JPH029307B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生体試料中のカテコールアミンを直接
選択的に高精度で高感度測定する自動分析装置に
関するものである。

カテコールアミンとはカテコール（３，４―ジ
ヒドロキシフエノール）骨格を有する生体アミン
の総体であり、このうちドーパミン、ノルアドレ
ナリン及びアドレナリンは副腎髄質ホルモン及び
化学伝達物質として知られている。これらの測定
は臨床医学における診断に極めて重要である。カ
テコールアミンのように構造の互に類似した化学
的に不安定な化合物の分離分析には液体クロマト
グラフイーが適している。

従来、カテコールアミンの液体クロマトグラフ
イーを用いる分析では、検出器に紫外吸光光度
計、螢光光度計及び電気化学検出器が用いられて
きた。しかし、紫外吸光光度計では感度が低く、
微量分析には適当でない。螢光光度計は多く用い
られているが、この場合カテコールアミンを螢光
体にするための反応試薬を必要とし、しかも反応
に数分を要し、カラム溶出後の反応コイル内での
ピークの広がりが問題となる。検出感度について
も螢光検出法ではノルアドレナリンとアドレナリ
ンについては高感度であるが、Ｌ―ドーパとドー
パミンについては感度が低い。これに対して電気
化学検出器ではカラム溶出直後に検出でき、検出
感度もそれぞれ1ng以下が検出でき高感度で平均
化している。しかしながら、従来の電気化学検出
器を用いるカテコールアミン分析法においては液
体クロマトグラフイーを実施する前にイオン交換
分離、アルミナ吸着、遠心分離及び溶媒抽出など
の複雑な試料の前処理が必要であり、その操作に
最時間（約２時間）を要し、その間に試料が分解
するおそれがあつた。また、精度の高い分析結果
を得るためにはこの前処理に熟練した技術者が不
可欠であり、しかも、分析するために貴重な生体
試料がかなり多量に必要であつた。

本発明はカテコールアミン分析における電気化
学的分析の高感度、高精度及び高再現性をさらに
向上させることができるフロー定電位電解セルを
提供し、あわせてこれに前処理不要の試料吸着・
分離用カラム流路を接続することを目的とするも
のである。

すなわち、本発明はカテコールアミンの電極反
応が可逆的に起ることに着目して、フロー定電位
電解電添測定に基づく２つの作用電極を有する流
通式薄層電解セル（以下二層極薄層電解セルと記
す）からなる電気化学検出器において、薄層内に
形成されたフローチヤンネルの上流側部に第１の
作用電極の極端面を露出させるとともに、下流側
部に第２の作用電極の極端面を露出させ、その第
１及び第２の作用電極の電位（対銀―塩化銀電極
電位）をそれぞれカテコールアミンの酸化及び還
元に必要な電位に設定して、第１の作用電極で酸
化したのち第２の作用電極で再び還元するさいに
流れる電流をそれぞれ記録することにより種々の
電気活性物質中のカテコールアミンだけを選択的
に検出するものである。これは、非可逆的に反応
する他成分の存在を許容するため、付随的に試料
準備からカテコールアミン吸着・分離カラムに到
る操作を次のように簡略かつ自動化をさせうるも
のである。

(1) 試料をイオン交換水で圧送して、PH約９のト
リス緩衝液の流れと合流させて自動的にPHを約
8.5に調節したのち、テフロン（登録商標名）
管からなるミクロアルミナカラム（粒径5μmの
アルミナを内径0.5mm、長さ約２cmのテフロン
管に充填したカラム）中に数10μ／minの流
速で通して、カテコールアミンをアルミナに吸
着させ、その後イオン交換水だけを送液してカ
ラムを洗浄する。

(2) 上記カテコールアミンを吸着させたミクロア
ルミナカラムの流路をバルブにより切換え、こ
れをミクロ分離管（粒径5μmのODSを内径0.5
mm、長さ約15cmのテフロン管に充填したカラ
ム）に連結し、移動相としてPH約1.8のBritton
−Robinson緩衝液を約8μ／minの流速で送
液して、カテコールアミンをミクロアルミナカ
ラムから脱着させると同時に分離し、上記電気
化学検出器の二電極薄層電解セル中に導いて検
出定量する。このような原理に基づいて構成さ
れた本発明のカテコールアミン自動分析装置
は、生体試料を約100μ以下しか必要とせず、
しかも試料の前処理なしに高感度及び高精度で
迅速にカテコールアミンの自動分析を行うこと
ができる。

以下、図面を参照して本発明装置の一実施例を
説明する。

本発明装置及びこれに付随する流路構成を示す
第１図において、試料のカラム導入及び排出の前
流路として試料給送機構１、第１緩衝液供給機構
２及び第２緩衝液供給機構３が配置される。試料
給送機構１はマイクロシリンジ４及びサンプルイ
ンジエクタ５からなる試料注入列と、マイクロフ
イーダー６、マイクロシリンジ７、三方一流路切
換バルブ８及びイオン交換水を収容した試薬容器
９からなる列とを含み、切換バルブ８の残り一方
の口はサンプルインジエクタ５に接続される。サ
ンプルインジエクタ５には試薬計量管５ａ及び廃
液容器１０が接続される。次に、第１緩衝液供給
機構２及び第２緩衝液供給機構３は、それぞれマ
イクロフイーダー１１及び１２、マイクロシリン
ジ１３及び１４、三方一流路切換バルブ１５及び
１６、並びに試薬容器１７及び１８の列からなつ
ている。この場合、第１緩衝液の列における試薬
容器１７にはPH約8.8のPH調整用緩衝液を、第２
緩衝液の列における試薬容器１８にはカテコール
アミンのカラム分離用移動相としてPH約1.8の緩
衝液をそれぞれ収容する。

サンプルインジエクタ５の試料送出流路は溶液
フイルター１９を介してミキシングジヨイント２
０の一つの入口に連結され、ミキシングジヨイン
ト２０の他方の入口には第１緩衝液の三方一流路
バルブ１５の残りの一方口（出口）が直結され
る。ミキシングジヨイント２０の合流出口は六方
二流路切換バルブ２１の一方口に接続される。こ
の切換バルブ２１はカテコールアミン吸着カラム
への試料導入、同カラム２２に吸着されたカテコ
ールアミンの脱着と分離カラム２３への移動その
他、液体クロマトグラフイーに必要なバルブ操作
を行うために、図示のごとくカラム２２，２３第
２緩衝液の三方一流路バルブ１６の残りの一方口
（出口）、及び廃液容器２７が接続される。

分離カラム２３の溶出流路は前述した二電極薄
層電解セル２４の入口に接続される。セル２４の
各電極はデユアルポテンシヨスタツト２５に接続
され、このポテンシヨスタツト２５の検出信号は
ニペンレコーダー２６に供給されるようになつて
いる。セル２４に接続された２７は廃液容器であ
る。

第２図は前記二電極薄層電解セルの構造及びミ
クロ分離カラムとの接続の仕方を示したものであ
り、同図Ａは電解セルの分解した側面を、同図Ｂ
はセルのスペーサーの正面を示すものである。３
６及び３７は作用電極であり、それぞれ直径８mm
のグラシーカーボン円盤を下部ダイフロン（登録
商標名）樹脂板３２に埋込んで、その表面をよく
研摩してガラス状にしたものを用いる。２８は参
照電極であり、銀―塩化銀電極をねじによつて上
部ダイフロン樹脂板３１に固定する。２９は対極
であり、ステンレス管をねじによつてダイフロン
樹脂板３１に固定し、セル出口の役割をも兼ね
る。３０はこれら樹脂板３１，３２のためのスペ
ーサーであり、厚さ50μm以下のテフロン膜の中
央部を細小に切り抜いてフローチヤンネルＦと
し、４本のねじでダイフロン樹脂板３１と３２の
間にはさみ込んだものである。好ましい実施例に
おいて、ミクロ分離カラム２５はねじでダイフロ
ン樹脂板３１に直接固定することによつて連絡に
よる空体積を0.3μ以下と極めて小さくする。

第３図は本発明装置の流路構成を示したもので
あり、尿試料中のカテコールアミン分析を例にと
つて説明する。まず、三方一流路切換バルブ８，
１５及び１６を同図Ａに示すような位置に設定
し、マイクロフイーダ６，１１、及び１２を負方
向に作動させて、イオン交換水３３及びPH調整液
３４及び移動相３５をそれぞれのマイクロシリン
ジ７，１３及び１４中へ吸引する。カテコールア
ミンを選択的にアルミナカラムに吸着させるため
に必要な試料のPH調整液３４としては、カテコー
ルアミンの安定化剤として0.25％EDTA（2Na）
及び0.05％NaHSO₃を含むPH約8.8のトリス緩衝
液を用いる。吸着されたカテコールアミンのアル
ミナカラムからの迅速な脱着及びミクロ分離カラ
ムによる相互分離のための移動相３５としてはイ
オンペア剤として0.5mM1―ヘプタンスルホン酸
ナトリウムを含むPH約1.8のBritton−Robinson緩
衝液を用いる。一方、サンプルインジエクタ―５
のバルブを第３図Ａに示すような位置に設定し、
尿試料50〜100μをマイクロシリンジ４に採取
して、試料ループ中へ注入する。次に、三方一流
路切換バルブ８，１５，１６、サンプルインジエ
クター５のバルブ及び六方二流路切換バルブ２１
を第３図Ｂに示すような位置に切換え、マイクロ
フイーダー６，１１及び１２を正方向に作動させ
て、アルミナカラムのコンデイシヨニング、試料
中のカテコールアミンのミクロアルミナカラムへ
の吸着濃縮及び洗浄操作と平行してミクロ分離カ
ラムのコンデイシヨニングを行なう。アルミナカ
ラムのコンデイシヨニングは前記PH調整液とイオ
ン交換水を各約30μ／minの流速で合流させミ
クロアルミナカラム中を通すことによつて行な
う。カテコールアミンのミクロアルミナカラムへ
の吸着濃度は試料をイオン交換水によつて約30μ
／minの流速で圧送し、石英ウールを充填した
溶液フイルター１９中を通して試料中の固形物を
除去し、同流速の前記PH調整液とミキシングジヨ
イント２０中で混合してPHを約8.5に調節したの
ち、ミクロアルミナカラム中へ通すことによつて
行なう。なお、ミキシングジヨイント２０からミ
クロアルミナカラム２２までの流路には内径0.5
mm、長さ約12cmのテフロン管を用いる。この操作
を約15分間行なつたのち、前記PH調整液の送液を
止め、イオン交換水だけをさらに15分間送液して
アルミナカラムの洗浄を行なう。その後、六方二
流路切換バルブ２１を第３図Ｃに示すような位置
に切換え、前記移動相を約8μ／minの一定流速
で送液して、カテコールアミンのアルミナカラム
からの脱着及びミクロ分離カラムによる分離を行
なう。一方、サンプルインジエクター５のバルブ
を第３図Ａに示すように切換えて、同時に平行し
て次の試料を試料ループ中へ注入する。そして、
カテコールアミンがアルミナカラムから完全に脱
着されたのち、各バルブを再び第３図Ｂに示すよ
うな位置に切換えることによつて、ミクロ分離カ
ラムによる分離操作の間に次の試料中のカテコー
ルアミンの濃縮操作を実施することができる。な
お、アルミナカラムは何度でも半永久的に再生使
用することが可能である。ミクロ分離カラムによ
つて分離されたカテコールアミンは作用電極３６
及び３７の電位をそれぞれ0.8V及び0.2V対銀―
塩化銀電極に設定してある二電極薄層電解セル２
４中に導びいて、作用電極３７に流れる還元電流
を測定することによつて各カテコールアミンを選
択的に検出定量する。カテコールアミンは作用電
極３６で酸化されてキノン型となり、作用電極３
７で再び還元されて元のカテコール型にもどる。

ここでアドレナリンの場合を例にとつて、その
電極過程を示すと次のとうりである。

なお、移動相の流路として約8μ／minを用い
たとき本電解セル２４では作用電極３６で酸化さ
れたカテコールアミンのうち約60％が作用電極３
７で再び還元されて元へもどる。

第４図及び第５図は尿試料の100μを本発明
装置に注入して得られたクロマトグラムであり、
各図Ａ及びＢはそれぞれ作用電極３６及び３７を
流れる電流を記録したものである。なお、各、Ａ
図は従来の１つの作用電極を有する薄層電解セル
を用いる電気化学検出器の応答に対応する。

図中のNA，AD，DA及びLDはそれぞれノル
アドレナリン、アドレナリン、ドーパミン及びＬ
―ドーパを示す。第４図及び第５図の試料ではそ
れぞれノルアドレナリン及びＬ―ドーパがカテコ
ールアミン以外に電気活性物質との分離が不完全
なために作用電極３６だけでは正確な定量が困難
である。しかし、多くのカテコールアミン以外の
電気活性物質の電極反応は非可逆であるので、各
図Ｂに示すように作用電極３７では還元されず、
二つの作用電極を用いればカテコールアミンだけ
を選択的に検出して精度よく定量することができ
ることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明装置の一実施例を含む分析シス
テムのフロー及びブロツク線図、第２図Ａは前記
システムにおける二電極薄層電解セルの構造を示
すためにその積層構造を分解した状態の側断面
図、同図Ｂはそのスペーサ層の平面図、第３図
Ａ，Ｂ及びＣは第１図に示したシステムの流路切
換状態をそれぞれ示す流路図、第４図及び第５図
は本発明装置によつて測定したクロマトグラムの
二例である。 １……試料給送機構、２……第１緩衝液供給機
構、３……第２緩衝液供給機構、４，７，１３，
１４……マイクロシリンジ、５……サンプルイン
ジエクタ、２０……ミキシングジヨイント、２２
……ミクロアルミナカラム、２３……ミクロ分離
カラム、２４……二電極薄層電解セル、２８……
参照電極、２９……対極兼セル出口、３６，３７
……作用電極。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 分離カラムから成分ごとに分離・溶出したカ
   テコールアミンを定電位電解法で測定するための
   流通式二作用電極型薄層電解セルにおいて、薄層
   スペーサに開口形成されたフローチヤンネルの上
   流側部に第１の作用電極の極端面を、下流側部に
   第２の作用電極の極端面をそれぞれ露出させ、第
   １の作用電極にはカテコールアミンを酸化させる
   に十分な電位を、第２の作用電極には前記酸化さ
   れたカテコールアミンを還元するに十分な電位を
   それぞれ印加するようにしたことを特徴とするカ
   テコールアミン分析装置。 ２ フローチヤンネルへの入口部にカテコールア
   ミン分離用カラムを装填したことを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の装置。