JPH0284191A - α−ガラクトシル基を含むオリゴ糖あるいは配糖体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はα−ガラクトシダーゼの脱水縮合反応によって
生じたα−ガラクトシル基を含む化合物をα−ガラクト
シダーゼの基質に用いることにより効率よく安価にα−
ガラクトシル基を含む有用オリゴ糖あるいは配糖体を製
造する方法に関するものである。

［従来の技術］ 近年、ラフィノース、スターキオースなどの非還元末端
にα−ガラクトシル基を有するオリゴ環が腸内有用細菌
であるビフィズス菌の増殖因子として有効であると認め
られ、これらオリゴ環を甘味料として用いることが検討
されている。ラフィノース、スターキオースの供給源と
しては、大豆オリゴ環またはビート中のラフィノースが
ある。

しかしながら、上記ラフィノース、スターキオースの原
料として考えられる大豆オリゴ環は旦的に少ないため大
量供給が難しく、また、価格も高い。

ビート中のラフィノースも、供給時期が１０月〜３月と
限定されること、および、現在のところ価格が高いとい
う欠点をもっている。

一方、オリゴ糖あるいは配糖体の合成法としては糖転移
酵素または加水分解酵素の糖転移作用を利用する方法が
開発されている。この方法は、縮合反応によるオリゴ糖
あるいは配糖体の合成とは違い特定の結合様式を持った
オリゴ糖あるいは配糖体のみと特異的に合成できる。例
えばβ−フラクトフラノシダーゼによるフラクトオリゴ
糖、β−ガラクトシダーゼによるβ−ガラクトオリゴ糖
の製造がある。同様にα−ガラクトシダーゼの糖転移作
用を利用１．２てα−ガラクトシル基を持ったオリゴ糖
、配糖体等の有用化合物を製造する方法が考えられるが
、この場合、α−ガラクトシル基を供給する安価な原料
が必要である。しかしながら、現在のところα結合した
ガラクトースを含むオリゴ糖、多糖は天然界に少なく、
ラフィノース、スターキオース、ベルベスコースなどの
ラフィノース族オリゴ糖やブランチオースあるいはそれ
らの誘導体しか存在せず、どれも大量供給が離しい。

［発明が解決しようとする開題点］ そこで１、本発明の目的はα−ガラクトシル基を有する
安価な原料を大量供給することにあり、更にこの基質を
使用してα−ガラクトシダーゼの転移反応を利用しα−
ガラクトシル基を持ったオリゴ糖、配糖体の合成法を堤
供することにある。

［開題点を解決するための手段］ 本発明者らは種々研究を重ねた結果、α−ガラクトシダ
ーゼの脱水縮合反応によって生じたα−ガラクトシル基
を含む化合物がα−ガラクトシダーゼの糖転移作用にお
けるガラクトシル基の供与体として使えることを見い出
し本発明に至った。

すなわち、本発明はガラクトースあるいはガラクトース
を含む化合物（例えば、ラフ１ヘースの加水分解物）な
どにα−ガラクトシダーゼを作用させ脱水縮合反応によ
って生じるα−ガラクトシル基を含む化合物を基質とし
てα−ガラクトシダーゼの転移作用によってα−ガラク
トシル基を転移させα−ガラクトシル基を含む有用なオ
リゴ糖、配糖体あるいは多糖を合成することを特徴とす
るものである。

以下に、本発明について詳述する。

α−ガラクトシダーゼの脱水縮合反応に供する原料とし
て使用しうるガラクトースとしては、市販のガラクトー
スはもちろん、α−ガラクトシル基あるいはβ−ガラク
トシル基を含む天然のオリゴ糖、配糖体あるいは多糖か
ら酵素（β−ガラクタナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
α−ガラクトシダーゼなど）あるいは酸を使用して加水
分解することにより調製したガラクトースあるいはガラ
クトース溶液も使用できる。

α−ガラクトシダーゼは本来加水分解酵素であるが、原
料のガラクトース濃度を高めると加水分解反応の逆反応
として脱水縮合反応も触媒するようになる。従って、高
濃度のガラクトースにα−ガラクトシダーゼを作用させ
た場合、α−１，６結合を主体としたガラクトビオース
を生成する。この場合、反応系に他の水酸基を持つ化合
物（例えば、囃糖やオリゴ糖）も存在すれば、これらの
化合物とガラクトースがα結合で結合した化合物も合成
される。この生成した化合物のガラクトースの結合位置
、あるいは、これらの化合物の比率は用いな酵家の由来
や反応形式により影響を受ける。

このようなα−ガラクトシル基を持つ化合物を効率よく
合成するには原料のガラクトースの濃度は高い程良く、
通常１０％以上の濃度を用いる方が好ましい。また、溶
解度の点から反応温度は高い方が望ましい。α−ガラク
トシダーゼの作用条件は用いる酵素によって異なるが、
ｐＨ３，０〜１０゜０、好ましくは５．０〜８．０の範
囲で、反応温度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜７０
”Ｃの範囲である。反応時間は、酵素の使用量によって
異なるが、通常１〜４８時間である。しかしながら、本
発明は以上の条件、あるいは反応形態のみに限定される
ものではない。

また、α−ガラクトシダーゼは、基質濃度を高めると糖
転移作用を触媒するようになる。従って、α−ガラクト
シダーゼの糖転移作用を利用しα−ガラクトシダーゼの
脱水縮合反応によって生じたα−ガラクトシル基を含む
化合物を供与体に用いて、ラフィノース、スターキオー
ス、ガラクトビオース、α−ガラクトシルグリセリンな
どを合成する場合、基質濃度は高い方が良い。また、受
容体となるシュークロース、ラフィノース、ガラクトー
ス、グリセリンなどの濃度も高い方が良い９通常１０〜
５０％濃度を用いる方が好ましい。α−ガラクｌ〜シダ
ーゼの作用条件は用いるｒ４素によつて異なるが、ｐＨ
３，０〜１Ｏ００、好ましくは５．０〜８．０の範囲で
、反応温度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃の
範囲である。反応時間は、酵素の使用量によって異なる
が、基質のα−ガラクトシル基を含む化合物が約９０％
程度分解される才で行うことが好ましく通常１〜４８時
間である。しかしながら、本発明は以上の条件、゛ある
いは反応形態のみに限定されるものではない９本発明の
前段で用いるα−ガラクトシダーゼは、ガラクトースあ
るいはガラクトースを含む溶液に作用させた場合、脱水
縮合反応によってα−ガラクトシル基を含む化合物を合
成するものであれば良い。才な、後段で用いるα−ガラ
クトシダーゼは、ガラクトビオースやメリビオースのよ
うなα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖や配糖体を分解
し、糖転移作用を触媒する酵素であれば良い。両酵素は
、起源・種類に限定されない。例えば、ビクノボラス・
シナパリス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ　ｃｉｎｎａｂａｒ
ｉ−ｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅ
ρｔｏｃ−ｏｃｃｕｓ　ｂｏｖｉ、ｓ）、デプロコツカ
ス・ニューモニア（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕ
ｆｆｉｏｎｉａｅ）、モルティエレラ・ビナセ（Ｍｏｒ
ｔｉｅｒｅｌｌａ　ｖｉｎａｃｅａ）などの微生物やビ
シア・サテイバ（Ｖｉｃｉａ　５ａｔｉｖａ）、緑色コ
ーヒー豆（Ｇｒｅｅｎ　ｃｏｆｆｅｅ　ｂｅａｎ）など
の植物が生産するα−ガラクトシダーゼが使用できる。

これらの微生物からα−ガラクトシダーゼを生産する方
法は、通常液体培蕎もしくは固体培養が用いられる。液
体培養の場合はその培養上澄液を、固体培養の場合はそ
の抽出液を、その丈ま酵素剤として利用できる９抜な、
場合によ一〕では菌体をそのま丈酵素剤として利用する
ことも可能である。また、必要に応じて既知の方法で精
製した酵素も使用できる。これら酵素あるいは酵素を生
産する菌体は固定化してカラムに詰めたり膜に固定化し
て連続式であるいはバッチ式で繰り返し反応に利用する
ことも可能である。

［発明の効果コ 現在、α−ガラクトシル基を含む有用なオリゴ糖や配糖
体を酵素的に合成する場合、安価で大量に存在するα−
ガラクトシル基の供給源は天然界では知られていない。

本発明のα−ガラクトシル基を含む化合物は、ガラクト
ースあるいはガラクトースを含む溶液からα−ガラクＩ
−，シダーゼによって大量に合成できる。このび−ガラ
クトシル基を含む化合物を供与体に用いることにより、
α−ガラクトシダーゼの糖転移作用によってα−ガラク
トシル基を含む有用なオリゴ糖や配糖体を酵素的に安価
かつ大量に合成できる。

次に本発明の詳細を実施例を挙げて説明する。

［実力色ＦＡ］ 酵素の活性 α−ガラクトシダーゼの活性測定法 １０＠Ｍバラニトロフェニル−α−ガラクトシド０．２
ｍｌと１００ｍＭ　＃酸緩衝液（ｐＨ５゜５）０．２ｍ
ｌにα−ガラクトシダーゼ溶液０．０５＠ｌを加えて４
０℃１０分間反応させる。反応後、０．２Ｍ　Ｎａ２Ｃ
Ｏ３０，５ｍｌを加えて反応を止め、遊離してくるバラ
ニトロフェノール量を分光光度計にて４００ｎｍの吸光
度を計ることにより測定しな。酵素活性１単位は、この
条件下で１分間に１μｍｏｌｅのバラニトロフェノール
を生成する酵素量と定義した。

実施例１ ■ガラクトビオースの作成 ガラクトース７０ｇを含むｐＨ５，０の＃酸緩衝液１０
０ｍ１に市販のモルティエレラ・ビナセ由来のα−ガラ
クトシダーゼ（生化学工業（株））２０単位を加え、５
０℃にて４８時間反応させた。反応液を活性炭カラムク
ロマトグラフィーにかけ、オリゴ糖類を吸着させた後、
エチルアルコール０％〜２０％の濃度勾配により溶出さ
せた。溶出液を濃縮乾燥して脱水縮合生成物２０ｇを得
た。この化合物は、酸で加水分解するとガラクトースの
みを生成し、ペーパークロマトグラフィーの移動度から
ガラクトビオースと同定した。

■α−ガラクトシダーゼによるオリゴ糖の作成前述の縮
合反応によって生成したガラクトビオース１ｇとシュー
クロース１＆を含むｐＨ５，０の酢酸緩衝液５ｍｌに、
実７４Ｍ１−■で使用したのと同種のα−ガラクトシダ
ーゼ４単位を加え５０°Ｃ２４時間反応させた。

反応液を１０分間煮沸加熱し酵素を失活させた後、反応
液１μｌをＰ紙にスポットしローフ゛タノール：ピリシ
゛ン：水＝６：４：３の組成の溶媒系で４重展開後、フ
ロログルシン法によるケトース呈色を行うと、ラフィノ
ースに相当する位置にスポットが検出された。この反応
液を活性炭カラムクロマトグラフィーにかけ、オリゴ糖
類を吸着させた後、エチルアルコールの濃度勾配により
溶出させた。この３量体画分を集め、濃縮し凍結乾燥標
品１．１ｇを得な。

本原品は、（ａ）α−ガラクトシダーゼで加水分解する
とガラクトースとシュークロースを等モル生成すること
、（ｂ）β−フラクＩ・シダーゼで加水分解すると、等
モルのメリビオースとフラクトースを生成すること、　
（Ｃ）α−ガラクトシダーゼとβ−フラクトシダーゼと
で加水分解するとガラクトース、グルコース、フラクト
ースを１モルずつ生成すること、（ｄ）ペーパークロマ
トグラフィーの移動度がラフィノースと一致する。以上
のことからラフィノースであると同定しな。

実施例２　（α−ガラクトシル基を有するオリゴ糖の作
成） ガラクトース３．５ｇを含むｐＨ６，０酢酸緩衝液５ｍ
ｌに市販の緑色コーヒー豆由来のα−ガラクトシダーゼ
溶液（ベーリンガー・マンハイム山之内（株））１単位
を加え、４０℃にて４８時間反応させた９さらに、シュ
ークロース１ｇを加え、さらに４０℃２４時間反応させ
た。

反応液１μｍをＰ紙にスポットし、ペーパークロマトグ
ラフィーにより反応生成物をケトース呈色で調べた結果
、ラフィノースと思われるスポットが確認された。実施
例１−■の場合と同様に活性炭カラムクロマトグラフィ
ーにより３量体区分を単離し、酵素法により構造を確認
した結果ラフィノースであることが明らかとなった。

実施ｆＩＡ３（α−ガラクトシル基を有する配糖体の作
成） ラクトース２ｇを塩酸で加水分解し、水酸化ナトリウム
で中和後ガラクトースとグルコースの等１混合物を得な
。この溶液を濃縮乾燥後、ｐＨ５，０の酢酸緩衝液１．
５ｉ１に溶解し実施例１−■で使用したのと同種のα−
ガラクトシダーゼを同様に作用させ、活性炭カラムクロ
マトグラフィーによりα−ガラクトシル基を含む２糖を
得な。この化合物５００ｍｇとグリセリン１ｇを含むｐ
Ｈ５，０の酢酸緩衝液３ｍｌに前述のα−ガラクトシダ
ーゼ３単位を加え、５０”Ｃで４８時間反応させた。そ
の後、反応液を１ｏ分間加熱し酵素を熱失活させた。

反応液にＩＮ　Ｎａ０）［溶液０．３１を加え、６０分
間加熱して還元糖を分解し、次いでイオン交換樹脂で処
理した後、ペーパークロマトグラフィーにより反応生成
物を調べた結果、グルコースに相当する位置にスポット
が確認された。このグルコースに相当する区分をペーパ
ーから抽出し、性質を調べな。

（ａ）この標品は還元力を有しない（ｂ）α−ガラクト
シダーゼにより加水分解するとガラクトースとグリセリ
ンを等モル生成する。以上のことよりこの原品はα−ガ
ラクトシルグリセリンであると同定した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）α−ガラクトシダーゼの脱水縮合反応によつて生
   じたα−ガラクトシル基を含む化合物を供与体に用いα
   −ガラクトシダーゼの糖転移作用を利用することを特徴
   とするα−ガラクトシル基を含むオリゴ糖あるいは配糖
   体の製造法