FI104376B - Hb A1c:lle spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita - Google Patents

Description

104376

Hb Alc:lle spesifisiä raonoklonaalisia vasta-aineita . Tämä hakemus on jakamalla erotettu FI-hakemuksesta 854187 5 Tämä keksintö koskee hemoglobiinin glykosyloituna

Hb Alc:na tunnetun muodon määrittämistä. Yksilön veressä olevan hemoglobiinin glykosyloitumisasteen määritys on käyttökelpoinen indeksi glukoositason tarkkailulle sokeritaudissa. Keksintö antaa käyttöön monoklonaalisia vas-10 ta-aineita, jotka tunnistavat spesifisesti glykosyloidut N-terminaaliset peptiditähteet Hb Alc:ssa.

Hemoglobiini on proteiinitetrameeri, joka muodostuu neljästä aminohappoketjusta (alayksiköstä), jossa kussakin on noin 143 osaa ja jonka kokonaismolekyylipaino 15 on noin 64 000. Molekyylin toisessa päässä (6-alayksikön NH2-pääte) on valiiniyksikkö, joka voi reagoida glukoosin kanssa. Hemoglobiinin glykosyloituminen tapahtuu ei-ent-symaattisella reaktiolla, jossa on mukana glukoosi ja valiinin α-aminoryhmä. Reagenssien välille syntyy Schiffin 20 emäsmuodostus ja glukoosille tapahtuu Amadori-uudelleenjärjestäytyminen, jolloin muodostuu 1-deoksifruktovaliini. Tämä kompleksi on kovalenttinen ja pääosin palautumaton. Glykosylointireaktiota säätelevät reagenssien, siis : hemoglobiinin ja glukoosin, konsentraatiot. Normaalilla · 25 (ei sokeritautia sairastavalla) yksilöllä noin 3 % ko- • · · · konaishemoglobiinista on glykosyloitunut. Hemoglobiinitet- • · · rameerit, joissa on 1-deoksifruktovaliini β-ketjun N-päät- teessä, identifioidaan glykosyloiduksi eli Alc-hemoglobii- ... niksi.

• · · • · · 30 Sokeritautisilla glukoositasot ovat riittävän • · · ’·) ‘ korkeita kasvattamaan glykosylaation nopeutta suoraan *:*: verrannollisena veren glukoosi tasoon, joka kuvastaa ·:· sokeritautitilan vakavuutta. Hemoglobiinissa Alc-taso on noussut noin 5-12 %:iin. Koska kiertävän hemoglobiinin- • · . 35 elinaika on noin 120 päivää, antaa glykosyloidun hemoglo- • · 2 104376 biinin mittaus arvon, joka heijastaa tämän ajanjakson keskimääräistä glukoositasoa. Erikoisesti paljon glukoosia sisältävä ateria ei heijastu korkeassa glykosyloidun hemoglobiinin tai seerumialbumiinin tasossa. Täten glykosyloi-5 dun hemoglobiinin pitoisuuden määrittämisellä saadaan totuudenmukaisempi kuva kiertävästä glukoositasosta ja siten totuudenmukaisempi kuva potilaan tilasta pitkällä aikavälillä.

US-patentissa 4 247 533 esitetään analyyttinen 10 menetelmä, jossa Hb Alc:n vasta-aineet saatiin tietystä lampaasta ruiskuttamalla Hb Alc:tä ja absorboimalla ei-gly-kosyloidulla hemoglobiinilla, jolloin saatiin polyklonaa-lisia vasta-aineita, jotka erottivat Hb Alc:n ja ei-gly-kosyloidun Hb:n. Tällaiset vasta-aineet muodostavat sitten 15 perustan kokeelle, jossa määritetään näytteessä olevan glykosyloidun hemoglobiinin osuus. Kokeessa tarvitaan kuitenkin sopivasti immunisoitu lammas ja vasta-aine- absorptiot, jotta saadaan sopiva spesifisyys. Siten on kallista ja vaikeaa tuottaa spesifisiä polyklonaalisia vasta-ainei-20 ta. Tällä absorptiomenetelmällä valmistettujen valmisteiden on raportoitu olevan matalia tiittereiltään ja af-finiteetiltaan. Tämän menetelmän toistettavuus on myös « avoin, koska ei ole olemassa selostuksia sen käytöstä ih- • · : misen hemoglobiinia sisältävien kliinisten näytteiden ana- ·:· 25 lysoinnissa.

• · · · :***; Toinen menetelmä löytää Hb Alc:lle spesifisiä vasta- • · · aineita, on esitetty US-patentissa 3 378 744. Nämä tut- kijat korvasivat immunisoivana aineena tavallisen hemoglo- ...^ biinimolekyylin synteettisellä peptidi-immunogeenillä.

• · · I,. 30 Tämä aine injektoitiin eläimeen, jolla tavallisesti ei ole • · · "*j * veressä Hb Alc:tä, esimerkiksi lampaaseen. Synteettisessä ”**: peptidi-immunogeenissä oli glykosyloitu peptiditähde, jos- ·:··; sa oli aminohapposekvenssi, joka vastaa ensimmäisiä 4-10 [ . aminohappoa hemoglobiinisekvenssissä N-päätteissä. Seuraa- • · . 35 vana esitettävät tutkimukset esittävät, että lampaan poly- • · 3 104376 klonaalisilla vasta-aineilla, jotka on saatu synteettistä peptidi-immunogeeniä vastaan, ei ole merkittävää spesifi-; syyttä glykosyloidulle muodolle, Hb Alc:lle.

Määritelmiä 5 Aminohappo_Lyhenne

Arginiini Arg

Asparagiinihappo Asp

Glutamiinihappo Glu

Lysiini Lys 10 Seriini Ser

Asparagiini Asn

Glutamiini Gin

Glysiini Gly

Proliini Pro 15 Treoniini Thr

Alaniini Ala

Histidiini His

Kysteiini Cys

Metioniini Met 20 Väliini Vai

Isoleusiini Ile *

• » I

Leusiini Leu

Tyros iini Tyr • f V·· Fenyylialaniini Phe 25 Tryptofaani Trp • · · • · • · • · · Tämä keksintö tekee mahdolliseksi määrittää erit- • · · täin spesifisesti glykosyloituja proteiineja, kuten glyko- .···, syloitua hemoglobiinia ja albumiinia ja erityisesti Hb • · · 30 Ale:tä biologisissa nesteissä, kuten veressä. Monoklonaa- • « · ‘ *, listen vasta-aineiden, jotka on saatu synteettisiä glyko- syloituja Hb Alc:ssä esiintyviä N-terminaalisia peptiditäh-*:··i teitä vastaan on havaittu sitoutuvan spesifisesti tällai- siin tähteisiin glykosyloiduissa hemoglobiinin S-alayksi- t · . 35 köissä. Vasta-aineet voidaan valmistaa erilaisilla tavan- • · 4 104376 omaisilla monoklonaalisten vasta-aineiden valmistus menetelmällä. Periaatteessa vasta-aineet valmistetaan synteettisesti johdettua immunogeeniä vastaan, jossa on haluttu glykosyloitu N-terminaalinen peptiditähde kemiallisesti 5 liittyneenä immunogeeniseen kantajaan siten, että glykosy-loidussa peptidissä on vähintään 2 ja edullisesti 5-15 aminohappoyksikköä, jotka vastaavat Hb Alc:ta. Saatavat vasta-aineet ovat spesifisiä glykosyloidulle synteettiselle peptidille ja vastaavalle esillä olevalle epitoopille 10 hemoglobiini Alc -molekyylissä.

Piirrokset ovat graafisia esityksiä esimerkeissä kuvatuista kokeista Hb Alc:n immunomäärityksestä.

Kuvio 1 on kuva, joka esittää glykopeptidi l:n aiheuttamaa (PEPTIDI 1) Ab-3:n sitoutumisen Alc:hen inhibi-15 tiota. Vasta-ainetta inkuboitiin etukäteen glykopeptidin kanssa, ennen kuin se siirrettiin Alc:llä päällystetylle mikrotiitterilevylle. Monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoo Ale:n, määritettiin käyttämällä toista vasta-aine-entsyymi-konjugaattia. Tulokset on piirretty kuvioon 1 20 inhibitio-%:na, jossa 0 %:n inhibitio on arvo, joka on saatu ilman kilpailevaa ainetta. 0-0 -viiva kuvaa * · i identtistä peptidiä, jossa ei ole hiilihydraattia, ja tämä * < '.‘•ί osoittaa sitä, että hiilihydraatti on oleellinen vasta- • · aineen sitoutumiselle. Kaikki pisteet ovat kolmen kokeen •i* 25 keskiarvoja.

• · i i :***; Kuviossa 2 on piirros, joka esittää glykopeptidin 3 ··· ·*·*· aiheuttamaa (PEPTIDI 3) Ab-3:n sitoutumisen Alc:hen inhibi- tiota. Kilpaileva koe suoritettiin kuviossa 1 esitetyllä ··. tavalla.

• · · • « · I,. 30 Kuvio 3 on piirros, joka esittää glykopeptidin 4 • ♦ « \ * aiheuttamaa (PEPTIDI 4) Ab-3:n ja Ab-4:n Alc:n sitoutumisen *Σ**ί inhibitiota. Kilpaileva koe suoritettiin kuviossa 1 esite- *:··; tyllä tavalla.

’ . Kuvio 4 on tyypillinen vakiokuvaaja käytettäessä • · 35 optimaalisia analyysiolosuhteita. Kokoverivakio valmistet- • · 5 104376 tiin käyttämällä erilaisissa suhteissa denaturoitua soke-ritautipotilaan kokoverta, jossa oli 12,66 % Alc:tä, mitat-; tuna HPLC-ioninvaihdolla, ja tavallisen luovuttajan ko koverta (3,83 % Alc). Kaikki kolmoismittausten pisteet on 5 piirretty.

Kuvio 5 on vakiokuvaaja käytettäessä synteettistä peptidivakiota. Analyysi suoritettiin kuviossa 4 esitetyllä tavalla sillä poikkeuksella, että kokoveren tilalla käytettiin erilaisia määriä synteettistä glykopeptidiä 10 kilpailijana. Kaikki kolmoismääritysten arvot piirrettiin.

Kuvio 6 on piirros, joka kuvaa immunoanalyysimene-telmän vertailua boronaattiaffiniteettimenetelmään dono-reillä. Kolmoismääritysten tulokset on piirretty immuno-analyysikoordinaattiin.

15 Kuvio 7 on piirros, joka kuvaa Hb Alc -epitoopin esille saattamista erilaisissa denaturointiolosuhteissa.

Kuvio 8 on piirros, jossa esitetään lampaan immunisoinnin tuloksia esimerkin 1 (b) mukaisella synteettisellä glykopeptidillä.

20 Kuvio 9 on piirros, joka esittää sen, että hiiren monoklonaaliset vasta-aineet ovat spesifisiä Alc -hemoglo-biinille.

HB Alc:n immunoanalyyttinen määrittäminen käyttäen • « keksinnön mukaista vasta-ainereagenssia, voi tapahtua pää-25 osin millä tahansa tavallisella menetelmällä. Tällaisia • · · f ovat klassisemmat menetelmät, kuten immunodiffuusio, im- ·»« munoelektroforeesi, agglutinointimenetelmät ja komplemen-tin sitominen, samoin kuin uudemmat menetelmät, joissa on käytettävä spesifisesti havaittavia leima-aineita, kuten • · · 30 radioimmunoanalyysi ja ei-radioisotooppiset menetelmät.

• · ·

Immunoanalyysin suorittaminen Hb Alc:lle keksinnön mukai-sesti käsittää oleelliset vaiheet, joissa käsitellään ve-sipitoinen koenäyte, jotta tehokkaasti denaturoidaan siinä mahdollisesti olevasta tästä proteiinista huomattava määrä

« I

. 35 halutun lineaarisen peptidiepitoopin saattamiseksi esille, • · 6 104376 ja saatetaan denaturoitu näyte kosketukseen vasta-ainerea-genssin kanssa, ja joissa määritetään vasta-ainereagenssin sitoutuminen tähän proteiiniin. Määritysvaihe vaihtelee t tietenkin käytetyn perusimmunoanalyysimenetelmän mukaises-5 ti. Tavallinen tähän määritykseen käytetty menetelmä käsittää leimatun reagenssin käyttämistä, joka reagoi joko analyytin tai vasta-ainereagenssin kanssa ja jota käytetään tavalla, joka osoittaa immuunikompleksin muodostumisen analyytin ja vasta-ainereagenssin välille tai kil-10 pailee tällaisen muodostumisen kanssa.

Jälkimmäinen menetelmä voidaan suorittaa lukuisilla tavoilla, kuten kilpailevalla sitoutumisella, jossa leimattu reagenssi saatetaan kilpailemaan proteiinianalyytin kanssa vasta-ainereagenssiin sitoutumisesta. Vasta-aine-15 reagenssiin sitoutuneen leimatun reagenssin määrä tai vapaan vasta-ainereagenssiin sitoutumattoman leimatun reagenssin määrä, mitataan sopivasti ja nämä voidaan funktionaalisesta suhteuttaa näytteessä olevaan proteiinianalyytin määrään. Koska tämä vasta-ainereagenssi on suunnattu 20 proteiinianalyytissä olevaan lineaariseen epitooppiin, leimattu reagenssi voi olla denaturoidun proteiinin tai • « · sen denaturoidun fragmentin leimattu muoto tai edullisesti • · lineaarisen epitoopin aminohapposekvenssin sisältävä pep- • · ·,*’! tiditähteen leimattu muoto. Jälkimmäinen edullinen rea- 25 genssi voidaan valmistaa käytössä olevilla synteettisillä peptidimenetelmillä ja laitteistoilla, eikä itse proteiini*; nimolekyyliä tarvitse eristää, puhdistaa eikä denaturoida.

Toinen käyttökelpoinen immunoanalyysimenetelmä pro-teiinianalyyttien havaitsemiseksi on sandwich-menetelmänä • · · 30 tunnettu menetelmä. Tässä menetelmässä käytetään kahta • · · \ vasta-ainereagenssia, joista toinen on leimattu ja toista « *·**· käytetään alkuperin leimatun, proteiinianalyyttiin sitou- *ί”ϊ tuneen vasta-aine-reagenssin erottamiseen sitoutumattomas- ta vasta-ainereagenssista. Leimaamaton toinen vasta-aine- • · • · 7 104376 reagenssi on tyypillisesti immobilisoitu tai immobilisoi-tavissa oleva muoto, kuten alalla on tunnettua. s Radioimmunoanalyyseissä vapaat molekyylit ja si dotut molekyylit on voitava erottaa toisistaan fysikaali-5 sesti, jotta leima voidaan mitata, sillä syntyvä signaali on kvalitatiivisesti sama molemmissa molekyyleissä. Tällainen menetelmä tunnetaan alalla heterogeenisenä, koska tarvitaan faasierotus. Tunnetaan muitakin heterogeenisiä immunoanalyysimenetelmiä, kuten entsyymileimatut immuno-10 analyysit, joihin joskus viitataan ELISA-menetelminä (ks. US-patentti 3 654 090), ja fluoresenssi-immunoanalyysit (ks. US-patentit 4 201 763; 4 133 639 ja 3 992 631).

Viime aikoina on kehitetty lukuisia immunoanalyysimenetelmiä, joissa vältetään erotusvaihe käyttämällä lei-15 maa, jonka havaittavaan signaaliin vaikuttaa leimatun rea-genssin sitoutuminen sitoutuvan aineen, siis vastaaineen kanssa. Tällaiset menetelmät ovat tulleet tunnetuiksi homogeenisinä menetelminä ja silloin kuin niitä on käytettävissä, ne ovat edullisia keksinnössä, koska erotusvaihetta 20 eikä radioisotooppeja ei tarvita. Eräitä tällaisia menetelmiä ovat fluoresenssisammutus ja -lisäys (ks. US-pa- • · ’·>·’ tentti 4 160 016), energiansiirtoimmunoanalyysi (ks. US- • · '.'l patentti 3 996 345) ja kaksoisvasta-aine - eteerinen esto « * - immunoanalyysi (ks. US-patentit 3 935 074 ja 3 998 943). tt'r 25 Erityisen edullisia homogeenisiä immunoanalyysimenetelmiä ovat sellaiset menetelmät, joissa käytetään entsyymillä • · · ;*·*; katalysoituun reaktioon osallistuvaa leimaa. Esimerkkejä ovat substraattileimattu immunoanalyysi (ks. US-patentti 4 ,···, 279 992 ja GB-patenttihakemusjulkaisu 1 552 607), pros- • · · 30 teettinen ryhmä (FAD)-leimattu immunoanalyysi (ks. US- • · t patentti 4 238 565), entsyymi modulaattorileimattu immuno-'·’*· analyysi, esimerkiksi inhibiittorileimojen käyttö (ks. US- patentit 4 134 972 ja 4 273 866) ja entsyymileimattu im-munoanalyysi (ks. US-patentti 3 817 837).

• · • · β 104376

Keksinnön mukaiselle vasta-ainereagenssille on tunnusomaista, että se sitoutuu spesifisesti Hb Alc:n lineaariseen peptidiepitooppiin. Täten tässä käytetyllä termillä "vasta-ainereagenssi" viitataan mihin tahansa aineeseen, 5 jossa on vasta-aineen sitoutumispaikka, joka on spesifinen tällaiselle peptidiepitoopille. Tämä termi käsittää siten kokonaiset vasta-aineet samoin kuin niiden sopivat fragmentit ja polyfunktionaaliset muodot. Kokonaisena vasta-aineena se voi kuulua mihin tahansa tunnettujen immunoglo-10 buliinien luokkaan tai alaluokkaan, esim. IgG, IgM jne. Mitä tahansa jonkin tällaisen immunoglobuliinin fragmenttia, jolla on spesifinen sitoutumiskyky peptidiepitooppiin, voidaan myös käyttää, esimerkiksi tavallisesti Fab:na, Fab':na ja F(ab')2:na tunnettuja IgG:n frag-15 mentteja. Lisäksi voidaan käyttää immunoglobuliinien tai niiden fragmenttien aggregaatteja, polymeerejä, johdannaisia, konjugaatteja ja hybridejä, silloin kun se sopii.

Vasta-ainereagenssin immunoglobuliinilähde voidaan saada millä tahansa käytettävissä olevalla menetelmällä, 20 kuten tavanomaisilla antiseerumi- ja monoklonaalimenetel-millä. Antiseerumi voidaan saada hyvin määritellyillä • · · ’.J.* menetelmillä, joissa eläin, kuten hiiri, kani, marsu tai • · vastaava eläin immunisoidaan sopivalla immunogeenillä.

• *

Immunoglobuliineja saadaan myös somaattisella soluhybridi-25 säätiöllä, jolla saadaan tavallisesti monoklonaalisiksi

IMI W

vasta-aineiksi kutsuttuja vasta-aineita.

• · · .'j*. Monoklonaaliset vasta-ainereagenssit ovat erityisen edullisia. Hybridoomasolulinjat saadaan tuottamaan vasta-aineita vain proteiinimolekyylin lineaarista peptidiepi- • · * *... 30 tooppiosaa vastaan pikemmin kuin kokonaista proteiinia • · · *. vastaan ja tällaiset solulinjat ja niiden vasta-aineet seulotaan selektiivisesti halutun epitoopin kanssa reagoi-"·; vien monoklonaalisten vasta-aineiden, identifioimiseksi ja eristämiseksi.

• « • · 9 104376

Eräässä menetelmässä tällaisten vasta-aineiden valmistamiseksi, proteiiniketjun fragmentti, joka vastaa ja sisältää luonnostaan esiintyvän lineaarisen peptidiepi-tooppisekvenssin, liitetään proteiinikantajaan ja injek-5 toidaan laboratorioeläimeen immuunivasteen aikaansaamiseksi. Vaihtoehtoisesti immunogeeni voi sisältää proteiinin tai sen fragmentin linearisoitua tai denaturoitua muotoa. Immunisoidun eläimen lymfosyytit, kuten pernasolut, yhdistetään myeloomasolujen kanssa, jotta saadaan hybridoomia, 10 joita viljellään ja jotka seulotaan monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamista varten. Monoklonaaliset vasta-aineet seulotaan niiden vasta-aineiden suhteen, jotka ovat selektiivisiä peptidiepitoopille, ja tämä tietty solulinja kloonataan käytettäväksi tuotettaessa lisää monoklonaalis-15 ta vasta-ainetta.

Vasta-aineiden tuottamiseksi synteettistä peptidi-immunogeeniä vastaan laboratorioeläimessä, esim. BALB/c hiirissä, rotissa tai vastaavissa eläimissä, tuotetaan peptidi, joka sisältää halutun epitoopin, ja eritetään se 20 luonnostaan esiintyvästä proteiinista tai syntetisoidaan se kemiallisesti ja puhdistetaan. Tällainen proteiinifrag-mentti sisältää halutun epitoopin kaikki kriittiset amino- '. happoyksiköt ja voi sisältää muita aminohappoyksiköitä, • · joista joku tai kaikki valinnaisesti vastaavat mielenkiin-25 non kohteena olevan proteiinin aminohapposekvenssiä.

Sen varmistamiseksi, että epitoopin sisältävä pep-tidifragmentti on optimaalisesti antigeeninen, se voidaan m edullisesti liittää moninkertaisesti immunogeeniseen kan-taja-aineeseen. Immunogeeninen kantaja-aine voi olla jokin i · » 30 yleisesti tunnetuista kantaja-aineista, jotka sisältävät · · funktionaalisia ryhmiä, jotka ovat käytettävissä peptidi- * '·**· tähteeseen sitoutumiseen. Useimmissa tapauksissa kantaja on proteiini tai polypeptidi, vaikka muita aineita, kuten hiilihydraatteja, polysakkarideja, lipopolysakkarideja, » · 35 nukleiinihappoja ja vastaavia aineita, joilla on riittävä • · 10 104376 koko ja immunogeenisyys voidaan myös käyttää. Useimmiten immunogeenisten proteiinien ja polypeptidien molekyylipai-not ovat luokkaa 4 000 - 10 000 000, edullisesti suurempia kuin 15 000 ja yleisemmin suurempia kuin 50 000. Yleensä 5 yhdestä eläinlajista otetut proteiinit ovat immunogeeni-siä, kun ne viedään toisen eläinlajin verenkiertoon. Erityisen käyttökelpoisia proteiineja ovat albumiinit, globu-liinit, hemosyaniinit, gluteliinit ja vastaavat proteiinit. Muita viitejulkaisuja tämänhetkisistä tavanomaisista 10 immunogeenisistä kantaja-aineista ja hapteenien liittämisestä niihin on esitetty seuraavassa: Parker, Radioimmu noassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, New Jersey USA, 1976); Butler, J. Immunol. Meth. (1974) 7:1 - 24; Weinryb ja Shroff, Drug 15 Metab. Rev. 10; (1974) 271 - 283; Broughton ja Strong,

Clin. Chem. 22; (1976) 726 - 732; ja Playfair et al., Br. Med. Bull. 30; (1974) 24 - 31.

Tiettyyn immunogeeniseen kantaja-aineeseen kytkettyjen epitooppien lukumäärää rajoittaa vain käytettävissä 20 olevien sitoutumispaikkojen lukumäärä kantajassa, ja lukumäärä voi olla useita tuhansia tietyillä suurimolekyyli- • « painoisilla synteettisillä peptideillä, kuten polylysii-

• I

'· *: nillä. Tietyn kantajan epitooppitiheys riippuu kantajan molekyylipainosta ja käytettävissä olevien sitoutumispaik-25 kojen tiheydestä. Optimaaliset epitooppitiheydet, joilla saavutetaan immunogeenin synteesin optimaalinen helppous ja toistettavuus sekä optimaalinen vasta-ainevaste, ovat noin 10 - 50 % käytettävissä olevista sitoutumisryhmistä kantaja-aineessa.

• · · 30 Peptidifragmentit liitetään kantaja-aineeseen joi- • · · lakin sopivalla kytkentämenetelmällä. Fragmentissa olevien ”*** natiivien aminohappojen funktionaalisia ryhmiä tai frag- *·"' mentin kemiallisella muuntamisella saatuja funktionaali- siä ryhmiä käytetään tavallisesti kytkettäessä suoraan tai -itt. 35 bifunktionaalisten kytkentäaineiden välityksellä kantajan · 11 104376 funktionaalisiin ryhmiin. Edullista on suunnitella pepti-difragmentti, jossa on yksi ainutlaatuinen reaktiivinen funktionaalinen ryhmä, jotta saadaan yksiselitteinen sitoutuminen kantaja-aineeseen.

5 Monoklonaalisten vasta-aineiden, jotka on saatu synteettisiä glykosyloituja N-terminaalisia Hb Alc:ssä esiintyviä peptiditähteitä vastaan, on havaittu sitoutuvan spesifisesti tällaisiin tähteisiin hemoglobiinin glykosy-loidussa β-alayksikössä. Vasta-aineet voidaan valmistaa 10 erilaisilla menetelmillä tavallisten monoklonaaliteknii-koiden mukaisesti. Periaatteessa vasta-aineet valmistetaan synteettisesti johdettua immunogeeniä vastaan, joka sisältää halutun glykosyloidun N-terminaalisen peptiditähteen kemiallisesti sitoutuneena immunogeeniseen kantajaan, jol-15 loin glykosyloitu peptidi sisältää vähintään 2 ja edullisesti noin 5-15 aminohappoyksikköä, jotka vastaavat Hb Alc:ta. Saadut monoklonaaliset vasta-aineet ovat spesifisiä glykosyloiduille synteettisille peptideille ja vastaavalle esille saatetulle epitoopille hemoglobiini Alc- molekyylis-20 sä.

. Monoklonaaliset vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä *;··] ihmisen veressä esiintyvälle Hb Alc:lle, erittyvät hybri- · i '· doomista, jotka on johdettu yhdistämällä myeloomasolut ja « « « · · ’. ·: synteettisellä peptidi-immunogeenillä immunisoidulta eläi- .25 meitä otetut lymfosyytit. Synteettinen peptidi-immunogeeni ··· on edullisesti muotoa: • · · • · · • · » [Glyko- (NH) Val-His-AA-R] n------Kanta j a • · · • · · • · · 30 jossa Glyko-(NH)Val vastaa ei-entsymaattisesti glykosyloi- • « · tua väliinitähdettä, His on toinen aminohappo natiivissa ’ * β-alayksikön Hb-sekvenssissä, AA on sidos tai yksi tai useampia aminohappotähteitä, R on sopiva liitosryhmä, kan-....: ta ja on immunogeeninen kantaja-aine ja n (epitooppitiheys) 35 on keskimäärin yhdestä kantajassa käytettävissä oleviin 12 104376 sitoutumispaikkojen lukumäärään. Liitosryhmä R voi olla mikä tahansa haluttu yhdistävä reagenssi ja AA voi sisältää yhden tai useamman ylimääräisen aminohappotähteen, joka vastaa hiilihydraattia sisältävää ihmisen hemoglobii-5 nin β-alayksikön N-päätettä. Ryhmä AA voidaan valita esimerkiksi seuraavista aminohapposekvensseistä tai mistä tahansa niiden jatkuvasta fragmentista, joka alkaa leusii-niyksiköllä: -Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-. Lisäksi liitos- ryhmä R voi sisältää ylimääräisiä aminohappoyksiköitä, 10 joita ei ole tavallisessa ihmisen hemoglobiinissa, mutta jotka voidaan kätevästi lisätä peptidisynteesimenetelmillä ja jotka voivat toimia funktionaalisina ryhminä sitomisessa kantaja-aineeseen. Erityisen käyttökelpoinen liitos-ryhmä on -Tyr-Tyr-Cys, jonka kautta saadaan ainutlaatuinen 15 tioliryhmä glykosyloidun peptidiyksikön liittämiseksi kontrolloidusti kantaja-aineisiin.

Keksinnön mukaiselle monoklonaaliselle Hb Alc -vasta-aineelle on tunnusomaista sen spesifisyys sitoa ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön N-terminaalisen peptidisekvens-20 sin glykosyloitua muotoa. Tämä glykosyloitu tähde on huo-, mättävä Hb Alc:n rakenneominaisuus. Keksinnön mukainen vas- « · t ta-aine vaatii epitoopin tai determinanttikohdan, jossa on I · | ' " vähintään 1-deoksifruktosyylihiilihydraattiyksikkö, joka ·.'·.· muodostuu glukoosin ja terminaalisen amiinin välisen reak- 25 tiotuotteen Amadori-uudelleenjärjestäytymisessä, ja siitä laajeneva peptidisekvenssi, joka sisältää vähintään yhden :':*: Hb Alc:n N-terminaalisen sekvenssin aminohappoyksiköistä asemassa, joka vastaa natiivin Hb Alc:n sekvenssiä. Pepti-disekvenssissä olevat muut aminohappoyksiköt, jotka ovat • · · 30 luonteenomaisia epitoopille, voivat olla samoja tai eri- • ♦ · laisia kuin natiivissa Hb Alc:n sekvenssissä esiintyvät ***** aminohappoyksiköt. Tällä tavalla epitoopille on tunnus- omaista vähintään kaksi kontakti- tai liitoskohtaa vasta-aineen kanssa, jotka kohdat ovat ainutlaatuisia glykosy-,,f<; 35 loidulle N-terminaaliselle Hb Alc -sekvenssille. Edullises- 13 104376 ti vasta-aine sitoo spesifisesti glykosyloidun peptiditäh-teen, jolla on seuraava kaava

Gluko-(NH)Val-His-AA- 5 jossa Gluko-(NH)Val ja AA ovat edellä määritellyt. Erityisen edullisten monoklonaalisten vasta-aineiden on havaittu olevan spesifisiä glykosyloidulle dipeptiditähteelle riippumatta AA:n luonteesta. Saadaan myös vasta-aineita, jot-10 ka spesifisesti vaativat pidempiä glykosyloituja peptidi-sekvenssejä, kun AA on 1 - 12, edullisesti 1-6, aminohappoa sisältävä sekvenssi, joka vastaa ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön N-päätettä. Tällainen monoklonaalisen vasta-aineen spesifisyys tekee mahdolliseksi Hb Alc:ssa 15 olevan, esille saatetun glykosyloidun N-terminaalisen pep-tiditähteen spesifisen havaitsemisen, kun taas hemoglobiinin ja muiden proteiinien Ja peptidien muut glykosyloidut peptidiepitoopit, joita esiintyy ihmisen verenkierrossa, jäävät oleellisesti havaitsematta.

20 Natiivin Hb Alc molekyylin glykosyloitu N-terminaa- linen peptiditähde saatetaan keksinnön mukaisten monok- • · · lonaalisten vasta-aineiden tai sen fragmenttien saataville *: sopivasti denaturoimalla tai hajottamalla analysoitavan '.‘j näytteen proteiini. Keksinnön mukaisten spesifisten vasta- t\" 25 aineiden valmistuksen onnistumisessa, jossa aikaisemmat :***: yritykset ovat epäonnistuneet, perustana oleva hypoteesi :*·*; esitetään seuraavaksi, mutta sen täsmäävyyttä ei tulisi pitää kriittisenä keksinnön mukaisen menetelmän keksin- .···, nöllisyydelle.

• · · #*..f 30 Ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön N-terminaalinen • · « sekvenssi on hyvin samanlainen kuin vastaava hiiren hemo- *·**· globiinin sekvenssi, jolloin ensimmäiset neljä aminohappoa '•"‘ί ovat identtiset. Lisäksi hiiren hemoglobiini on glykosy- ..i.: loitunut lähes samassa määrin kuin ihmisen hemoglobiini.

• · . 35 Siten natiivissa ihmisen hemoglobiinimolekyylissä β-alayk- • · 14 104376 sikön N-terminaalinen sekvenssi ei olisi hiirelle vieras, eikä immunovastetta olisi odotettavissa. Tämä on tunnetun tekniikan mukainen päätelmä ja sen mukaisesti on valittu eläin (lammas), jolla on aivan toisenlainen hemoglobiini-5 sekvenssi, joka ei glykosyloitunut, immunovasteen havaitsemisen toivossa. Kuitenkin esillä olevassa keksinnössä on osoitettu, että kun glykosyloitu N-terminaalinen tähde altistetaan hiiren immuunisysteemille synteettisen peptidi -immunogeenin muodossa, epitooppi esiintyy rakenteena, 10 johon hiiri voi muodostaa immunologisen vasteen. Somaattisten solu kloonausmenetelmien kautta voidaan eristää hybridoomia, jotka erittävät erittäin spesifisiä vasta-aineita. Nämä vasta- aineet sitoutuvat glykosyloituun N-terminaaliseen peptiditähteeseen natiivisessa hemoglobii-15 nimolekyylissä, mikäli se on altistunut riittävästi vuorovaikutuksen saamiseksi vasta-aineen sitovan kohdan kanssa. Epitoopin altistustapaa selostetaan tarkemmin jäl-j empänä.

Vasta-ainereagenssin steerinen pääsy epitooppiin 20 voidaan saada aikaan millä tahansa tehokkaalla tavalla. Epitoopin altistumisen koskemattomassa proteiinissa ymmär- iti retään tapahtuvan fysikaalisella tai kemiallisella denatu- .* roinnilla tai hajottamisella vähintään epitoopin alueella.

• · Tällainen denaturoiminen tai hajottaminen voidaan paikal-25 listaa epitoopin alueelle tai se voi vaatia yleisempää tai pääosin täydellistä tertiaarisen ja lisäksi sekundaarisen proteiinirakenteen denaturoimista tai osittaista tai täy-dellistä proteiinin hajottamista.

Denaturoiminen voidaan suorittaa erilaisilla ta- • · · 30 voilla mukaan lukien proteiinien tavanomaiset käsittelyme- • · · *. netelmät fysikaalisilla menetelmillä, kuten lämmöllä, uit- raäänellä, korkealla tai matalalla pH:11a, kuten on edul- lista, kemiallisella denaturoinnilla hajottamalla tai ____: saattamalla vuorovaikutukseen kaotrooppisen aineen tai • · 35 liuoksessa olevan kaotroopin kanssa. Käyttökelpoisia kao- • · 15 104376 trooppisia aineita niihin rajoittumatta ovat guanidiini, urea ja erilaiset detergentit, kuten natriumdodekyylisul-faatti (SDS) ja muut niihin rajoittumatta, esim. deoksiko-laatti ja tietyt sappihappojen suolat, 3-(3-koolamidopro-5 pyyli)dimetyyli-ammonio-l-propaanisulfonaatti, orgaaniset liuottimet, kuten metanoli, propanoli ja asetonitriili, ja tietyt suolat, kuten kaliumtiosyanaatti. Ionittomat detergentit, kuten Triton X, Tween, Nonidet NP-40 ja oktyyli-glukosidit voivat myös toimia proteiinin denaturoijina. 10 Reagensseja (esim. merkaptoetanoli tai ditiotreitoli), jotka pelkistävät disulfidisidoksia, voivat olla tehokkaita denaturointiprosessin edistäjiä. Proteiinin denatu-rointi voi olla tehokkainta, mikäli käytetään kemiallisten ja/tai kemiallisten ja fysikaalisten menetelmien yhdistel-15 miä (esim. guanidiini ja lämpö, guanidiini ja SDS tai guanidiini ja ditiotreitoli). Erityisesti voimakkaat kaotroo-pit, kuten guanidiini, ovat erityisen edullisia. Tietenkin vältetään denaturointiolosuhteita, jotka saavat aikaan huomattavaa aggregaatiota, liukenemattomuutta tai proteii-20 nin saostumista siten, että riittämätön määrä esille saa- . tettua epitooppia on saatavissa liuoksessa vasta-aineeseen * · · sitoutumista varten. Riittävä määrä denaturoitua proteii- • · t • nia täytyy jäädä liuokseen tai suspensioon, jotta saavute- • · taan käyttökelpoinen immunositoutuminen. Tarvittavan liu- 25 koisuuden määrä riippuu aiotun tai halutun sitoutumisen : : olosuhteista.

• · ·

Merkittävä määrä haluttua proteiinia tietyssä koe-näytteessä voidaan denaturoida peptidiepitoopin saat-tamiseksi esille vasta-aineeseen sitoutumista varten, yh- • · · .···. 30 distämällä näyte kaotroopin vesiliuoksen kanssa, jossa

• I I

kaotrooppia on läsnä riittävä pitoisuus denaturoimaan mer- 16 104376 sen pitoisuus on edullisesti suurempi kuin 1-molaarinen 3-molaarisen liuoksen ollessa erityisen käyttökelpoinen. Denaturointiprosessia edistää merkittävästi seoksen lyhytaikainen lämmittäminen. On havaittu, että lämpötiloissa 5 alle 37 °C denaturoiminen kaotroopilla voi kestää yhdestä useaan tuntiin, kun taas 50 °C:n yläpuolella olevissa lämpötiloissa riittävä denaturoituminen voidaan saavuttaa minuutissa tai sitä nopeammin. Jotta estettäisiin vasta-aineen ja muiden myöhemmin lisättävien proteiinireagens-10 sien merkittävä denaturoiminen, laimennetaan näyte-kao-trooppiseos tavallisesti erillisenä vaiheena tai lisäämällä reagenssiliuoksia tasolle, jolla kaotrooppi ei oleellisesti pysty denaturoimaan näitä reagensseja ja joka kuitenkin pitää epitoopin saatavilla estämällä mielenkiinnon 15 kohteena olevan proteiinin merkittävän renaturoitumisen. Guanidiinin tapauksessa tämä edullisesti vaatii laimentamisen alle noin 1,0-molaariseen pitoisuuteen.

Keksinnössä hajotuksessa käytettävistä proteolyyt-tisistä entsyymeistä ei-rajoittavia esimerkkejä ovat tryp-20 siini, kymotrypsiini, proliini-spesifinen endoproteaasi, Pepsiini ja papaiini. Suoritettaessa immunoanalyysiä ana- • · · lyysiseokseen lisätään proteolyyttisten entsyymien inhi- • · • · · . biittoreita, kuten tunnettua, riittävästi estämään pro- • · ·.**: teiinianalyysiaineiden hajoamista.

25 Tarkemmin esitettynä hybridoomasolulinjoja kasvate- taan vasta-aineiden tuottamiseksi vain hemoglobiinimole- ;*j*j kyylin glukosyloituja osia vastaan pikemmin kuin koko pro- teiinia vastaan, ja tällaiset solulinjat ja niiden vasta- .·♦·. aineet seulotaan niiden monoklonaalisten vasta-aineiden • · · #30 identifioimiseksi ja eristämiseksi, jotka tämän jälkeen * * * *. reagoivat selektiivisesti glykosyloidun Hb Alc -epitoopin ***** kanssa.

Tällaisten vasta-aineiden tuottamiseksi yhdistetään proteiiniket jun fragmentti, joka vastaa luonnostaan • · . 35 esiintyvää glykosyloitua peptidisekvenssiä, proteiinikan- » ·

: I

17 104376 tajaan ja injektoidaan laboratorioeläimeen immuunivasteen aikaansaamiseksi. Immunisoidun eläimen lymfosyytit, kuten pernasolut, fuusioidaan myeloomasolujen kanssa, hybridoo-mien saamiseksi, joita kasvatetaan ja seulotaan mono-5 klonaalisten vasta-aineiden tuottamisen suhteen. Mono-klonaalisista vasta-aineista erotetaan ne, jotka ovat selektiivisiä glykosyloidulle peptidiepitoopille ja tietty solulinja kloonataan käytettäväksi tuotettaessa lisää monoklonaalista vasta-ainetta.

10 Vasta-aineen tuottamiseksi laboratorioeläimellä, esim. BALB/c -hiirissä, rotissa tai vastaavissa eläimissä, glykosyloidun hemoglobiinifragmentin tulee joko olla tuotettu ja eristetty luonnostaan esiintyvästä ihmisen hemoglobiinista tai olla kemiallisesti syntetisoitu ja puh-15 distettu. Hemoglobiinifragmentissa tulisi olla 1-deoksi- fruktoositähde ja vähintään kaksi aminohappoyksikköä, edullisesti 3, 4, 5 tai vielä useampia tähteitä, jotka vastaavat hemoglobiinin β-alayksikön N-päätettä (väliini-histidiini). Edullisesti siinä on noin 5 - 15 ja edul-20 lisemmin 7-10 yksikköä.

. Sen varmistamiseksi, että glykosyloitu peptidifrag- • « · '·/·’ mentti on optimaalisesti antigeeninen, se voidaan edulli- • · · '· ”· sesti yhdistää kantaja-aineeseen, joka on suuri immuno- •V’.' geeninen molekyyli, kuten naudan seerumialbumiini (BSA) 25 tai tulivuorikotilon hemosyaniini (KHL). Fragmentissa tu- lisi olla myös luonnostaan uudelleenjärjestäytynyt glu- :T: koosi-valiini-reaktion addukti, joka voi olla läsnä alusta * alkaen, kuten on eristetyssä luonnostaan esiintyvässä he-moglobiinifragmentissa tai edullisesti se voidaan muodos- • « .···, 30 taa synteettiseen peptidiin sen synteesin aikana tai ennen • · · peptidin liittämistä suureen proteiinikantajaan. Kantaja • · voidaan lisätä millä tavalla tahansa, joka ei tuhoa frag- mentin antigeenisyyttä.

Glykosyloitu fragmentti voidaan tuottaa kemial- * · 35 lisella tai entsymaattisella luonnostaan esiintyvän Hb:n • · is 104376 esim. Alc:n hajotuksella. Tämä fragmentti voidaan liittää kantajaan käyttäen klassisia kytkentämenetelmiä, esim. glutaraldehydi- tai karbodi-imidi-menetelmiä, ja käyttää konjugaattia immunogeeninä.

5 Edullisessa kemiallisessa menetelmässä osan tunnet- tua hemoglobiinisekvenssiä syntetisoimiseksi tarvitaan yhden tai useamman aminohappoyksikön lisäys (joita ei ole tavallisessa sekvenssissä) sen antigeenisyyden ja kytken-täominaisuuksien optimoimiseksi. Tällöin pääteyksikkö si-10 sältää tioli (SH) -ryhmän, jonka avulla se voidaan kytkeä ligandiin tavanomaisella tavalla, kuten reaktiolla bifunk-tionaalisen kytkentäreagenssin kanssa, esim. m-maleimido-bentsoyyli N-sulfosukkinimidiesterin (MBS) kanssa.

Edullisen suoritusmuodon mukaisesti synteettisen Hb 15 fragmentin lysiinipäähän, jossa on kahdeksan yksikköä NH2-valiini-histidiini-leusiini-treoniini-proliini-glutamiini-happo-glutamiinihappo-lysiini-COOH, lisättiin tyrosiinia, ja kysteiiniä, jolloin saatiin 11 yksikköä sisältävä kys-teiinipäätteinen peptidi.

20 Tämä voidaan glykosyloida tavallisella tavalla ei- , entsymaattisella reaktiolla glukoosin kanssa. Tämän jäl- ' * keen glykopeptidi kytketään suureen kantaja-aineeseen, • « · '« * jolloin saadaan antigeeni, joka annetaan vasta-aineiden tuottamista varten. Glykosyloidulle peptidiepitoopille 25 vasta-ainetta tuottavasta eläimestä saadut lymfosyytit ··· !>t>: yhdistetään sitten tavallisella tavalla hybridoomien tuot- :T: tamiseksi, jotka kloonataan, ja ne, jotka tuottavat spesi- 9 fisyydeltään halutunlaisia monoklonaalisia vasta-aineita, kloonataan edelleen. Se solulinja tai ne solulinjat, joi-30 den monoklonaalisilla vasta-aineilla on suurin selek- • « · tiivisyys glykosyloidulle epitoopille vastakohtana ei-gly- » kosyloidulle Hb: lie, saatetaan tämän jälkeen lisääntymään ja vasta-aineet otetaan talteen. Viitejulkaisuja tällai- sista monoklonaalisista vasta-ainemenetelmistä ovat Lym- .,.,j 35 phocyte Hybridomas, toim. Melchers et ai., SpringerVerlag • « 104376 (New York 1978), Nature 266:495 (1977); Science 208: 692 (1980) ja Methods in Enzymology 74 (osa B): 3 - 46 (1981).

Vasta-aineita voidaan sitten käyttää tavalliseen tapaan reagoimaan verinäytteiden kanssa, jotka sisältävät 5 tuntemattoman määrän glykosyloitua Hb:ta, ja reaktion astetta voidaan verrata kalibroitujen standardien avulla glykosyloitumisasteen määrittämistä varten. Mittaus voi tapahtua fluoresenssilla, immunoanalyysillä tai vastaavalla tavalla, liittämällä sopivia mitattavia ryhmiä monok-10 lonaalisiln vasta-aineisiin tunnetulla tavalla ilman, että niiden sitoutumisvoima Hb Alc:n glykosyloituihin epitoop-peihin pienenee.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää reagenssitesti-liuskaan perustuvaa analyysiä, jossa karboksyyliä sisäl-15 tävä aine, kuten karboksimetyyliselluloosa, päällystetään puu- tai muoviliuskan pinnalle. Tämän jälkeen liuska upotetaan hajotettuun ja denaturoituun tuntemattomaan verinäytteeseen ja näin mahdollisesti glykosyloitunut hemoglobiini adsorboidaan. Tämän jälkeen liuska upotetaan mo-20 noklonaalisten vasta-aineiden liuokseen, jotka on sopivas- . ti leimattu (esim. entsyymi, fluoresenssi, kofaktorit « · * jne.) kohdassa, joka ei häiritse sitoutumista Hb Alc -epi- * · · • '·' toopin kanssa. Sitoutuneen vasta-aineen määrä määritetään * · liuskassa olevan leima-aineen määrän perusteella ja se 25 osoittaa tuntemattomassa näytteessä olevan glykosyloitu- ·»· neen Hb:n määrän. Leima-aineen sitoutuminen ja sen määrit-täminen suoritetaan tavanomaisella tavalla.

Liitosryhmä R edellä esitetyssä kaavassa voi olla oleellisesti mikä tahansa sopiva ja stabiili rakenne. Täi-30 lainen liitosryhmä R on tavallisesti alifaattinen ketju, • · · joka sisältää 1-20 atomia ilman vetyä ja mukaan lukien * ’ heteroatomit, kuten typpi, happi ja rikki. Glykosyloitu tähde voi olla liitettynä erilaisten ryhmien kautta, jol-loin muodostuu liitosketju R, mukaan lukien metyleeni, 35 eetteri, tioeetteri, imino ja vastaavat yhdisteet. Alan * · 20 104376 ammattimiehellä on tiedossaan suuri määrä liitosryhmiä, joista voidaan valita immunogeenin valmistamista varten. Tavallisesti glykosyloitu peptidi valmistetaan päättämällä se funktionaaliseen ryhmään, kuten amino-, karboksyyli-, 5 tioli-, hydroksyyli- tai maleimidoryhmään, joka on aktiivinen kytkentäreaktiossa sopivaan kantajamolekyylin ryhmään.

Seuraavilla esimerkeillä valaistaan kyseistä keksintöä, mutta niitä ei pidä tulkita keksintöä rajoittavik-10 si.

Esimerkki 1

Vasta-aineiden valmistaminen ja karakterisointi Hb Alc:n glykopeptidiepitoopille a) Syntetisoitiin 11 aminohappoa sisältävä peptidi, 15 jossa oli B-hemoglobiinin 8 N-terminaalista yksikköä ja kaksi tyrosiiniyksikköä ja kysteiiniyksikkö, menetelmällä, jonka ovat esittäneet Gutte, B. ja R.B. Merrifield; J. Am. Chem. Soc., 91:2,501 (1969), jolloin saatiin seuraa-vat peptidit: NH2-valiini-histidiini-leusiini-treoniini- 20 proliini-glutamiinihappo-glutaamihappo-lysiini-tyrosiini- . tyrosiini-kysteiini COOH.

i » ψ Tämän peptidin glykosyloimiseksi 200 mg tätä puh- • ♦ » • ’ distettua peptidiä saatetaan reagoimaan 0,25 molaarisen * * glukoosin kanssa 20 ml:ssa vedetöntä pyridiiniä 48 tunnin ..li' 25 ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Seos kuivataan vakuu- • · · missä. Saatava siirappi suspendoidaan uudelleen 20 milli-molaariseen kaliumfosfaattiin, pH 2,95, ja puhdistetaan HPLC:lla.

Glykopeptidin sisältävät fraktiot liuotetaan 0,1 M 30 trietyyliammoniumasetaattiin, pH 8,5, ja kromatografoidaan • · · *. Affigel-601 boronaattiaffiniteettihartsilla (Biorad), joi- ***** loin glykopeptidi adsorboituu selektiivisesti. Hartsi pes- tään 0,1 M trietyyliammoniumasetaatilla, pH 8,5, ja glyko- t

peptidi eluoidaan 0,1 M trietyyliammoniumasetaatilla, pH

• · 35 5,0. Eluaatti kylmäkuivataan.

• · 21 104376

Tuote suspendoidaan uudelleen 1 ml:aan vettä, saatetaan reagoimaan 500-kertaisen moolaarisen ylimäärän kanssa ditiotreitolia (SH-ryhmän säilyttämiseksi kys-teiinissä) ja pelkistetty peptidi puhdistetaan uudelleen 5 HPLC:lla ja kylmäkuivataan. Tämä glykopeptidi säilytetään -20 eC:ssa typen alla ennen jatkokäyttöä.

b) KLH-MBS konjugaatti, kuten aikaisemmin on esitetty julkaisussa, Lerner R. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 78:3403 (1981), saatetaan reagoimaan kohdan a) tuot- 10 teen kanssa siten, että glykopeptidiä on kaksinkertainen moolisuhde maleimidiin verrattuna kantajassa, 50 mil-limolaarisessa (mM) kaliumfosfaatissa, pH 7,2, yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa.

c) kohdan b) liuos sekoitetaan yhtä suuren tilavuu-15 den kanssa Freund'n täydellistä adjuvanttia, jolloin muodostuu vesi-öljyssä-emulsio, ja 200 pg konjugaattia injektoidaan BALB/cBy hiiriin. Hiirille annetaan tehosteannos 30. ja 60. päivinä, ne tapetaan ja niiden pernat käytetään fuusioon Kohlerin ja Milsteinin, Nature 256:495 (1975), 20 mukaisesti, jolloin saadaan lukuisia hybridoomia. Hybri-. doomat seulotaan, jotta voidaan identifioida ne, jotka « · i tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesi- • « · | ' ί fisiä glykosyloidulle peptidiepitoopille.

*\ i Alc:lle spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden t 25 seulonta suoritetaan käyttäen ELISA-menetelmää, jossa vas- • · · ta-aine absorboidaan polystyreeni-mikrotiitterilevyjen :*Γ: pinnoille (Linbro). Antigeenit ovat puhdistettuja ihmisen

Alc- ja ei-glukolysoituja Ao-hemoglobiineja. Alc puhdiste- taan ihmisen punasoluhemolysaatista käyttäen kahta eri- .···, 30 laista kromatografista menetelmää. Ensimmäisessä puhdis- • · · tuksessa glykosyloitu hemoglobiini sidotaan boronaattiaf- m • * finiteettihartsin pinnalle, Pierce Chemical Co., Rockford,

Illinois, USA, tuote nro 42 000, valmistajan kuvaamalla tavalla. Tyypillisesti käytetään 1 - 5 g hemoglobiinia 100 ,,,,· 35 ml kohti boronaattihartsia ja sitoutunut (glykohemoglobii- • · 22 104376 ni) fraktio eluoidaan, kuten Pierce Chemical Co., Glyco-Test Bulletin -julkaisussa esitetään, tuote nro 42 000. Eluoitu glykohemoglobiinifraktio tasapainotetaan ionivah-vuudeltaan matalaan puskuriin ja kromatografoidaan ionin-5 vaihtohartsilla, kuten McDonald, M. et ai., J. Biol. Chem., 253:2327 - 2332 (1978) ovat esittäneet. Alc-"piikki" analysoidaan isoelektrisellä fokusoinnilla ja hiilihyd-raattianalyysillä käyttäen tiobarbituurihappoanalyysiä ja tulokset osoittavat, että tämä puhdistusmenetelmä tuotti 10 ultrapuhdasta Alc- hemoglobiinia, koska puhdistetussa materiaalissa on sekä hiilihydraattia että tavallisesta Ao-hemoglobiinista poikkeava isoelektrinen piste hemoglobiini. Samalla tavalla Ao-hemoglobiini puhdistettiin sen ominaisuuden perusteella, ettei se sitoudu boronaattiaffini-15 teettihartsiin, ja sitten se kromatografoitiin ioninvaihdolla Ao-"piikkinä" ioninvaihtokromatografisessa puhdistuksessa. Puhtaat Alc ja Ao-hemoglobiinit adsorboidaan erillisille mikrotiitterilevyille (2 pg/100 μΐ PBS/kuoppa) yön yli 4 eC:ssa. Levyjen vapaat sitoutumispaikat täyte-20 tään l-%:lla BSAtlla PBS:ssa 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja pestään sitten neljä kertaa PBSrlla. Super- . .·. natantti kustakin hybridomasolulinjasta lisätään Alc- ja * · ·

Ao-levylle ja levyjä inkuboidaan huoneenlämpötilassa 60 • · · ! I minuuttia. Levyt pestään neljä kertaa PBS:llä ja toinen • · • *' 25 vasta-aine (kanin anti-hiiri-IgG-peroksidaasi, Miles Labo-

Ml ratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA laimennuksena 1:5 • · · 000 1 %:ssa BSA:ssa PBS:ssa) lisätään ja levyjä inkuboi- • · · V · daan 60 minuuttia huoneenlämpötilassa. Levyt pestään neljä kertaa PBS:llä ja 200 μΐ substraattiliuosta (24,3 mM sit-30 ruunahappo, 51,4 M natriumfosfaatti, pH 5,3, joka sisältää 2,2 mM o-fenyleenidiamiinia ja 5,2 mM vetyperoksidia) li-’ . sätään. Reaktio lopetetaan 20 minuutin kuluttua lisäämällä 50 μΐ 8 M H2S04:ta ja peroksidaasireaktion tuote luetaan aallonpituudella 492 nm.

• · • · 23 104376 200 lähtöhybridoomasta, jotka tuottavat vasta-aineita hemoglobiinia vastaan, yhdeksän (9) identifioidaan spesifisiksi Alc-epitoopille, kun taas 191 reagoi sekä Alc:n ja ei-glykosyloidun hemoglobiinin kanssa. Koska etukäteen 5 immunisoidun hiiren seerumilla ei esiinny havaittavaa vas-ta-ainevastetta ihmisen Ao- tai Alc -hemoglobiinille ELISA-menetelmässä, pääasiallinen immuunivaste on kahdeksaa pep-tidisekvenssiä vastaan, jotka ovat yhtä yhteisiä Alc:lle ja Ao:lle. Koska synteettinen peptidi-immunogeeni koostuu 10 hemoglobiinisekvenssin kahdeksasta aminohappotähteestä, hiirien immuunivaste kohdistuu pääasiassa peptidiä eikä hiilihydraattia vastaan (191 200:sta hybridomasta reagoi sekä Ao:n että Alc:n kanssa). Kuten on odotettua, immunisoidun hiiren seerumissa on myös laajasti ristiin reagoi-15 via vasta-aineita, jotka reagoivat sekä Ao:n että Alc:n kanssa, mikä viittaa siihen, ettei spesifisyyttä Alc:lle saavuteta, ellei hybridoomia seulota Alc:lle eikä Ao-hemo-globiinille reaktiivisuuden suhteen. Edullisia hybridoomia, jotka tuottavat vasta-aineita Alc-hemoglobiinia vas-20 taan eivätkä Ao-hemoglobiinia vastaan, talletettiin ATCC:hen identifioituina talletustunnuksin ATCC HB 8639 . ja ATCC HB 8869, 11. lokakuuta 1984 ja 10. heinäkuuta « « « .1985, vastaavasti.

• i · r < * · ! d) Alc:n kanssa vasta-aineen sitomisesta kilpaile- • ’’ 25 vien peptidien identifiointi.

• · ·

Seuraavat peptidit valmistetaan entsyymihajotuk-sella glykosyloidusta 11 aminohappoa sisältävästä lähtö-

IM

·.· · peptidistä GlykoVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-

Cys (Glykopeptidi 1). Kaikki peptidifragmentit puhdiste-30 taan HPLC:lla ja kvantitoidaan aminohapposekvenssillä.

:*·*; Lähtöpeptidin tryptisellä hajottamisella tuotettiin pep- * . tidi Glyko-Val-His-Leu-Thr-ProGlu-Glu-Lys (Glykopeptidi 2). Proliinispesifinen endoproteaasi tuottaa peptidin Glyko-Val-His-Leu-Thr-Pro (Glykopeptidi 3). Peptidi Glyko- ·:·: 35 Val-His-FAD (Glykopeptidi 4), jossa dipeptidi on yhdistet- • m 24 104376 ty N6-aminoheksyyli-FAD:iin ja sitten glykosyloitu, valmistetaan menetelmällä, jonka ovat esittäneet Carrico ja Johnson, US-patentti nro 4 255 566, ja joka on saatu tri. Kin Yip*Itä ja tri. R. Buckler'Itä, Ames Division, Miles 5 Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana USA.

Tyypillisessä kilpailuanalyysissä kutakin peptidiä, kahdeksan nanomoolia - kahdeksan pikomoolia 100 pl:ssa PBS:ää, jossa 7,2 mM Na2HP04, 2,8 mM NaH2P04 ja 127 mM NaCl, pH 7,4, inkuboidaan 100 μ1:η kanssa monoklonaalista solu-10 viljelysupernatanttia 60 minuuttia huoneenlämpötilassa. Tämä seos lisätään polystyreeni mikrotiitterilevylle, joka on päällystetty 1 pg:lla Alc hemoglobiinia/kuoppa. Mikäli peptidi kilpailee vasta-aineen kanssa, ei vasta-aine ole vapaa sitomaan immobilisoitua Alc:ta. Levy pestään neljä 15 kertaa PBSrlla. Toinen vasta-aine kanin anti-hiiri-IgG kytkettynä piparjuuriperoksidaasiin) lisätään 30 minuutin ajaksija levy pestään PBS:lla. Substraatti (2,2 mM o-feny-leenidiamiini) ja vetyperoksidi (0,012 %) lisätään ja syn-tynyt väri mitataan aallonpituudella 492 nm. Tuotteen 20 määrä viittaa kilpailun asteeseen esim. jos tuotetta ei ole yhtään, se merkitsee sitä, että kilpaileva peptidi .kokonaan esti vasta-aineen sitoutumisen immobilisoituun Alc:n. Tulokset osoittavat, että kaikki neljä aikaisemmin I · · ,* I esitettyä glukopeptidiä mukaan lukien Gluko-Val-His-FAD, »Il 25 ovat tehokkaita kilpailijoita. Glykopeptidit 1-4 estävät • » » ···! täysin yhden vasta-aineista, Ab-4:n, sitoutumisen A,_:hen *...· (ks. kuviot 1 - 3). Glykopeptidit 2-3 mutta ei Glyko- • · · V · peptidi 4, estävät toisen vsta-aineen, Ab-3:n (ks. kuviot 1 - 4).

30 Peptidit, joilta puuttuu hiilihydraatti, eivät in- hiboi kilpailevasti, mikä osoittaa, että hiilihydraatti on • . oleellinen epitoopin komponentti ja tuottaa spesifisyyden vasta-aineiden Alc -hemoglobiinin tunnistamiselle (ks. kuvio 1).

• • * 25 104376

Esimerkki 2

Kilpaileva immunoanalyysi Hb Alc:lle Tämä kilpaileva immunoanalyysi perustuu siihen, että käytetään tiettyä määrää hapteeni-leimaa (kuten esi-5 tetään esimerkissä 5), joka kilpailee hajotetun kokoveren Alc:n kanssa immobilisoidun vasta-aineen sitomisesta. Koska vasta-aine tunnistaa sekä Alc:n että hapteenin, näytteessä oleva Alc:n määrä määrää sen hapteeni-leiman määrän, joka sitoutuu vasta-aineeseen. Koska vasta-aine on immobilisoi-10 tu voidaan kaikki sitoutumaton reagenssi poistaa yksinkertaisella pesuvaiheella. Sitoutunut leima voidaan sitten määrittää ja verrata standardiin alkuperäisissä verinäytteissä olevan Alc:n määrittämistä varten.

Analyysi on kehitetty käyttäen kokoverta näytteenä 15 ja menetelmä voidaan jakaa seuraavana esitettäviin vaiheisiin: (1) Solujen hajotus - hemoglobiinin denaturointi

Koska lopullisessa analyysissä tarvitaan kokoverta alle 0,3 μΐ, laimennetaan tarkasti pipetoitavissa oleva 20 määrä verta (5 - 50 μΐ sormenpäästä tai kokoverta) denaturoivaan liuokseen (3 M guanidiini-HCl, 10 mM Tris-HCl, pH

. 7,5) ja liuosta kuumennetaan 56 °C:ssa 2-15 minuuttia.

• · ·

Alempia lämpötiloja voidaan myös käyttää, mutta silloin · · i ! tarvitaan enemmän aikaa näytteen denaturoimiseksi täydel- ' 25 lisesti. Denaturointi (a) inaktivoi koaguloitumismekanis- • « « ;·· min, mikäli näytteitä ei ole valmistettu antikoagulanteis- • · *···' sa; (b) hajotttaa punasolut; (c) denaturoi proteaasit,

Ml \· · entsyymit jne, ja optimaalisesti saattaa esille hemoglo biinin Alc-epitoopin; (d) vaikuttaa joko steriloivasti tai :T: 30 estävästi mikro-organismien kasvuun denaturoidussa veri- näytteessä, vaikka näytettä ei olisi valmistettu ja käsi-* . telty aseptisesti (esim. veri sormenpäästä) ja (e) saa aikaan stabiilin kliinisen näytteen, jota voidaan säilyttää päiviä huoneenlämpötilassa, ilman että sillä on vaiku-*:“: 35 tusta lopulliseen analyysiin.

• · 26 104376 (2) Laimennus ja kilpailu

Pieni määrä denaturoitua kokoverta pipetoidaan tilavuudeltaan kymmenkertaiseen määrään puskuria, joka sisältää hapteeni-leiman. Tämä tehokkaasti laimentaa hemo-5 globiinin analyysiin sopivaan pitoisuuteen ja laimentaa denaturoivan aineen alhaiseen pitoisuuteen, joka ei häiritse vasta-ainetta tai entsyymiaktiivisuutta. Vasta-aineella päällystetty helmi lisätään sitten tietyksi ajaksi, jona aikana vasta-aine sitoutuu joko Alc- hemoglobiiniin 10 tai hapteeni-HRP:en.

(3) Pesu ja lukeminen

Kilpailevan inkuboinnin jälkeen helmi pestään ja leima luetaan sopivan substraatin lisäämisen jälkeen. Tämän jälkeen signaalia verrataan standardiin ja määrite-15 tään alkuperäisessä kokoverinäytteessä olevan Alc:n määrä.

Yhteenveto analyysin yksityiskohdista esitetään seuraavassa:

Helmen päällystysmenetelmä:

Polystyreenihelmet (halkaisija 0,63 cm, peilimäinen 20 pintakäsittely) valmistaa Precision Ball Company, Chicago,

Illinois, USA. Erät seulotaan, jotta saadaan helmiä, joil-. la esiintyy vähiten vaihtelua saman näytteen useissa im-

I I

,/. munoanalyysimäärityksissä. Ennen päällystämistä helmet • · ! pestään absoluuttisella metanolilla ja sen jälkeen vedel- ' ,· 25 lä. Metanolipesu vaikutti merkittävästi alentavan saman • * « ···· näytteen useiden määritysten variaatiokerrointa. Tämän • ·

*··.* jälkeen vasta-aineliuos (5 pg vasta-ainetta/100 μΐ 0,2 M

• · · V · natriumboraattia, pH 8,5, jossa on 0,02 % natriumatsidia) lisätään kosteisiin helmiin ja helmiä pyöritetään yön yli :T: 30 4 °C:ssa. Tämän jälkeen helmet pestään, tyhjät sitoutumis- kohdat täytetään 1 %:lla BSArlla PBS:ssa, jossa on 0,02 % * . natriumatsidia. Tyypillisesti päällystetään 500 - 1 000 | helmeä samalla kerralla ja niitä käytetään viikkoja ilman todisteita vasta-aineaktiivisuuden pienenemisestä. Pääl-·:··: 35 lystyskokeet, joissa käytettiin radioaktiivista vasta- • « 27 - 104376 ainetta osoittivat, että 0,5 pg vasta-ainetta sitoutuu helmeä kohti.

Helmiä käytetään tässä immunoanalyysissä, koska ne pystyvät sitomaan suhteellisen suuria proteiinimääriä.

5 Proteiinin hydrofobinen absorptio polystyreenin pinnalle on käytännöllistä, mutta se voitaisiin varmasti korvata jollakin monista menetelmistä, joissa proteiinit kiinnitetään kovalenttisesti polystyreeniin, funktionalisoi-tuihin hartseihin tai piioksidiin. Polystyreeni voi olla 10 malliltaan myös putki tai kyvetti.

Työskentelymenetelmä on seuraavananlainen: (a) Laimenna 50 μΐ kokoverta 1,0 mitään denaturointiliuosta (3 M guanidiini-HCl, 10 mM Tris, pH 7,5), kuumenna 56 °C:ssa 15 minuuttia, laimenna edelleen 15 100 pl 1,0 mitään denaturointiliuosta.

(b) Lisää 50 μΐ edellä saatua liuosta 0,5 mitään fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) pH 7,5, joka sisältää hapteeni-HPRtää. Inkuboinnit, pesut ja entsymaat-tiset reaktiot suoritetaan kätevästi 48-kuoppaisilla poly- 20 styreenikudosviljelylevyillä.

(c) Lisää vasta-aineella päällystetty helmi ja in- .kuboi 30 minuuttia huoneenlämpötilassa samalla ravistaen.

• · « (d) Pese helmet puskurilla (PBS) (tavallisesti 3 • · ! pesua 1 ml annoksilla).

• · · ’ / 25 (e) Lisää o-fenyleenidiamiinisubstraatti ja vety- • · · ···· peroksidi.

·*** (f) Pysäytä reaktio ja lue tuote 20 minuutin kulut- • · · V · tua. Edellä esitettyä analyysiä käytetään seuraavana esi tettyjen kliinisten tulosten määrittämisessä. Vakiokuvaa-: 30 ja on esitetty kuviossa 4. Kilpailu käyttäen Glykopeptidi l:tä esitetään kuviossa 5. Normaalien ja diabeettisten ' , luovuttajien arviointi esitetään kuviossa 6. Boronaattiaf- ] finiteettimääritykset on suoritettu täsmälleen valmis tajan, Pierce Chemical Co:n (GlycoTest, tuote nro 42 000) :··: 35 kuvaamalla tavalla.

• · 28 104376

Esimerkki 3

Alc -epitoopin optimaalinen esille saattaminen

Ihmisen Alc-epitoopin optimaalinen reaktiivisuus saadaan käsittelemällä natiivia hemoglobiinia (kokoveressä 5 tai hemolysaatissa) menetelmillä tai reagensseilla, jotka saattavat epitoopin esille vasta-aineen sitoutumispaikal-le. Epitoopin optimaalinen esille saattaminen voidaan saada aikaan fysikaalisella denaturoinnilla (lämpö, ultraääni, jne), kemiallisella menetelmällä, jossa käytetään 10 klassisia denaturoivia aineita (urea, guanidiini, SDS, proteaasi) tai fysikaalisten ja kemiallisten menetelmien yhdistelmällä. Tehokkain on menetelmä, jossa kokoveri (50 μΐ) lisätään 1 ml:aan liuosta, jossa on 3 M guanidiinive-tykloridia ja 10 mM Tris-HCl:a, pH 7,4 ja liuosta kuumen-15 netaan 56 °C:seen yli yhdeksi minuutiksi. Saatava näyte toimii optimaalisesti seuraavissa Alc -epitoopin immunoana-lyyseissä. Liuos voidaan laimentaa kymmenenteen osaan puskurilla, jolloin guanidiini laimenee 0,3 M:n pitoisuuteen, jolla on vähän tai ei ollenkaan vaikutusta normaaleihin 20 vasta-aine-antigeeni-vuorovaikutuksiin ja entsyymiak tiivisuuksiin ja on sopiva väliaine seuraavissa immuno- , analyyseissä.

• · » Käytetään esimerkin 2 mukaista kilpailevaa immuno- • · · i analyysiä. Kilpailija on sokeritautisen kokoveressä oleva « « · • / 25 Alc. Kokoverinäyte viedään 3,0 M guanidiiniin 20 °C:ssa, m •••j 37 eC:ssa tai 56 °C:ssa 0 - 320 minuutin ajanjaksoiksi.

*·..* Tulokset (kuvio 7) osoittavat, että ajan kuluessa ··· · 20 °C:ssa tai 37 °C:ssa, epitooppi tulee esille ja siten tehokkaasti kilpailee hapteeni-HRP konjugaatin kanssa. 30 56 °C:ssa epitooppi tulee esille maksimaalisesti viiden :*·*: minuutin kuluttua, joka on aikaisin piste, joka on määri- * , tetty tässä analyysissä. Tulokset osoittavat, että natii- ] vissa hemoglobiini Alc -tetrameerissa epitooppi on sisään päin ja saavuttamattomissa eikä kilpaile lineaarisen syn- •:··* 35 teettisen glukopeptidi-HPR konjugaatin kanssa. Kuitenkin « « 29 104376 mikäli hemoglobiini Ale denaturoidaan, tulee juuri esille saatetusta epitoopista tehokas kilpailija lineaariselle glykopeptidi-entsyymikonjugaatille.

Esimerkki 4 5 Vasta-ainespesifisyyden vertailu: Lampaan polyklo- naalinen vasta-aine verrattuna hiiren monoklonaaliseen vasteeseen

Lammas immunisoidaan, viiteen paikkaan, IM Freundin täydellisessä adjuvantissa esimerkin 1 (b) mukaisella gly-10 kopeptidi-KHL-konjugaatilla (4 mg). Tehosteinjektiot suoritetaan samalla tavalla 30 ja 60 päivän kuluttua. 60 päivän tehosteannos on Freundin epätäydellisessä apuaineessa. Etukäteen immunisoitu seerumi ja immuuniseerumi määritettään niiden AAlc- ja Ao- spesifisyyden suhteen ELISA-ana-15 lyysissä, kuten esitetään esimerkissä 1 (c). Tulokset (ks. kuvio 7) osoittavat, että synteettinen glykopeptidi stimuloi immuunivasteen ihmisen hemoglobiinia vastaan, mutta immunoglobuliinit eivät ole spesifisiä AAlc-hemoglobiinia vastaan. Tätä vastoin hiiren monoklonaaliset vasta-aineet 20 Alc:lle ovat aivan spesifisiä Alc:lle mitattuna samalla analyysillä (esimerkin 1 (c) ELISA-analyysi; ks. kuvio 8).

; Yritykset puhdistaa lampaan antiseerumista immuno- « i · .·. : affinisesti vastaainetta, joka on spesifinen Aleille,

• I I

.* eivät onnistuneet.

• » I

25 Esimerkki 5 • · « 1 1 “** Hapteeni-leima-konjugaattien valmistus Valmistet- • · tiin Glykopeptidi l:n (HPR):n konjugaatti.

• · · ’·* ' Hapteeni-HPR-konjugaatti valmistettiin saattamalla 15 mg piparjuuriperoksidaasia (HPR) reagoimaan 10-kertaisen : 30 molaarisen ylimäärän kanssa MBS:ää (ks. esimerkki 1 b) 50 ml:ssa natriumfosfaattia, 1 mM EDTA, pH 7,0. MBS-HRP-kon-jugaatti puhdistettiin geelisuodatuksella (käyttäen edellä • esitettyä puskuria) ja 0,34 mg glykopeptidihapteenia (Pe-. ' ptidi 1) lisättiin. Lopullinen hapteeni-HPR-konjugaatti '·“· 35 puhdistettiin geelisuodatuksella HPLC:lla ja käytettiin » « 104376 30 laimennuksena 1:1 000 1:100 000 esimerkin 3 mukaisessa kilpailevassa immunoanalyysissä.

Esimerkki 6

Testiliuska-immunoanalyysi Hb Alc:lle 5 a) 1 mg esimerkin 1 (c) mukaista monoklonaalista vasta-ainetta 0,1 M natriumboraattipuskurissa, pH 8,5, voidaan sekoittaa 200-kertaisen molaarisen ylimäärän fluoreseiini-isotiosyanaattia (FITC) ja antaa reagoida 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Fluoreiinilla leimattu mono-10 klonaalinen vasta-aine voidaan puhdistaa geelisuodatuk-sella.

b) Testiliuska (polystyreeni, selluloosa jne), jossa on COOH-ryhmiä, upotetaan 0,5 ml:aan tuntematonta denaturoitua hemolysaattia, pH 7,5. Liuska huuhdotaan pus-15 kurilla pH:ssa 7,5 ja upotetaan puskuroituun liuokseen, jossa on kohdan a) mukaista fluoreseiinileimattua monoklonaalista vasta-ainetta viideksi minuutiksi huoneenlämpö-tilassa. Liuska huuhdellaan uudelleen ja liuskan fluore-senssiaste kuvaa tuntemattoman näytteen Hb Alc:n astetta. 20 Esimerkki 7

Monoklonaalisen vasta-aineen liittäminen reagenssi- . liuskaan ja sen käyttö immunoanalyysissä « « · ; Whatman 1 -suodatinpaperi (7 cm) viedään 20 ml:aan I' \ jääkylmää d-H20:ta ja liuoksen pH säädetään välille 10,5 - • « i * 25 11,5 5 M NaOH:lla. Liuosta tarkkaillaan koko aktivoinnin •"j ajan ja pH pidetään välillä 10,5 - 11,5 lisäämällä tipoit- • · *···* tain 5 M NaOH:ta. Pieni sekoitussauva viedään sen dekant- ··♦ V : terilasin pohjalle, jossa suodatuspaperi on. Tämän jälkeen dekantterilasi viedään jäällä täytettyyn petrimaljaan, ·.· * 30 joko laitetaan magneettisekoittajan päälle. Dekanterila- siin lisätään 1 g kiinteää BrCN:a ja tätä inkuboidaan sa-maila sekoittaen 20 minuuttia (jäissä). Suodatinpaperi • · , poistetaan liuoksesta ja pestään 100 ml:11a jääkylmää tis lattua vettä (d-H20). Tämän jälkeen se pestään jääkylmässä 35 0,2 M Na2HP04-sitruunahappopuskurissa, pH 6,8. Vasta-aine « • · » · · • · 31 104376 (1 mg/ml 0,2M Na2HP04~sitruunahappopuskurissa, pH 6,8) lisätään ja vasta-aineen kytkeytymisen annetaan tapahtua yhden tunnin ajan. Etanoliamiinia (10 ml 1 mM:sta liuosta) lisätään täyttämään reagoimattomat paikat (15 min) ja pa-5 peri pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, 10 mM NaH2P04, 140 mM NaCl, pH 7,5) reagoimattomien komponenttien poistamiseksi.

Tämä reagenssiliuska upotetaan standardisoituun määrään tuntematonta, denaturoitua hemolysaattia, jossa on 10 vasta-ainesitoutumisen leimattu kilpailija Ale hemoglobiinille. Sopiva kilpailija on glykopeptidi (Glykopeptidi 1), joka on kovalenttisesti kiinnitetty piparjuuriperoksi-daasiin (Hapteeni-HRP). Liuska poistetaan ja huuhdotaan PBS:11a. Liuskaan sitoutunut hemoglobiinin määrä mitataan 15 (määrä on kääntäen verrannollinen näytteen Alc:han ja Alc-hemoglobiini voidaankvantitoida vertaamalla standardinäyt-teisiin.

Esimerkki 8

Alc:n ELISA-määritys 20 Tietty tilavuus denaturoitua verihemolysaattia (100 μΐ) lisätään polystyreenimikrotiitterilevyille ja . annetaan sitoutua huoneenlämpötilassa 60 minuuttia. Levy

I I I

,·, ; pestään neljä kertaa PBS: 11a, jossa on 0,05 % Tween-20:tä

I I

^ (PBST). Monoklonaalinen vasta-aine (sitoutuneena piparjuu- ’ / 25 riperoksidaasiin) lisätään (100 μΐ, 1 μg/ml) PBST:ssa ja M» •**j annetaan reagoida 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Yli- • · *···* määräinen vasta-aine poistetaan pesemällä neljä kertaa V* PBST:lla. Lisätään substraatti (o-fenyleenidiamiini, 2,2 mM) ja H202 (0,012 %) PBS:ssa ja reaktiotuote mitataan aal- 30 lonpituudella 492. Värin voimakkuus kuvaa hemolysaatissa olevaa Alc:n määrää verrattaessa standardiarvoihin.

^ *. Esimerkki 9 « «

Ale:n radioimmunoanalyysi 100 μΐ denaturoitua verihemolysaattia (200 nmoolia '.*·: 35 hemoglobiinia) sekoitetaan 7 nmoolin kanssa jodattua pep- * • · 32 104376 tidiä Glyko-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Cys (500 000 pulssia minuutissa/7 nmoolia). Monoklonaalista vasta-ainetta lisätään määrä, joka on riittävä sitomaan 50 % glykosyloidusta peptidistä, jos verihemolysaatissa on 5 tavallinen (noin 3 %) määrä Alc_ hemoglobiinia. Suuremmat hemoglobiini Alc-arvot kilpailevat peptidin kanssa samalla pienentäen vasta-aineen sitomien pulssien kokonaismäärää. Vasta-aine voidaan ottaa talteen immuunisaostamalla toisella vasta-aineella (kanin anti- hiiri-IgG) tai absorp-10 tiolla proteiini A -päällystetyille hiukkasille. Vasta-aineeseen sitoutunut jodattu peptidimäärä voidaan määrittää gammaisotooppilaskimessa ja se antaa verihemolysaatissa olevan Alc:n määrän verrattaessa standardeihin.

Tulee ymmärtää, että selitys ja esimerkit ovat va-15 laisevia mutta eivät kyseistä keksintöä rajoittavia ja muita suoritusmuotoja, jotka ovat keksinnön hengen ja suo-japiirin mukaisia, on alan ammattilaisten löydettävissä.

i i « f I f I I I

' I

* I « I · I « • f • « ·

• f I I I

« • M ft ···♦ ··· • · • · ··♦ • Φ» € · ft • · · • M • ♦ « * * · • ft ft • · · • ♦ · • ft ft · • • · ft »MH « ft ft • > » ' ft « ft

Claims (10)

104376

1. Monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, joka sisältää vasta-aineen sitomiskohdan, tunnettu 5 siitä, että se sitoutuu spesifisesti ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön glykosyloituun N-terminaaliseen peptidisek-venssiin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnettu siitä, et- 10 tä se sitoutuu spesifisesti glykosyloituun peptiditäh-teeseen, jolla on kaava Glyko-(NH)Val-His-AA jossa Glyko-(NH)Vai merkitsee ei-entsymaattisesti glykosyloitunutta valiinitähdettä ja AA on sidos tai yksi 15 tai useampia lisäaminohappotähteitä.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnettu siitä, että AA on 1 - 12 aminohappoa sisältävä sekvenssi, joka vastaa ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön N-päätä.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen mono klonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnet - :ti,: t u siitä, että se on muodostettu immunogeeniä vastaan, * · joka sisältää glykosyloitua peptidiä kemiallisesti liitet-tynä immunogeeniseen kantaja-aineeseen, jolloin glykosy- ··· 25 loidussa peptidissä on vähintään kaksi aminohappoyksikköä, jotka vastaavat hemoglobiinin β-alayksikön N-päätä, tai de- IM naturoitua tai hajotettua proteiinia vastaan. • · ·

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mono- ... klonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnet- « « · 30. u siitä, että se sitoutuu spesifisesti mainittuun glyko- I « I * syloituun N-terminaaliseen peptidisekvenssiin, kun se on saatettu esille riittävästi, jotta vasta-aineen pääsy sii-; hen on steerisesti mahdollista.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen monoklonaalinen 35 vasta-aine tai sen fragmentti, tunnettu siitä, et- « · 104376 tä mainittu glykosyloitu peptidisekvenssi on saatettu esille vasta-ainetta varten fysikaalisen tai kemiallisen dena-turoinnin tai hajotuksen avulla.

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen monoklo-5 naalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnettu siitä, että mainittu glykosyloitu peptidisekvenssi on saatettu esille vasta-ainetta varten kemiallisen denaturoinnin avulla saattamalla se kosketukseen kaotrooppisen aineen, edullisesti guanidiinin, urean, tiosyanaatin tai detergen-10 tin, kanssa.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mono-klonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, tunnet-t u siitä, että se sitoutuu spesifisesti mainittuun glyko-syloituun N-terminaaliseen peptidisekvenssiin tai hemoglo- 15 biiniin, joka on adsorboitu edullisesti polystyreenistä tai selluloosasta valmistetulle kiinteälle pinnalle.

9. Hybridoomasolulinja, joka erittää monoklonaalis-ta vasta-ainetta, joka sitoutuu spesifisesti ihmisen hemoglobiinin β-alayksikön glykosyloituun N-terminaaliseen 20 peptidisekvenssiin ja jonka ATCC-talletusnumero on HB 8639 tai 8869.

10. Hybridoomien, joiden ATCC-tunnusnumerot ovat HB : 8639 tai HB 8869, tuottamat monoklonaaliset vasta-aineet hemoglobiini Aic:lle. • I « • · « • ·· * • · · • · • · t · · • · · • * · * · · • · · • · « * · · • · · • · · • · · • « f I ( · « · « • « 35 104376