JPH03103176A - ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〉 本発明は新規なピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
およびその製造方法に関する．（従来の技術〉 ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼは、医薬品とし
て注目されている核酸の製造に有用な酵素である． これまでに、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼに
関する報告は次のようなものがある．１．Ｐ．Ｐ．Ｓａ
ｕｎｄｅｒｓ，Ｂ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎ　　ａｎｄ　　Ｇ
．Ｆ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２４４．３６９１（１９６７） ２．Ｅ．Ｗ．Ｙａｍａｄａ．，Ｊ．Ｂ　ｉ　ｏ　ｌ　．
Ｃｈｅｍ．２４３．１６４９　（１９６８）３．Ｊ．Ｊ
．Ｓｃｏｃｃａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６．
６６０６　（１９７１）（発明が解決しようとする課題
） しかし、前述のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
は耐熱性が低いものであった．本発明者らはこれまでに
知られているピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼよ
り、耐熱性にすぐれ、反応速度が速い新規な酵素を提供
すること？目的として、鋭意研究を進めた． （問題点を解決するための手段〉 本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼは以下
の性質を有する． ■作用：ピリミジンヌクレオシド　＋　リン酸■塩基　
＋　リボースーｌ−リン酸 ■基質特異性：シチジン、シトシン、およびその誘導体
以外のピリミジンヌクレオシドと塩基に対して作用する
． ■至適ｐＨおよび安定ｐＨ 至適ρＨはｐＨ７〜ｌ１ ｐＨ４．５　〜１０．５において７０℃の処理を３０分
しても失活しない． ■至適温度および作用適温の範囲 至適温度；７０℃ ｐＨ７．０において５０〜７０℃では６０分処理をして
も安定 ｐＨ７．０、７０℃における半減期： ｌ５．１時間 ■＋ｐＨ、温度などによる失活の条件：ｐＨ７．０、８
０℃で処理したとき６０分で失活する． ■阻害、活性化および安定化 特別な活性化剤や安定化剤を必要としない．塩化マンガ
ンにより阻害を受ける． ■分子量：　８５０００　（ＴＳＫゲルＧ−３０００Ｓ
Ｗによるゲル枦過法） ■サブユニットの分子量 ５４０００　（ＳＤＳ電気泳動法） 本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼは至適
ｐＨおよび安定ｐＨ、至適温度および作用適温の範囲に
おいて、これまでに知られているものと性質を異にして
いる． 次に本発明の酵素の製造法について説明する．本発明に
おいて用いられる該酵素生産菌の好ましい例として本発
明者らによって土壌中より分離されたバチルス・ステア
ロサーモフィルス／ｌｔｙ　ｃｉ／／ｌ．！　５７１１
ｌθｌ７ｅｔｚ７７ｐ７ｉ／〃ｓ）　Ｊ　Ｔ　Ｓ　８　
５　９がある．この菌株は、通商産業省工業技術院微生
物工業研究所に寄託されており、その寄託番号は、微工
研菌寄第９６６６号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９６６６）であ
る． この菌株の菌学的性質をパージエイズ・マニュアル第２
巻に準じて検討した結果を以下に示す．１，形態 桿菌＝５．４〜６．５μｍＸ０．７〜０．９μ　ｍ 楕円形の胞子形成＝２．０〜２．３μｍ×１．１〜１．
２μｍ、１ｍ胞 に１個、位置は末端 ２．培養的性質 ＮＢ培地：６２℃、２日間培養 平板上：白色僅かに黄色を含む．光沢あり，不透明、盛
り上がらない．コロニ ーの形は円形波状 スラント上：白色僅がに黄色を含む．光沢あり、不透明
、盛り上がらな い．生育は中程度 ３．生化学的性質 １　グラム染色 陽性 ２　嫌気的培養 ３　運動性 ４　オキシダーゼ ５　カタラーゼ ６　ゼラチンの液化 ７　リトマスミルク ８　０Ｆテスト ９Ｖ−Ｐテスト １０　　グルコースからの ガスの発生 ｌ１　グルコースからの 酸の産生 １２　アラビノースからの 酸の産生 １３　マニトールからの 酸の産生 １４　キシロースからの 酸の産生 １５　サブロー培地での生育 スラント 生育せず あり、周毛 陽性 陽性 液化能あり 凝固させる 醗酵タイプ 陰性 発生せず 産生した 産生ぜず 産土した 産生ぜず 生育した 液体　　　　　　生育した １６　　０．００１％リゾチーム 下での生育　　　　　　生育せず １７　　０．０２％アジ化物 下での生育　　　　　　生育せず １８　７％ＮａＣｌ 下での生育　　　　　　生育せず （２％まで生育した） １９　カゼインの加水分解　　　分解能あり２０　デン
プンの加水分解　　　分解能あり２１　ジヒドロキシア
セトン の生成　　　　　　　生成せず ２２　エッグヨーク試験　　　　生育せず２３　クエン
酸の利用　　　　　陰性 ２４　インドールの産生　　　　陰性 ２５　ウレアーゼ活性　　　　　陽性 ２６　フェニルアラニンの 脱アミノ化　　　　　陰性 ２７　アルギニンデヒドロ ラーゼ活性　　　　　　陽性１ ２８　チロシンの分解　　　　　陰性 ２９　レバン産生　　　　　　　陰性 ３０　　ｗ４酸塩の還元　　　　　　陽性３１　硝酸ナ
トリウムの 脱窒能　　　　　　　　陰性 ３２　硫化水素の生成　　　　　陽性 ３３　無機窒素源の利用 Ｎ　Ｏ　ｘを唯一の 窒素源として　　　生育した ＮＨ．を唯一の 窒素源として　　　生育した ３４　　０Ｃ含量　　　　　　　　４７．３％３５　生
育温度　　　　４０〜７１℃で生育最適　６０〜６８℃ ３６　ρＨ範囲　　　　ｐＨ５．７〜８．５最適ｐＨ６
．０〜７．０ 以上の性質に基づき、本株菌はバチルス・ステアロサー
モフィルス／ｌｉｒｉ／／ｔｔｓ　ｓｈ／７ｒρ／／Ｉ
ＩＩＩρβＩｉ／ＶＳ）と同定される． 上記株菌の培養は、バチルス・ステアロサーモフィルス
の通常行われる条件で良い．好ましくは培地に窒素源と
して、トリプトン、ベプトンまたはカザミノ酸を、炭素
源としてグルコースまたはスクロースを含み、さらに酵
母エキスと塩化ナトリウムを含む培地を用い、６０〜６
５℃、１８０〜２２Ｏｒｐｍ７′振とう培養するか、通
気攪拌培養による条件が良い． また、本発明における使用菌としては、バチルス・ステ
アロサーモフィルスＪＴＳ８５９だけでなく、バチルス
属に属する前記した機能を持つピリミジンヌクレオシド
ホスホリラーゼを生産する微生物であればすべて用いる
ことができる．培養物よりピリミジンヌクレオシドホス
ホリラーゼを採取する方法は定法に従って行えば良い．
一例として、集菌した菌体を破壊した後、熱処理、アセ
トン処理、ｐＨ処理を順次ほどこし、ついで・ＤＥＡＥ
　（ジエチルアミノエチル）陽イオン樹脂力ラム，ブチ
ル基疎水クロマト力ラム、およびゲル枦過を行う方法を
示すことができる．本発明のピリミジンヌクレオシドホ
スホリラーゼを用い、ビリミジン塩基とリボース−１−
リン酸からピリミジンヌクレオシドを効率よく製造する
ことができる．以下、本発明の実施例を示し、さらに詳
しく説明する． （実施例１）バチルス・ステアロサーモフイルス（Ｅａ
ｃｊ／／ｕｓ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｊノ／／
ｓ）ＪＴＳ８５９の培養、集菌ベプトン２０ｇ、イース
トエキス１０ｇ、グルコース３ｇ、塩化ナトリウム３ｇ
および水１１よりなるｐＨ６．０の培地を用いた．この
培地２Ｉにバチルス・ステアロサーモフィルスＪＴＳ８
５９の胞子３．２Ｘ１０’個を添加し、攪拌Ｋ（直径６
０ｍ、上下部各６枚）を有するジャーファメンターを用
い、攪拌翼を６８０ｒｐｍで回転させつつ、通気Ｊｉｌ
．５ｖｖｍ、培養温度６５℃、ｐＨ５．９〜６．２で８
時間培養した． 培養終了後、菌体を遠心分離（１００００ｇ．４℃，１
５分〉により集菌した． （実施例２）酵素の分離精製 得られた湿菌１６０ｇを２　０　ｍ　Ｍリン酸カリウム
（ｐＨ７．０、以下「緩衝液」という）に懸濁し，ダイ
ノミル（Ｗｉｌｌｙ　　Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製、ス
イス）で菌体を破壊した．［衡液を添加し，、１　４　
０　０　ｍｌとした後、遠心分Ｍ（８３００ｇ、２０分
）を行い、上清１３００ｍｌを得た．沈澱物は５　０　
０　ｍｌの緩衡液で懸濁し、ダイモミルで５分間処理し
た．緩衡液を添加し、１０３０ｍｌとした後、遠心分離
（８３００ｇ、２０分）を行い、上清９９０ｍｌを得た
．この上清９９０ｍｌを先の上清１３００ｍｌと合わせ
、６３℃で１時間桜やかに攪拌した．ついで、遠心分離
（８３００ｇ．４０分）を行い．上清２１３０ｍｌを得
た．熱処理をした上清２１３０ｍｌに、アセトン２００
ｍｌと緩衝液２００ｍｌの混合溶液（−１０℃）を添加
した．さらに、−１０℃のアセトン１．８１を加え、５
〜１０℃でｌ５分間攪拌した．つぎに、遠心分離（９０
００ｇ、５分）を行なった．得られた上清に−１０℃の
アセトン２．５１を添加し１５分間攪拌した後、遠心分
離（９０００ｇ、５分〉を行ない沈澱物を得た．この沈
澱物を８００ｍｌの緩衝液に懸濁させアセトン処理済み
酵素液８５　０　ｍｌを得た． アセトン処理済み酵素液８５０ｍｌにＩＭリン酸を加え
、ρＨを４．７５として１時間Ｏ℃に保った．遠心分離
（８９００ｇ、１時間）を行い、上清を得た．この上清
にＩＭの水酸化カリウムを加え、ｐＨを７．０に調整し
８４０ｍｌの酵素液を得た． 得られた酵素液８　４　０　ｍｌをＤＥＡＥ　　Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌ　　６５０Ｍ（東ソー製）２００ｍｌを充
填したカラム（Φ４５Ｘ１２６ｍ）に添加した．ついで
２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２Ｍで
溶出を行い、ついで２０ｍＭリン酸カリウムとＯ．Ｏ’
５Ｍ、０．１Ｍ，０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０、５Ｍの塩
化ナトリウムよりなるｐＨ７．０の溶液各１１を順次用
いて溶出を行った．次に２０ｍＭリン酸カリウム、Ｏ．
ＩＭ塩化ナトリウム溶液の溶出画分１１に本酵素活性を
見出だした．得られた溶出画分に同量の２０ｍＭリン酸
カリウム溶液（ｐＨ７．０）を加えた後、ＩＭ水酸化カ
リウム溶液でｐＨ８．０にした．この溶液をＤＥＡＥ　
　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　　６５０Ｍ（東ソー製＞４５０
ｍｌを充填したカラム（Φ３１×５３園）に添加した． さらに、２０ｍＭリン酸カリウムと５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムよりなる溶液（ｐＨ８．０）ｌＮと、２０ｍＭリン
酸カリウム溶液と２　０　０　ｍ　Ｍ塩化ナトリウムよ
りなる溶液（ｐＨ８．０）ＩＪとで塩化ナトリウム濃度
の増加するグラジエントを作り、溶出し、１７６ｍｌの
活性画分を得た．この両分に硫安２７．９ｇを添加した
後、水酸化カリウムでｐＨを７．０に調節した．　この
溶液を、１．２ＭｉｌＥＥ安と２０ｍＭリン酸カリウム
よりなる溶液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＢ
ｕｔｙｌ　　ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　　６５０Ｓ（東ソー
製）１００ｍｌ（Φ１６Ｘ３００ｍ）のカラムに添加し
、１．２ＭＩ安と２０ｍＭリン酸カリウムよりなる溶液
（ｐＨ７．０）１００ｍｌで溶出した． さらに、１．２Ｍ硫安と２０ｍＭリン酸カリウムよりな
る溶液２５０ｍｌと２０ｍＭリン酸カリウム溶液（　ｐ
　Ｈ　７　．　０　）　２　５　０　ａ＋１とで硫安濃
度の減少するグラジエントを作り、溶出した．活性画分
７５ｍｌを分取し、２０ｍＭリン酸カリウム溶液に対し
透析後、限外枦過で１４．２ａ＋ｌに濃縮した． 得られた活性区分１４．２ｍｌを０．２Ｍリン酸カリウ
ム溶液（ｐＨ７．０）に対して透析した後、限外が過に
より７ｍｌに濃縮した． 得られた溶液を２０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．
０・）で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷ〈東ソー製、Φ７
．５Ｘ７５ｍ）に添加した．次いで、２０ｍＭカリウム
および５０ｍＭ塩化ナトリウムよりなる溶液（ｐＨ８．
０）と、２０ｍＭリン酸カリウムおよび２２５ｍＭ塩化
ナトリウムよりなる溶液（ρＨ８．０）を用いて、塩化
ナトリウム濃度が増加するグラジエントにより流速１ｍ
１／分で溶出した． 得られた溶液を０．２Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ６．
８）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ−Ｇ３ｏｏｏｓｗ（東ソ
ー製、Φ７．５Ｘ７５０肩）に添加した．次いで、０．
２Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ６．８）を用い、流速０
．５ｍｌ／分で溶出し、本発明のピリミジンヌクレオシ
ドホスホリラーゼ１２．１ｍｇを得た． （実施例３）理化学的性質 ■作用および基質特異性 本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ０．１
４μｇを含む２０ｍＭヌクレオシド２０ｍＭリン酸カリ
ウム溶液（ｐＨ７．０）２５０μ１を６０℃で２０分間
反応させ、生成した１＝基を定量した．結果を表１に示
す． また本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ０
．１４μｇ、２０ｍＭ塩基、２０ｍＭリボース−１−リ
ン酸および２０ｍＭリン酸カリウムよりなる溶液（ｐＨ
７．０）２５０μ１を６０℃で２０分間反応させ、生成
したヌクレオシドを定量した．結果を表・２に示す． 表１ 表２ （以下余白） ■至適ｐＨおよび安定ｐＨ 本発明のピリミジンヌクレオシドホスボリラーゼ０．５
５μｇを含む２０ｍＭＳ−メチルウリジン、２０ｍＭリ
ン酸カリウム溶液（ｐＨ３．０〜１３）ｌｍｊｌを６０
’Ｃで２０分間反応させ、生成したヒボキサンチンを測
定した．結果を図１に示す． ｐＨ７から１１．５の間において高い酵素活性がｚ２め
られた． 安定ｐ｝Ｉを調べるために本発明のピリミジンヌクレオ
シドホスホリラーゼ０．５５μｇを９０μ１の２０ｍＭ
クエン酸緩衡液（２０ｍＭリン酸カリウムを含む）、２
０ｍＭグリシン緩衡液（２０ｍＭリン酸カリウムを含む
）．２０ｍＭｌ−リス・塩酸Ｍ衡液（２０ｍＭリン酸カ
リウムを含む）、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中各々
７０℃で３０分間加熟処理した後、残存する酵素活性を
定量した．結果を図２に示す． 酵素活性はｐＨ６．５〜１０．５において、失活しなか
った． ■至適温度および作用適温の範囲 本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ０．５
５μｇを含む２０ｍＭＳ−メチルウリジン、２０ｍＭリ
ン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）１　ｍｌを４０〜８０
℃で反応させ、生戒したヒボキサンチンを定量した．結
果を図３に示す．７０℃以下では温度が高いほど生成速
度が速く、８０℃では３０分以内に酵素が失活した．ま
た、２’ＯｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）中で
の酵素の半減期は、図４に示ように７０℃において１５
．１時間であった． ■阻害、活性化および安定化 本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ０．５
５μｇを含む２０ｍＭＳ−メチルウリジン、２０ｍＭリ
ン酸カリウム溶液と１ｍＭの各種金属イオン溶液（ｐＨ
７．０＞ｌｍｌを６０℃で２０分反応させ，生成したヒ
ボキサンチンを定量した． Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ　ａ　・７　Ｈ　ｔ　Ｏ、Ｈ　ｇ　Ｃ　
Ｉ　ｚ　．　Ｃ　ｕ　Ｓ　Ｏ．−５Ｈ．Ｏ、ＺｎＳＯ４
・７Ｈ２　０，ＣＨｘ　ＩＣＯＯＨ．ＥＤＴＡ、パラク
ロロメルクリベンゾエイトでは阻害は認められなかった
が、Ｍｎ（１２・４Ｈ２０では強い阻害が認められた．
■分子量 ＴＳＫゲルＧ−３０００ＳＷ（東ソーＭ）によるゲルＰ
過法では８５０００であった．ＳＤＳ電気泳動法による
サブユニットの分子量は５４０００であった． ■アミノ酸組成 アミノ酸アナライザー（日立製Ｈ８３５）により分析し
た．結果を表３に示す． 表３ （発明の効果》 本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼにより
塩基より核酸を容易に得ることができる．

【図面の簡単な説明】

第ｌ図は本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラー
ゼのｐＨ依存性を示す図面である．第２図は本発明のピ
リミジンヌクレオシドホスホリラーゼのｐＨ安定性を示
す図面である．第３図は作用適温の範囲を示す図面であ
る．第４図は酵素活性の半減期を示す図面である．出即
人　日本たばこ産業株式会社 残゛存５８姓（γ。） Ｏ 会 ０ Φ ０ ＣＯ Ｏ ０ ０ チミン （ｍＭ） 千＄ン （ｍＭ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有するピリミジンヌクレオシド
   ホスホリラーゼ （１）作用：ピリミジンヌクレオシド＋リン酸⇔塩基＋
   リボース−１− リン酸 （２）基質特異性：シチジン、シトシン、およびその誘
   導体以外のピリミジンヌクレオシドと塩基に対して作用
   する。 （３）至適ｐＨおよび安定ｐＨ 至適ｐＨはｐＨ７〜１１ ｐＨ６．５〜１０．５において７０℃の処 理を３０分しても失活しない。 （４）至適温度および作用適温の範囲 至適温度は７０℃、ｐＨ７．０において５０〜７０℃で
   は６０分処理をしても安定 （５）：ｐＨ、温度などによる失活の条件：ｐＨ７．０
   、８０℃で処理したとき６０分 で失活する。 （６）阻害、活性化および安定化 特別な活性化剤や安定化剤を必要としない。 塩化マンガンにより阻害を受ける。 （７）分子量：８５０００（ＴＳＫゲルＧ−３０００Ｓ
   Ｗによるゲル濾過法） （８）サブユニットの分子量 ５４０００（ＳＤＳ電気泳動法） ２、請求項１項に記載の酵素を生産する能力を有するバ
   チルス属に属する微生物を培養し、培養物より該酵素を
   採取することを特徴とするピリミジンヌクレオシドホス
   ホリラーゼの製造方法。