JPH025882A - 複製配列、その調製方法および利用 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia
且匹り旦■)の自律複製配列、その調製方法および遺伝
子組換を使用する方法における利用に関するものである
。
且匹り旦■)の自律複製配列、その調製方法および遺伝
子組換を使用する方法における利用に関するものである
。
(従来の技術)
酵母プラスミドの複製の自律を与える配列の存在、役割
およびクローン化は、サッカロミセス・セレビシアエ(
Saccharom ces cerevisiae)
において研究されてきた(参考文献l、2)。酵母標識
遺伝子(例えば星、鱈孤、い下転TRPI等のような生
合成酵素に対してコード番号をつけた遺伝子)をクロー
ンしたバクテリアプラスミド(タイプpBR322)は
、もっともしばしば遺伝子座の相同組み換えによって、
染色体中に僅かな頻度で組み込むことができる。この種
のプラスミドに一層1(自律複製配列)と呼ばれる配列
を導入する場合、形質転換は次の特性を与える。
およびクローン化は、サッカロミセス・セレビシアエ(
Saccharom ces cerevisiae)
において研究されてきた(参考文献l、2)。酵母標識
遺伝子(例えば星、鱈孤、い下転TRPI等のような生
合成酵素に対してコード番号をつけた遺伝子)をクロー
ンしたバクテリアプラスミド(タイプpBR322)は
、もっともしばしば遺伝子座の相同組み換えによって、
染色体中に僅かな頻度で組み込むことができる。この種
のプラスミドに一層1(自律複製配列)と呼ばれる配列
を導入する場合、形質転換は次の特性を与える。
−高い効力(DNA1x当り10000個以上の形質転
換細胞)、 一プラスミドの染色体外複製、 一有糸核***の相対的不安定。
換細胞)、 一プラスミドの染色体外複製、 一有糸核***の相対的不安定。
これらの配列凹は同種または異種のDNA配列である。
これらは染色体起源または染色体外起源(プラスミド、
ミトコンドリアなど)である。
ミトコンドリアなど)である。
しかし数人の著者によって書かれた前記文献(1,2)
は大抵の場合、異種ホスト中でarsの性質を表示する
配列が、初期の構造ではこの特性を有しないことを明ら
かに示している。相同の関係では、最も一般に受は入れ
られた仮定は染色体から遊離したarsが複製源に対応
することであり、酵母染色体につき平均20ないし40
Kbの間隔があると見積もられている。
は大抵の場合、異種ホスト中でarsの性質を表示する
配列が、初期の構造ではこの特性を有しないことを明ら
かに示している。相同の関係では、最も一般に受は入れ
られた仮定は染色体から遊離したarsが複製源に対応
することであり、酵母染色体につき平均20ないし40
Kbの間隔があると見積もられている。
工業酵母ヤロウィア・リポリチカについては、組込形質
転換はサッカロミセス・セレビシアエのLYS2遺伝子
(3)およびヤロウィア・リポリチカのLEU2遺伝子
(4)で記載されている。この同じ遺伝子のプロモータ
ーは、1eu2遺伝子座で染色体中に組み込まれる異種
遺伝子(フレオマイシンとベータ・ガラクトシダーゼに
耐性)の発現を誘導するために用いられた(5)。また
、切断位置しか示さない制限酵素で形質転換するプラス
ミドを線状にするとき、100の因子によって形質転換
の頻度が太き(なる(そのときDNA1uにつき100
以下から10000以上 の形質転換体となる)ことが
認められた(4)。すでにサッカロミセス・セレビシア
エで知られている制限酵素によって生産された結合性末
端を再組み換え効果は、ヤロウィア・リポリチカで一層
顕著である。
転換はサッカロミセス・セレビシアエのLYS2遺伝子
(3)およびヤロウィア・リポリチカのLEU2遺伝子
(4)で記載されている。この同じ遺伝子のプロモータ
ーは、1eu2遺伝子座で染色体中に組み込まれる異種
遺伝子(フレオマイシンとベータ・ガラクトシダーゼに
耐性)の発現を誘導するために用いられた(5)。また
、切断位置しか示さない制限酵素で形質転換するプラス
ミドを線状にするとき、100の因子によって形質転換
の頻度が太き(なる(そのときDNA1uにつき100
以下から10000以上 の形質転換体となる)ことが
認められた(4)。すでにサッカロミセス・セレビシア
エで知られている制限酵素によって生産された結合性末
端を再組み換え効果は、ヤロウィア・リポリチカで一層
顕著である。
(発明が解決しようとする課題)
ヤロウィア・リポリチカによる組込形質転換を用いる際
に相補性によって遺伝子をクローン化することが望まし
い場合、次に示す困難にぶつかる。
に相補性によって遺伝子をクローン化することが望まし
い場合、次に示す困難にぶつかる。
(a)DNAライブラリはρBR322+ LB皿タイ
プの組込みプラスミドにおいて実現されるので、唯−度
このプラスミドにおいて存在する制限部位がクローン化
フラグメントにおいて同様には存在しないかどうかは知
られていない。従って、DNAを線状にするため、形質
転換の効力が一層小さい局部制限を行う(そして種々の
酵素を用いてこの試験を行う)ことになる。
プの組込みプラスミドにおいて実現されるので、唯−度
このプラスミドにおいて存在する制限部位がクローン化
フラグメントにおいて同様には存在しないかどうかは知
られていない。従って、DNAを線状にするため、形質
転換の効力が一層小さい局部制限を行う(そして種々の
酵素を用いてこの試験を行う)ことになる。
(b) −度、相補性によってクローンが得られると
サザン法および放射能試験によって、クローン化されゲ
ノムに組み込まれたフラグメントの制限地図を細かく分
析する必要がある。この地図の研究は、連結反応後、大
腸菌(Escherichia coli)での形質転
換によって選択されるプラスミドを引き出すため、形質
転換体のDNA全体を切断できる酵素はどれを使用でき
るかを知ることができる。
サザン法および放射能試験によって、クローン化されゲ
ノムに組み込まれたフラグメントの制限地図を細かく分
析する必要がある。この地図の研究は、連結反応後、大
腸菌(Escherichia coli)での形質転
換によって選択されるプラスミドを引き出すため、形質
転換体のDNA全体を切断できる酵素はどれを使用でき
るかを知ることができる。
凹配列を含む複製型プラスミドにDNAライブラリを実
現できると、これら2つの不都合はなくなる。事実、そ
の結果、制限酵素によってプラスミドを切断することは
不用となり、染色体外に保持されたプラスミドは容易に
大腸菌で修復される。」圏配列の存在はまた、プラスミ
ドが一般に多数複製されるので、原則として遺伝子を増
強することができる。これらの理由はすべて、ヤロウィ
ア・リポリチカに対する皿の研究を正当化した。
現できると、これら2つの不都合はなくなる。事実、そ
の結果、制限酵素によってプラスミドを切断することは
不用となり、染色体外に保持されたプラスミドは容易に
大腸菌で修復される。」圏配列の存在はまた、プラスミ
ドが一般に多数複製されるので、原則として遺伝子を増
強することができる。これらの理由はすべて、ヤロウィ
ア・リポリチカに対する皿の研究を正当化した。
多くの研究所において多くの選択が試みられ失敗したが
(6)、この酵母の細胞***法がこれに関係していると
いう仮説が発表された。実際に(第1図)ヤロウィア・
リポリチカは二形性であり、菌糸体と酵母状形態を生じ
る。」見プラスミドが分離に対した強い母性質を示す、
すなわちコピーの全体がブロックとして分離する傾向が
あり、系統的に娘細胞に変化しないことが、サッカロミ
セス・セレビシアエで示された(7)。娘細胞が酵母型
の細胞の芽であるとすれば、選択位置で分割することを
確実に止めるが、さらに母細胞は次に分割する間にプラ
スミドを伝える可能性を有している(サッカロミセス・
セレビシアエでは母細胞は約20回分割する)。その代
わりに、菌糸体について問題にするならば、各細胞は一
個の娘細胞しか生成しない。プラスミドが分割する間に
伝えられないならば、コロニーは選択位置で分割するこ
とを停止する。この仮定に基づいて、菌糸体を形成する
ことができない突然変異体を選択し、ars配列の研究
のために用いた。この種の配列は実際に分離されており
、菌糸体タイプの細胞にも作用することが明らかになっ
た。
(6)、この酵母の細胞***法がこれに関係していると
いう仮説が発表された。実際に(第1図)ヤロウィア・
リポリチカは二形性であり、菌糸体と酵母状形態を生じ
る。」見プラスミドが分離に対した強い母性質を示す、
すなわちコピーの全体がブロックとして分離する傾向が
あり、系統的に娘細胞に変化しないことが、サッカロミ
セス・セレビシアエで示された(7)。娘細胞が酵母型
の細胞の芽であるとすれば、選択位置で分割することを
確実に止めるが、さらに母細胞は次に分割する間にプラ
スミドを伝える可能性を有している(サッカロミセス・
セレビシアエでは母細胞は約20回分割する)。その代
わりに、菌糸体について問題にするならば、各細胞は一
個の娘細胞しか生成しない。プラスミドが分割する間に
伝えられないならば、コロニーは選択位置で分割するこ
とを停止する。この仮定に基づいて、菌糸体を形成する
ことができない突然変異体を選択し、ars配列の研究
のために用いた。この種の配列は実際に分離されており
、菌糸体タイプの細胞にも作用することが明らかになっ
た。
(課題を解決するための手段)
本発明はヤロウィア・リポリチカにおいて有効なars
配列並びにこのようなars配列を有するDNA配列に
関するものである。特に、本発明は第8B図の制限地図
に示す2.2 Wbの勿旧/勿旧DNAフラグメントに
よってもたらされるヤロウィア・リポリチカにおいて有
効なars配列、およびこれらの配列を含むプラスミド
に関するものである。
配列並びにこのようなars配列を有するDNA配列に
関するものである。特に、本発明は第8B図の制限地図
に示す2.2 Wbの勿旧/勿旧DNAフラグメントに
よってもたらされるヤロウィア・リポリチカにおいて有
効なars配列、およびこれらの配列を含むプラスミド
に関するものである。
さらに本発明は、特にヤロウィア・リポリチカで有効な
、特に次の方法で得られる皿配列を有するプラスミドに
関するものである。
、特に次の方法で得られる皿配列を有するプラスミドに
関するものである。
a) ヤロウィア・リポリチカのゲノムフラグメントラ
イブラリがヤロウィア・リポリチカの栄養要求体を補足
する組込みベクターにおいて形成され、b) 前記組込
みベクターによって補足されることができる栄養要求体
を有するヤロウィア・リポリチカのホスト株が、前記ラ
イブラリのプラスミドで形質転換され、 C) コロニーハイブリダイゼーションを、組込みベク
ターを検出するゾンデを用いて行い、最強の信号を有す
る形質転換体を選択し、 d) ベクタークローンの微小溶解物を調製し、染色体
外プラスミドを検出し、 e) これらのプラスミドはars配列を有し、形質転
換力を試験して確認でき、元のベクターの形質転換力よ
りも少なくとも5倍である。
イブラリがヤロウィア・リポリチカの栄養要求体を補足
する組込みベクターにおいて形成され、b) 前記組込
みベクターによって補足されることができる栄養要求体
を有するヤロウィア・リポリチカのホスト株が、前記ラ
イブラリのプラスミドで形質転換され、 C) コロニーハイブリダイゼーションを、組込みベク
ターを検出するゾンデを用いて行い、最強の信号を有す
る形質転換体を選択し、 d) ベクタークローンの微小溶解物を調製し、染色体
外プラスミドを検出し、 e) これらのプラスミドはars配列を有し、形質転
換力を試験して確認でき、元のベクターの形質転換力よ
りも少なくとも5倍である。
以下の実施例においては、ヤロウィア・リポリチカのコ
ロニーは、肉眼図で異なる形態を示すものであり、即ち
、いわゆる「縮れ」またはざらついているコロニーは、
皮膜を形成し寒天表面に毛で囲まれており、この形態は
細胞が不揃いであまり数多くない時に鮮明であるが、他
方、「縮れていない」コロニーはこれらの性質を示さな
い。
ロニーは、肉眼図で異なる形態を示すものであり、即ち
、いわゆる「縮れ」またはざらついているコロニーは、
皮膜を形成し寒天表面に毛で囲まれており、この形態は
細胞が不揃いであまり数多くない時に鮮明であるが、他
方、「縮れていない」コロニーはこれらの性質を示さな
い。
縮れている表現型は、rFil+」で示され、対応する
遺伝子型はrfil+Jで示される。
遺伝子型はrfil+Jで示される。
実施例に示すように、受容体法がFil−株である場合
、bとCの段階で形質転換体の安定性を試験でき、さら
に安定性の小さい形質転換体を選択できる。実際に、こ
れは最初の皿配列を選択するため用いられた方法である
。しかし、Fil十株を用いる時、前記の方法を用いる
ことが好ましい。
、bとCの段階で形質転換体の安定性を試験でき、さら
に安定性の小さい形質転換体を選択できる。実際に、こ
れは最初の皿配列を選択するため用いられた方法である
。しかし、Fil十株を用いる時、前記の方法を用いる
ことが好ましい。
勿論、この方法は、各場合において、凹配列を有するプ
ラスミドを選択しながら、多くの修飾を受けることがで
きる。
ラスミドを選択しながら、多くの修飾を受けることがで
きる。
好適例では、本発明による方法は、次の方法で・行われ
る。
る。
−plN^62タイプの組込みベクターにおいてヤロウ
ィア・リポリチカのゲノムフラグメントのライブラリの
形成; −Fil十株においてこのライブラリのスーパーコイル
化した円形プラスミドの形質転換: LEI3+形質転
換体の選択(これは組込みプラスミドまたは複製型プラ
スミドを含むことができる);−pBR322ゾンデを
用いたコロニーハイブリダイゼーション:より強力な信
号がマルチコピー複製型形質転換体に見出される;潜在
arsクローンの単離; 一選択されたクローンの微小溶解物は非制限DNAのサ
ザン転写: pBR322ゾンデを用いた染色体外プラ
スミドの検出; 一徹小溶解物のDNAを用い大腸菌の形質転換およびa
rsプラスミドの増幅; 一適当なところで、クローンの不安定性の特性化。
ィア・リポリチカのゲノムフラグメントのライブラリの
形成; −Fil十株においてこのライブラリのスーパーコイル
化した円形プラスミドの形質転換: LEI3+形質転
換体の選択(これは組込みプラスミドまたは複製型プラ
スミドを含むことができる);−pBR322ゾンデを
用いたコロニーハイブリダイゼーション:より強力な信
号がマルチコピー複製型形質転換体に見出される;潜在
arsクローンの単離; 一選択されたクローンの微小溶解物は非制限DNAのサ
ザン転写: pBR322ゾンデを用いた染色体外プラ
スミドの検出; 一徹小溶解物のDNAを用い大腸菌の形質転換およびa
rsプラスミドの増幅; 一適当なところで、クローンの不安定性の特性化。
特に、前記方法は−pINA62のようなpBR322
から派生した特定のベクターの利用に対応する。
から派生した特定のベクターの利用に対応する。
以下実施例に基づき本発明を説明するが、本発明はこれ
らの実施例によって制限されるものではない。
らの実施例によって制限されるものではない。
同様に、実施例において、ars配列を有するプラスミ
ドから、この配列またはars配列を有する一層大きい
配列を単離することができる。さらに単離されたこれら
の配列、または同様に単離されたプラスミドのフラグメ
ントは、これらの−酊1配列の存在によって前述のプラ
スミドを染色体外状態に維持され増幅できるので、表現
ベクトルプラスミドの生産のために用いられ、これは前
記プラスミドによって表された蛋白質の生産過剰に導か
れる。
ドから、この配列またはars配列を有する一層大きい
配列を単離することができる。さらに単離されたこれら
の配列、または同様に単離されたプラスミドのフラグメ
ントは、これらの−酊1配列の存在によって前述のプラ
スミドを染色体外状態に維持され増幅できるので、表現
ベクトルプラスミドの生産のために用いられ、これは前
記プラスミドによって表された蛋白質の生産過剰に導か
れる。
幾つかの表現ベクターは既に、従来技術、特にヨーロッ
パ特許第0220864号、第0138508号および
第0166659号に記載されている。
パ特許第0220864号、第0138508号および
第0166659号に記載されている。
これらの特許では、本質的にはいわゆる組み込みベクタ
ーを記載しており、その不利な点は先に記載した。しか
し、これらの組み込みベクターは前記」n配列を結合す
るならば染色体外プラスミドに形質転換される。
ーを記載しており、その不利な点は先に記載した。しか
し、これらの組み込みベクターは前記」n配列を結合す
るならば染色体外プラスミドに形質転換される。
表現ベクターの技術は詳細には記載しないが、この技術
は、ヤロウィア・リポリチカにおける遺伝子の表現要素
、特にヤロウィア・リポリチカのプロモーターであるプ
ロモーター、例えば凹またはSUC2遺伝子のプロモー
ターに関し、またクローン化できる遺伝子のタイプに関
して実際に前記特許に既に広範囲に記載されている。ク
ローン化できる遺伝子のなかで、例えばヨーロッパ特許
第229864号に記載されているようなプロレニンお
よびヒトアナフィラトキシンC5Aに対してコードする
遺伝子、アルカリ性細胞外プロテアーゼ(八EP)、イ
ンベルターゼ、ボルシンインターヘエロンα、またはプ
ロキモシンを挙げる必要がある。
は、ヤロウィア・リポリチカにおける遺伝子の表現要素
、特にヤロウィア・リポリチカのプロモーターであるプ
ロモーター、例えば凹またはSUC2遺伝子のプロモー
ターに関し、またクローン化できる遺伝子のタイプに関
して実際に前記特許に既に広範囲に記載されている。ク
ローン化できる遺伝子のなかで、例えばヨーロッパ特許
第229864号に記載されているようなプロレニンお
よびヒトアナフィラトキシンC5Aに対してコードする
遺伝子、アルカリ性細胞外プロテアーゼ(八EP)、イ
ンベルターゼ、ボルシンインターヘエロンα、またはプ
ロキモシンを挙げる必要がある。
例として、本発明においては単に対応する」n配列の効
力を示すためβ−ガラクトシダーゼの表現についてのみ
述べるが、ヨーロッパ特許第0220864号に記載さ
れたプラスミドを利用し、−徂1配列を結合することに
よって、同じタイプの組立てを行うことができることは
明らかである。
力を示すためβ−ガラクトシダーゼの表現についてのみ
述べるが、ヨーロッパ特許第0220864号に記載さ
れたプラスミドを利用し、−徂1配列を結合することに
よって、同じタイプの組立てを行うことができることは
明らかである。
従って本発明は、またヤロウィア・リポリチカにおいて
有効なars配列を有するDNA配列の他に、前記配列
を組み込むプラスミドと、特に工業的蛋白質を表現する
ためのプラスミドに関するものである。
有効なars配列を有するDNA配列の他に、前記配列
を組み込むプラスミドと、特に工業的蛋白質を表現する
ためのプラスミドに関するものである。
ヤロウィア・リポリチカにおける工業的蛋白質の表現の
ためのこれらのプラスミドは、前記蛋白質に対してコー
ドする配列の他に、遺伝単位の集合体、特にプロモータ
ーを含む制御領域を含み、ヤロウィア・リポリチカにお
いて前記蛋白質の表現を確保でき、さらに」n配列を有
する。
ためのこれらのプラスミドは、前記蛋白質に対してコー
ドする配列の他に、遺伝単位の集合体、特にプロモータ
ーを含む制御領域を含み、ヤロウィア・リポリチカにお
いて前記蛋白質の表現を確保でき、さらに」n配列を有
する。
また、このタイプのn配列を有し、ヤロウィア・リポリ
チカを相補することができる組み込みプラスミドの提案
に関するものである。
チカを相補することができる組み込みプラスミドの提案
に関するものである。
さらに、本発明は前記の如くプラスミドによって形質転
換されるヤロウィア・リポリチカ株に関するもので、こ
の株はFil÷またはFil−とすることができる。
換されるヤロウィア・リポリチカ株に関するもので、こ
の株はFil÷またはFil−とすることができる。
最後に、本発明は、その生長を確保する途中で本発明に
よるヤロウィア・リポリチカ株を培養することを特徴と
する工業的蛋白質の製造方法に関するものである。
よるヤロウィア・リポリチカ株を培養することを特徴と
する工業的蛋白質の製造方法に関するものである。
(実施例)
以下、実施例に基づき本発明を説明する。
ス」1殊上
顕微鏡スケールの菌糸体の生成は、肉眼によると異なる
形態のコロニーによって表される。即ち、「縮れた」ま
たは粗いコロニーは、寒天の表面で皮膜を形成し、毛根
で囲まれている(第2図)。
形態のコロニーによって表される。即ち、「縮れた」ま
たは粗いコロニーは、寒天の表面で皮膜を形成し、毛根
で囲まれている(第2図)。
この形態は1ケース当りの細胞の数はあまり多くなく
(100以下)、また細胞がグルコースの濃度が大きく
豊富な培地にある場合に一層鮮明である。
(100以下)、また細胞がグルコースの濃度が大きく
豊富な培地にある場合に一層鮮明である。
実際にUV線でINAG33122株(勤旦、に婬−3
5゜」肛2. IYS2−5. adel)の培体を
60%の生存率の線量で照射する。完全な培地における
相の発現後、細胞をYPD、。培地(抽出酵母1%、ペ
プトン1%、グルコース30g/ l、寒天20g/
i ) 、または、YPD I。
5゜」肛2. IYS2−5. adel)の培体を
60%の生存率の線量で照射する。完全な培地における
相の発現後、細胞をYPD、。培地(抽出酵母1%、ペ
プトン1%、グルコース30g/ l、寒天20g/
i ) 、または、YPD I。
培地(10g#!のグルコースのみ)に広げた(約50
07ケース)。28°Cで8日間培養後、不定型の形態
を示すコロニーを双眼ルビプで符号を付け、精製した。
07ケース)。28°Cで8日間培養後、不定型の形態
を示すコロニーを双眼ルビプで符号を付け、精製した。
その表現型を小さい密度のコロニーを顕微鏡で観察して
確認した。最後に7つの突然変異株が最初の61000
コロニーに保持され(頻度1.I X 10−’)、−
個だけが続く実験に対して充分純粋で安定な表現型を示
した。この表現型をFil−と言い、遺伝子型をfil
l−18で示す。この株の名はINAG33129(ハ
旦、に婬−35,」肛2.h婬−5.閃1.旦旦−18
)である。
確認した。最後に7つの突然変異株が最初の61000
コロニーに保持され(頻度1.I X 10−’)、−
個だけが続く実験に対して充分純粋で安定な表現型を示
した。この表現型をFil−と言い、遺伝子型をfil
l−18で示す。この株の名はINAG33129(ハ
旦、に婬−35,」肛2.h婬−5.閃1.旦旦−18
)である。
った約20のプラスミドについて評価した挿入部の平均
長さは、はぼ5.2kbである。これらのプールのDN
Aは、エチジウムプロミドとセシウムクロリドの変化度
で抽出精製した。
長さは、はぼ5.2kbである。これらのプールのDN
Aは、エチジウムプロミドとセシウムクロリドの変化度
で抽出精製した。
突然変異する(非常に安定な)受容体株1eu2−35
(デイ・エム・オグリチアクのDX465−7B株の原
産、参考文献8) 、pBR322の5alI部位(第
4図)にクローン化したLEU2対立遺伝子を含むプラ
スミド−pINA62 (参考文献5)においてライブ
ラリを構成した。ヤロウィア・リポリチカの15901
−4株(ハ側。
(デイ・エム・オグリチアクのDX465−7B株の原
産、参考文献8) 、pBR322の5alI部位(第
4図)にクローン化したLEU2対立遺伝子を含むプラ
スミド−pINA62 (参考文献5)においてライブ
ラリを構成した。ヤロウィア・リポリチカの15901
−4株(ハ側。
肛録−21.ニー51皿−5)のDNAは、完全にII
I酵素によって消化され、BamtlTによって予め切
断された−pINA62プラスミドに混合し、アルカリ
性ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。
I酵素によって消化され、BamtlTによって予め切
断された−pINA62プラスミドに混合し、アルカリ
性ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。
ライブラリは完全にゲノムを切断せず、89%がハイブ
リッドと呼ばれる全部で7000クローンを示す4組(
またはプール)から構成された。無作意に取りロウイア
・リポリチカではarsは比較的不安定であるという仮
定から、まずプールのDNAを用いてINAG3312
9株を形質転換し、次に不安定なりローンを探した。プ
ールのDNAは、染色体外複製で配列を直接選択するた
め、予め制限しなっかった。それでも、上I酵素(−p
INA62出発のプールにおいて単独の部位でLEU2
配列に位置する)によって部分的または全体的に切断さ
れたこのDNAは、Jのような組み込みによって形質転
換することができる(たとえ後者よりも弱い頻度である
としても)。形質変換体の数、試験したクローンの数、
不安定のクーロンのパーセンテージ(はぼ10%である
)は、表1に示した。
リッドと呼ばれる全部で7000クローンを示す4組(
またはプール)から構成された。無作意に取りロウイア
・リポリチカではarsは比較的不安定であるという仮
定から、まずプールのDNAを用いてINAG3312
9株を形質転換し、次に不安定なりローンを探した。プ
ールのDNAは、染色体外複製で配列を直接選択するた
め、予め制限しなっかった。それでも、上I酵素(−p
INA62出発のプールにおいて単独の部位でLEU2
配列に位置する)によって部分的または全体的に切断さ
れたこのDNAは、Jのような組み込みによって形質転
換することができる(たとえ後者よりも弱い頻度である
としても)。形質変換体の数、試験したクローンの数、
不安定のクーロンのパーセンテージ(はぼ10%である
)は、表1に示した。
表土
不安定なりローンは、Leu−コロニーを有意に分離し
たクローンである。
たクローンである。
91−−と93じ4生
プール番号
プール長さ(1)
1234計
不安定なりローンの数 10 12 1 0不安
定なりローンの% 12 16 2 <8
11(1)バクテリアクローンの数 形質転換体クローンの不安定性を試験するため、豊かな
培地で線を付け、生長後、最少培地(硫酸アンモニウム
のない酵母窒素塩基1.7g/ffi、窒素源リシ:/
1g/j!、アデニン−MCI 100mg/ 1、グ
ルコース10g7N、寒天20g/ff1)およびL−
ロイシン(200mg/ l )を補充した最少培地で
複製した。
定なりローンの% 12 16 2 <8
11(1)バクテリアクローンの数 形質転換体クローンの不安定性を試験するため、豊かな
培地で線を付け、生長後、最少培地(硫酸アンモニウム
のない酵母窒素塩基1.7g/ffi、窒素源リシ:/
1g/j!、アデニン−MCI 100mg/ 1、グ
ルコース10g7N、寒天20g/ff1)およびL−
ロイシン(200mg/ l )を補充した最少培地で
複製した。
不安定なコロニーは選択培地に保持し、全体のDNAは
既に述べた(9)微小細胞溶解の方法で抽出した。この
DNAは、アガロースゲルで電気泳動させ、次にサザン
法(10)によってナイロン膜(ビオデイン、ポールフ
ランス)で形質転換し、カップルの置換技術にツクトラ
ンスレーションキット、アメルシャムフランス)によっ
てizpで印したプラスミド−pINA62のDNAで
交雑した。
既に述べた(9)微小細胞溶解の方法で抽出した。この
DNAは、アガロースゲルで電気泳動させ、次にサザン
法(10)によってナイロン膜(ビオデイン、ポールフ
ランス)で形質転換し、カップルの置換技術にツクトラ
ンスレーションキット、アメルシャムフランス)によっ
てizpで印したプラスミド−pINA62のDNAで
交雑した。
この放射能プルーブ(probe)は、非常に複雑なバ
ンドの形で、染色体」町対立遺伝子に印をつけることが
でき、DNAは制限されてなく、染色体外バンドは形質
転換体プラスミド(pINA62+挿入部)に相当する
。さらに多くは閉じられた円形(共有閉鎖円、CCC)
に相当するプラスミドのハンド(第5図)の移動を区別
した後、少なくとも5つのプラスミドの切断を認めるこ
とができる。若千の穴(well)の中に見られる他の
バンドは、同じ株に複数のプラスミドが存在し、あるい
は同じ分子の開放した円形(OC)に相当する。二つの
仮定を区別するため、アンピシリンに耐性のコロニー(
耐性のバクテリア遺伝子はpINA62に存在する)を
選択することによって形質転換体から抽出したDNAを
用いて大腸菌の88101株(hsdR−+ hsdM
−+recA13. u飢44,1acZ4.圏uB6
+ 朗2.並1゜Sm’ )を形質転換する。選定さ
れた酵母の各形質転換体に対して、プラスミドを抽出し
制限酵素によって分析した大腸菌のコロニーを得る。酵
母の各形質転換体が一個のタイプのプラスミドしか含ま
ないことを確証する。5個の選択プラスミドの制限地図
を第6図に示した。これらの地図の分析、並びにこれら
のプラスミドの制限とars配列の一つ(−pINA1
19プラスミドのフラグメント)との間で実現されたハ
イブリダイゼーション(本文には記載されていない)の
結果は、クローン化したarsフラグメントの3個は実
際に相同であることを示している。当該フラグメントは
、適切な場合(−pINA119と−pINAI26の
場合に)連結時に他のフラグメントを連結する4、5k
bの同じJII−arsI■フラグメントを含む、結論
として、3個の異なるars配列が入手でき、これらは
pINA119と−pINA123と−pINAI24
のプラスミドによって支持され、それぞれ5.2kb
、 6.6kb 、 17.8kbのDNAフラグメン
トに位置する。
ンドの形で、染色体」町対立遺伝子に印をつけることが
でき、DNAは制限されてなく、染色体外バンドは形質
転換体プラスミド(pINA62+挿入部)に相当する
。さらに多くは閉じられた円形(共有閉鎖円、CCC)
に相当するプラスミドのハンド(第5図)の移動を区別
した後、少なくとも5つのプラスミドの切断を認めるこ
とができる。若千の穴(well)の中に見られる他の
バンドは、同じ株に複数のプラスミドが存在し、あるい
は同じ分子の開放した円形(OC)に相当する。二つの
仮定を区別するため、アンピシリンに耐性のコロニー(
耐性のバクテリア遺伝子はpINA62に存在する)を
選択することによって形質転換体から抽出したDNAを
用いて大腸菌の88101株(hsdR−+ hsdM
−+recA13. u飢44,1acZ4.圏uB6
+ 朗2.並1゜Sm’ )を形質転換する。選定さ
れた酵母の各形質転換体に対して、プラスミドを抽出し
制限酵素によって分析した大腸菌のコロニーを得る。酵
母の各形質転換体が一個のタイプのプラスミドしか含ま
ないことを確証する。5個の選択プラスミドの制限地図
を第6図に示した。これらの地図の分析、並びにこれら
のプラスミドの制限とars配列の一つ(−pINA1
19プラスミドのフラグメント)との間で実現されたハ
イブリダイゼーション(本文には記載されていない)の
結果は、クローン化したarsフラグメントの3個は実
際に相同であることを示している。当該フラグメントは
、適切な場合(−pINA119と−pINAI26の
場合に)連結時に他のフラグメントを連結する4、5k
bの同じJII−arsI■フラグメントを含む、結論
として、3個の異なるars配列が入手でき、これらは
pINA119と−pINA123と−pINAI24
のプラスミドによって支持され、それぞれ5.2kb
、 6.6kb 、 17.8kbのDNAフラグメン
トに位置する。
尚第5図は不安定な形質転換体におけるプラスミドの検
出を示す図で、受容体株pi1− (穴AとK)と種々
の形質転換体(六BないしJ)の制限されないDNAは
pINA62プラスミドによって構成された放射性プロ
ーブ(izpで標識した)を用いて(ビオシンに移動し
移転した後)ハイブリダイゼーションさせた。
出を示す図で、受容体株pi1− (穴AとK)と種々
の形質転換体(六BないしJ)の制限されないDNAは
pINA62プラスミドによって構成された放射性プロ
ーブ(izpで標識した)を用いて(ビオシンに移動し
移転した後)ハイブリダイゼーションさせた。
2組のゲルは、左側は形質転換体2−18 (穴B)、
2−26 (穴C) 、2−39 C穴D) 、3−1
9 (穴E)および2−75 (六F)を示し、右側は
形質転換体2−18(穴G) 、1−68 (穴)I)
、1−77 (穴■)および127(穴J)を示す。
2−26 (穴C) 、2−39 C穴D) 、3−1
9 (穴E)および2−75 (六F)を示し、右側は
形質転換体2−18(穴G) 、1−68 (穴)I)
、1−77 (穴■)および127(穴J)を示す。
形質転換体の名称において、第一の数字は開始点の「プ
ール」を示し、第二の数字は順位の番号である。染色体
DNAは複雑なバンド(diffuse band)の
形でプローブLE02部分に表され(DNAは制限され
ない)、大部分の穴(特に唯一の信号を構成する受容体
株、穴AおよびK)に認められる。強度の差は実際、ゲ
ル上に付着したDNAの変量を反映している。プラスミ
ドは少なくとも開口した円(OC)の形で示し、また複
数はCCCの形で示す。図では、プラスミドの5箇所の
長さを区別することができ、順に第1(穴D)、第2(
穴B、 C,F、 G) 、第3(穴H)、第4(六E
)および(穴TおよびJ)で増加する。
ール」を示し、第二の数字は順位の番号である。染色体
DNAは複雑なバンド(diffuse band)の
形でプローブLE02部分に表され(DNAは制限され
ない)、大部分の穴(特に唯一の信号を構成する受容体
株、穴AおよびK)に認められる。強度の差は実際、ゲ
ル上に付着したDNAの変量を反映している。プラスミ
ドは少なくとも開口した円(OC)の形で示し、また複
数はCCCの形で示す。図では、プラスミドの5箇所の
長さを区別することができ、順に第1(穴D)、第2(
穴B、 C,F、 G) 、第3(穴H)、第4(六E
)および(穴TおよびJ)で増加する。
第6図は、第5図に定義した5種の形質転換体から単離
された5種のプラスミドの制限地図すなわち、 pNA119は形質転換体2−18に由来(クラス2)
、pNΔ123は形質転換体1−68に由来(クラス3
)、p NA124は形質転換体1−77に由来(クラ
ス5)、p NA125は形質転換体2−39に由来(
クラス1)、p NA126は形質転換体3−19に由
来(クラス4)。
された5種のプラスミドの制限地図すなわち、 pNA119は形質転換体2−18に由来(クラス2)
、pNΔ123は形質転換体1−68に由来(クラス3
)、p NA124は形質転換体1−77に由来(クラ
ス5)、p NA125は形質転換体2−39に由来(
クラス1)、p NA126は形質転換体3−19に由
来(クラス4)。
pBI?322の部分は黒で示し、LEU2遺伝子は点
線で示し、ars配列を有する挿入部は空白で示した。
線で示し、ars配列を有する挿入部は空白で示した。
プラスミドはpBR322の5allの位置で開口して
いるが、Sal Iの地図は挿入によって確立されない
。
いるが、Sal Iの地図は挿入によって確立されない
。
制限部位を示すと、B=B憇旧、G=Bれ■、E=」並
R1,,H=肛閃■、B / G =Jd IIフラグ
メントのクローン化によって壊れたBamH1部位であ
る。矢印は、その方向と共に(2個のIn部位によって
限定された)相同領域を示す。
R1,,H=肛閃■、B / G =Jd IIフラグ
メントのクローン化によって壊れたBamH1部位であ
る。矢印は、その方向と共に(2個のIn部位によって
限定された)相同領域を示す。
ヤロウィア・リポリチカにおいて染色体外分子として選
択したプラスミドが高い頻度でこの酵母を形質転換でき
ることを示すために、Fil−突然変異体株(INAG
33129)と、Fil十株(INAG33122)を
用いる。二つは−pINA119によって高い頻度で形
質転換できることが明らかになった(表2、実験1.2
)。これらの結果から、組み込み(ここでは」匹Iによ
って制限された−pINA62と−pINA119プラ
スミド)によるINAG33129株の形質転換の最適
な状態は、制限されていない−pINA119を用いて
得られた複製形質転換の最適な状態に対応しない(第1
の場合は実験3と、第2の場合は実験1と2と比較)こ
とがわかる。この最適な状態の生物学的決定は、未知で
あり、このことは、一方の実験が他方の実験に対してこ
れらの結果の非常に鮮明な定量的変動を説明している。
択したプラスミドが高い頻度でこの酵母を形質転換でき
ることを示すために、Fil−突然変異体株(INAG
33129)と、Fil十株(INAG33122)を
用いる。二つは−pINA119によって高い頻度で形
質転換できることが明らかになった(表2、実験1.2
)。これらの結果から、組み込み(ここでは」匹Iによ
って制限された−pINA62と−pINA119プラ
スミド)によるINAG33129株の形質転換の最適
な状態は、制限されていない−pINA119を用いて
得られた複製形質転換の最適な状態に対応しない(第1
の場合は実験3と、第2の場合は実験1と2と比較)こ
とがわかる。この最適な状態の生物学的決定は、未知で
あり、このことは、一方の実験が他方の実験に対してこ
れらの結果の非常に鮮明な定量的変動を説明している。
従って、この変動は、pINA119プラスミドが常に
最初無傷のpINA62プラスミドよりも20ないし1
00倍多く形質転換する事実の理由とはならず、これは
皿の存在をよく証明している。
最初無傷のpINA62プラスミドよりも20ないし1
00倍多く形質転換する事実の理由とはならず、これは
皿の存在をよく証明している。
実験3では、−pINA119を用いて一般のフラグメ
ントを有することが明らかになる−pINA125とp
INA126プラスミドは、INAG33129株を殆
ど同じ頻度で形質転換する(pINA125は少し少な
く形質転換する)。pINA124の長さがplN^1
19のほぼ二倍であることから、plN八1へ3と−p
INA124は有効性が殆ど同じであると考えられる。
ントを有することが明らかになる−pINA125とp
INA126プラスミドは、INAG33129株を殆
ど同じ頻度で形質転換する(pINA125は少し少な
く形質転換する)。pINA124の長さがplN^1
19のほぼ二倍であることから、plN八1へ3と−p
INA124は有効性が殆ど同じであると考えられる。
また、表2から与えられる組み合わせは、この実験にお
いてFil−突然変異株よりも頻度が小さいにもかかわ
らず、Fil十株はarsプラスミドによって同様に形
質転換できることを示している。これらのプラスミドは
、制限していない−pINA62よりも100倍多いI
NAG33122株を形質転換する。この結果は、ar
sの選択で細胞***の形を理由付ける最初の仮定からも
非常に驚くべきことである。従って、arsプラスミド
が同様にFil−株において染色体外法を保持するかど
うかを見出す必要がある。
いてFil−突然変異株よりも頻度が小さいにもかかわ
らず、Fil十株はarsプラスミドによって同様に形
質転換できることを示している。これらのプラスミドは
、制限していない−pINA62よりも100倍多いI
NAG33122株を形質転換する。この結果は、ar
sの選択で細胞***の形を理由付ける最初の仮定からも
非常に驚くべきことである。従って、arsプラスミド
が同様にFil−株において染色体外法を保持するかど
うかを見出す必要がある。
実施例4で述べたものと同様のサザンで移動した後、交
雑の実験は、I)INA119 (示していない)に
よって得られたFil十形質転換体の場合であることを
示している。この意外な状態を一層特徴づけるために、
形質転換体の安定性について調べる。
雑の実験は、I)INA119 (示していない)に
よって得られたFil十形質転換体の場合であることを
示している。この意外な状態を一層特徴づけるために、
形質転換体の安定性について調べる。
実Jll比
5個の−pINA119とpINA123ないし−pI
NA126のフ。
NA126のフ。
ラスミドの安定性を、液体選択培地(ロイシンを含まな
い)で、平行して最少培地、ロイシンの豊富な培地で、
5ないし10世代後に評価した。各培地で数えたコロニ
ーの数に関して、表3Aに示したような原栄養株のパー
センテージを与える。このパーセンテージは65〜84
%であり、INAG33122株における種々のars
配列の安定性と有意差はなかった。その代わりに、サッ
カロミセス・セレビシアエ(2)でのars配列の挙動
に対して、このパーセンテージがこんなに高いことは注
目すべきである。
い)で、平行して最少培地、ロイシンの豊富な培地で、
5ないし10世代後に評価した。各培地で数えたコロニ
ーの数に関して、表3Aに示したような原栄養株のパー
センテージを与える。このパーセンテージは65〜84
%であり、INAG33122株における種々のars
配列の安定性と有意差はなかった。その代わりに、サッ
カロミセス・セレビシアエ(2)でのars配列の挙動
に対して、このパーセンテージがこんなに高いことは注
目すべきである。
この安定性を詳細に研究するに当り、pINA119で
示されるars配列について特に関心がもたれる。
示されるars配列について特に関心がもたれる。
Fil−株(INAG33129)、またはFil十株
(rNAG33122)で得られた形質転換体は選択培
地、非選択培地で約10世代の間に培養し、栄養要求株
のパーセンテージかはそれぞれの場合について前記のよ
うに評価した。表3Bの結果は、INAG33129に
おいて選択培地の皿の相対的安定性を証明するが、Fi
l+株において安定性が一層大きいことを示している。
(rNAG33122)で得られた形質転換体は選択培
地、非選択培地で約10世代の間に培養し、栄養要求株
のパーセンテージかはそれぞれの場合について前記のよ
うに評価した。表3Bの結果は、INAG33129に
おいて選択培地の皿の相対的安定性を証明するが、Fi
l+株において安定性が一層大きいことを示している。
この結果を確認するため、菌糸体の生長の表現型が、−
層顕著であり1eu2−35(Fil+十と呼ぶ)を形
質転換し、この株において非常に高い絶対的な安定性を
確かめる。pINA119のDNAが常にハイブリダイ
ゼーションで染色体外バンドとして見分けられることが
証明される(示していない)。非選択培地の安定性は、
各場合において選択培地よりも低いが、同様にFit−
/Fil十表現型の作用で同じように前進した。
層顕著であり1eu2−35(Fil+十と呼ぶ)を形
質転換し、この株において非常に高い絶対的な安定性を
確かめる。pINA119のDNAが常にハイブリダイ
ゼーションで染色体外バンドとして見分けられることが
証明される(示していない)。非選択培地の安定性は、
各場合において選択培地よりも低いが、同様にFit−
/Fil十表現型の作用で同じように前進した。
表主
NA
原栄養株%
−pINA119 −pINA123 −pINAI2
4 −pINAI25 pINA126銖 表
現型 培地での原栄養株の%選択 非選択 INAG33129 Fil−60〜7010〜15
INAG33122 Fil+ 70〜80
60MLII Fil+÷ 85〜100
80〜90従って、最初の仮定に反して、arsの単
離における失敗は、菌糸体における生長を妨げるこれら
配列の非常に大きい不安定性によるものではなく、不安
定なりローンを探すことによっては見出せないという事
である。実際に、Fil十株において、これらの配列は
組み込みのものと同様安定に見える。
4 −pINAI25 pINA126銖 表
現型 培地での原栄養株の%選択 非選択 INAG33129 Fil−60〜7010〜15
INAG33122 Fil+ 70〜80
60MLII Fil+÷ 85〜100
80〜90従って、最初の仮定に反して、arsの単
離における失敗は、菌糸体における生長を妨げるこれら
配列の非常に大きい不安定性によるものではなく、不安
定なりローンを探すことによっては見出せないという事
である。実際に、Fil十株において、これらの配列は
組み込みのものと同様安定に見える。
これらの条件では、プラスミドは常に染色体外にあり、
安定性は組み込まれたコピーの存在によるものではない
ことを示す必要がある。このために、これらクローンの
安定性において変化があったかどうかじらへるように、
選択培地で50世代の間にINAG33122の30の
形質転換体とINAG33129の30の形質転換体を
培養する。実験の詳細は以下の図と表4に示した。
安定性は組み込まれたコピーの存在によるものではない
ことを示す必要がある。このために、これらクローンの
安定性において変化があったかどうかじらへるように、
選択培地で50世代の間にINAG33122の30の
形質転換体とINAG33129の30の形質転換体を
培養する。実験の詳細は以下の図と表4に示した。
表土
につ 50 の での
(結果は与えられた種類の分離に属するクローン数とし
て表した(原栄養株の%))。実験はFil+株の30
クローンとFil−株の30クローンとについて実施し
た。
て表した(原栄養株の%))。実験はFil+株の30
クローンとFil−株の30クローンとについて実施し
た。
非選択培地で2日経た後に得られた原栄養株のパーセン
テージとしての定性的評価は、50世代前または後に、
株Fil+または株Fil−の場合に、−層安定なプロ
フィルに形質転換しないことを示している(表4)。組
み込みの不在を示すため、50世代を経る前と後にFi
l+とFil−の形質転換体からDNAを抽出し、■■
と勿旧酵素によって制限する。制限されたDNAと制限
されないDNAを、アガロースゲル(89mMのトリス
緩衝液、89mMの硼酸、2.5mMのEDTA、pH
8,3に対して0.7%)に移した後、ビオシンで形質
転換し、放射能ゾンデpBR322でハイブリダイゼー
ションした。結果は(示していない)はプラスミドバン
ドの存在と組み込みによるバンドの不在を示した。
テージとしての定性的評価は、50世代前または後に、
株Fil+または株Fil−の場合に、−層安定なプロ
フィルに形質転換しないことを示している(表4)。組
み込みの不在を示すため、50世代を経る前と後にFi
l+とFil−の形質転換体からDNAを抽出し、■■
と勿旧酵素によって制限する。制限されたDNAと制限
されないDNAを、アガロースゲル(89mMのトリス
緩衝液、89mMの硼酸、2.5mMのEDTA、pH
8,3に対して0.7%)に移した後、ビオシンで形質
転換し、放射能ゾンデpBR322でハイブリダイゼー
ションした。結果は(示していない)はプラスミドバン
ドの存在と組み込みによるバンドの不在を示した。
サッカロミセス・セレビシアエにおいて、若干のars
配列がゲノムに繰返され(特にテロマー末端の近くに見
出されるもの)、他のものは単一コピーに存在する(1
.2.11)ことが知られている。この状態を、lNA
119のars配列に対して研究する。このため、実際
に挿入の全体を覆う4.6kbのPstl−EcoRI
内的フラグメント(第7図)を精製し、アガロースゲル
に平行に移したゲノムとプラスミドのDNA制限移転に
対してゾンデとして用いる。既に第6図(また第7図)
に示したpINA119の制限図にてらして分析した結
果では、多分独特の配列(フラグメントjlII−Jd
IIの間に正確に繰り返されるものより少なく)を示し
ている。2. lkbのBamHIの内バンドは、2.
3kbの■屁IIIの内バンドと同様に、ゲノムと同じ
位置に再び認られる。ゾンデによるゲノムに現れる」し
I 1フラグメントは、−pINA119におけるar
sによりもたらされるクローン化したフラグメントと同
じである単一4.5kbバンドに対応する(事実pIN
A119では、連結反応中に結合した二個のlIIフラ
グメントがあり、ここでは当該フラグメントは2つの内
大きいもノテ、これは−pINA125と−pINAI
26 )挿入で相同である)。
配列がゲノムに繰返され(特にテロマー末端の近くに見
出されるもの)、他のものは単一コピーに存在する(1
.2.11)ことが知られている。この状態を、lNA
119のars配列に対して研究する。このため、実際
に挿入の全体を覆う4.6kbのPstl−EcoRI
内的フラグメント(第7図)を精製し、アガロースゲル
に平行に移したゲノムとプラスミドのDNA制限移転に
対してゾンデとして用いる。既に第6図(また第7図)
に示したpINA119の制限図にてらして分析した結
果では、多分独特の配列(フラグメントjlII−Jd
IIの間に正確に繰り返されるものより少なく)を示し
ている。2. lkbのBamHIの内バンドは、2.
3kbの■屁IIIの内バンドと同様に、ゲノムと同じ
位置に再び認られる。ゾンデによるゲノムに現れる」し
I 1フラグメントは、−pINA119におけるar
sによりもたらされるクローン化したフラグメントと同
じである単一4.5kbバンドに対応する(事実pIN
A119では、連結反応中に結合した二個のlIIフラ
グメントがあり、ここでは当該フラグメントは2つの内
大きいもノテ、これは−pINA125と−pINAI
26 )挿入で相同である)。
尚第7図は、韮プラスミド−1】工u1の制限地図であ
る。ars配列をもつ部分に影線で示し、これは点線の
LEU2を有する。寸法はキロベースの目盛である。使
用した酵素は、A−」匣1.B=」ユニ旧、G = 」
加↓II、E= EcoRI、H=HindllI、P
= PstlSS= S旦1、およびX=Xholであ
る。図の下には、ヤロウィア・リポリチカの1eu2−
35株について(制限されていないDNAと共に)、欠
失および実施された再クローンおよび高頻度での形質転
換の有効性を示している。2.2kbの」憇旧−」憇旧
フラグメントを含有するプラスミドpINA171のみ
が有効である。
る。ars配列をもつ部分に影線で示し、これは点線の
LEU2を有する。寸法はキロベースの目盛である。使
用した酵素は、A−」匣1.B=」ユニ旧、G = 」
加↓II、E= EcoRI、H=HindllI、P
= PstlSS= S旦1、およびX=Xholであ
る。図の下には、ヤロウィア・リポリチカの1eu2−
35株について(制限されていないDNAと共に)、欠
失および実施された再クローンおよび高頻度での形質転
換の有効性を示している。2.2kbの」憇旧−」憇旧
フラグメントを含有するプラスミドpINA171のみ
が有効である。
確かにこの寸法は(サッカロミセス・セレビシアエ(1
,2,11)について記載された凹と比較することによ
り)ars因子として必要な最少の配列のものよりも大
きいので、−pINA119の挿入においてarsを一
層正確に局限するために欠失と再クローンの実験を行う
。次の戦略は第7図に記載されており、結論として−p
INA171に存在する2、2kbの内フラグメントB
amtlI−Bam旧によってarsが保持されるべき
であると結論することができる。
,2,11)について記載された凹と比較することによ
り)ars因子として必要な最少の配列のものよりも大
きいので、−pINA119の挿入においてarsを一
層正確に局限するために欠失と再クローンの実験を行う
。次の戦略は第7図に記載されており、結論として−p
INA171に存在する2、2kbの内フラグメントB
amtlI−Bam旧によってarsが保持されるべき
であると結論することができる。
このプラスミドは、株Fil+と株Fil−を高い頻度
で形質転換できる(表2)。染色体外法(示していない
)を保持でき、その安定性は−pINA119のそれと
同じである(株INAG33129で選択培地で5世代
後の原栄養株は約65%、INAG33122では81
%)。
で形質転換できる(表2)。染色体外法(示していない
)を保持でき、その安定性は−pINA119のそれと
同じである(株INAG33129で選択培地で5世代
後の原栄養株は約65%、INAG33122では81
%)。
このプラスミドは遺伝子の増幅の目的で後から(る構造
の基礎として使用された。
の基礎として使用された。
なお、フラグメントBam1ll−Bam旧はcolE
I型のバクテリアプラスミドとM13ファージとの間の
ハイブリッドであるベクター「ブルースクリプトM13
」に再クローンされた。このベクターはクローン北条部
位を有し、一方ではBamt(I部位に皿を挿入し、他
方では5alI部位と」■1部位(これは多部位のXh
oI と」…Iとの間でクローン化した)との間に含ま
れるLHU2の3kbの最少コードの配列を許した。こ
の8.2kbベクターは高い頻度でヤロウィア・リポリ
チカINAG33129を形質転換でき、第8図に記載
したarsの詳細地図の設定に関係した欠失と再クロー
ンの新しい組に対する基礎として使用された。
I型のバクテリアプラスミドとM13ファージとの間の
ハイブリッドであるベクター「ブルースクリプトM13
」に再クローンされた。このベクターはクローン北条部
位を有し、一方ではBamt(I部位に皿を挿入し、他
方では5alI部位と」■1部位(これは多部位のXh
oI と」…Iとの間でクローン化した)との間に含ま
れるLHU2の3kbの最少コードの配列を許した。こ
の8.2kbベクターは高い頻度でヤロウィア・リポリ
チカINAG33129を形質転換でき、第8図に記載
したarsの詳細地図の設定に関係した欠失と再クロー
ンの新しい組に対する基礎として使用された。
第8図は、ヤロウィア・リポリチカに対するミニベクタ
ーの構造を示す図で、 A−この8.2kbベクターは次のものを含む。
ーの構造を示す図で、 A−この8.2kbベクターは次のものを含む。
・2.2kb(BamHI −Bam1ll ) a
rsフラグメント、これはヤロウィア・リポリチカにお
いて複製を行う。
rsフラグメント、これはヤロウィア・リポリチカにお
いて複製を行う。
・LEU2遺伝子(末端のないコード部分、5alIか
ら」匹■まで3kb)。
ら」匹■まで3kb)。
・複製colE1バクテリヤ源、これはE、coViに
おいて増殖を行う。
おいて増殖を行う。
・高収率でRNAを作ることのできるバクテリオファー
ジT3とT7のプロモーター(従って、例えば極めて熱
いし放射能プローブを合成することができる)。
ジT3とT7のプロモーター(従って、例えば極めて熱
いし放射能プローブを合成することができる)。
・配列行為を容易にするM13配列(マルチサイトの双
方でのDNA鎖の相補的プライマー配列は商業的に入手
し得る)。
方でのDNA鎖の相補的プライマー配列は商業的に入手
し得る)。
・例えばエキソヌクレアーゼmまたは酵素」虹31によ
って、遺伝子の後からのクローン化またはインヴイトロ
での欠失の開始を可能にするマルチサイト。
って、遺伝子の後からのクローン化またはインヴイトロ
での欠失の開始を可能にするマルチサイト。
B−2,2kb の−壜凪旧−」憇旧領域での凹フラグ
メントの詳細地図(縮尺図)。
メントの詳細地図(縮尺図)。
この図では制限位置はA = A■I、B = Bam
1(I。
1(I。
C= AccI、 H=HindlII、N=NotI
、R=Rsa1、.5=SalI、T= JHI、V=
EcoRVテ示した。
、R=Rsa1、.5=SalI、T= JHI、V=
EcoRVテ示した。
実lI津亀
遺伝子の増幅のためにpINA119上に存在するar
sの有効性を示すため、次のプラスミドの構成を実施し
た。ベーターガラクトシダーゼに対してコードする大腸
菌の1acZ遺伝子を■皿のプロモーターの制御下にヤ
ロウィア・リポリチカで示すことができる(5)ので、
■皿を有する組み込みプラスミド−pINA98 (第
9図)とLacZの表現の構造で示される■■1部位に
おいて2.2kbのフラグメントars Ban H
I−Ban旧をクローンする。新しいplNへ135プ
ラスミドは従って複製であり、INAG33122とI
NAG33129に導入される。
sの有効性を示すため、次のプラスミドの構成を実施し
た。ベーターガラクトシダーゼに対してコードする大腸
菌の1acZ遺伝子を■皿のプロモーターの制御下にヤ
ロウィア・リポリチカで示すことができる(5)ので、
■皿を有する組み込みプラスミド−pINA98 (第
9図)とLacZの表現の構造で示される■■1部位に
おいて2.2kbのフラグメントars Ban H
I−Ban旧をクローンする。新しいplNへ135プ
ラスミドは従って複製であり、INAG33122とI
NAG33129に導入される。
第9図は、ベータ・ガラクトシダーゼの表現で、組み込
みプラスミド−pINA98からプラスミド−pINA
135を組み立てる説明図、LEU2遺伝子をもつヤロ
ウィア・リポリチカのDNAのSal I −Sat
Iフラグメントに存する2箇所の4m部位の間のars
のクローン化は、LEU2遺伝子の表現について効果が
ない。これらの箇所が実際のコード配列の外にあるから
である。1 acZ遺伝子の上流にはLEU2プロモー
ターが認められる( BamHIにクローン化した」a
u3aフラグメント、参考文献5)。
みプラスミド−pINA98からプラスミド−pINA
135を組み立てる説明図、LEU2遺伝子をもつヤロ
ウィア・リポリチカのDNAのSal I −Sat
Iフラグメントに存する2箇所の4m部位の間のars
のクローン化は、LEU2遺伝子の表現について効果が
ない。これらの箇所が実際のコード配列の外にあるから
である。1 acZ遺伝子の上流にはLEU2プロモー
ターが認められる( BamHIにクローン化した」a
u3aフラグメント、参考文献5)。
まず、ベーターガラクトシダーゼの表現はX−ga1発
色基体を含む最少培地の皿で符号を付け、1分間トルエ
ン化の後、皿を37°Cで装置し複製型形質転換体によ
って発現した着色強度がモノコピー形質転換体のそれよ
りもすぐれていることを観察する。この事実を定量化す
るため、形質転換体の粗製抽出物をつ(す、ミラー(1
2)の方法によってベーターガラクトシダーゼ活性を測
定し、プラトフォード法(13)によって計算した蛋白
質量に関係させる。このベーターガラクトシダーゼの比
活性を、細胞を粉砕した場合に培地の中に原栄養体細胞
のパーセンテージによって修正する。このパーセンテー
ジは選択培地と非選択培地に平行培養で評価する。表5
に示した活性の結果は、arsで得られた増幅が2〜9
の因子で変化し株Fil+および株Fil−で同様であ
ることを示している。
色基体を含む最少培地の皿で符号を付け、1分間トルエ
ン化の後、皿を37°Cで装置し複製型形質転換体によ
って発現した着色強度がモノコピー形質転換体のそれよ
りもすぐれていることを観察する。この事実を定量化す
るため、形質転換体の粗製抽出物をつ(す、ミラー(1
2)の方法によってベーターガラクトシダーゼ活性を測
定し、プラトフォード法(13)によって計算した蛋白
質量に関係させる。このベーターガラクトシダーゼの比
活性を、細胞を粉砕した場合に培地の中に原栄養体細胞
のパーセンテージによって修正する。このパーセンテー
ジは選択培地と非選択培地に平行培養で評価する。表5
に示した活性の結果は、arsで得られた増幅が2〜9
の因子で変化し株Fil+および株Fil−で同様であ
ることを示している。
粗抽出物のベーターガラクトシダーゼの比活性の測定。
抽出時の細胞の密度は、d当りの細胞の数で表わし、比
活性は国際単位(1単位は37°Cでオルトニトロフェ
ノール−ガラクトシダーゼを1分間当り10−9モル加
水分解する酵素量として定義される)であり、培地中の
原栄養株のパーセンテージを考慮して修正する。1の水
準は、任意にplN^98(組み込みプラスミド)によ
って形質転換したクローンで得られた2つの測定値の平
均とする。0の水準は−pINA171(LacZのな
いLEU2+ ars)によって形質転換された株に
相当する。株Fil+または株Fil−においてpIN
A135 (第9図に記載した複製型プラスミド)を
用いた結果の異なる線は、独立した形質転換体に相当す
る。
活性は国際単位(1単位は37°Cでオルトニトロフェ
ノール−ガラクトシダーゼを1分間当り10−9モル加
水分解する酵素量として定義される)であり、培地中の
原栄養株のパーセンテージを考慮して修正する。1の水
準は、任意にplN^98(組み込みプラスミド)によ
って形質転換したクローンで得られた2つの測定値の平
均とする。0の水準は−pINA171(LacZのな
いLEU2+ ars)によって形質転換された株に
相当する。株Fil+または株Fil−においてpIN
A135 (第9図に記載した複製型プラスミド)を
用いた結果の異なる線は、独立した形質転換体に相当す
る。
ヤロウィア・リポリチカに対して存効なars配列の単
離が株Fil−(形態突然変異体)に依存しないことを
確認するために、既にars配列を有するプラスミドが
株Fil+において複製できることを示した。さて本発
明者等は遺伝子のライブラリで株Fil+を直接形質転
換することによりarsを見つけることができることを
示すように努めた。まず、同じライブラリを用いて(「
プール2」)、形質転換体Leu+の中から不安定であ
った若干のものを選択した(表6参照)。存在するプラ
スミドを酵母の形質転換体の全DNAのミニ調製で大腸
菌の形質転換によって単離した。この同じ「プール」か
ら株Fil−において予め単離したars18を有する
クローンを見つけた。しかし、ライブラリの構成の際に
(フラグメントはIIIによって野生株のDNAを完全
に制限することから得られ、−pINA62の」短冊部
位に挿入される)一つの、同じプラスミドにおいて複数
の」旦IIフラグメントの再連結反応を行うことができ
ることから、これらのクローンは始めに記載したpIN
A119プラスミドと厳密には同一ではない。
離が株Fil−(形態突然変異体)に依存しないことを
確認するために、既にars配列を有するプラスミドが
株Fil+において複製できることを示した。さて本発
明者等は遺伝子のライブラリで株Fil+を直接形質転
換することによりarsを見つけることができることを
示すように努めた。まず、同じライブラリを用いて(「
プール2」)、形質転換体Leu+の中から不安定であ
った若干のものを選択した(表6参照)。存在するプラ
スミドを酵母の形質転換体の全DNAのミニ調製で大腸
菌の形質転換によって単離した。この同じ「プール」か
ら株Fil−において予め単離したars18を有する
クローンを見つけた。しかし、ライブラリの構成の際に
(フラグメントはIIIによって野生株のDNAを完全
に制限することから得られ、−pINA62の」短冊部
位に挿入される)一つの、同じプラスミドにおいて複数
の」旦IIフラグメントの再連結反応を行うことができ
ることから、これらのクローンは始めに記載したpIN
A119プラスミドと厳密には同一ではない。
本発明者等は配列AGATCT (JII部位)がヤロ
ウィア・リポリチカに対して可能な’ars共通配列の
部分を形成することができるかは無視して、同様に5a
u3Aによって野生株(W29)のゲノムを部分消化し
、大きいが約10〜15kbのフラグメントを選択し、
同じ−pINA62プラスミドのBan旧部位にクロー
ンすることによって構成される他のライブラリを用いる
ことを決定した。後記参考文献(14)に記載されてい
るこのライブラリはヤロウィア・リポリチカゲノムで代
表され、なお染色体に導がれた組み込みによって3個の
ヤロウィア・リポリチカ遺伝子を得ることができる。株
Fil+と株Fil−を形質転換するためにこのライブ
ラリの制限しないDNAを使用した。この場合、本発明
者等はLeu十原栄養株に対して不安定であったクロー
ンを同定した。このため、ロイシンを補充した固体最少
培地で2回続けて形質転換体を培養し、この同じ培地に
線をつけて、ロイシンを含む最少培地と含まない最少培
地で複製によって分類する単離されたコロニーを得た。
ウィア・リポリチカに対して可能な’ars共通配列の
部分を形成することができるかは無視して、同様に5a
u3Aによって野生株(W29)のゲノムを部分消化し
、大きいが約10〜15kbのフラグメントを選択し、
同じ−pINA62プラスミドのBan旧部位にクロー
ンすることによって構成される他のライブラリを用いる
ことを決定した。後記参考文献(14)に記載されてい
るこのライブラリはヤロウィア・リポリチカゲノムで代
表され、なお染色体に導がれた組み込みによって3個の
ヤロウィア・リポリチカ遺伝子を得ることができる。株
Fil+と株Fil−を形質転換するためにこのライブ
ラリの制限しないDNAを使用した。この場合、本発明
者等はLeu十原栄養株に対して不安定であったクロー
ンを同定した。このため、ロイシンを補充した固体最少
培地で2回続けて形質転換体を培養し、この同じ培地に
線をつけて、ロイシンを含む最少培地と含まない最少培
地で複製によって分類する単離されたコロニーを得た。
また、分析の過程で2個の新しい」胆形質転換体を得た
。対応する配列は、表6に」工1で示した。DNAの2
個のライブラリで実現された形質転換の結果も示した。
。対応する配列は、表6に」工1で示した。DNAの2
個のライブラリで実現された形質転換の結果も示した。
表6:異なるゲノムライブラリによって形質転換された
株Fil+と株Fil−における韮配列の取得。
株Fil+と株Fil−における韮配列の取得。
見出された凹配列の名前を示した(特性化の過程での配
列に対すしars” )。最後の欄は、所定の実験に対
して試験したクローンの数で見出される個々のarsの
数の割合によって示した。
列に対すしars” )。最後の欄は、所定の実験に対
して試験したクローンの数で見出される個々のarsの
数の割合によって示した。
単離した実際に異なるars配列を考慮すると、使用し
たライブラリの型に関係なく、これはFilの関係では
2.5%程度でFil÷の関係では0.6%程度の頻度
で選択されることがわかる(表7)。
たライブラリの型に関係なく、これはFilの関係では
2.5%程度でFil÷の関係では0.6%程度の頻度
で選択されることがわかる(表7)。
表1
工で知られたものよりも著しく小さく、極く僅かな配列
がヤロウィア・リポリチカで自動複製を支持できること
を示している。これらの結果は、この種類のすべての株
におけるars配列の単離法の一般を明らかにする。
がヤロウィア・リポリチカで自動複製を支持できること
を示している。これらの結果は、この種類のすべての株
におけるars配列の単離法の一般を明らかにする。
また、当業者にはヤロウィア・リポリチカで有効なar
s配列を単離するため使用した方法は、何れかの起源の
DNAを用いて複製できることは明らかである。例とし
て、バクテリオファージλのDNAがこのような有効な
配列を含むことを示すことができた(44972bpと
48502bpの位置間、Nucleic Ac1d
Re5earch、 長、 r189〜r217)。
s配列を単離するため使用した方法は、何れかの起源の
DNAを用いて複製できることは明らかである。例とし
て、バクテリオファージλのDNAがこのような有効な
配列を含むことを示すことができた(44972bpと
48502bpの位置間、Nucleic Ac1d
Re5earch、 長、 r189〜r217)。
表6に示した4つのすべての実験で、2つのゲノムライ
ブラリで得られたヤロウイア・リポリチカの形質転換体
の間で異なるars配列を有するLeu+クローンのパ
ーセンテージ。
ブラリで得られたヤロウイア・リポリチカの形質転換体
の間で異なるars配列を有するLeu+クローンのパ
ーセンテージ。
これらの数字は、サツカロミセス・セレビシア前記配列
を更に良く特徴づけるために、種々のプラスミド−pI
NA171 、pTN八1へ3 、PIN八1へ4(第
6図と7図参照)の副クローンと欠失で実施した。
を更に良く特徴づけるために、種々のプラスミド−pI
NA171 、pTN八1へ3 、PIN八1へ4(第
6図と7図参照)の副クローンと欠失で実施した。
最後の2つのプラスミドからの構成を第10図に示すが
、それぞれ2.7kbと2.4kbのフラグメントにつ
いて2個のars68とars77の有効部分を局在化
できることがわかる。これはarsベクターを築くため
に必要なりNAの長さを非常に短縮することを示してい
る。実際に、ヤロウィア・リポリチカのDNAの挿入は
、最初プラスミドpINA123と−pINA124に
おいてそれぞれ6.6kbと17.8kbであった。
、それぞれ2.7kbと2.4kbのフラグメントにつ
いて2個のars68とars77の有効部分を局在化
できることがわかる。これはarsベクターを築くため
に必要なりNAの長さを非常に短縮することを示してい
る。実際に、ヤロウィア・リポリチカのDNAの挿入は
、最初プラスミドpINA123と−pINA124に
おいてそれぞれ6.6kbと17.8kbであった。
また、同じタイプの手段でars18配列を分析した。
プラスミドの構成は前記プラスミドplNΔ171を使
用するか、あるいは第8A図のミニベクターであるI]
lNA147を使用して実施した。これらの2つのベク
ターはars活性を持つ2.2kbの同じフラグメント
」短冊を含み、同じ印の遺伝子LEU2(pINA14
7の場合には2.0kbのフラグメント韮1−5at
I 、 −pINA171の場合には、やはりプラスミ
ドpINA62 (第4図)に認められる5、3kbの
フラグメント5alt−3at I)を含む。これはp
INA147に対してブルースクリプトから(ストラタ
ジーン、3770タンシイストリート、サンジエゴ、C
A92121)、1N^171に対してpBR322か
ら構成されたバクテリア部分において異なる。
用するか、あるいは第8A図のミニベクターであるI]
lNA147を使用して実施した。これらの2つのベク
ターはars活性を持つ2.2kbの同じフラグメント
」短冊を含み、同じ印の遺伝子LEU2(pINA14
7の場合には2.0kbのフラグメント韮1−5at
I 、 −pINA171の場合には、やはりプラスミ
ドpINA62 (第4図)に認められる5、3kbの
フラグメント5alt−3at I)を含む。これはp
INA147に対してブルースクリプトから(ストラタ
ジーン、3770タンシイストリート、サンジエゴ、C
A92121)、1N^171に対してpBR322か
ら構成されたバクテリア部分において異なる。
プラスミドの構成は全て、plN^211の場合は別と
して、第11図に示した制限部位を用いた欠失または再
クローンによって行った。このpINA211プラスミ
ドは、サッカロミセス・セレビシアエで観察されるイン
・ヴイヴオの欠失の記載(15,16)から感得した次
の方法で得られ: pINA147プラスミドを酵素」
圏Iによって連結し、この部位はarsの上流で若干塩
基性のブルースクリプト部分に認められ;酵母をこのよ
うにして線状にしたプラスミドで形質転換し;表現型L
eu+に対して安定なりローンを同定し、含まれている
プラスミドを抽出した。酵母ヤロウィア・リポリチカが
それ自体とこのプラスミドを次に円形の分子の状態で増
殖するように再連結する前に、このプラスミドは、イン
・ヴイヴオで酵母ヤロウイア・リポリチカにより実現す
る塩基の約70対の欠失を含むことが確認される。
して、第11図に示した制限部位を用いた欠失または再
クローンによって行った。このpINA211プラスミ
ドは、サッカロミセス・セレビシアエで観察されるイン
・ヴイヴオの欠失の記載(15,16)から感得した次
の方法で得られ: pINA147プラスミドを酵素」
圏Iによって連結し、この部位はarsの上流で若干塩
基性のブルースクリプト部分に認められ;酵母をこのよ
うにして線状にしたプラスミドで形質転換し;表現型L
eu+に対して安定なりローンを同定し、含まれている
プラスミドを抽出した。酵母ヤロウィア・リポリチカが
それ自体とこのプラスミドを次に円形の分子の状態で増
殖するように再連結する前に、このプラスミドは、イン
・ヴイヴオで酵母ヤロウイア・リポリチカにより実現す
る塩基の約70対の欠失を含むことが確認される。
また、第11図に示したように、高い頻度の形質転換と
染色体外復製とによる配列は、隣合った2つの領域に物
理的に局在化できることを示すことができた。2つの因
子を確認するため、プラスミド−pINA176に示さ
れる1、3kbのフラグメントを使用することを決定し
た。このフラグメントarsは、ベクターの」短冊部位
に右側の5au3A部位が連結されてBam111部位
が再形成されるので、2個のBam旧部位によって境界
を限定される。このフラグメントは、従ってpB113
22に基づく他のベクターに、テトラサイクリン(pI
NA232)に耐性のためコードする遺伝子に存在する
」印旧部位において、あるいはLEU2(pINA23
7と−pINA237°)の配列の末端部分に存在する
JLLII部位において、あるいはベクター(pTNA
240とpTNA240’ )のPvull@B(立に
挿入されるクローン化の多部位のarsII部位におい
て挿入できる。これらのベクター−pINA237、p
lN八2へ0 、plN八2へ0゛、−pINA240
’が特に適するが、これはarsの挿入がj711部位
に生じた場合、挿入のBam111部位が消失している
からである。
染色体外復製とによる配列は、隣合った2つの領域に物
理的に局在化できることを示すことができた。2つの因
子を確認するため、プラスミド−pINA176に示さ
れる1、3kbのフラグメントを使用することを決定し
た。このフラグメントarsは、ベクターの」短冊部位
に右側の5au3A部位が連結されてBam111部位
が再形成されるので、2個のBam旧部位によって境界
を限定される。このフラグメントは、従ってpB113
22に基づく他のベクターに、テトラサイクリン(pI
NA232)に耐性のためコードする遺伝子に存在する
」印旧部位において、あるいはLEU2(pINA23
7と−pINA237°)の配列の末端部分に存在する
JLLII部位において、あるいはベクター(pTNA
240とpTNA240’ )のPvull@B(立に
挿入されるクローン化の多部位のarsII部位におい
て挿入できる。これらのベクター−pINA237、p
lN八2へ0 、plN八2へ0゛、−pINA240
’が特に適するが、これはarsの挿入がj711部位
に生じた場合、挿入のBam111部位が消失している
からである。
これらのベクターはその結果、
一遺伝子LEU2を表現できる2kb配列。
−1,3kbに滅じたars18の配列。
アンピシリンとテトラサイクリンの抗生物質に耐性の2
個の遺伝子。
個の遺伝子。
一テトラサイクリンに敏感なのでハイブリッドクローン
の符号を付けて(特にこの種の複製プラスミドについて
ゲノムライブラリを構成するため5au3Aによって部
分消化から出たフラグメントの)クローン化することで
きる単一の」短冊部位。
の符号を付けて(特にこの種の複製プラスミドについて
ゲノムライブラリを構成するため5au3Aによって部
分消化から出たフラグメントの)クローン化することで
きる単一の」短冊部位。
プラスミド−pINA176 、 plN八2へ2 、
PIN八2八ツ37lNA237’、−pINA240
、 −pINA240’の地図は、第12図に記載し
た。全部、株Fil+INAG33122を形質転換す
る能力について試験し、制限されていないDNAμg当
り、5000以上の形質転換体を得ることができた。
PIN八2八ツ37lNA237’、−pINA240
、 −pINA240’の地図は、第12図に記載し
た。全部、株Fil+INAG33122を形質転換す
る能力について試験し、制限されていないDNAμg当
り、5000以上の形質転換体を得ることができた。
尚第11図はars1B配列の縮減図で、左側にその名
称を示したプラスミドは中央に下線を引いたars18
の部分とヤロウィア・リポリチカの■皿遺伝子を含み、
場合によってバクテリアベクターpBR322(p I
NA 122、pINA120 、pINA232)ま
たはブルースクリプト(−pINA147、−pINA
173 、−pINA174、−pINA175 、−
pINA176 、pINA211)の1つまたはその
他に存在する。その構成を本文中に説明したpINA2
11の構成を除いて、上に示した制限部位を用いて欠失
または再クローン化によってすべて組み立てられる。基
本的な2つの領域、一つは高頻度の形質転換、他の一つ
は自動複製能に対する領域は中央に下線を引いた。
称を示したプラスミドは中央に下線を引いたars18
の部分とヤロウィア・リポリチカの■皿遺伝子を含み、
場合によってバクテリアベクターpBR322(p I
NA 122、pINA120 、pINA232)ま
たはブルースクリプト(−pINA147、−pINA
173 、−pINA174、−pINA175 、−
pINA176 、pINA211)の1つまたはその
他に存在する。その構成を本文中に説明したpINA2
11の構成を除いて、上に示した制限部位を用いて欠失
または再クローン化によってすべて組み立てられる。基
本的な2つの領域、一つは高頻度の形質転換、他の一つ
は自動複製能に対する領域は中央に下線を引いた。
注直1)形質転換の頻度は++(DNAIμg当たり5
000以上の形質転換体) 、+(DNAI I!g当
たり200〜500以下の形質転換体)、または−(D
NAIμg当たり200未満の形態転換体)によって示
した。
000以上の形質転換体) 、+(DNAI I!g当
たり200〜500以下の形質転換体)、または−(D
NAIμg当たり200未満の形態転換体)によって示
した。
(2) Leu十表視表現型安定性は+(不安定)ま
たは−(安定)によって示した。
たは−(安定)によって示した。
第12図はars18配列を有する種々の大腸菌−ヤロ
ウイア・リポリチカシャトルプラスミドを示す図で、す
べて、酵母におけるLeu十表視表現型て選択できる。
ウイア・リポリチカシャトルプラスミドを示す図で、す
べて、酵母におけるLeu十表視表現型て選択できる。
プラスミドpINA232は」し工欠失によって第6図
に記載したプラスミド1ぴA月1−から派生する。従っ
て、ars機能に必要でない領域を単一Bam1lI部
位の上流に有する。5つの他のプラスミドは第11図に
定義した1、3kbの最少の韮領域を有する。バクテリ
ア部分はpINA176の場合はブルースクリプトから
成り、他のプラスミドの場合にはpBR322から成る
。2つのベクター−pINA237とpINA237’
は、pINA62の部分消化によって得られる国遺伝子
を有する2298bpフラグメントを単一EcoRI部
位で挿入したpBR322プラスミドから導く。
に記載したプラスミド1ぴA月1−から派生する。従っ
て、ars機能に必要でない領域を単一Bam1lI部
位の上流に有する。5つの他のプラスミドは第11図に
定義した1、3kbの最少の韮領域を有する。バクテリ
ア部分はpINA176の場合はブルースクリプトから
成り、他のプラスミドの場合にはpBR322から成る
。2つのベクター−pINA237とpINA237’
は、pINA62の部分消化によって得られる国遺伝子
を有する2298bpフラグメントを単一EcoRI部
位で挿入したpBR322プラスミドから導く。
次に、ars18を有する1、3kbの■旧フラグメン
トは国に並ぶ」烈■の2つの部位の間に2方向に挿入し
た。−pINA240とpIN^240′のプラスミド
は、ars18を有する一Bamlllフラグメントの
2方向に導入できる」紅IIリンカ−(ベーリンガー参
照番号909734)を単一Pvu Uの部位で挿入し
たpBR322プラスミドから導く。LE02遺伝子は
得られたプラスミドに上記のように導入された。
トは国に並ぶ」烈■の2つの部位の間に2方向に挿入し
た。−pINA240とpIN^240′のプラスミド
は、ars18を有する一Bamlllフラグメントの
2方向に導入できる」紅IIリンカ−(ベーリンガー参
照番号909734)を単一Pvu Uの部位で挿入し
たpBR322プラスミドから導く。LE02遺伝子は
得られたプラスミドに上記のように導入された。
さらに、ars18の1.3kbのフラグメントは、二
つのストランドについて、ジデオキシヌクレオチドのサ
ンガー法によって確立されたヌクレオチド配列によって
更に特徴づけられた。第13図は、AT (67,5%
)に富み、10〜13の塩基の内繰り返しで、順方向で
、あるいは逆の方向で複雑なプロフイルを特徴づける1
305のヌクレオチド配列を示した。さらに意味のある
ことは下線を引いた。これらのうちの大部分は、上記の
本発明者等が自己複製に重要であることを示した配列の
部分に示されているので、この働きの役割が重要か否か
示すことができる。
つのストランドについて、ジデオキシヌクレオチドのサ
ンガー法によって確立されたヌクレオチド配列によって
更に特徴づけられた。第13図は、AT (67,5%
)に富み、10〜13の塩基の内繰り返しで、順方向で
、あるいは逆の方向で複雑なプロフイルを特徴づける1
305のヌクレオチド配列を示した。さらに意味のある
ことは下線を引いた。これらのうちの大部分は、上記の
本発明者等が自己複製に重要であることを示した配列の
部分に示されているので、この働きの役割が重要か否か
示すことができる。
尚第13図はars18の配列図で、第11図に述べた
制御部位を、配列の上方に示した。少なくとも10個の
塩基を有する順方向(A−f:、)と逆方向(8〜M)
の反復は下線を引き、塩基の数はハイフンの後に示した
。特に反復にはDに含まれ、配列Eはパリンドロームそ
のものである。同様に順方向の著しい反復・A−B−C
に注意を要する(1075〜1121と1147〜11
83)。更に、AT交代(500〜520と1220〜
1250領域)並びにA (150〜180領域)また
はT (340〜370領域)の反復が見出された。最
後に、囲まれた配列はサッカロミセス・セレビシアエ酵
素で定義された(コンセンサスWTTTATPTTTW
を有する11に対して9または10の相同塩基、WはA
またはT、PはAまたはGを示す、参考文献26)ar
sコンセンサスをもつ不完全な相同体に相当する。
制御部位を、配列の上方に示した。少なくとも10個の
塩基を有する順方向(A−f:、)と逆方向(8〜M)
の反復は下線を引き、塩基の数はハイフンの後に示した
。特に反復にはDに含まれ、配列Eはパリンドロームそ
のものである。同様に順方向の著しい反復・A−B−C
に注意を要する(1075〜1121と1147〜11
83)。更に、AT交代(500〜520と1220〜
1250領域)並びにA (150〜180領域)また
はT (340〜370領域)の反復が見出された。最
後に、囲まれた配列はサッカロミセス・セレビシアエ酵
素で定義された(コンセンサスWTTTATPTTTW
を有する11に対して9または10の相同塩基、WはA
またはT、PはAまたはGを示す、参考文献26)ar
sコンセンサスをもつ不完全な相同体に相当する。
ars について の と
予め、大腸菌の遺伝子LacZを増幅するため−pIN
A119について存在するars18の有用性を示した
。
A119について存在するars18の有用性を示した
。
ここで、このars18配列は細胞外アルカリ性プロテ
アーゼまたはAEP(17)に対してコードするヤロウ
ィア・リポリチカのXPR2相同遺伝子、インベルター
ゼに対してコードするサッカロミセス・セレビシアエの
SUC2非対応遺伝子(18) 、インターフェロンα
1に対してコードする豚のプロINFα1遺伝子(19
) 、および生キモシンに対してコードするプローRE
N遺伝子(同文献)の増幅を可能にすることを示す。こ
れらの遺伝子の増幅は、対応する蛋白質の生産と分泌の
増加を可能にした。使用したプラスミドと株の組み合わ
せは第14図と表8に示した。
アーゼまたはAEP(17)に対してコードするヤロウ
ィア・リポリチカのXPR2相同遺伝子、インベルター
ゼに対してコードするサッカロミセス・セレビシアエの
SUC2非対応遺伝子(18) 、インターフェロンα
1に対してコードする豚のプロINFα1遺伝子(19
) 、および生キモシンに対してコードするプローRE
N遺伝子(同文献)の増幅を可能にすることを示す。こ
れらの遺伝子の増幅は、対応する蛋白質の生産と分泌の
増加を可能にした。使用したプラスミドと株の組み合わ
せは第14図と表8に示した。
第14−1〜4図は、遺伝子増幅に用いられる組込みと
複製のプラスミドの構造の説明図で、71えヱ a) −pINAL57−この***ベクターは、u図
遺伝子を有するρlNA128 (参考文献14)の
IIIフラグメン) (6,9kb)による遺伝子凹の
内部jllIフラグメント(0,9kb)の置換によっ
て生成された。
複製のプラスミドの構造の説明図で、71えヱ a) −pINAL57−この***ベクターは、u図
遺伝子を有するρlNA128 (参考文献14)の
IIIフラグメン) (6,9kb)による遺伝子凹の
内部jllIフラグメント(0,9kb)の置換によっ
て生成された。
b) pINA136−この複製型ベクターは選択マ
ーカー」罠とars18を含む複製型ベクターplNへ
171にXPR2遺伝子を含む−pINA152のC1
a Iフラグメント(4,5kb)を挿入して生成され
た。
ーカー」罠とars18を含む複製型ベクターplNへ
171にXPR2遺伝子を含む−pINA152のC1
a Iフラグメント(4,5kb)を挿入して生成され
た。
麩捜肥遺孤ヱ
a) pIN八1へ9−興票マーカーと狸録プロモー
ター(第17図)の制御の下にSUC2遺伝子を含む組
込みベクター。このベクターは株JM55においてXP
R2位置に組み込まれる。
ター(第17図)の制御の下にSUC2遺伝子を含む組
込みベクター。このベクターは株JM55においてXP
R2位置に組み込まれる。
b) −pINA181−複製型ベクターpINへ1
76(第12図)の5ailとC1alとの部位の間に
挿入したplN^169の3.9kbのC1a I −
Sal Iフラグメントの形で、肌遺伝子を含む複製型
ベクター3)ブローINF−α1゛云 a) pINA187−−pINA156に由来する
ヤロウィア・リポリチカURA3マーカーと−pINA
18 (第19図)のブローINF−α、遺伝子を含む
組込みベクター。
76(第12図)の5ailとC1alとの部位の間に
挿入したplN^169の3.9kbのC1a I −
Sal Iフラグメントの形で、肌遺伝子を含む複製型
ベクター3)ブローINF−α1゛云 a) pINA187−−pINA156に由来する
ヤロウィア・リポリチカURA3マーカーと−pINA
18 (第19図)のブローINF−α、遺伝子を含む
組込みベクター。
このベクターは株JM77においてXPR2部位に組込
まれる。
まれる。
b) pINA250−pIN^186のC1a I
−Pst Iフラグメント(4,2kb) と複製
型ベクターpIN^237(第12図)のC1a I
−Pst Iフラグメント(4,4kb)の連結反応に
よって構成されたブローINF−α1遺伝子を含む複製
型ベクター u1旦」U遺猛ヱ a) pLX34−ウシプロレニン(参考文献20)
に対してコードする遺伝子を含む組込みベクター。
−Pst Iフラグメント(4,2kb) と複製
型ベクターpIN^237(第12図)のC1a I
−Pst Iフラグメント(4,4kb)の連結反応に
よって構成されたブローINF−α1遺伝子を含む複製
型ベクター u1旦」U遺猛ヱ a) pLX34−ウシプロレニン(参考文献20)
に対してコードする遺伝子を含む組込みベクター。
b) pIN^184−プロREN遺伝子を含む複製
型遺伝子。プ町1暉遺伝子とLEU2マーカーの双方を
有するpLX34のC1a I −Pvu Iフラグメ
ント(5,9kb)をars18を含むpINA130
のC1a I −Pvu Iフラグメント(5,9kb
) と連結し、これによってマーカー遺伝子をアンピシ
リンに耐性に改質する。
型遺伝子。プ町1暉遺伝子とLEU2マーカーの双方を
有するpLX34のC1a I −Pvu Iフラグメ
ント(5,9kb)をars18を含むpINA130
のC1a I −Pvu Iフラグメント(5,9kb
) と連結し、これによってマーカー遺伝子をアンピシ
リンに耐性に改質する。
凹相同遺伝子およびSUC2非対応遺伝子、ブローIN
Fα1およびブロー」遺伝子の増幅に対して使用した組
込みと複製ベクターの名称。種々の活性のアッセイに対
して選択された受容体株と形質転換体の名称は、最後の
二個に認られる。
Fα1およびブロー」遺伝子の増幅に対して使用した組
込みと複製ベクターの名称。種々の活性のアッセイに対
して選択された受容体株と形質転換体の名称は、最後の
二個に認られる。
アルカリ性細胞外プロテアーゼ(ARP)に対しコード
するヤロウィア・リポリチカのXPR2遺伝子を、複製
プラスミドに挿入し、次にヤロウィア・リポリチカに導
入した。本発明者等は次の我々の収集した株によって分
泌したアルカリ性細胞外プロテアーゼの生産と比較した
。
するヤロウィア・リポリチカのXPR2遺伝子を、複製
プラスミドに挿入し、次にヤロウィア・リポリチカに導
入した。本発明者等は次の我々の収集した株によって分
泌したアルカリ性細胞外プロテアーゼの生産と比較した
。
JM12 (MatB、 Ieu2−35 、LYS5
−12 、ura348、秤皿)は、第14図に示した
プラスミドpINA157を使用して破壊した。この破
壊は、予め制限酵素Mlul とEcoRIで制限した
プラスミドpINA157を用いて株JM12の形質転
換により得られる。第15図に示した原理によれば、二
重交差によってLYS5遺伝子に対しXPR2遺伝子の
置換が得られた。得られた株JM23は、従ってマーカ
ーpと破壊された遺伝子凹を除いて、株JM12と同質
遺伝子型である。
−12 、ura348、秤皿)は、第14図に示した
プラスミドpINA157を使用して破壊した。この破
壊は、予め制限酵素Mlul とEcoRIで制限した
プラスミドpINA157を用いて株JM12の形質転
換により得られる。第15図に示した原理によれば、二
重交差によってLYS5遺伝子に対しXPR2遺伝子の
置換が得られた。得られた株JM23は、従ってマーカ
ーpと破壊された遺伝子凹を除いて、株JM12と同質
遺伝子型である。
この株は、アルカリ性細胞外プロテアーゼを生産しない
が、蛋白質の生産には良い受容体である。
が、蛋白質の生産には良い受容体である。
JM12と同質遺伝子であるこの株を複製型プラスミド
plNへ136で形質転換した。JM69とJM70は
、複製型プラスミドpINA136で形質転換した株J
M23に相当する。
plNへ136で形質転換した。JM69とJM70は
、複製型プラスミドpINA136で形質転換した株J
M23に相当する。
第15図は、株JM23の構造の概略図で、株JM12
のXPR2遺伝子座(C)の染色体制限地図と***プラ
スミド−pINA157の制限地図を示す。***プラス
ミドは前以って制限酵素Mlu TとEcoRIによっ
て制限された。相同領域MluI−Bれ■と」れII−
E匹R1における二重の「交叉」によってXPR2遺伝
子を二遺伝子によって置換した。
のXPR2遺伝子座(C)の染色体制限地図と***プラ
スミド−pINA157の制限地図を示す。***プラス
ミドは前以って制限酵素Mlu TとEcoRIによっ
て制限された。相同領域MluI−Bれ■と」れII−
E匹R1における二重の「交叉」によってXPR2遺伝
子を二遺伝子によって置換した。
株JM12、JM23、JM69とJM70によって分
泌されたARPの分量の比較を第9図に示した。これは
、因子3.4ないし5.6によって修正増幅がars1
8で得られることを示している。この修正増幅因子は、
既にβ−ガラクトシダーゼのアッセイに対し既に説明し
たように、アッセイの際に培地内のLeu十細胞のパー
センテージを考慮に入れる。
泌されたARPの分量の比較を第9図に示した。これは
、因子3.4ないし5.6によって修正増幅がars1
8で得られることを示している。この修正増幅因子は、
既にβ−ガラクトシダーゼのアッセイに対し既に説明し
たように、アッセイの際に培地内のLeu十細胞のパー
センテージを考慮に入れる。
JM12 無し
破壊された株JM23、XPR2遺伝子の染色体コピー
を有する株JM12および複製型プラスミドに囲遺伝子
を有する形質転換体JM69とJM70によって分泌さ
れたプロテアーゼ活性の生産の比較。培養は、28°C
でGPP培地(グリセロール6.7g#!、硫酸アンモ
ニウムを含まない酵母窒素塩基1.7g/4.50mM
リン酸塩緩衝液pH6,8)で実施した。培地を10ク
リット単位で接種し、上澄みを接種後23時間で引き出
した。プロテアーゼ活性をドニーらの方法(27)によ
って測定し、ここでは任意の単位で示す。Leu十細胞
のパーセンテージは、ロイシンで補充した培地で培養部
分を培養して、次にロイシンを用いない培地および用い
た培地で複製して決定する。修正した増幅はLeu十細
胞のパーセンテージによって修正した活性を用いて計算
する。
を有する株JM12および複製型プラスミドに囲遺伝子
を有する形質転換体JM69とJM70によって分泌さ
れたプロテアーゼ活性の生産の比較。培養は、28°C
でGPP培地(グリセロール6.7g#!、硫酸アンモ
ニウムを含まない酵母窒素塩基1.7g/4.50mM
リン酸塩緩衝液pH6,8)で実施した。培地を10ク
リット単位で接種し、上澄みを接種後23時間で引き出
した。プロテアーゼ活性をドニーらの方法(27)によ
って測定し、ここでは任意の単位で示す。Leu十細胞
のパーセンテージは、ロイシンで補充した培地で培養部
分を培養して、次にロイシンを用いない培地および用い
た培地で複製して決定する。修正した増幅はLeu十細
胞のパーセンテージによって修正した活性を用いて計算
する。
XPR2遺伝子のプロモーターは複雑な規則を持ってい
る(21)。生成物の動態と水準は培地と培養条件に依
存する。従って、株JM12と株JM70の生成の動態
を、誘導しないYNB培地(硫酸アンモニウムを含まな
い酵母窒素塩基1.7g#!、グルタミン酸ナトリウム
1g/2、グルコースLog/ l 、 50mMリン
酸塩緩衝液、pl+6.8)と、二つの誘導培地YNB
pp(プロテアーゼペプトン1.78/fにつきYNB
を添加する)およびYPDm (酵母抽出物1g/!、
プロテアーゼペプトン50g/ 1、グルコース10g
/ I!、’)において比較した。プロテアーゼ活性は
、基質(50mMトリスで10mg / ml 、、p
H8)としてアゾコール(シグマA3143)を用いて
測定し、30分間30°Cで培養した後、520nmで
の吸収増加を測定した。
る(21)。生成物の動態と水準は培地と培養条件に依
存する。従って、株JM12と株JM70の生成の動態
を、誘導しないYNB培地(硫酸アンモニウムを含まな
い酵母窒素塩基1.7g#!、グルタミン酸ナトリウム
1g/2、グルコースLog/ l 、 50mMリン
酸塩緩衝液、pl+6.8)と、二つの誘導培地YNB
pp(プロテアーゼペプトン1.78/fにつきYNB
を添加する)およびYPDm (酵母抽出物1g/!、
プロテアーゼペプトン50g/ 1、グルコース10g
/ I!、’)において比較した。プロテアーゼ活性は
、基質(50mMトリスで10mg / ml 、、p
H8)としてアゾコール(シグマA3143)を用いて
測定し、30分間30°Cで培養した後、520nmで
の吸収増加を測定した。
結果を第16図と表10に示す。
JM12 − 染色体型 YNB O,0810
01JM12 = 染色体型 YNBpp4.2
100 1JM12 − 染色体型 YPDm
12.2 100 1JM70 plNlNA15
1複製型 YNB 3.4 B1.6 52JM
70 −pINA136 複製型 YNBpp 1
2 84.63.4JM70 pINA136 複
製型 YPDm 60.2 83.65.9接種後
40時間で得られた活性値。プロテアーゼ活性は任意の
単位である。
01JM12 = 染色体型 YNBpp4.2
100 1JM12 − 染色体型 YPDm
12.2 100 1JM70 plNlNA15
1複製型 YNB 3.4 B1.6 52JM
70 −pINA136 複製型 YNBpp 1
2 84.63.4JM70 pINA136 複
製型 YPDm 60.2 83.65.9接種後
40時間で得られた活性値。プロテアーゼ活性は任意の
単位である。
接種後40時間で得られた増幅は、誘導培地で調製され
た培地に対して3.4〜5.9で変化する。これに対し
て、抑圧培地(YNB)では、制御の回避は複製型形質
転換体の場合に行われ、これによって50の因子による
増幅を説明できる。この現象は、制御分子を同定できる
ことが、まだ説明されておらず、従って未だ殆ど活用さ
れずに残っている表現の増幅の他の可能性があることを
示唆している。
た培地に対して3.4〜5.9で変化する。これに対し
て、抑圧培地(YNB)では、制御の回避は複製型形質
転換体の場合に行われ、これによって50の因子による
増幅を説明できる。この現象は、制御分子を同定できる
ことが、まだ説明されておらず、従って未だ殆ど活用さ
れずに残っている表現の増幅の他の可能性があることを
示唆している。
実去l吐U
インベルターゼ(18)に対しコードするサッカロミセ
ス・セレビシアエのSUC2遺伝子を、XPR2プロテ
アーゼの制御下に置き、アルカリ性細胞外プロテアーゼ
(第17図参照)の信号配列に融合した。
ス・セレビシアエのSUC2遺伝子を、XPR2プロテ
アーゼの制御下に置き、アルカリ性細胞外プロテアーゼ
(第17図参照)の信号配列に融合した。
第17図は、プレーXPR2−5IIC2融合体を有す
るプラスミドpINA169の構造の説明図で、Hin
dIII−EcoRVフラグメントによって支持される
凹プロモーターの上流領域は、pBR322(−pIN
A150)に挿入された。次にC1a I欠失はl1i
nd I[[(pINA151)部位を除去することが
できる。さらに、突然変異誘発によってプロテアーゼの
信号配列をコードする領域の後に旧ndlI[部位を生
じさせたこのために、ATGの周囲領域を被う553b
P Xho I −hLI[7ラグメントを有するフ
ァージM13mplB−X4に、突然変異誘発物質のオ
リゴヌクレオチド: (5’ CAGCATCAG^八GCTTCTGCへG
GGGCG3’ )によって突然変異を誘発した。突然
変異フラグメントはBamflI−Sal !制限の後
で精製され、プラスミドpINA165を生成するため
lNA151に導かれた。
るプラスミドpINA169の構造の説明図で、Hin
dIII−EcoRVフラグメントによって支持される
凹プロモーターの上流領域は、pBR322(−pIN
A150)に挿入された。次にC1a I欠失はl1i
nd I[[(pINA151)部位を除去することが
できる。さらに、突然変異誘発によってプロテアーゼの
信号配列をコードする領域の後に旧ndlI[部位を生
じさせたこのために、ATGの周囲領域を被う553b
P Xho I −hLI[7ラグメントを有するフ
ァージM13mplB−X4に、突然変異誘発物質のオ
リゴヌクレオチド: (5’ CAGCATCAG^八GCTTCTGCへG
GGGCG3’ )によって突然変異を誘発した。突然
変異フラグメントはBamflI−Sal !制限の後
で精製され、プラスミドpINA165を生成するため
lNA151に導かれた。
」coRV欠失によって−pINA166において■弗
発令(−pINA62の5.3kbのフラグメント)と
狂R2プロモーターを有するプラスミドpINA166
を商事させた。
発令(−pINA62の5.3kbのフラグメント)と
狂R2プロモーターを有するプラスミドpINA166
を商事させた。
最後に、I)RB58 (参考文献18)の2kbの
肛画■フラグメントから派生したサッカロミセス・セレ
ビシアエの5uc2遺伝子を挿入し最終プラスミドpI
NA169を生じさせた。
肛画■フラグメントから派生したサッカロミセス・セレ
ビシアエの5uc2遺伝子を挿入し最終プラスミドpI
NA169を生じさせた。
次の二つの株のインへルターゼの生産を比較したニーJ
M55、XPR2部位で組み込まれた組込みプラスミド
−pINA169で形質転換した株JM23に対応する
。
M55、XPR2部位で組み込まれた組込みプラスミド
−pINA169で形質転換した株JM23に対応する
。
組込みは、単一の切断部位が凹領域である制限酵素Nh
eIで制限酵素ρlNA169を予め制限したので、凹
部位に向けられる。
eIで制限酵素ρlNA169を予め制限したので、凹
部位に向けられる。
Pl、これは複製型プラスミド−pINA181で形質
転換された株JM23に対応する。
転換された株JM23に対応する。
インベルターゼ活性を、ウニルナ−ら(22)の方法に
よって測定した。インベルターゼ生産の増幅を、誘導Y
PDm培地で測定した。これは炭素源がスクロース(1
0g/ ffi )またはグルコース(log/ Q
)である。結果を、第18図に示す。培養40時間後、
グルコースまたはスクロースで2〜2.9の未修正増幅
因子(即ち、全細胞が生産力を存する)が得られた。こ
の構成はヤロウィア・リポリチカを炭素源としてスクロ
ースを含む培地で生長させることができ、従ってこの有
機体に対して新規の基質を示すことができることを示し
ている。
よって測定した。インベルターゼ生産の増幅を、誘導Y
PDm培地で測定した。これは炭素源がスクロース(1
0g/ ffi )またはグルコース(log/ Q
)である。結果を、第18図に示す。培養40時間後、
グルコースまたはスクロースで2〜2.9の未修正増幅
因子(即ち、全細胞が生産力を存する)が得られた。こ
の構成はヤロウィア・リポリチカを炭素源としてスクロ
ースを含む培地で生長させることができ、従ってこの有
機体に対して新規の基質を示すことができることを示し
ている。
第18図は、組込まれたSUC2遺伝子(I)を有する
株JM58と−pINA181複製型ベクター(R)に
針皿遺伝子を存する株1’lによって、28°CでYP
Dmサッカロース(^)とYPDmグルコース(B)の
培地で、生長過程でのインベルターゼ活性の生成を比較
する曲線図である。
株JM58と−pINA181複製型ベクター(R)に
針皿遺伝子を存する株1’lによって、28°CでYP
Dmサッカロース(^)とYPDmグルコース(B)の
培地で、生長過程でのインベルターゼ活性の生成を比較
する曲線図である。
非ウィルス性活性を有するインターフェロンα1に対し
コードする豚プローINF−α1を、XP112プロモ
ーターの制御下に置き、AEP (構成について、第
19図参照)の「プレプロ」部位に融合した。複製型プ
ラスミド(−pINA250)に遺伝子を有する肛毀部
位で組み込まれた遺伝子のコピーを有する株によって生
産されたインターフェロンの生産を比較したニ 一株JM77は、単一切断部位がXPR2領域である制
限酵素肚1で予め制限されたプラスミド−pINA18
7を用いて形質転換された株JM23に対応し;株JM
85、JM86およびJM87は、複製型プラスミドp
IN^250を用いて形質転換された株JM23に対応
する。
コードする豚プローINF−α1を、XP112プロモ
ーターの制御下に置き、AEP (構成について、第
19図参照)の「プレプロ」部位に融合した。複製型プ
ラスミド(−pINA250)に遺伝子を有する肛毀部
位で組み込まれた遺伝子のコピーを有する株によって生
産されたインターフェロンの生産を比較したニ 一株JM77は、単一切断部位がXPR2領域である制
限酵素肚1で予め制限されたプラスミド−pINA18
7を用いて形質転換された株JM23に対応し;株JM
85、JM86およびJM87は、複製型プラスミドp
IN^250を用いて形質転換された株JM23に対応
する。
尚第19図は、プレプロXPR2−IFN−α1融合体
を有するプラスミドpINA187の構造の説明図で、
ブタのインターフェロンα1をコードするブロー−IF
N−α1遺伝子を含むpLD67ベクターが知られてい
る(参考文献19)。Xba Iおよび」μUの酵素に
よって開き、次にオリゴクレオチドA (56mer)
とB (48mar)を用いて連結した。後者はプロテ
アーゼの「プレープロ」領域を伴う過程でlys −A
rg部位(下線)を生成してXba I −Apa I
アダプターを形成することができ、成熟インターフェロ
ン(−pINA185)をコードする配列に続く。
を有するプラスミドpINA187の構造の説明図で、
ブタのインターフェロンα1をコードするブロー−IF
N−α1遺伝子を含むpLD67ベクターが知られてい
る(参考文献19)。Xba Iおよび」μUの酵素に
よって開き、次にオリゴクレオチドA (56mer)
とB (48mar)を用いて連結した。後者はプロテ
アーゼの「プレープロ」領域を伴う過程でlys −A
rg部位(下線)を生成してXba I −Apa I
アダプターを形成することができ、成熟インターフェロ
ン(−pINA185)をコードする配列に続く。
A : CTAGATCTAAGCGATGTGA
CCTGCCCCAGACCCACTCCCTGGCC
CACACCAGGGCC B : TAGATTCGTTACACTGGAC
GGGGTCTGGGTGAGGGACCGGGTGT
GGTC ハイブリダイゼーション遺伝子は、XPR2プロモータ
ーを再形成する1、9kbの」圏I−X画Iフラグメン
トの挿入によって生成され、AEPのブレーフロ部位を
コードする配列は、インターフェロン(plN^186
)をコードする配列に続く。組込みベクター−pINA
187は、pTNA156に由来する。1.7kbのフ
ラグメントEcoRI−)1indI[[によって支持
されたtlRA3選択マーカーを有する。
CCTGCCCCAGACCCACTCCCTGGCC
CACACCAGGGCC B : TAGATTCGTTACACTGGAC
GGGGTCTGGGTGAGGGACCGGGTGT
GGTC ハイブリダイゼーション遺伝子は、XPR2プロモータ
ーを再形成する1、9kbの」圏I−X画Iフラグメン
トの挿入によって生成され、AEPのブレーフロ部位を
コードする配列は、インターフェロン(plN^186
)をコードする配列に続く。組込みベクター−pINA
187は、pTNA156に由来する。1.7kbのフ
ラグメントEcoRI−)1indI[[によって支持
されたtlRA3選択マーカーを有する。
第11表に示した結果は、3.75ないし8.2の因子
によって修正された増幅がars18で得られることを
示している。
によって修正された増幅がars18で得られることを
示している。
衷U
株 ブラスミF 特 性 培地INFα LED
′−修正活性 χ 増幅 JM77 plNlN八ツ87組込型 YPDm
100 100 1JM85 −pINA250
複製型 YPDm 300 49 6.IJM
86 pINA250 複製型 YPDm 300
〜225 368.2〜6.2JM88 −pINA
250 複製型 YPDm 225 60 3
.75ハイブリッド遺伝子XPR2−INFα1の染色
体コピーを有する株JM7?、複製プラスミドにXPR
2−INFα1遺伝子を有する形質転換体JK85、J
M86、JM87によって分泌された抗ウイルス性活性
の生成の比較。
′−修正活性 χ 増幅 JM77 plNlN八ツ87組込型 YPDm
100 100 1JM85 −pINA250
複製型 YPDm 300 49 6.IJM
86 pINA250 複製型 YPDm 300
〜225 368.2〜6.2JM88 −pINA
250 複製型 YPDm 225 60 3
.75ハイブリッド遺伝子XPR2−INFα1の染色
体コピーを有する株JM7?、複製プラスミドにXPR
2−INFα1遺伝子を有する形質転換体JK85、J
M86、JM87によって分泌された抗ウイルス性活性
の生成の比較。
培養は、20″CでYPDm培地(酵母抽出物1g#!
、プロテアーゼペプトン50g/ l、グルコースLo
g/ Q )で行った。培地を10久リット単位で接種
し、上澄みを接種後48時間および53時間で引き出し
た。抗ウィルス活性をボンナルシールおよびラウデによ
る方法(28)によって測定し、ここでは任意の単位で
示す。
、プロテアーゼペプトン50g/ l、グルコースLo
g/ Q )で行った。培地を10久リット単位で接種
し、上澄みを接種後48時間および53時間で引き出し
た。抗ウィルス活性をボンナルシールおよびラウデによ
る方法(28)によって測定し、ここでは任意の単位で
示す。
実画l吐則
ヤロウィア・リポリチカによるプロキモシンの生産は、
既に参考文献(23)の特許およびフラングらによる組
込みプラスミドLEU2−プロRENが記載されている
文献(20)で実証されている。このプラスミドは、p
LX34と呼ばれ、第14図に示した。これはヤロウィ
ア・リポリチカのLEU2遺伝子のプロモーターの制御
の下にプロREN遺伝子を有する。
既に参考文献(23)の特許およびフラングらによる組
込みプラスミドLEU2−プロRENが記載されている
文献(20)で実証されている。このプラスミドは、p
LX34と呼ばれ、第14図に示した。これはヤロウィ
ア・リポリチカのLEU2遺伝子のプロモーターの制御
の下にプロREN遺伝子を有する。
キモシンの生産を比較するニ
一株0L249 、これはI?、l−ゲノム遺伝子座で
組み込まれたpLX34に宿を貸す; 株DL118 、これはプラスミドpIN^184と同
質遺伝子型であり、これによって形質転換される。後者
はars18 (第14図参照)の付加によってpLX
34から誘導される。プロキモシンを生産し不安定なL
eu十表視表現型する形質転換体は、23°Cで液体培
地で選択され培養された。
組み込まれたpLX34に宿を貸す; 株DL118 、これはプラスミドpIN^184と同
質遺伝子型であり、これによって形質転換される。後者
はars18 (第14図参照)の付加によってpLX
34から誘導される。プロキモシンを生産し不安定なL
eu十表視表現型する形質転換体は、23°Cで液体培
地で選択され培養された。
第12表は、YNIIS最少培地(酵素窒素塩基6.7
g/l、グルコースLog/ i!、 )で60時間の
培養の後、キモシン生産が複製形質転換体において組込
型制御におけるよりも1゜3倍高いことを示している。
g/l、グルコースLog/ i!、 )で60時間の
培養の後、キモシン生産が複製形質転換体において組込
型制御におけるよりも1゜3倍高いことを示している。
キモシン活性のアッセイは、ヤロウィア・リポリチカの
異なる形質転換体の培地上澄みに存在する。活性は任意
の単位で示した。アッセイに対し、参考文献(20)に
記載の方法は次の通りであった:細胞を遠心分離後、上
澄みを20分間、酵素前駆体を活性キモシンに転換する
ため、約pH2(塩酸を用いた)にて処理して活性化し
た。後者の活性は、37°Cにて乳1 d (p16.
5で41.5mMの酢酸ナトリウム、13.6mMの塩
化カルシウム中に12%デイフコスキムミルク)を凝固
する容量によって、市販のレンニン(シグマR4879
)の標準系と比較して、測定した。
異なる形質転換体の培地上澄みに存在する。活性は任意
の単位で示した。アッセイに対し、参考文献(20)に
記載の方法は次の通りであった:細胞を遠心分離後、上
澄みを20分間、酵素前駆体を活性キモシンに転換する
ため、約pH2(塩酸を用いた)にて処理して活性化し
た。後者の活性は、37°Cにて乳1 d (p16.
5で41.5mMの酢酸ナトリウム、13.6mMの塩
化カルシウム中に12%デイフコスキムミルク)を凝固
する容量によって、市販のレンニン(シグマR4879
)の標準系と比較して、測定した。
この生産は最少培地(70%の平均値)にプラスミドを
有する細胞を対象とする場合、増幅因子1.77が認ら
れる。
有する細胞を対象とする場合、増幅因子1.77が認ら
れる。
同じ実験を、上記の株INAG33122 (Fil
”)を同じプラスミドpLX34 (酵素Xholでプ
ラスミドの線形化によって■肥ゲノム遺伝子座に向けら
れた組込み)とptN八1へ4(複製型プラスミド)で
形質転換によって行った。形質転換体をYEPC完全培
地(酵母抽出物0.1%、ペプトン5%ニゲルコース1
%)で培養した。23°Cで50時間培養後、培地中の
キモシン生産物は、複製形質転換体では組込み形質転換
体の場合の如く3倍高いことを見出した。この段階の培
養で観察されたLeu十細胞のパーセンテージ(45%
)によって補正後、生成した増幅は2.8倍である。I
NF−α、遺伝子と抗体は、クロード・う・ボンナルジ
ェル、アンスチテユ・ナシオナル・ド・う・ルシエルシ
エ・アグロノミク、ジュイアンージョサから伝えられ、
IFNの生物学的投薬は、前記研究所で行われた。
”)を同じプラスミドpLX34 (酵素Xholでプ
ラスミドの線形化によって■肥ゲノム遺伝子座に向けら
れた組込み)とptN八1へ4(複製型プラスミド)で
形質転換によって行った。形質転換体をYEPC完全培
地(酵母抽出物0.1%、ペプトン5%ニゲルコース1
%)で培養した。23°Cで50時間培養後、培地中の
キモシン生産物は、複製形質転換体では組込み形質転換
体の場合の如く3倍高いことを見出した。この段階の培
養で観察されたLeu十細胞のパーセンテージ(45%
)によって補正後、生成した増幅は2.8倍である。I
NF−α、遺伝子と抗体は、クロード・う・ボンナルジ
ェル、アンスチテユ・ナシオナル・ド・う・ルシエルシ
エ・アグロノミク、ジュイアンージョサから伝えられ、
IFNの生物学的投薬は、前記研究所で行われた。
SUC2、INF−α1およびプロテアーゼはジャンー
マルク・ニコードの協力で実施した。
マルク・ニコードの協力で実施した。
次の株は1988年1月21日に、アンスチテユ・パス
ツールのコレクシオン・ナシオナル・ド・タルチュール
・ド・ミクロオーガニズム、28 リュド ドクテル
ールー75724パリ セデクス15、にて寄託された
: エシエルシ7・コリ(Escherichia col
t) : INAG20 580ノ−pINA123 第1−724号 一ヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia 1ip
olytica) :INAG 33 129 第1−725号 一ヤロウイア・リポリチカ(Yarroinia 1i
polytica) :INAG 33462/−p
INA119 第1−726号皇jL訪吠 1、ウィリアム・デイ・エイチ:イースト、1985゜
上(1〜2)、1〜14゜ 2、キールシイ・ニス:バイオ・エッセイズ:1(4)
、 157〜161゜ 3、ゲイタルディン・シー、リベット・エイ・エムとへ
スロット・エイチ: Curr、 Genet、 +
1985+刊、49〜58゜ 4、ダヴイドウ、エル・ニス、アポストラコス・デイ、
オドンネル・エム・エム、ブロクトル・エイ・アール、
オグリチアク・デイ・エム、ウィング・アール・エイ、
スタスコ・アイ、ド・レーク・ジェヘ・アール: Cu
rr、 Genet、 、 1985.10.39〜4
8゜ 5、ゲイタルジン・シー、リベット・エイ・エムCur
r、 Genet、 、 1987.11. 369〜
375゜6、ウィング・アール・エイ、オグリジアク・
デイ−・エム;糸状菌の分子遺伝学、テンパーレーク・
ダプリュ・イー(著)、UCLAシンボジア34巻、1
985.367〜382゜ 7、ムレイ・エイ・ダブリュ及びツオスタク・ジェイ・
ダブリユニセル 1983.34.961〜970゜8
、ダヴイドウ、エル・ニスおよびレーク・ジエイ・アー
ル:ヨーロッパ特許第0138,50B−Al、 19
84゜9、フォアニール・ピー、ガイタルジン・シー・
ベルシイ・エム・エイ、フルートライク・ジエイ、およ
びヴアン・ヘーリクハイツェン・エイチ:Gene、
1986.42.273〜282)。
ツールのコレクシオン・ナシオナル・ド・タルチュール
・ド・ミクロオーガニズム、28 リュド ドクテル
ールー75724パリ セデクス15、にて寄託された
: エシエルシ7・コリ(Escherichia col
t) : INAG20 580ノ−pINA123 第1−724号 一ヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia 1ip
olytica) :INAG 33 129 第1−725号 一ヤロウイア・リポリチカ(Yarroinia 1i
polytica) :INAG 33462/−p
INA119 第1−726号皇jL訪吠 1、ウィリアム・デイ・エイチ:イースト、1985゜
上(1〜2)、1〜14゜ 2、キールシイ・ニス:バイオ・エッセイズ:1(4)
、 157〜161゜ 3、ゲイタルディン・シー、リベット・エイ・エムとへ
スロット・エイチ: Curr、 Genet、 +
1985+刊、49〜58゜ 4、ダヴイドウ、エル・ニス、アポストラコス・デイ、
オドンネル・エム・エム、ブロクトル・エイ・アール、
オグリチアク・デイ・エム、ウィング・アール・エイ、
スタスコ・アイ、ド・レーク・ジェヘ・アール: Cu
rr、 Genet、 、 1985.10.39〜4
8゜ 5、ゲイタルジン・シー、リベット・エイ・エムCur
r、 Genet、 、 1987.11. 369〜
375゜6、ウィング・アール・エイ、オグリジアク・
デイ−・エム;糸状菌の分子遺伝学、テンパーレーク・
ダプリュ・イー(著)、UCLAシンボジア34巻、1
985.367〜382゜ 7、ムレイ・エイ・ダブリュ及びツオスタク・ジェイ・
ダブリユニセル 1983.34.961〜970゜8
、ダヴイドウ、エル・ニスおよびレーク・ジエイ・アー
ル:ヨーロッパ特許第0138,50B−Al、 19
84゜9、フォアニール・ピー、ガイタルジン・シー・
ベルシイ・エム・エイ、フルートライク・ジエイ、およ
びヴアン・ヘーリクハイツェン・エイチ:Gene、
1986.42.273〜282)。
10、サザン・イー・エム: J、 Mo1. Bio
l、、 1975゜餞、 503) 11、チャン・シー・ニス・エム、タイ・ビーケイ:、
J、 Mo1. Biol、、 1983. 168.
505〜52312、ミラー・ジエイ・エイチ:分子遺
伝学におけル実験にて、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−1
971゜ 13、フ゛ラドフォード・エイチ・エム、八na1.
Biochem、、 1976、72.248゜14、
クスアン・ジェー、フルニール・ビーおよびガイタルジ
ン・シー:ターゲット組込みによる酵素ヤロウィア・リ
ポリチカからの皿遺伝子をコードするサツカロピンデヒ
ドロゲナーゼのクローニング、Curr、 Genet
、 14 : 15〜21(1988)。
l、、 1975゜餞、 503) 11、チャン・シー・ニス・エム、タイ・ビーケイ:、
J、 Mo1. Biol、、 1983. 168.
505〜52312、ミラー・ジエイ・エイチ:分子遺
伝学におけル実験にて、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−1
971゜ 13、フ゛ラドフォード・エイチ・エム、八na1.
Biochem、、 1976、72.248゜14、
クスアン・ジェー、フルニール・ビーおよびガイタルジ
ン・シー:ターゲット組込みによる酵素ヤロウィア・リ
ポリチカからの皿遺伝子をコードするサツカロピンデヒ
ドロゲナーゼのクローニング、Curr、 Genet
、 14 : 15〜21(1988)。
15、オル・ライ−バー・ティ、ツォスタク・ジェイ:
酵母組み換え:ダブルストランド・ギャップ修復と交差
との組み合せ、Proc、 Natl、八cad、 S
ci、。
酵母組み換え:ダブルストランド・ギャップ修復と交差
との組み合せ、Proc、 Natl、八cad、 S
ci、。
80 : 4417〜4421 (1983)。
16、クネス・ニス・ホトスティンおよびフォックス・
エム:逆位ダイマーと組み換えプラスミド生成物の酵母
線状イヒDNA形成の形質転換、J、 Mol。
エム:逆位ダイマーと組み換えプラスミド生成物の酵母
線状イヒDNA形成の形質転換、J、 Mol。
Biol、、 184〜387 (1987)。
17、 タビドウ・エル、オドンネル・エム、カツマレ
ク・エフ、ペレイラ・デイ、ド・レーク・ジ工左のアル
カリ性細胞外プロテアーゼ遺伝子のクローニングと配列
、J、 Bacteriol、 169 : 4621
〜4629 (1987))。
ク・エフ、ペレイラ・デイ、ド・レーク・ジ工左のアル
カリ性細胞外プロテアーゼ遺伝子のクローニングと配列
、J、 Bacteriol、 169 : 4621
〜4629 (1987))。
18、タウジグ・アールとカールソン・エム:インベル
ターゼに対する酵母SUC2遺伝子のヌクレオチド配列
、Nucleic Ac1ds Res、 11 :
1943〜1954(1983)。
ターゼに対する酵母SUC2遺伝子のヌクレオチド配列
、Nucleic Ac1ds Res、 11 :
1943〜1954(1983)。
19、レフニブル・エフおよびカールソン・エム:生物
学的に活性なブタインターフェロンをコードする遺伝子
の分子クローニングと配列、ジャーナル・オン・インタ
ーフェロン・リサーチ、6:349〜360 (198
6) ’)。
学的に活性なブタインターフェロンをコードする遺伝子
の分子クローニングと配列、ジャーナル・オン・インタ
ーフェロン・リサーチ、6:349〜360 (198
6) ’)。
20、フランテ・エイ、カツマレク・エフ、アイゼンハ
ード・エム、ゲオゲガン・ケイ、ダンレイ・デイ、ドジ
ーウ・シヱイ、オートンネル・エム、ゴラヘル・エムお
よびランス・ニス;ヤロウィア・リポリチカにおけるウ
シプロキモシンの表現と分泌、インダストリアル・ミク
ロビオロジイ、29:43〜57 (198B) ) 21、オリトチアク・デイ、ドメイン・エイおよびタン
ネンバウム・ニス:カン−イ ゛・1ボ1チカの細胞外
プロテアーゼ生産の制御、Biochim、 Biop
h。
ード・エム、ゲオゲガン・ケイ、ダンレイ・デイ、ドジ
ーウ・シヱイ、オートンネル・エム、ゴラヘル・エムお
よびランス・ニス;ヤロウィア・リポリチカにおけるウ
シプロキモシンの表現と分泌、インダストリアル・ミク
ロビオロジイ、29:43〜57 (198B) ) 21、オリトチアク・デイ、ドメイン・エイおよびタン
ネンバウム・ニス:カン−イ ゛・1ボ1チカの細胞外
プロテアーゼ生産の制御、Biochim、 Biop
h。
Acta 497 : 525〜538 (1977)
。
。
22、ウニルナ−・ダブリュ、レイ・エイチおよびライ
リンガ−・エイチ・ゼ・ント:へnalyt、 Che
m。
リンガ−・エイチ・ゼ・ント:へnalyt、 Che
m。
252 : 224 (1970)。
23、ダヴイドウ・エル、フランク・エイおよびジーウ
・ジエイ:ヤロウィア・リポリチカによる非対応蛋白質
の表現と分泌、ヨーロッパ特許出r9M86−3078
39.1986゜ 24、キクチ・ワイ:酵母プラスミドは、その安定性を
維持するためにシス作用遺伝子座と二個のプラスミド蛋
白質を必要とする、Ce1l 35 : 487〜4
93 (1983)。
・ジエイ:ヤロウィア・リポリチカによる非対応蛋白質
の表現と分泌、ヨーロッパ特許出r9M86−3078
39.1986゜ 24、キクチ・ワイ:酵母プラスミドは、その安定性を
維持するためにシス作用遺伝子座と二個のプラスミド蛋
白質を必要とする、Ce1l 35 : 487〜4
93 (1983)。
25、ウォルフーデイトリッヒ・エイチ、シピツキ・エ
ムおよびコーリ・ジェイ:シゾサッカロミセス・ポンプ
におけるプラスミドの複製:新規な遺伝子エレメントに
よる対称分離の改良、Mol、 Ce1l。
ムおよびコーリ・ジェイ:シゾサッカロミセス・ポンプ
におけるプラスミドの複製:新規な遺伝子エレメントに
よる対称分離の改良、Mol、 Ce1l。
Biol、 6 : 80〜89 (1986) 。
26、ウィリアムソン・ディー:酵母AI?Sエレメン
ト、シラスフ イヤーズ オン:プログレス レポト、
イースト1:1〜14 (1985) 。
ト、シラスフ イヤーズ オン:プログレス レポト、
イースト1:1〜14 (1985) 。
27、ドニーら:プラスミンに対する基質としてのIC
メチル化βカゼインおよび乳蛋白質形質転換体の研究へ
のその応用、B、 B、八、 626 : 117〜1
26(1980) 。
メチル化βカゼインおよび乳蛋白質形質転換体の研究へ
のその応用、B、 B、八、 626 : 117〜1
26(1980) 。
28、う・ボンナルシールおよびラウデ・エイチ:実験
的に誘発したウィルス腸炎の間の新生のブタ腸における
高いインターフェロンのタイターInfect、 Im
mun、32 : 28〜31 (1981) 。
的に誘発したウィルス腸炎の間の新生のブタ腸における
高いインターフェロンのタイターInfect、 Im
mun、32 : 28〜31 (1981) 。
第1図は、菌糸体の生長細胞または酵母型細胞において
、母性分離に関する性質を示す染色体外プラスミドの伝
達(播種)図で、生長(C)または生長停止(A)は選
択遺伝子をもつプラスミド(O印)の存否による。核は
・印で示し、第2図は、親株Fi1+(INAG331
22)と突然変異体Fil−(INAG33129)の
コロニーの形態を上(A)、下(B)に示した倍率5〜
10倍の拡大図、第3図は、光学顕微鏡(倍率400倍
)で観察した株Fil+(A)と突然変異体Fil−(
B)の細胞の形態を示す顕微鏡写真図、 第4図は、このプラスミドのホーBam1l1位での1
mフラグメント(黒)のライブラリ構造の計画を示すp
lN^62の組み込みベクター地図で、影線部分はアン
ピシリンに耐性のblaiji伝子であり、点線部分は
ヤロウィア・リポリチカのLEU2遺伝子であり、」亘
はプラスミドの複製のバクテリヤ源を示し、 第5図は不安定な形質転換体におけるプラスミドの検出
を示す図、 第6図は、第5図に定義した5種の形質転換体から単離
された5種のプラスミドの制限地図、第7図は、ars
プラスミド」用紅旦の制限地図、第8図は、ヤロウィア
・リポリチカに対するミニベクターの構造を示す説明図
、 第9図は、ベータ・ガラクトシダーゼの表現で、組み込
みプラスミドplN^98からプラスミド蛋白質八13
5を組み立てる説明図、 第10図は、ars6Bとars77を有するフラグメ
ントの縮減図で、派生的プラスミドに存在する部分のみ
を示しており、これらのすべてが形質転換マーカーとし
てLEU2遺伝子を含み、 第11図はars18配列の縮減図、 第12図はars1B配列を有する種々の大腸菌−ヤロ
ウイア・リポリチカシャトルプラスミドを示す説明図、 第13図はars18の配列図、 第14−1〜4図は、遺伝子増幅に用いられる組込みと
複製のプラスミドの構造の説明図、第15図は、株JM
23の構造の概略図、第16図は、組込まれたXPR2
遺伝子(1)を有する株JM12と、複製型ベクター−
pINA136(Tl)に狸録遺伝子を有する株JM7
0による生長過程で生産されたプロテアーゼ活性の発生
の比較を示す曲線図で、28゛CにてYNB (A)、
YNBpp (B)およびYPDm (C)で培養し、
プロテアーゼ活性は任意単位で示し、 第17図は、プレーXPR2−SUC2融合体を有する
プラスミド−pINA169の構造の説明図、第18図
は、組込まれたSUC2遺伝子(I)を有する株JM5
BとpINA181複製型ベクター(R)に銭別遺伝子
を有する株P1によって、28°CでYPDmサッカロ
ース(A)とYPDmグルコース(B)の培地で、生長
過程でのインベルターゼ活性の生成を比較する曲線図、
第19図は、プレプロXPR2−IFN−α1融合体を
有するプラスミド−pINA187の構造の説明図であ
る。
、母性分離に関する性質を示す染色体外プラスミドの伝
達(播種)図で、生長(C)または生長停止(A)は選
択遺伝子をもつプラスミド(O印)の存否による。核は
・印で示し、第2図は、親株Fi1+(INAG331
22)と突然変異体Fil−(INAG33129)の
コロニーの形態を上(A)、下(B)に示した倍率5〜
10倍の拡大図、第3図は、光学顕微鏡(倍率400倍
)で観察した株Fil+(A)と突然変異体Fil−(
B)の細胞の形態を示す顕微鏡写真図、 第4図は、このプラスミドのホーBam1l1位での1
mフラグメント(黒)のライブラリ構造の計画を示すp
lN^62の組み込みベクター地図で、影線部分はアン
ピシリンに耐性のblaiji伝子であり、点線部分は
ヤロウィア・リポリチカのLEU2遺伝子であり、」亘
はプラスミドの複製のバクテリヤ源を示し、 第5図は不安定な形質転換体におけるプラスミドの検出
を示す図、 第6図は、第5図に定義した5種の形質転換体から単離
された5種のプラスミドの制限地図、第7図は、ars
プラスミド」用紅旦の制限地図、第8図は、ヤロウィア
・リポリチカに対するミニベクターの構造を示す説明図
、 第9図は、ベータ・ガラクトシダーゼの表現で、組み込
みプラスミドplN^98からプラスミド蛋白質八13
5を組み立てる説明図、 第10図は、ars6Bとars77を有するフラグメ
ントの縮減図で、派生的プラスミドに存在する部分のみ
を示しており、これらのすべてが形質転換マーカーとし
てLEU2遺伝子を含み、 第11図はars18配列の縮減図、 第12図はars1B配列を有する種々の大腸菌−ヤロ
ウイア・リポリチカシャトルプラスミドを示す説明図、 第13図はars18の配列図、 第14−1〜4図は、遺伝子増幅に用いられる組込みと
複製のプラスミドの構造の説明図、第15図は、株JM
23の構造の概略図、第16図は、組込まれたXPR2
遺伝子(1)を有する株JM12と、複製型ベクター−
pINA136(Tl)に狸録遺伝子を有する株JM7
0による生長過程で生産されたプロテアーゼ活性の発生
の比較を示す曲線図で、28゛CにてYNB (A)、
YNBpp (B)およびYPDm (C)で培養し、
プロテアーゼ活性は任意単位で示し、 第17図は、プレーXPR2−SUC2融合体を有する
プラスミド−pINA169の構造の説明図、第18図
は、組込まれたSUC2遺伝子(I)を有する株JM5
BとpINA181複製型ベクター(R)に銭別遺伝子
を有する株P1によって、28°CでYPDmサッカロ
ース(A)とYPDmグルコース(B)の培地で、生長
過程でのインベルターゼ活性の生成を比較する曲線図、
第19図は、プレプロXPR2−IFN−α1融合体を
有するプラスミド−pINA187の構造の説明図であ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ヤロウィア・リポリチカにおいて効能のある自律複
製配列。 2、第8B図の制限地図を有する2.2Kb(¥Bam
¥HI/¥Bam¥HI)DNAフラグメントによって
支持され請求項1記載の自律複製配列。 3、第13図に示した配列の有効部分に相当する請求項
1記載の自律複製配列。 4、¥ars¥68または¥ars¥77配列である請
求項1記載の自律複製配列。 5、請求項1ないし4のいずれか一つの項に記載の自律
複製配列を有するDNA。 6、請求項1ないし4のいずれか一つの項に記載の自律
複製配列を有するプラスミド。 7、請求項1ないし4のいずれか一つの項に記載のヤロ
ウィア・リポリチカに効能のある自律複製配列を有し、
特に、次の方法: a)ヤロウィア・リポリチカのゲノムフラグメントのラ
イブラリがヤロウィア・リポリチカの栄養要求体を補足
する組込みベクターにおいて形成され、 b)前記組込みベクターによって補足されることができ
る栄養要求体を有するヤロウィア・リポリチカのホスト
株が、前記ライブラリのプラスミドで形質転換され、 c)コロニーハイブリダイゼーションを、組込みベクタ
ーを検出するプローブを用いて行い、最強の信号を有す
る形質転換体を選択し、 d)ベクタークローンの微小溶解物を調製し、染色体外
プラスミドを検出する ことにより得られ、これらのプラスミドは ¥ars¥配列を有し、この配列は形質転換力を試験し
て確認でき、元のベクターの形質転換力の少なくとも5
倍である、 ことを特徴とするプラスミド。 8、次の工程: −pINA62タイプの組込みベクターにおいてヤロウ
ィア・リポリチカのゲノムフラグメントのライブラリの
形成; Fil+株においてこのライブラリのスーパ −コイル化した円形プラスミドの形質転換、LEU+形
質転換体(これは組込みプラスミドまたは複製型プラス
ミドを含むことができる)の選択; −pBR322プローブを用いたコロニーハイブリダイ
ゼーション:より強力な信号がマルチコピー複製型形質
転換体に見出されることが期待され;潜在自律複製配列
クローンの単離; −選択されたクローンの微小溶解物は非制限DNAのサ
ザン転写:pBR322プローブを用いた染色体外プラ
スミドの検出; −微小溶解物のDNAを用い大腸菌の形質転換および自
律複製配列プラスミドの増幅; −適当な場合、クローンの不安定性の特性化 から成る工程を含む方法で得られた請求項7記載のプラ
スミド。 9、Fil−ホスト株に対し形質転換体の不安定性を試
験し、さらに最低の不安定性を有する形質転換体を選択
する請求項8記載のプラスミド。 10、請求項8または9に記載のプラスミドから得られ
る自律複製配列を有するDNA配列。 11、ヤロウィア・リポリチカにおいて効能のある自律
複製配列を含むヤロウィア・リポリチカの栄養要求体を
補足する組込みベクターを含むプラスミド。 12、ヤロウィア・リポリチカにおける工業的蛋白質の
表現を確保する全要素を含み、自律複製配列を含むヤロ
ウィア・リポリチカにおける前記蛋白質の表現のための
プラスミド。 13、ヤロウィア・リポリチカ蛋白質の制御下に前記蛋
白質に対しコードする配列を含む請求項12記載のプラ
スミド。 14、プロモーターが¥XPR2¥または¥LEU2¥
プロモーターである請求項1記載のプラスミド。 15、蛋白質がAEP、インベルターゼ、ポルシンイン
ターフェロン−α_1およびプロキモシンから選ばれる
請求項14記載のプラスミド。 16、ヤロウィア・リポリチカの¥XPR2¥遺伝子を
含む請求項15記載のプラスミド。 17、¥XPR2¥プロモーターの制御下にサッカロミ
セス・セレビシアエの¥SUC2¥遺伝子を含む請求項
15記載のプラスミド。 18、¥SUC2¥遺伝子をアルカリ性染色体外プロテ
アーゼの信号配列に融合する請求項17記載のプラスミ
ド。 19、プロ¥REN¥遺伝子がヤロウィア・リポリチカ
の¥LEU2¥遺伝子のプロモーターの制御下にある請
求項15記載のプラスミド。 20、請求項6乃至9および11ないし19のいずれか
一つの項に記載のプラスミドによって形質転換されたヤ
ロウィア・リポリチカの株。 21、プラスミドが少なくとも一つの非対応配列を含む
請求項20記載の株。 22、Fil+株である請求項20または21記載の株
。 23、Fil−株である請求項20または21記載の株
。 24、請求項20ないし23のいずれか一つの項に記載
のヤロウィア・リポリチカの株を、その生長を確保する
培地で培養する産業的蛋白質の調製方法。 25、請求項24記載の方法により得られた蛋白質。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8800973A FR2626584B1 (fr) | 1988-01-28 | 1988-01-28 | Sequence ars efficace chez yarrowia lipolytica et procede pour sa preparation |
FR8800973 | 1988-01-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH025882A true JPH025882A (ja) | 1990-01-10 |
Family
ID=9362718
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1016504A Pending JPH025882A (ja) | 1988-01-28 | 1989-01-27 | 複製配列、その調製方法および利用 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5212087A (ja) |
EP (1) | EP0329501A1 (ja) |
JP (1) | JPH025882A (ja) |
DK (1) | DK38989A (ja) |
FR (1) | FR2626584B1 (ja) |
IE (1) | IE890282L (ja) |
IL (1) | IL89086A0 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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JP2014503216A (ja) * | 2010-12-30 | 2014-02-13 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | スクロース利用のための、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowialipolytica)におけるサッカロミセス・セレビシア(Saccharomycescerevisiae)SUC2遺伝子の使用 |
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WO2000053803A1 (fr) * | 1999-03-05 | 2000-09-14 | Transgene | FRAGMENT NUCLEOTIDIQUE, SONDE, AMORCE, REACTIF ET PROCEDE DE DETECTION D'UNE SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DERIVEE DE L'ORIGINE DE REPLICATION DE pBR322 |
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BR112012011576A2 (pt) * | 2009-10-16 | 2015-09-15 | Baylor College Medicine | dna de minicírculos superenrolados para aplicações de terapia genética |
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JP5970463B2 (ja) | 2010-11-03 | 2016-08-17 | ソラザイム, インコーポレイテッドSolazyme Inc | 流動点が低い微生物油、それから生成される誘電性流体、及び関連する方法 |
EP3643774A1 (en) | 2011-02-02 | 2020-04-29 | Corbion Biotech, Inc. | Tailored oils produced from recombinant oleaginous microorganisms |
SG11201406711TA (en) | 2012-04-18 | 2014-11-27 | Solazyme Inc | Tailored oils |
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FR3009619B1 (fr) | 2013-08-07 | 2017-12-29 | Roquette Freres | Compositions de biomasse de microalgues riches en proteines de qualite sensorielle optimisee |
BR112016006839A8 (pt) | 2013-10-04 | 2017-10-03 | Solazyme Inc | Óleos customizados |
BR112017000414A2 (pt) | 2014-07-10 | 2017-11-07 | Terravia Holdings Inc | genes cetoacil-acp sintase e utilizações dos mesmos |
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IN163393B (ja) * | 1983-10-06 | 1988-09-17 | Pfizer | |
EP0166659B1 (fr) * | 1984-06-26 | 1989-08-30 | Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) | Vecteurs de transformation de la levure yarrowia lipolytica, procédé de transformation et levure transformée |
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-
1988
- 1988-01-28 FR FR8800973A patent/FR2626584B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-01-26 EP EP89400218A patent/EP0329501A1/fr not_active Withdrawn
- 1989-01-26 IL IL89086A patent/IL89086A0/xx unknown
- 1989-01-27 JP JP1016504A patent/JPH025882A/ja active Pending
- 1989-01-27 DK DK038989A patent/DK38989A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-01-27 IE IE890282A patent/IE890282L/xx unknown
- 1989-01-27 US US07/303,874 patent/US5212087A/en not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
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