JPH0113059B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生体試料中のカテコールアミンを直接
選沢的に高精度で高感度測定する自動分析装置に
関するものである。

カテコールアミンとはカテコール（８，４−ジ
ヒドロキシフエノール）骨格を有する生体アミン
の総称であり、このうちドーパミン、ノルアドレ
ナリン及びアドレナリンは副腎髄質ホルモン及び
化学伝達物質として知られている。これらの測定
は臨床医学における診断に極めて重要である。カ
テコールアミンのように構造の互に類似した化学
的に不安定な化合物の分離分析には液体クロマト
グラフイーが適している。

従来、カテコールアミンの液体クロマトグラフ
イーを用いる分析では、検出器に紫外吸光光度
計、螢光光度計及び電気化学検出器が用いられて
きた。しかし、紫外吸光光度計では感度が低く、
微量分析には適当でない。螢光光度計は多く用い
られているが、この場合カテコールアミンを螢光
体にするための反応試薬を必要とし、しかも反応
に数分を要し、カラム溶出後の反応コイル内での
ピークの広がりが問題となる。検出感度について
も螢光検出法ではノルアドレナリンとアドレナリ
ンについては高感度であるが、Ｌ−ドーパとドー
パミンについては感度が低い。これに対して電気
化学検出器ではカラム溶出直後に検出でき、検出
感度もそれぞれ1nｇ以下が検出でき高感度で平
均化している。しかしながら、従来の電気化学検
出器を用いるカテコールアミン分析法においては
液体クロマトグラフイーを実施する前にイオン交
換分離、アルミナ吸着、遠心分離及び溶媒抽出な
どの複雑な試料の前処理が必要であり、その操作
に長時間（約２時間）を要し、その間に試料が分
離するおそれがあつた。また、精度の高い分析結
果を得るためにはこの前処理に熟練した技術者が
不可欠であり、しかも、分析するために貴重な生
体試料がかなり多量に必要であつた。

本発明は、カテコールアミン分析における電気
化学的検出の高感度−高再現性をさらに向上させ
ると共に、それに必要な液体クロマトグラフイー
のために試料前処理操作を省略して試料準備から
カラム導入までの操作を自動化した分析装置を提
供しようとするものである。

上述した本発明の目的は、カテコールアミンの
電極反応が可逆的に起こることに着目した新規の
定電位電解測定セルの使用を前提として達成され
るものである。

すなわち、本発明者はフロー定電位電解電流測
定に基づく２つの作用電極を有する薄層電解セル
（以下２電極薄層電解セルと記す）からなる電気
化学検出器を創出し、その第１及び第２の作用電
極の電位（対銀−塩化銀電極電位）をそれぞれカ
テコールアミンの酸化及び還元に必要な値に設定
して、第１の作用電極で酸化したのち第２の作用
電極で再び還元するさいに流れる電流をそれぞれ
記録することにより種々の電気活性物質中のカテ
コールアミンだけを選択的に検出できることを発
見した。これにより非可逆的に反応する他成分が
含まれていても、それらは還元曲線には現れない
ため、試料の前処理を省略して次のような切替え
流路系を含むカテコールアミン分析装置の構成が
可能となつた。

(1) 試料をイオン交換水で圧送して、PH約９のト
リス緩衝液の流れと合流させて自動的にPHを約
8.5に調節したのち、商品名“テフロン”で通
称されるテトラフルオルエチレン重合体（以下
「テフロン」と称する。）製の管からなるミクロ
アルミナカラム（粒径5μｍのアルミナを内径
0.5mm、長さ約２cmのテフロン管に充填したカ
ラム中に数10μ／minの流速で通して、カテ
コールアミンをアルミナに吸着させ、その後イ
オン交換水だけを送液してカラムを洗浄する。

(2) 上記カテコールアミンを吸着させたミクロア
ルミナカラムの流路をバルブで切換え、これを
ミクロ分離管（粒径5μｍのODSを内径0.5mm、
長さ約15cmのテフロン管に充填したカラムに連
結し、移動相として、リン酸、ホウ酸、酢酸及
び水酸化ナトリウムを混合して得られるPH約
1.8のいわゆるブリトン−ロビンソン緩衝液を
約8μ／minの流速で送液してカテコールアミ
ンをミクロアルミナカラムから脱着させると同
時に分離し、上記電気化学検出器の２電極薄層
電解セル中に導いて検出定量する。

このような原理に基づいて構成された本発明の
カテコールアミン自動分析装置は、生体試料を約
100μ以下しか必要とせず、しかも試料の前処
理なしに高感度及び高精度で迅速にカテコールア
ミンの自動分析を行うことができる。

以下、図面を参照して本発明装置の一実施例を
説明する。

本発明装置及びこれに付随する流路構成を示す
第１図において、試料のカラム導入及び排出の前
流路として試料給送機構１、第１緩衝液供給機構
２及び第２緩衝液供給機構３が配置される。試料
給送機構１はマイクロシリンジ４及びサンプルイ
ンジエクタ５からなる試料注入列と、マイクロフ
イーダー６、マイクロシリンジ７、三方一流路切
換バルブ８及びイオン交換水を収容した試薬容器
９からなる列とを含み、切換バルブ８の残り一方
の口はサンプルインジエクタ５に接続される。サ
ンプルインジエクタ５には試料計量管５ａ及び廃
液容器１０が接続される。次に、第１緩衝液供給
機構２及び第２緩衝液供給機構３は、それぞれマ
イクロフイーダー１１及び１２、マイクロシリン
ジ１３及び１４、三方一流路切換バルブ１５及び
１６、並びに試薬容器１７及び１８の列からなつ
ている。この場合、第１緩衝液の列における試薬
容器１７にはPH約8.8のPH調整用緩衝液を、第２
緩衝液の列における試薬容器１８にはカテコール
アミンのカラム分離用移動相としてPH約1.8の緩
衝液をそれぞれ収容する。

サンプルインジエクタ５の試料送出流路は溶液
フイルター１９を介してミキシングジヨイント２
０の一つの入口に連結され、ミキシングジヨイン
ト２０の他方の入口には第１緩衝液の三方一流路
バルブ１５の残りの一方口（出口）が直結され
る。ミキシングジヨイント２０の合流出口は六方
二流路切換バルブ２１の一方口に接続される。こ
の切換バルブ２１はカテコールアミン吸着カラム
２２への試料導入、同カラム２２に吸着されたカ
テコールアミンの脱着と分離カラム２３への移動
その他、液体クロマトグラフイーに必要なバルブ
操作を行うために、図示のごとくカラム２２，２
３、第２緩衝液の三方一流路バルブ１６の残りの
一方口（出口）、及び廃液容器２７が接続される。

分離カラム２３の溶出流路は前述した二電極薄
層電解セル２４の入口に接続される。セル２４の
各電極はデユアルポテンシヨスタツト２５に接続
され、このポテンシヨスタツト２５の検出信号は
ニペンレコーダー２６に供給されるようになつて
いる。セル２４に接続された２７は廃液容器であ
る。

第２図は前記二電極薄層電解セルの構造及びミ
クロ分離カラムとの接続の仕方を示したものであ
り、同図Ａは電解セルの分解した側面を、同図Ｂ
はセルのスペーサーの正面を示すものである。３
６及び３７は作用電極であり、それぞれ直径３mm
のグラシーカーボン円盤を下部商品名“ダイフロ
ン”で通称されるトリフルオルクロロエチレン重
合体（以下「ダイフロン」と称する。）からなる
樹脂板３２に埋込んで、その表面をよく研磨して
ガラス状にしたものを用いる。２８は参照電極で
あり、銀−塩化銀電極をねじによつて上部ダイフ
ロン樹脂板３１に固定する。２９は対極であり、
ステンレス管をねじによつてダイフロン樹脂板３
１に固定し、セル出口の役割をも兼ねる。３０は
これら樹脂板３１，３２のためのスペーサーであ
り、厚さ50μｍ以下のテフロン膜の中央部を細小
に切り抜いてフローチヤンネルＦとし、４本のね
じでダイフロン樹脂板３１と３２の間にはさみ込
んだものである。好ましい実施例において、ミク
ロ分離カラム２５はねじでダイフロン樹脂板３１
に直接固定することによつて連絡による空体積を
0.3μ以下と極めて小さくする。

第３図は本発明装置の流路構成を示したもので
あり、尿試料中のカテコールアミン分析を例にと
つて説明する。まず、三方一流路バルブ８，１５
及び１６を同図Ａに示すような位置に設定し、マ
イクロフイーダ６，１１及び１２を負方向に作動
させて、イオン交換水３３及びPH調整液３４及び
移動相３５をそれぞれのマイクロシリンジ７，１
３及び１４中へ吸引する。カテコールアミンを選
択的にアルミナカラムに吸着させるために必要な
試料のPH調整液３４としては、カテコールアミン
の安定化剤として0.25％EDTA（2Na）及び
0.05NaHSO₃を含むPH約8.8のトリス緩衝液を用
いる。吸着されたカテコールアミンのアルミナカ
ラムからの迅速な脱着及びミクロ分離カラムによ
る相互分離のための移動相３５としてはイオンペ
ア剤として0.5ｍM1−ヘプタンスルホン酸ナトリ
ウムを含むPH約1.8のブリトン−ロビンソン緩衝
液を用いる。一方、サンプルインジエクター５の
バルブを第３図Ａに示すような位置に設定し、尿
試料50〜100μをマイクロシリンジ４に採取し
て、試料ループ中へ注入する。次に、三方一流路
切換バルブ８，１５，１６、サンプルインジエク
ター５のバルブ及び六方二流切換バルブ２１を第
３図Ｂに示すような位置に切換え、マイクロフイ
ーダー６，１１及び１２を正方向に作動させて、
アルミナカラムのコンデイシヨニング、試料中の
カテコールアミンのミクロアルミナカラムへの吸
着濃縮及び洗浄操作と平行してミクロ分離カラム
のコンデイシヨニングを行なう。アルミナカラム
のコンデイシヨニングは前記PH調整液とイオン交
換水を約30μ／minの流速で合流させミクロア
ルミナカラム中を通すことによつて行なう。カテ
コールアミンのミクロアルミナカラムへの吸着濃
縮は試料をイオン交換水によつて約30μ／min
の流速で圧送し、石英ウールを充填した溶液フイ
ルター１９中を通して試料中の固形物を除去し、
同流速の前記PH調整液とミキシングジヨイント２
０中で混合してPHを約8.5に調節したのち、ミク
ロアルミナカラム中へ通すことによつて行なう。
なお、ミキシングジヨイント２０からミクロアル
ミナカラム２２までの流路には内径0.5mm、長さ
約12cmのテフロン管を用いる。この操作を約15分
間行なつたのち、前記PH調整液の送液を止め、イ
オン交換水だけをさらに15分間送液してアルミナ
カラムの洗浄を行なう。その後、六方二流路切換
バルブ２１を第３図Ｃに示すような位置に切換
え、前記移動相を約8μ／minの一定流速で送液
して、カテコールアミンのアルミナカラムからの
脱着及びミクロ分離カラムによる分離を行なう。
一方、サンプルインジエクター５のバルブを第３
図Ａに示すように切換えて、同時に平行して次の
試料を試料ループ中へ注入する。そして、カテコ
ールアミンがアルミナカラムから完全に脱着され
たのち、各バルブを再び第３図Ｂに示すような位
置に切換えることによつて、ミクロ分離カラムに
よる分離操作の間に次の試料中のカテコールアミ
ンの濃縮操作を実施することができる。なお、ア
ルミナカラムは何度でも半永久的に再生使用する
ことが可能である。ミクロ分離カラムによつて分
離されたカテコールアミンは作用電極３６及び３
７の電位をそれぞれ0.8V及び0.2V対銀−塩化銀
電極に設定してある二電極薄層電解セル２４中に
導びいて、作用電極３７に流れる還元電流を測定
することによつて各カテコールアミンを選択的に
検出定量する。カテコールアミンは作用電極３６
で酸化されてキノン型となり、作用電極３７で再
び還元されて元のカテコール型にもどる。

ここでアドレナリンの場合を例にとつて、その
電極過程を示すと次のとうりである。

なお、移動相の流速として約8μ／minを用い
たとき本電解セル２４では作用電極３６で酸化さ
れたカテコールアミンのうち約60％が作用電極３
７で再び還元されて元へもどる。

第４図及び第５図は尿試料の100μを本発明
装置に注入して得られたクロマトグラムであり、
各図Ａ及びＢはそれぞれ作用電極３６及び３７を
流れる電流を記録したものである。なお、各図Ａ
は従来の１つの作用電極を有する薄層電解セルを
用いる電気化学検出器の応答に対応する。図中の
NA、AD、DA及びLDはそれぞれノルアドレナ
リン、アドレナリン、ドーパミン及びＬ−ドーパ
を示す。第４図及び第５図の試料ではそれぞれノ
ルアドレナリン及びＬ−ドーパがカテコールアミ
ン以外の電気活性物質との分離が不完全なために
作用電極３６だけでは正確な定量が困難である。
しかし、多くのカテコールアミン以外の電気活性
物質の電極反応は非可逆であるので、各図Ｂに示
すように作用電極３７では還元されず、二つの作
用電極を用いればカテコールアミンだけを選択的
に検出して精度よく定量することができることが
明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明装置の一実施例を含む分析シス
テムのフロー及びブロツク線図、第２図Ａは前記
システムにおける二電極薄層電解セルの構造を示
すためにその積層構造を分解した状態の側断面
図、同図Ｂはそのスペーサ層の平面図、第３図
Ａ，Ｂ及びＣは第１図に示したシステムの流路切
換状態をそれぞれ示す流路図、第４図及び第５図
は本発明装置によつて測定したクロマトグラムの
二例である。 １……試料給送機構、２……第１緩衝液供給機
構、３……第２緩衝液供給機構、４，７，１３，
１４……マイクロシリンジ、５……サンプルイン
ジエクタ、２０……ミキシングジヨイント、２２
……ミクロアルミナカラム、２３……ミクロ分離
カラム、２４……二電極薄層電解セル、２８……
参照電極、２９……対極兼セル出口、３６，３７
……作用電極。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 計量ループに接続してループ内の試料を送出
   するためのイオン交換水の供給部からなる試料圧
   送機構と、 PH調整用緩衝液を供給する機構と、 前記圧送機構及び前記緩衝液供給機構からそれ
   ぞれ流出した液を合流させる機構と、 前記合流機構において形成された混合流を導入
   して溶解した試料中のカテコールアミンを選択的
   に吸着するためのアルミナ充填カラムと、 前記アルミナ充填カラムから溶離したカテコー
   ルアミンを成分ごとに分離するための分離カラム
   と、 前記両カラムからのカテコールアミンの溶離及
   び分離において移動相として用いられる第２の緩
   衝液の供給機構と、 前記合流機構、前記二つのカラム及び前記第２
   緩衝液供給機構に接続され、少くとも前記混合
   流を前記アルミナ充填カラムに導びくためのカテ
   コールアミン吸着流路、及び前記第２緩衝液を
   前記アルミナ充填カラムを経て前記分離カラムに
   導びくためのカテコールアミン脱着・分離流路、
   を選択的に形成するための流路切換え弁機構と、 前記分離カラムから溶出・分離した成分を定電
   位電解法により測定するための電解セルと を具備したことを特徴とするカテコールアミン分
   析装置。 ２ 電解セルが２作用電極型薄層電解セルからな
   り、第１の作用電極にはカテコールアミンを酸化
   させるに十分な電位を、第２の作用電極には酸化
   したカテコールアミンを還元すＲに十分な電位を
   それぞれ印加するようにしたことを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の装置。