JPH03123487A - 新規ポリペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

産ＪＬヒ曵末」Ｌ汰Ｉ− 本発明はある種の癌細胞から産生されるポリペプチドを
コードするｃＤＮＡをクローニングし。 それを使用して、本来の癌細胞が産生ずるポリペプチド
を遺伝子工学的手法を用いて産生ずる方法に関する。 災来夏技権 ある種の細胞が分泌する蛋白、ポリペプチドの単離精製
は、その生理活性を指標にして種々の方法、例えば、ゲ
ルろ適法、吸着クロマトグラフィー、電気泳動１等電点
分画法により行われるが。 存在する生理活性物質の量が少ない場合は、その単離に
は困難が伴う。この点を解決するため、当ポリペプチド
を遺伝子工学的手法により大量に産生させる事を試み、
本来の細胞が産生ずるポリペプチドと免疫学的測定法に
おいて同等に反応する本ポリペプチドを産生させる事が
可能になっている。 一方、癌細胞が増殖因子等、種々のポリペプチドを分泌
する事は知られており、これらのポリペプチドと癌との
関連について関心がもたれている。 例えばヒト乳癌細胞のＭＣＦ７は、ＴＧＦ（ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）　ａ　
、β、γ〔デイクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ）等、キャンサ
ーリサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、）　４６．１７０７
−１７１３．（１９８６））　、インスリン様増殖因子
〔ハフ（Ｈａｆｆ）等、キャンサー　リサーチ（Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　４６．４６１３−４６１９．（１
９８６））また血小板由来増殖因子〔ブラウゼルト（Ｂ
ｒｏｕｚｅｒｔ）等、プロシージングオブナショナルア
カデミーオブサイエンスユーエスエー（Ｐｒｏ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　８４．５７６３−５７６７　（１
９８７））等を分泌することが知られている。 一方、本発明者等の一人は、このように種々の増殖因子
を分泌するＭＣＦ７細胞と増殖因子の１種であるＥ　Ｇ
　Ｆ　（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔ
ｏｒ）との関係を調べるため、ヒトＥＧＦを測定できる
Ｅｒ　Ａ　（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓ５ａｙ
）　を確立し、ＭＣＦ７やヒト胃癌細胞のＭＫＮ−４５
、ＫＡＴＯ−ｎｌの培養液について測定を試みた結果、
ＥＧＦと異なる新規の物質が産生されていることを見出
した。 これは上記のヒトＥＧＦ測定系中に、ＥＧＦに対する抗
体の他に別の抗体が混じっていた為に検出されたものと
考えられる。そして、この新規ポリペプチドと癌との関
連を知る目的で、このポリペプチドの精製を行い、その
構造を明らかにすると共に〔バイオケミカルバイオフィ
ジカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。 Ｃｏｍｍ、）　１５５３６６（１９８８））　、これに
基いて特許出願を行なっている（特願平１−３５１１１
号）。 このポリペプチドは、Ｎ末端がＥＡＱであり、アミノ酸
が６０個からなるものであり、このポリペプチドはヒト
乳癌細胞であるＭＣＦ７．あるいはヒト胃癌細胞である
ＭＫＮ−４５もしくはＫＡＴＯ−■の産生する新規ポリ
ペプチドであり、またこのポリペプチドは等電点が４．
３、分子量は６，６６１ダルトンであり、そのアミノ酸
配列は ＥＡＱＴＥＴＣＴＶＡＰＲＥＲＱＮＣＧＦＰＧＶＴＰＳ
ＱＣＡＮＫＧＣＣＦＤＤＴＶＲＧＶＰＷＣＦＹＰＮＴＩ
ＤＶＰＰＥＥＥＣＥＦである。 更に、ヒト乳癌細胞において、エストロゲンによって誘
発されるｍＲＮＡについては、シャンボン（Ｃｈａｍｂ
ｏｎ）等がその完全な塩基配列を解明しており、この塩
基配列から８４個のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（９１４０ダルトン）の存在が予測されている。そして
この８４個のアミノ酸配列におけるシグナルペプチド配
列を予測し、実際に分泌されるポリペプチドが、５８個
のアミノ酸配列からなるもの（６４５０ダルトン）ある
いは６３個のアミノ酸配列からなるもの（６９７０ダル
トン）ではないかと予測している〔シャンボン等、ヌク
レイツク　アシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　１２．　Ｎｏ、６　（１９
８４）　２８６１−２８７８、及びシャンボン等、ディ
ーエヌ　ニー（ＤＮＡ）　（４）　１１〜２１　（１９
８５）〕。しかしながら、これはあくまでも予測にすぎ
ず、実際にこのような分泌ポリペプチドをアミノ酸配列
が確定できるまで、単離精製はしてぃなかっだのである
。 明が解　しようどする問題占 このようにヒト乳癌細胞のＭＣＦ７等が分泌しているポ
リペプチドを単離、精製し、このポリペプチドと癌等と
の関連の究明のために供することが、この分野で望まれ
ていたのであるが、少量のポリペプチドを単離、精製す
るのは困難であり、又このポリペプチドは天然のものか
ら大量に安定に抽出することは難かしいこともあって、
このポリペプチドを大量に産生ずる方法の提供が望まれ
ていたのである。 占を　　するための 本発明者等はこのポリペプチドを大量に製造する方法と
して、ヒト乳癌細胞のＭＣＦ７等から得られるｍＲＮＡ
から相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、それを基にして
本ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有
する発現型ベクターを製造、これを大腸菌、酵母または
動物細胞等に組み込んだ、いわゆる遺伝子組み換えによ
り本ペプチドを大量に製造する方法を提供するものであ
る。 本発明は（ｉ）Ｎ末端がＥＡＱであり、アミノ酸が６０
個からなるポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する
ＤＮＡ、（ｉｉ）該ＤＮＡを大腸菌、酵母、動物細胞の
発現用ベクターに、Ｎ末端がＥＡＱであり、アミノ酸が
６０個からなるポリペプチドを発現させるように構築し
た組み換えＤＮＡ、（ｉｉｉ　）該組み換えＤＮＡを保
持する形質転換体、（ｉｖ）該形質転換体を培養し、培
養物中にＮ末端がＥＡＱであり、アミノ酸が６０個から
なるポリペプチドを生成蓄積せしめ、これを採取するこ
とを特徴とする、該ポリペプチドの製造法に関するもの
である。 本発明方法におけるポリペプチドをコードする塩基配列
を有するＤＮＡを含有する発現型ベクターは、例えば、
（ｉ）種々の本ペプチド産生細胞、例えばＭ　ＣＦ　７
細胞などからメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を分
離し、（…）該ｍＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ　（ｃＤ
ＮＡ）を１次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、（ｉｉｉ）該
相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込み、（
ｉｖ）得られた組み換えファージまたはプラスミドで宿
主を形質転換し、（Ｖ）得られた形質転換体を培養後、
形質転換体から適当な方法１例えば本ペプチドの一部を
コードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
により、あるいは抗水ペプチド抗体を用いたイムノアッ
セイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージある
いはプラスミドを単離し、（ｖｉ）その組み換えＤＮＡ
から目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、（■）該
クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプ
ロモーターの下流に連結する、ことにより製造すること
ができる。 本ペプチドをコードするｍＲＮＡは、種々の本ペプチド
産生細胞、例えばヒト乳癌細胞であるＭＣＦ７．あるい
はヒト胃癌細胞であるＭＫＮ−４５もしくはＫＡＴＯ−
Ｉｌｌなどから得ることができる。 これら本ペプチド産生細胞からＲＮＡを調製する方法と
しては、グアニジンチオシアネート法〔（ジェー・エム
・チルブライン（Ｊ、Ｍ、　、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）ら、
バイオケミストリー（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　
、　１８．５２９４（１９７９））などが挙げられる。 このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵
素を用いて、例えば岡山（）１．ｏｋａｙａｍａ）らの
方法〔モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　（１，ｅｌｌｕｌａｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　２゜１６１　（１９８２）および
同誌３　２８０（１９８３））に従いｃＤＮＡを合成し
、得られたｃＤＮＡをプラスミドに組み込む。 ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸
菌由来のｐＢ　Ｒ３２２［ジーン（ｇｅｎｅ）、２９５
（１９７７））、ρＢＲ３２５（ジーン、４，１．２１
（１９７８））、ｐＵ　Ｃ１２〔ジーン、月ｊ、、２５
９（１９８２））、ｐＵ　Ｃ１３（ジーン、Ｕ片２５９
（１９８２））、枯草菌由来のＰＵＢＩＩＯ（バイオケ
ミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーヨ
ン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎ）、旦２６７８（１９８３）：ｌなどが挙げられる
が、その他のものであっても、宿主内で複製増殖される
ものであれば、いずれをも用いることができる。またｃ
ＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、たとえば
λｇｔｌｌ（ヤング及びデーヴイス（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ
，、ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，、）プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、
８０．１１９４（１９８３））などが挙げられるが、そ
の他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば
用いることができる。 プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、ティー
・マニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュ
ラー拳クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）　＝１−ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラト
リ−（Ｃｏ１．ｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ−
ｂｏｒａｔｏｒｙ）、第２１１−２６８頁（１９８２）
に記載の方法などが挙げられる。またファージベクター
にｃＤＮＡを組み込む方法としては、たとえばヒューン
（Ｈｙｕｎｈ、Ｔ、Ｖ、）らの方法〔デイ−・エヌ・ニ
ークローニングアプラクティカルアプローチ（ＤＮＡ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒ
ｏａｃｈ）上、　４９（１９８５））などが挙げられる
。 このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主たと
えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌。 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などに導入する。 上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２Ｄ
　Ｈ１（プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。 Ａ、）１１６０（１９６８））、Ｍ２Ｏ３（ヌクレイツ
ク・アシッズ・リサーチ、（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、９３０９（１９８１））、Ｊ
Ａ２２１（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ））、１２０５］７（１９７８）〕、　Ｈ
Ｂ　１０１（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー月１４５９（１，９６９））、　Ｃ６００（ジェ
ネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、血４４０（１９
５４））などが挙げられる。 上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチリ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍ　Ｉ　
１１４（ジーン。 υユ２５５（１９８３））、２０７−２１（ジャーナル
・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ％８７（１９８４））などが
挙げられる。 プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、たとえ
ばティー・マニアティス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら
。 モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、第２４９頁（１９８２）に記
載のカルシウムクロライド法あるいはカルシウムクロラ
イド／ルビジウムクロライド法などが挙げられる。 またファージ・ベクターを用いる場合には、たとえば増
殖させた゛大腸菌にインビトロパッケージング法を用い
て導入することができる。 本ペプチドｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含有する本ペプチドｃＤＮ
Ａライブラリーは上記の方法などで得ることが出来るが
、ＭＣＦ７ｃＤＮＡライブラリーから本ペプチドｃＤＮ
Ａをクローニングする方法としては、本ペプチドのアミ
ノ酸配列に基づいて化学合成したオリゴヌクレオチドを
プローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション
またはプラークハイブリダイゼーション法〔ティー・マ
ニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー
・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃ
ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ−ｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）、（１９８２））などが挙げられる。 このようにしてクローン化された本ペプチドｃＤＮＡは
必要があればプラスミド、例えばρＢＲ３２２゜ｐＵｃ
ｌ、２．　ｐＵｃｌ３．　ｐＵｃｌ８．　ｐＵｃｌ９．
　ｐＵｃｌ１８．ｐＵｃｌ１９などにサブクローニング
してポリペプチドｃＤＮＡを得ることができる。 このようにして得られたＤＮＡの塩基配列を、たとえば
マキサム・ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒ
ｔ、　ｗ、、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ニー・
ニス・ニー（ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、）、７４，５６０（１９７７））
あるいはジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、ら、ヌ
クレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）９３０９（１９８１））
によって決定し、既知のアミノ酸配列から本ペプチドを
コートするｃＤＮＡ（式Ｉ）が得られる。 と記のようにしてクローン化された本ペプチドをコード
するＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制
限闇素で消化して使用することが出来る。 クローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモータ
ーの下流に連結して発現型ベクターを得ることができる
。 該ＤＮＡはその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これら
の翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成りＮ
Ａアダプターを用いて付加することもできる。さらに該
ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモーターを接続
する。 ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐ、ＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵｃ１２、ｐＵｃ
１３）、酵母由来プラスミド（例、ＹＩｐ、ＹＥｐ、Ｙ
Ｒｐ、ＹＣｐ）、あるいはλファージなどのバクテリオ
ファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィルスな
どの動物ウィルスなどが挙げられる。 本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。 形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である場合は
、ｔｒｐプロモーター、ｆｌａｃプロモーター、ｒｅｃ
Ａプロモーター、λＰＬプロモータＱＰＰプロモーター
などが、宿主がバチルス属菌である場合は、５ＰＯＬプ
ロモーター、ＳＰ○２プロモーター、ｐｅｎＰプロモー
ターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨ０５プロモー
ターＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ
プロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリ
キア属菌でプロモーターがｔｒｐプロモーターまたはえ
ＰＬプロモーターであることが好ましい。 宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターメタロチオネイ
ンプロモーター　ヒートショックプロモーターなどがそ
れぞれ利用できる。 なお、発現にエンハンサ−の利用も効果的である。 このようにして構築された本ペプチドの成熟ペプチドを
コードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転
換体を製造する。 宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。 上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具体例としては
、前記したものと同様のものが挙げられる。 上記酵母としては、たとえばサツカロマイセスセレビシ
ェ（Ｓａｃｃａｒｏｎ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）　Ａ　Ｈ２２。 ＡＨ２２Ｒ、ＮＡ３７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄなどが挙
げられる。 動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７、Ｖｅ
ｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ。 マウスＬ細胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。 上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばプ
ロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オ
ブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ）、６９．２１１０（１９７２）やジ
ーン、１７，１０７１０７（１９などに記載の方法に従
って行なわれる。 バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
　、１６８，１１１（１９７９）などに記載の方法に従
って行なわれる。 酵母を形質転換するには、たとえばプロシージング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、
７５．１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行な
われる。 動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジ−（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）昇、４５６（１９７３）に記載の方
法に従って行なわれる。 このようにして、本ペプチド成熟ペプチドをコードする
ＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転
換体が得られる。 宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉。 ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニラム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカーペプトン、カゼ
イン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機
または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウ
ム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが
挙げられる。 また、間借、ビタミン類、生長促進因子などを添加して
もよい。 培地のｐＨは約５〜８が望ましい。 エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉ
ｌｌｅｒ）　＋ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・
イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊ。 ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）。 ４３１−４３３．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮｅｗＹｏｒｋ　１９７
２）が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率
よく働かせるために、たとえば３β−インドリルアクリ
ル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や攪拌を
加えることもできる。 宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０’
Ｃで約６〜２４時間行ない、必要により通気や攪拌を加
えることもできる。 宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
）最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、ら、［プロ
シージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ）７７．４５０５（１９８０）　］が挙げられ
る。培地のＰＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培
養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必
要に応じて通気や攪拌を加える。 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１２２　。 ５０１　（１９５２）］　、　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地〔ヴ
イロロジ−（Ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ）、８，３９６（１９
５９））、　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地〔ジャーナル
・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーショ
ン（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉ
ｃａｎＭｅｄｉｃａｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）　１
９９，５１９（１９６７）］、　１９９培地〔プロシー
ジング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオ
ロジカル・メディスン（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ
　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ）７３．１　（１９５０
））などが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ま
しい、培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間
行い、必要に応じて通気や攪拌を加える。 上記培養物から本ペプチド成熟ペプチドを分離精製する
には、例えば下記の方法により行なうことができる。 成熟ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際
しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め
、これを適当な緩衝液に懸濁し。 超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによっ
て菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過に
より本ペプチドの前駆体たんばくや成熟ペプチドの粗抽
出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素
や塩酸グアニジンなどのたんばく変性−剤や、トリトン
Ｘ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中に前駆体たんばくや成熟ペプチドが分泌される
場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体ある
いは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このように
して得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる前
駆体たんばくや成熟ペプチドは、自体公知の分離・精製
法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの
公知の分は、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの
溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過
法、および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換
クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、ア
フィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を
利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの
疎水性の差を利用する方法１等電点電気泳動法などの等
電点の差を利用する方法などが挙げられる。 かくして生成する本ペプチドの前駆体たんばくや成熟ペ
プチドは特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイな
どにより測定することができる。 作」し４転

【 本発明のＤＮＡでＤＮＡ感染または形質転換した菌体や
細胞では、大量の本ペプチド前卵体たんばくや成熟たん
ばくを大量に生産、精製することができる。 本ポリペプチドはある種の癌細胞から生産、分泌される
もので、癌との関連が予測され、癌の増殖機構の解明、
ひいては癌の治療薬の提供に役立つものと考えられる。 また、このポリペプチドは、既知の、すい臓から分泌さ
れるパンクレアティックスパスモリティックエンザイム
（ＰａｎｃｒｅａｔｉｃＳｐａｓｍｏｌｙｔｉｃ　ｅｎ
ｚｙｍｅ　、ＰＳＰ）［ジョージエンセン（Ｊｏｒｇｅ
ｎｓｅｎ）等、レギュレートリーペプチド（Ｒｅｇｕｌ
ａｔｏｒｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ）　３　、２０７−２１９
（１９８２））と相同性が高く、このものがもつ腸管ぜ
ん動抑制作用があることが推定され、また筋収縮弛緩作
用が推定される。 本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏ＋＋
＋ｍ１ｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏ
ｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野にお
ける慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に
明示しなければＬ一体を示すものとする。 ＤＮＡ　　：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ　　：アデニン Ｔ　　：チミン Ｇ　　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＲＮＡ　　：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メツセンジャーリポ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸 ＡＴＰ　　：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　　ニドデシル硫酸ナトリウム Ｇ　ニゲリシン Ａ　：アラニン Ｖ　：バリン Ｌ　：ロイシン ■　：イソロイシン Ｓ　：セリン Ｔ　：スレオニン Ｃニジスティン Ｍ　：メチオニン Ｅ　：グルタミン酸 Ｄ　：アスパラギン酸 Ｋ　：リジン Ｒ：アルギニン Ｈ：ヒスチジン Ｆ　：フエニールアラニン Ｙ　：チロシン Ｗ　ニトリブトファン Ｐ　ニブロリン Ｎ　：アスパラギン Ｑ　：グルタミン 実】１殊 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れに限定されることはない。 後述の実施例で得られた形質転換体サツカロマイセス　
セレビシｘ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２Ｒ／ｐＧＬＤ９０６−１０は平
成１年２月２１日に通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所（ＦＲＩ）にブダペスト条約に基き受託番号Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−２３０１として寄託され、また該微生
物は平成１年２月２８日から財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に受託番号ＩＦ０　１０４６５として寄託されてい
る。 ｍ　　ＭＣＦ７細胞ｃＤＮＡライブラリーの作製 ＭＣＦ７細胞１を１０％ウシ胎仔血清を含むイーグル最
少培地中にて単層培養し、１０’個の細胞よりＲＮＡを
グアニジン・熱フェノール法〔マニアティスティ（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、Ｔ、）ら、モレキュラークローニングア
　ラボラトリ−マニュアル（Ｍ。１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌ
ｏｎｉｎｇ−Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ
）、ｐｐ、１９４−１９５、１９８２）を用いて抽出し
、このＲＮＡからポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴｄＴセルロ
ースカラムクロマトグラフィーにより精製した（同上、
ｐｐ１９７−１９８）。このポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型と
するｃＤＮＡを岡山らの方法で作製し、ｃＤＮＡライブ
ラリーを作製した。 １奮性Ｌ　本ペプチドの一部をコードするＤＮＡプロー
ブの作製 ９番目のＶａｌから１５残基目のＧｉｎまでのアミノ酸
配列　Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒ
ｇ−ＧｉｎをコードするＤＮＡ配列のうち、最も使用頻
度の高いコドンをラーゼ（Ｌａｔｈｅ、Ｒ，）の報告〔
ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、珪閃、　１−１２（１９８５）に従って選
出し、次のような配列を持つ、ＤＮＡプローブを合成し
た。 ”ＧＴＧ　　ＧＣＣＣＣＣＣＧＴ　　ＧＡＡＡＧＡ　　
ＣＡＧ” このＤＮＡプローブの５′端をＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて”Ｐ−りん酸化し、ｃＤＮＡライブラリ
のスクリーニングに用いた。 ＩＬ粁主　本ペプチドのｃＤＮＡの単離とその塩基配列
の決定 大腸菌Ｃ６００ｈｆｌに前述のｃＤＮＡライブラリーを
感染させてブレーティングし、コロニーを出現せしめた
。コロニーをナイロン膜にうつしとり、３１Ｐで標識し
た前項のＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションを行
なった。ハイブリダイゼーションは、４２℃で行なった
。ハイブリダイゼーション陽性の数個のクローンをそれ
ぞれ単離し、そのうちのひとつであるＮｏ、５２のｃＤ
ＮＡ部分の塩基配列を決定した。このプラスミドに含ま
れるｃＤＮＡ部分は１．８Ｋｂｐであった。このｃＤＮ
Ａ部分の塩基配列をサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の方法「
プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ）７４．５４６３−５４６７（１９７７）
）によって決定した。この塩基配列およびそれより推定
される前駆体蛋白質のアミノ酸配列を式Ｉに示した。ロ
コで囲った領域が、本ペプチドである。 式■ Ａ　ＴＣＣＣＴＧ　ＡＣＴ　ＣＧＧ　ＧＧＴ　ＣＧＣＣ
ＴＴ　　２２ＭｅｔＡｌａ　　　２ ２３　　ＴＧＧ　ＡＧＣＡＧＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣ
Ａ　ＡＴＧ　ＧＣＣ４６３Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａ
ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　　１０４７
　　ＡＣＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＣＡＡＧ　ＧＴＧ　Ａ
ＴＣ，ＴＧＣ−７０＋１　　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　
　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　　１８７
１　　ＧＣＣＣＴＧ　ＧＴＣＣＴＧ　ＧＴＧ　ＴＣＣＡ
ＴＧ　ＣＴＧ　　％ＴＣＴ　ＧＣＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧ
　ＡＣＧ　ＧＧＧ　ＴＧＣＣＧＴ　ＣＣＣＣＡＧ　ＣＡ
ＣＧＧＴ　ＧＡＴ　ＴＡＧ　ＴＣＣＣＡＧ　ＡＧＣＴＣ
Ｇ　ＧＣＴ　ＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＧＡ　ＣＡＣ
ＣＴＣＡＧＡ　ＣＡＣＧＣＴ　ＴＣＴ　ＧＣＡＧＣＴ　
ＧＴＧ　ＣＣＴ　ＣＧＧ　ＣＴＣＡＣＡ　ＡＣＡ　ＣＡ
ＧＡＴＴ　ＧＡＣＴＧＣＴＣＴ　ＧＡＣＴＴＴ　ＧＡＣ
ＴＡＣＴＣＡ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　ＧＣＣＴＡＡ　ＡＡＡ
　ＴＴＡ　ＡＡＡＧＡＧ　ＡＴＣＧＡＴ　ＡＴＴ 実施例３に記載のプラスミドＮｏ、５２（２０Ｐｇ）を
それぞれ４０ユニツトの制限醒素Ｂａ１ｌとＰｖｕ■〔
ともに全酒造（株）〕で消化した後、１．５％アガロー
スゲル電気泳動を用いて、０．３６ＫｂＤＮＡ断片を分
離した。本ＤＮＡ断片（２μｇ）にＸｈｏＩリンカ−ｄ
（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）（全酒造（株）〕を０．１μｇ加
え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ〔全酒造（株）　）　２００ユ
ニツトを用いて５０μＱの反溶液（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−）１ｃＱ、　ｐＨ７，６／６．６ｍＭ　ＭｇＣＱ２／
１０鱈ジチオスレイト−・ル１０．１ｍＭ　ＡＴＰ）中
で１４℃、１６時間反応させた。次に３０ユニツトの制
限酵素ｘｈＯ１〔（株）ニラボンジーン〕を加え、３７
℃、２時間反応を行い、ＤＮＡ断片両端のトリミングを
行った。本ＤＮＡ断片０．５μｇと、酵母用発現ベクタ
ーｐＧＬＤ９０６−１　（特開昭６１−４３９９１号）
を制限酵素５ａｌＩで消化して得られた９、４Ｋｂ　Ｄ
ＮＡ断片０．１ｇｇを２００ユニツト（７）　Ｔ　４．
　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用いて上記の反応液（５０μＱ
）中で連結し、Ｅ。 ｃｏｌｉＤＨＩ（モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。 ｒａｔｏｒｙ；１９８２）の形質転換を行なった。得ら
れたアンピシリン耐性の形質転換体からプラスミドｐＧ
ＬＤ９０６−１ｏを分離した（第１図）。 プラスミドｐ　Ｇ　Ｌ　Ｄ９０６−１０３μｇを用いて
、プロトプラスト法〔ヒンネン（ｌ（ｉｎｎｅｎ）等、
プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ）７５．１９２７（１９７８）〕によりサ
ツカロマイセスセレビシェ（ＳａＣＣｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ａ　Ｈ２２Ｒ−（宮の原
ら、プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）８０゜１　（１９８３））の形質転
換を行った。その結果ロイシンを含まない培地で生育で
きる形質転換体ＡＨ２２Ｒ７ｐ　Ｇ　Ｌ　Ｄ９０６−１
０を分離した。 ７ｓ母を宿主とする本ペプチドの ペプチドの生産 実施例４で得られた多くの形質転換体Ｓ　、　ｃｅｒｅ
ｖｉｃｉａｅ　ＡＨ２２ＲＶｐＧＬＤ９０６−１０から
数珠を選び以下の方法によりこれらのペプチドの生産能
を調べた。 Ｋｉｔａｎｏ（バイオ／テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣ
ＮＯＬＯＧＹ）　。 ５　、２８１（１９８７））らの培地５ｍΩを試験管に
分注し、これに形質転換体を接種した後、３０℃で３日
間振盪培養した。その１ｍＱを同一培地１０ｍ　Ｑを分
注した試験管に移し、３０℃で１日振盪培養した。次に
その３ｍｆｌを前と同一の培地３０ｍＱを含む２００ｍ
Ｑフラスコに移し、３０℃で２日間培養した。 得られた培養液を３，０００回転で１０分間遠心分画し
、上清と菌体に分離した。菌体はＲｏｓｅらの方法〔プ
ロシーデイングオブザナショナルアカデミーオブサイエ
ンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
）、　７８．２４６０（１９８１））により破砕し、抽
出液を得た。すなわち、１０ｍＱの培養液より集菌した
菌体を一度ＳＭバッファー（８５ｍＭ　　ＮａＣＱ、１
ｍＭＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　
、　ｐ　Ｈ７，４）で洗浄した後、−８０℃で菌体を凍
結した。凍結菌体に１ｍＱの破砕用バッファ　　（１０
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　、　ｐＨ８，０，２０％Ｇ
ｌｙｃｅｒｏｌ、　１　ｍ　Ｍ　　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　、
　１ｍ　ＭＤＴＴ）と２ｇのグラスビーズを加え、ポル
テックスミキサーによる強い攪拌で破砕した。これを遠
心分離し、上清を菌体抽出液とした。 本ペプチドの定量は、以下に示すＥＩＡによって行った
。 プレート感作 抗−ｈＥＧＦを含むＩｇＧ分画（ウサギ血清より精製）
２００μｇ／ｍＱを５０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８
，０）に加えたものを、１００μＱ／ウエルずつ９６穴
プレート（住人ベークライト製）に分注した。３７℃、
３時間反応させた後、液を捨てて、更にバッファーＡを
加えブロッキングを行った。そして更に４°Ｃで一晩静
置した。バッファーＡの組成は次のとおりである。 ０．１Ｍ　リン酸バッファー　（ｐＨ７，０）０．１％
牛血清アルブミン（ＢＳＡ） ０．３Ｍ　ＮａＣ１ ０，１％　ＮａＮ。 １ｍＭ　ＭｇＣ１□ そしてこのアッセイ系を用いて、次のようにしてアッセ
イを行なった。 アッセイ プレート使用直前にバッファーＡ２００μＱ／ウエルで
１回洗浄した。バッファーＡ１００μＱ／ウエルとサン
プル１００μＱを加えた（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）。 このものを４℃で一晩反応させた。次いで洗浄バッファ
ー２００μＱ／ウエルで４回洗浄した。このものに、Ｆ
　ａ　ｂ　’−ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（洗浄バッ
ファーで原液を１０００倍希釈したもの）■００μＱ／
ウェルを加え３７°Ｃで４時間反応させた。その後、洗
浄バッファー２００μＱ／警ｅｌｌで４回洗浄し、０゜
１Ｍ　リン酸バッフγ−（ｐ　Ｈ７，０）中に溶解した
０゜６％ＨＰ　Ｐ　Ａ　（３−（ｐ−ハイドロキシフェ
ニル）プロピオン酸〕を１００μＱ／ウエル及び０．０
１５％Ｈ２Ｏ２を１００μＱ／ウェル加え、３７℃で１
時間以上反応させ、０．１Ｍグリシン−Ｎ　ａＯＨ（ｐ
　Ｈ１０，３）５０　ｐ　Ｑ／υｅｌｌで反応を停止さ
せた。このものをダイナミＭ ツクＤＹＮＡＴＥＣＨＭＩＣＲＯＦＬＵＯＲ（白色・蛍
光増強用）に移し、イムノリーダー（Ｉｍｍｕｎｏｒｅ
ａｄｅｒ）で蛍光を測定した（３６５ｎＩ１１励起、　
４１５ｎｍ蛍光測定）。なお、対照として、次のものを
用いた。 負（ｎｅｇａｔｉｖｅ）　：　Ｈ２０（０）正（ｐｏｓ
ｉｔｉｖｅ）　：Ｏ，ｌ　Ｎ硫酸中の１．０Ｍｇ／＋ｎ
Ｑキニン　（１００） その結果、形質転換体は、菌体内と菌体外に本ペプチド
を生産していることがわかった。 菌体内　　　　　　菌体外 Ｂ（破砕液のみ）Ｏ Ｌ　ＡＨ２２Ｒ−Ｎｏ、１　５４．１　　　　　２０２
２　　７１　　Ｎｏ、３　５２．０ ３　　　ＪＪ　　Ｎｏ、５　５４．８ ４　　７１　　Ｎｏ、７　６６．１　　　　　２３０５
　　　／Ｌ　　Ｎｏ、９　５９．８　　　　　２２７６
　　　Ｈ（：、　　　Ｑ　　　　　　　　ＯＣ：　　ベ
クターをもたない対照 夫灸鮭ゆ　　　　　での本ポリペプチドの動物細胞、例
えばＣＯ３７，ＣＨ○細胞での本ポリペプチドの発現の
目的で以下の図に示すようなプラスミドを構築した。 プラスミドＮｏ、５２を精製し、Ｐｓｔｌで切断後、Ｔ
４ポリメラーゼで処理し、ＢｇｌＩＩリンカ−を結合し
た後、ｐ　Ｔ　Ｂ　５５１のＢｇｌｌｌサイトに組み込
み、ｐＴｓ６００２を得た（第２図）。 このプラスミドを動物細胞のＣＯ３７に導入し、本ポリ
ペプチドの産生をＥＩＡ検討した結果５細胞外の培養液
中に本ポリペプチドが分泌されていることを確認した。 また細胞内にもその存在を確認した。 細胞外（ｐｍ／ｍｌ）　　　細胞内（ｐｇ／ｍｌ）検体
　１　　　３３，５　　　　　１０．８２　　　　　３
８．５　　　　　　　３７．５３　　　　　４４．０　
　　　　　　３０．０４　　　　　３６．５　　　　　
　　５１．０さらに第３図で示したようにして作製した
プラスミドｐＴｓ７００３で形質転換したＣＨＯ細胞（
Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｌｌｙ　ｃｅ
ｌｌ）には、細胞外液中に１０２０．３７５０．１７０
０．２１５０．１０７０　ｐｇ／ｍｌの本ポリペプチド
を産生する細胞株が得られた。 酵母形質転換体ＡＨ２２ＲＶρＧ　Ｌ　Ｄ　９０６−１
０を３ＳＳ−システィン存在下に培養し、その上清に、
本ポリペプチド測定用のＥＩＡに使用した抗体を加え、
３７℃、１時間、４℃で一晩静置後、プロティンＡセフ
ァロースを添加し、抗原、抗体複合体として回収した後
、２０％のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、乾
燥後、オートラジオグラフをとり、判定した結果、分子
量が約８，０００ダルトンの位置に単一バンドとして同
定された。ＭＣＦ７１胞を同様に培養液中に３５３−シ
スティンを添加して培養し、その上清を上記の方法と同
じくポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した（第４
図）。このようにして発現させた本ポリペプチドは、大
量に精製でき、その生理活性の検討に供し得る。 上記の実施例７で得た酵母（Ａ　Ｈ２２Ｒ−／ｐ　ＧＬ
　Ｄ　９０６−１０）培養上清ＩＱを１％酢酸で透析（
Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３　、登録商標）し、凍結乾燥
した後０．０５Ｍの酢酸アンモニウム（ｐ　Ｈ５，５）
　２５ｍ　Ｑに溶解した。沈殿物は４℃における３００
Ｏｒｐｍ、　１０分の遠心分離で除去した。次いでＤＥ
ＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ａ　＝　
２５のカラムクロマトグラフィー（第５図）、セファデ
ックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−５０，スーパーファ
イン（Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ　）を使用したゲルろ過法（
第６図）、逆相の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）を経て（第７図）、　ＥＩＡ陽性分画のＮｏ、７を
アミノ酸配列の決定に使用した。 ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５のカラムクロマトグ
ラフィーに当っては、カラムは直径１．６ｃｍＸ　４３
Ｃ！ＩＩ長、床容積１００ｍ　Ｑのものを用い、０．８
ｍ　ＱＺ分の流速で０．０５　Ｍから２Ｍの酢酸アンモ
ニウム（ｐＨ５，５）直線勾配で溶出を行い、ファルマ
シアＦＰＬＣシステムを用い、１０ｍ　Ｑ　／分画で分
画した。これらの分画のＡ　２８０ｎｍにおける吸光度
。 電導度、ＥＩＡ　（酵素免疫活性）の測定を行い、第５
図にその結果を示した。分画数２１〜３０の本ペプチド
に相当する部分について凍結乾燥を行い、このものを１
％酢酸１０ｍ　Ｑに溶解してゲルろ過工程に移った。 ゲルろ過に当っては、直径２．５Ｃ１ｌｌＸ１０８■長
、床容積５００ｍ　ＱのセファデックスＧ−５０スーパ
ーフアインを用い、０．２ｍｕ／分の流速で１％酢酸で
溶出を行い、４ｍΩ／分画の割合で分画した。 Ａ　２８０ｎｍにおける吸光度、電導度、ＥＩＡの測定
を行い、第６図にその結果を示している。分画数８９〜
１０１の部分について凍結乾燥を行い、このものを１０
％ＴＦＡ１００μＱに溶解して逆相ＨＰＬＣ工程に移っ
た。 逆相ＨＰＬＣに当っては、直径４．６ｎｖｎＸ　２５０
ｍｍ長のカラム（Ｉｉ！ａｋｏｐａｋすａｃｏｓｉｌ　
ＩＯＣ１，、’７１録商標）を用い、０〜５０％ＣＨ３
ＣＮ含有０．１％ＴＦＡ直線勾配を１．０ｍ　Ｑ　７分
の割合で流し、１．５ｍ　Ｑ　／分画の割合で分画した
後、ＥＩＡ測定を行った。 その結果を第７図に示す。試料（分画数７）を凍結乾燥
し、２０％のアセトニトリルに溶解した後、エドマン分
解を行い、定法通り分析した結果、Ｎ末端配列は各アミ
ノ酸を一文字表示で表わすと。 ＥＡＱＴＥＴＣＴＶＡＰであった。この配列は本発明者
の一部が発見したヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７細胞の分泌す
る新規ポリペプチドの２５〜３５残基と一致し、ＭＣＦ
−７細胞が分泌するペプチドと同じであることが判明し
た（特願平１−３５１１１号参照）。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵母を宿主とする本ペプチド発現ベクターの構
築図であり、第２図及び第３図は動物細胞を宿主とする
本ペプチド発現ベクターの構築図である。第４図は酵母
およびＭＣＦ７細胞で生産される本ポリペプチドの同定
に関する電気泳動図である。 第５図、第６図および第７図は本発明で得られた本ポリ
ペプチドの精製の過程を示す図であり、第５図がカラム
クロマトグラフィー、第６図がゲルろ過法、第７図が逆
相高速液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｎ末端がＥＡＱであり、アミノ酸が６０個からな
   るポリペプチドを、コードするＤＮＡを含有するＤＮＡ
   。
2. （２）ポリペプチドの等電点が４．３である請求項１記
   載のＤＮＡ。
3. （３）ポリペプチドの分子量が６，６６１である請求項
   １または２記載のＤＮＡ。
4. （４）アミノ酸配列が ＥＡＱＴＥＴＣＴＶＡＰＲＥＲＱＮＣＧＦＰＧＶＴＰＳ
   ＱＣＡＮＫＧＣＣＦＤＤＴＶＲＧＶＰＷＣＦＹＰＮＴＩ
   ＤＶＰＰＥＥＥＣＥＦ からなるポリペプチドである、請求項１記載のＤＮＡ。
5. （５）ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７あるいはヒト胃癌細胞であ
   るＭＫＮ−４５もしくはＫＡＴＯ−III由来のメッセン
   ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から合成したｃＤＮＡである
   、請求項１記載のＤＮＡ。
6. （６）請求項１、２、３、４または５記載のＤＮＡを、
   大腸菌、酵母、動物細胞の発現用ベクターに、Ｎ末端が
   ＥＡＱであり、アミノ酸が６０個からなるポリペプチド
   を、発現させるように構築した組み換えＤＮＡ。
7. （７）酵母において、ポリペプチドを培養液中に分泌す
   るようにするシグナル配列を含む請求項６記載の組み換
   えＤＮＡ。
8. （８）請求項６または７記載のＤＮＡを保持する形質転
   換体。
9. （９）形質転換体の宿主が大腸菌、酵母またはヒト乳癌
   細胞であるＭＣＦ７、あるいはヒト胃癌細胞であるＭＫ
   Ｎ−４５もしくはＫＡＴＯ−IIIを除く動物細胞である
   請求項８記載の形質転換体。
10. （１０）請求項８または９記載の形質転換体を培養し、
    培養物中に、Ｎ末端がＥＡＱであり、アミノ酸が６０個
    からなるポリペプチドを生成蓄積せしめ、これを採取す
    ることを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
11. （１１）部位特異的変異により改変した請求項１０記載
    のポリペプチドの製造法。