定した
。測定結果を第２表及び第３表に示した。その結果、い
ずれも１２０％以内の回収性を示し良好であった。

第２表希釈回収性試験結果 第３表添加回収試験結果 実施例２ 実施例１の（１）の固定化抗体の調製において、シュー
ドウリジンに対するモノクローナル抗体をビーズに固定
する際の抗体溶液のｐＨを１．５〜９．５の範囲で変化
させ、固定化抗体の活性を測定した。

測定方法は実施例１と同様な方法で行った。但し、シュ
ードウリジン濃度は０　、０．５，５　、５０μｇ／ｍ
ｌの点について比較した。

結果を第２図に示した。この結果から、他のｐＨで固定
した場合に比べ、抗体固定時のｐＨが２．０〜４．５の
範囲の場合は、固定化抗体と抗原との反応性が高まり、
高い吸光度を与え、感度の面でも有利であることがわか
る。

実施例３ 実施例１の（１１の固定化抗体の調製において、■モノ
クローナル抗体の濃度を１０μｇ／ｍｌとし、■固定化
後の処理を１％ＢＳＡ−２０％ラクトース０、ＯＩＨＰ
　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７，２）溶液で、２５℃３時間浸漬処
理し、脱水後、真空乾煤して固定化抗体を調製した以外
は、実施例１と同様な方法で正常人及び白血病患者の尿
検体を用いシュードウリジンを測定した。その結果を第
４表に示した。濃度表示としてはクレアチニン補正を行
い表示した。

第４表から本発明の測定は精度良く定量が可能であり、
臨床上、癌の診断やモニタリングに有用であることがわ
かる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で作成した本発明のシュードウリジ
ンの測定方法における検量線を示す。 第２図は、本発明においてモノクローナル抗体でピース
に固定するときのｐＨを変化させた場合の固定ｐＨと固
定化抗体の活性（吸光度）との関係（実施例２）を示す
。 第４表　尿検体の測定値

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、試料中のシュードウリジンを競合法で測定するに際
   し、シュードウリジンに対するモノクローナル抗体を不
   溶性担体に固定した固定化抗体と標識物質で標識した標
   識シュードウリジンを用いることを特徴とするシュード
   ウリジンの測定方法。 ２、固定化抗体が、シュードウリジンに対するモノクロ
   ーナル抗体を含有するｐＨ２．０〜４．５の水溶液中で
   該抗体を不溶性担体に固定したものである請求項１記載
   の測定方法。 ３、試料中のシュードウリジンを競合法で測定するため
   の測定試薬であって、（ａ）シュードウリジンに対する
   モノクローナル抗体を不溶性担体に固定した固定化抗体
   試薬と（ｂ）標識物質で標識した標識シュードウリジン
   とを含むことからなる測定試薬。 ４、試料中のシュードウリジンを競合法で測定するため
   の試薬キットであって、（ａ）シュードウリジンに対す
   るモノクローナル抗体を不溶性担体に固定した固定化抗
   体試薬と（ｂ）標識物質で標識した標識シュードウリジ
   ンとを含むことからなる試薬キット。