FR2665908A1 - Sequence centromerique et adn comportant une telle sequence. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une séquence centromérique caractérisée en ce qu'elle est génétiquement liée à une séquence ARS efficace chez Y. lipolytica ainsi qu'un ADN comportant une telle séquence.
Description
La présente invention concerne des séquences centromériques qui sont liées à des séquences de réplication autonome (séquences ARS) efficaces chez la levure Yarrowia lipolytica. Elle concerne également la préparation de vecteurs centromériques et de minichromosomes, comportant ces séquences, chez Y. lipolytica, ainsi que leurs applications.
Chez les eucaryotes, les centromères, ci-après désignés par régions ou fragments "CEN" sont des régions chromosomiques particulières qui s'attachent aux microtubules du fuseau achromatique lors des divisions nucléaires et sont responsables de la ségrégation régulière des chromosomes à la mitose et à la méiose. Il n'existe normalement qu'un seul centromère par chromosome. Si un second centromère est introduit dans un chromosome, cela conduira à la rupture du chromosome aberrant lors de la mitose. Toute molécule d'ADN possédant une séquence centromérique pourra après division cellulaire être retrouvée régulièrement dans les deux cellules filles.
Les fragments "CEN" caractérisés sur les plasmides leur confèrent une stabilité mitotique, et bien que ne présentant pas de régions étendues d'homologie, ils partagent certains traits communs, en particulier une région ayant une teneur en bases A+T supérieure à 90%.
Ces centromères n'ont été jusqu'ici caractérisés au plan moléculaire que chez deux espèces de levure, S. cerevisiae et S. pombe (Clarke L., Trends in Genet. 1990, 6, 150-154).
Ils présentent des tailles et des structures très différentes chez ces deux organismes : 100 bp chez S. cerevisiae, environ 100 kb chez S.
pombe.
Chez la levure Y.lipolytica, on a isolé des séquences conférant l'autonomie de réplication (ou séquence ARS) à des plasmides de cette levure.
Les vecteurs portant des séquences ARS sont caractérisés par une haute fréquence de transformation et une instabilité ségrégationnellé.
Ils peuvent être obtenus après constitution d'une banque de fragments génomiques de Y. lipolytica dans un vecteur intégratif complémentant une auxotrophie de Y. lipolytica, -par transformation d'une souche de Y.
lipolytica présentant cette auxotrophie. Les transformants sont ensuite sélectionnés pour mettre en évidence les plasmides extrachromosomiques qui portent -une séquence ARS ; cette séquence ARS confére aux plasmides un pouvoir de transformation au moins 5 fois supérieur au pouvoir de transformation du vecteur d'origine. Ces séquences ARS sont fonctionnelles chez Y. lipolytica et sont utilisables pour la réalisation de plasmides vecteurs d'expression pouvant se maintenir à ltétat extrachromosomique et être amplifiés.
Cependant, les inventeurs ont maintenant constaté que les séquences ARS fonctionnelles sur plasmides isolées chez Y. lipolytica ont un comportement atypique. Elles sont rares dans le génôme de Y. lipolytica une pour au moins 1000 kb d'ADN génomique, contre une pour 10 à 30 kb chez les autres levures. Les plasmides portant ces séquences ont une stabilité mitotique très supérieure à celle des plasmides ARS décrits par ailleurs. En outre, le nombre de copies par cellule transformée est faible (de l'ordre de 1 à 5), alors que chez les autres levures les cellules transformées contiennent typiquement plusieurs dizaines de copies du vecteur transformant.
De façon tout à fait surprenante, on a trouvé que certaines de ces séquences de réplication autonome sont associées à une séquence centromérique.
C'est pourquoi la présente invention se rapporte à une séquence centromérique caractérisée en ce qu'elle est génétiquement liée à une séquence ARS efficace chez Y. lipolytica.
La possibilité d'isoler les quatre produits de la méïose sous forme de tétrades ordonnées rend possible la détermination de la distance entre un gène et le centromère du chromosome sur lequel il se trouve. La liaison au centromère se mesure, après sporulation d'un diploïde hétérogygote pour deux marqueurs A et B (type AB/ab), par analyse de tétrades.
Si A et B ne sont pas tous deux liés à un centromère, trois types d'asques sont possibles : ditypes parentaux (DP) [AB AB ab ab], ditypes recombinés (DR) [Ab Ab aB aB]- et tétratypes (TT) [AB ab Ab aB1 en proportion lDP:lDR:2TT. Si les deux marqueurs sont chacun lié à un centromère on n observe plus la classe TT (Mortimer et Schild (1981) in The Molecular
Biology of the yeast S. cerevisiae, Cold Spring Harbor ed., p. 11-26). I1 existe 4 ou 5 chromosomes chez la levure Y. lipolytica et la carte génétique connue actuellement ne comporte aucun marqueur lié aux centromères (Ogrydziak (1988) J. Basic Microbiol. 28, 185-196).
Biology of the yeast S. cerevisiae, Cold Spring Harbor ed., p. 11-26). I1 existe 4 ou 5 chromosomes chez la levure Y. lipolytica et la carte génétique connue actuellement ne comporte aucun marqueur lié aux centromères (Ogrydziak (1988) J. Basic Microbiol. 28, 185-196).
Pour démontrer une liaison à un centromère d'une séquence de réplication autonome (ARS), on marque génétiquement les chromosomes au voisinage d'ARS et on montre que ces séquences sont indiscernables de centromères en analyse de tétrades. Le marquage est réalisé par substitution d'une copie chromosomique sauvage par un gène délété créé in vitro.
A partir des plasmides comportant les séquences ARS, on a pu isoler des séquences moins larges portant la séquence ARS. C'est ainsi qu'on a pu caractériser en particulier 2 types de séquences ARS différentes portées par les plasmides pINA119 et pINA123. La partie efficace de ces séquences, notées ARS18 et ARS68 est localisée respectivement sur des fragments d'ADN de 1,3 kb et 2,3 kb.
Le fragment de 1,3 kb de l'ARS18 a été caractérisé par sa séquence nucléotidique. Les séquences responsables de la transformation à haute fréquence et de la réplication extrachromosomique peuvent être physiquement localisées sur deux régions adjacentes.
La présente invention concerne donc une séquence centro mérique caractérisée en ce qu'elle est portée par la séquence ARS18 de 1,3 kb, efficace chez Y. lipolytica.
La présente invention concerne également une séquence centromérique caractérisée en ce qu'elle est portée par la séquence ARS68 de 2,3 kb, efficace chez Y. lipolytica. Ce fragment, BamHI-BglII, obtenu par délétions successives d'un fragment de 6,6 kb est capable de maintenir des plasmides à l'état extra-chromosomique.
La présente invention se rapporte également à un ADN comportant une séquence centromérique génétiquement liée à une séquence
ARS efficace chez Y. lipolytica.
ARS efficace chez Y. lipolytica.
Cet ADN peut comporter en outre un promoteur inductible adjacent et contrôlant la séquence centromérique. Cet ADN sera de préférence un plasmide, dont l'amplification ainsi inductible permet de s'affranchir de la contrainte du bas nombre de copies des plasmides imposé par les régions centromériques. On obtient ainsi des vecteurs réplicatifs à haut nombre de copies. Ces plasmides pourront donc comporter en outre des éléments permettant l'expression d'une protéine chez Y. lipolytica, selon des techniques communes de l'homme de métier.
L'insertion de séquences CEN dans un plasmide doit conférer à celui-ci les propriétés d'un minichromosome, en particulier une ségrégation régulière en méiose. Si on croise une souche CEN+ par une souche CEN et que le diploïde est mis à sporuler, on trouve dans la descendance 50% de souches CEN+ et 50% de souches CEN . En analyse de tétrades, on observe des ségrégations de type 2+:2- ou 4+:0- (et non 1+:3- comme avec les vecteurs ARS).
La présente invention concerne également un ADN comportant une séquence centromérique génétiquement liée à une séquence ARS tel qu'il a été défini plus haut, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des séquences télomères à ses extrémités. En effet, l'insertion de séquences centromériques dans un chromosome doit conduire à la formation de chromosomes dicentriques connus pour être instables, qui doivent se casser à la mitose et être perdus. Certains cependant, à la suite d'un cycle cassure-fusion, peuvent être stabilisés par l'addition de télomères. On observe alors une disparition du chromosome initial et apparition de nouveaux minichromosomes linéaires, stabilisés par l'adjonction de télomères de ciliés aux extrémités libres. Des minichromosomes entièrement artificiels peuvent aussi être créés in vitro, en assemblant télomères, centromères, ARS et marqueur de sélection, plus toute séquence d'ADN souhaitable. Sur des minichromosomes de petite taille ((50 kb), la fonction centromérique est partiellement éteinte, autorisant un accroissement du nombre de copies de plasmides dans les cellules transformées.
La présente invention se rapporte également à un ADN comportant une séquence centromérique tel qu'il a été défini précédemment et caractérisé en ce qu'il comporte une séquence appartenant au génôme de
Y. lipolytica, et en ce que cette séquence est modifiée.
Y. lipolytica, et en ce que cette séquence est modifiée.
C'est ainsi que l'on pourra cribler des gènes mutants chez Y.
lipolytica par l'utilisation de plasmides échangeables, fondés sur l'incom
patibilité de vecteurs CEN entre eux.
patibilité de vecteurs CEN entre eux.
La présente invention se rapporte également à un ADN présentant l'une des structures décrites précédemment, caractérisé en ce qu'il comporte, dans une région adjacente à la séquence centromérique, une séquence permettant son insertion dans un site d'un chromosome de Y.
lipolytica.
Des plasmides de ce type permettent de cibler la fragmentation de chromosome en des sites précis, permettant entre autres de localiser physiquement un gène sur un chromosome.
On pourra donc constituer une carte génétique de Y. lipolytica grâce à la création de souche portant des centromères marqués.
Dans les exemples qui suivent, on se référera au figures ci-annexées qui représentent
FIGURE 1 : Substitution d'une copie chromosomique sauvage par un
gène délété créé in vitro. Le plasmide pINA270 est liné
arisé par NotI
FIGURE 2 : Définition des régions ARS18 et ARS68 et de leurs régions
adjacentes. Les fragments indiqués ont été clonés dans un
vecteur LEU2 et essayés pour leur aptitude à transformer la
levure de façon intégrative (S) ou réplicative (U). Les
tailles sont exprimées en kb. Les enzymes utilisés sont AccI
(A), BstBI (B), BamHI (Ba), BglII (Bg), EcoRV (ex), HindIII
(H), Sau3A (S), TaqI(T) et XbaI (X).
FIGURE 1 : Substitution d'une copie chromosomique sauvage par un
gène délété créé in vitro. Le plasmide pINA270 est liné
arisé par NotI
FIGURE 2 : Définition des régions ARS18 et ARS68 et de leurs régions
adjacentes. Les fragments indiqués ont été clonés dans un
vecteur LEU2 et essayés pour leur aptitude à transformer la
levure de façon intégrative (S) ou réplicative (U). Les
tailles sont exprimées en kb. Les enzymes utilisés sont AccI
(A), BstBI (B), BamHI (Ba), BglII (Bg), EcoRV (ex), HindIII
(H), Sau3A (S), TaqI(T) et XbaI (X).
FIGURE 3 : Plasmides pINA242 et pINA450. Les sites XhoI utilisés pour
le ciblage chromosomique sont soulignés.
le ciblage chromosomique sont soulignés.
FIGURE 4 : Analyse de 13 clones stables après intégration d'ARS 18.
Seul le clone 3 résulte d'une conversion.
FIGURE 5 : Séparation en électrophorèse en champs pulsés des
chromosomes de la souche reveveuse INAG33122 (MatB, leu
2-35, lys 2-5, scpr2) et de deux intégrants obtenus avec
pINA176 ou pINAl 19. La bande supplémentaire est indiquée
par #,l la position des chromosomes par #
En 1 et 2 : transformants. En 3 : souche receveuse
En 4 : témoin S. pombe; En 5 : S. cerevisiae
FIGURE 6 : Plasmide de délétion d'ARS18. La région flanquant ARS18
est représentée en pointillé. P et sp représentent les sites
PstI et SphI utilisés pour la transformation.Les enzymes
utilisées sont EcoRI (E), ClaI (C), HindIII (H), XhoI (X), BglII
(G), BamHI (B) et SalI (S)
FIGURE 7 : Analyse des transformants obtenus avec ARS68 LEU2 et
ARS18 URA3
FIGURE 8 : Création de plasmides dicentriques par recombinaison in
vivo. Après digestion par HindIII, les tailles attendues en kb
sont, pour pINA386 : 9,1 ; pour pINA3lî : 4,8 ; 5,6 ; pour
pINA447 : 2,9 ; 4,8 ; 12,5.
chromosomes de la souche reveveuse INAG33122 (MatB, leu
2-35, lys 2-5, scpr2) et de deux intégrants obtenus avec
pINA176 ou pINAl 19. La bande supplémentaire est indiquée
par #,l la position des chromosomes par #
En 1 et 2 : transformants. En 3 : souche receveuse
En 4 : témoin S. pombe; En 5 : S. cerevisiae
FIGURE 6 : Plasmide de délétion d'ARS18. La région flanquant ARS18
est représentée en pointillé. P et sp représentent les sites
PstI et SphI utilisés pour la transformation.Les enzymes
utilisées sont EcoRI (E), ClaI (C), HindIII (H), XhoI (X), BglII
(G), BamHI (B) et SalI (S)
FIGURE 7 : Analyse des transformants obtenus avec ARS68 LEU2 et
ARS18 URA3
FIGURE 8 : Création de plasmides dicentriques par recombinaison in
vivo. Après digestion par HindIII, les tailles attendues en kb
sont, pour pINA386 : 9,1 ; pour pINA3lî : 4,8 ; 5,6 ; pour
pINA447 : 2,9 ; 4,8 ; 12,5.
EXEMPLE 1: OBTENTION DE SOUCHES ISOGENIQUES PORTANT DES
MARQUEURS STABLES UTILISABLES EN TRANSFOR
MATION.
MARQUEURS STABLES UTILISABLES EN TRANSFOR
MATION.
L'analyse de trétrades suppose l'utilisation de souches donnant une bonne fréquence de germination des spores et une ségrégation régulière à la méiose. Ceci n'est le cas actuellement que pour quelques souches de Y. lipolytica résultant d'un programme d'isogénisation ; ces souches ne portent pas de marqueurs utilisables en transformation et il n'est pas souhaitable pour des raisons évidentes de les soumettre à un cycle de mutagénèse. I1 serait cependant désirable d'y introduire de tels marqueurs, de préférence des délétions connues construites in vitro. Nous avons construit de telles souches par transformation comme décrit ci-après.
Nous avons précédemment décrit la création de la souche E105 par introduction d'un marqueur ura3-302 dans la souche AHa issue d'un programme d'amélioration génétique à l'aide d'un vecteur de disruption pINA302 (exprimant l'invertase de S. cerevisiae, EPA 90401503-9). Nous décrivons ici une stratégie alternative permettant de générer par transformation des souches portant une mutation définie. Cette stratégie est comme on le verra généralisable à tout marqueur pour lequel on dispose du gène sauvage clone.
La souche E105 (MatA, his-l, ura3-302) a été croisée avec une souche isogénique Ahd (MatB, lysi 1-23) et, après sporulation du diploïde, une souche Exil9 (MatB, lyslî-23, ura3-302) a été isolée.
Cette souche a été transformée par intégration du plasmide pINA270 (voir figure 1) ciblé au locus LEU2 par digestion par l'enzyme
NotI. pINA270 dérive du plasmide pINA62 (Gaillardin et Ribet (1987) Curr.
NotI. pINA270 dérive du plasmide pINA62 (Gaillardin et Ribet (1987) Curr.
Genet. 11, 369-375) par digestion StuI et religation du plasmide sur lui-même, créant ainsi une délétion de 682 pb dans la partie codante du gène LEU2. Le fragment HindIII-BamHI de 1489 pb de pINA156 (EPA89401556-9) portant le gène URA3 a été inséré ensuite entre les sites
HindIII et BamHI de ce plasmide pour générer pINA270.
HindIII et BamHI de ce plasmide pour générer pINA270.
L'intégration de ce vecteur au locus LEU2 de AHa génère une duplication imparfaite de LEU2 flanquant le plasmide. L'excision de ce plasmide par un évènement de recombinaison homologue entre les régions dupliquées peut -ou non- laisser en place la copie délétée du gène LEU2 (voir figure 1). Cette excision rend la souche Ura-. Chez S. cerevisiae, les souches ura3- sont connues pour être résistantes à l'acide 5-fluoroorotique (5FOA), un composé toxique pour les souches sauvages parce que converti en 5-fluoroUMP par le produit du gène URA3+ (Boeke et al. (1984) Mol.
Gen. Genet. 197, 345-346). Nous avons établi que la souche Ura+ AHd était effectivement incapable de croître sur un milieu minimum contenant du glucose (10 g/l), du Yeast Nitrogen Base Difco (7,5 g/l), de la lysine (100 mu/1), de l'uracile (15 mu/1) et du 5FOA (1, 25 g/l), tandis que la souche Ura-El 19 poussait normalement sur ce milieu. Si on étale jusqu'à 106 cellules de la souche Eu 19 transformée par pINA270 sur ce même milieu supplémenté en leucine (200 mg/1), cette souche Ura+ est inhibée par le 5-FOA ; une centaine de clones résistants apparaissent cependant après 3 jours.Après purification, ces clones se sont avérés Ura-, 50% d'entre eux étant de plus Leu-. Par analyse de Southern, on peut démontrer que tous ces clones résultent d'une excision du vecteur telle que décrite sur la figure 1. Les clones Leu- en particulier portent maintenant la délétion leu2-270, facilement détectable par une digestion SalI de l'ADN génomique suivie d'une hybridation avec une sonde LEU2 : la bande sauvage de 5 kb environ est remplacée par une bande de 4,3 kb environ. Une souche MatB, lysll-23, ura3-302, leu2-270 a été sauvegardée sous le nom de E122.
La souche E122 a été recroisée par AHa et, après sporulation du diploïde, des souches isogéniques MatA, his-i, ura3-302, leu2-270 ont été isolées. Ces souches ont été criblées pour leur aptitude à la transformation à l'aide d'un vecteur pINA62 linéarisé par NotI, et la souche 22301-3 a été sauvegardée. La présence des délétions ura3-302 et ieu2-270 dans cette souche a été confirmée par analyse de Southern.
Ce même procédé nous a en particulier permis de créer des dérivés de ces souches ou de souches équivalentes, portant des délétions dans les gènes de la protéase exocellulaire (gène XPR2) ou dans des gènes essentiels (gènes de l'ARN 7S SCR1 ou SCR2).
EXEMPLE 2 DEFINITION DE REGIONS ADJACENTES A ARS18 ET A
ARS68 UTILES POUR LE CIBLAGE CHROMOSOMIQUE.
ARS68 UTILES POUR LE CIBLAGE CHROMOSOMIQUE.
Nous avons précédemment démontré que la région nécessaire au maintien extrachromosomique d'ARS18 correspondait à un fragment
BamHI-Sau3A de 1,3 kb entièrement séquencé (EP 0329501). Un fragment adjacent BamHI-BglII (figure 2) ne donne par contre lieu qu'à des intégrations chromosomiques.
BamHI-Sau3A de 1,3 kb entièrement séquencé (EP 0329501). Un fragment adjacent BamHI-BglII (figure 2) ne donne par contre lieu qu'à des intégrations chromosomiques.
Par délétions successives du fragment d'ADN de 6,6 kb portant
ARS68, nous avons également défini un fragment BamHI-BglII capable de maintenir des plasmides portant le gène LEU2 à l'état extrachromosomique présent dans pINA386, voir figure 2), tandis que le fragment BamHI-BglII adjacent (présent dans pINA242) en était incapable et donnait à basse fréquence des transformants stables (voir figure 2).
ARS68, nous avons également défini un fragment BamHI-BglII capable de maintenir des plasmides portant le gène LEU2 à l'état extrachromosomique présent dans pINA386, voir figure 2), tandis que le fragment BamHI-BglII adjacent (présent dans pINA242) en était incapable et donnait à basse fréquence des transformants stables (voir figure 2).
Des expériences précédentes nous avaient démontré qu'il était très difficile d'intégrer dans le génôme des plasmides portant ARS18 ou
ARS68 (voir aussi l'exemple 4). Nous avons voulu tester si les régions adjacentes aux ARS définies ci-dessus étaient capables de cibler un plasmide au voisinage d'ARS18 ou d'ARS68. Pour cela le fragment BamHI-BglII de 2,8 kb de pINAll9 a été introduit dans un plasmide portant le gène URA3 de Y. lipolytica : le plasmide résultant, pINA450 porte une région adjacente à ARS18 (voir figure 3). Le plasmide pINA242 précédemment mentionné porte une région adjacente à ARS68 (voir figures 2 et 3).
ARS68 (voir aussi l'exemple 4). Nous avons voulu tester si les régions adjacentes aux ARS définies ci-dessus étaient capables de cibler un plasmide au voisinage d'ARS18 ou d'ARS68. Pour cela le fragment BamHI-BglII de 2,8 kb de pINAll9 a été introduit dans un plasmide portant le gène URA3 de Y. lipolytica : le plasmide résultant, pINA450 porte une région adjacente à ARS18 (voir figure 3). Le plasmide pINA242 précédemment mentionné porte une région adjacente à ARS68 (voir figures 2 et 3).
Ces plasmides ne portent pas, dans les régions adjacentes aux
ARS, de site unique utilisable pour le ciblage chromosomique lors d'une transformation intégrative. Ils portent par contre chacun 3 sites XhoI, 2 dans les gènes marqueurs (URA3 ou LEU2) et 1 dans le fragment adjacent aux ARS. Après digestion ménagée par l'enzyme XhoI, les formes linéaires de chacun de ces plasmides ont été isolées. pINA450 a servi à transformer
E122 (sélection Ura+) et pINA242 a servi à transformer 22301-3 (sélection
Leu+). Dans ces souches qui portent une délétion des allèles URA3 et LEU2, les plasmides ouverts par XhoI au niveau des gènes marqueurs ne peuvent s'intégrer par homologie et transformeront à basse fréquence ; les plasmides ouverts par XhoI au niveau des régions adjacentes aux ARS doivent au contraire transformer à Haute fréquence si leur intégration est stable.Plus de 1000 transformants Ura+ ou Leu+ ont été obtenus : par analyse de Southern, on peut démontrer que la majorité d'entre eux (18 sur 18 testés) contiennent bien les vecteurs intégrés aux loci ARS18 et ARS68.
ARS, de site unique utilisable pour le ciblage chromosomique lors d'une transformation intégrative. Ils portent par contre chacun 3 sites XhoI, 2 dans les gènes marqueurs (URA3 ou LEU2) et 1 dans le fragment adjacent aux ARS. Après digestion ménagée par l'enzyme XhoI, les formes linéaires de chacun de ces plasmides ont été isolées. pINA450 a servi à transformer
E122 (sélection Ura+) et pINA242 a servi à transformer 22301-3 (sélection
Leu+). Dans ces souches qui portent une délétion des allèles URA3 et LEU2, les plasmides ouverts par XhoI au niveau des gènes marqueurs ne peuvent s'intégrer par homologie et transformeront à basse fréquence ; les plasmides ouverts par XhoI au niveau des régions adjacentes aux ARS doivent au contraire transformer à Haute fréquence si leur intégration est stable.Plus de 1000 transformants Ura+ ou Leu+ ont été obtenus : par analyse de Southern, on peut démontrer que la majorité d'entre eux (18 sur 18 testés) contiennent bien les vecteurs intégrés aux loci ARS18 et ARS68.
EXEMPLE 3 : SEGREGATION DES LOCI ARS18 ET ARS68.
Les souches transformées E122/pINA450 et 22301-3/pINA242 ont été croisées et on a isolé sur milieu minimum le diploïde D224
MatA ura3-302 leu2-270 ARS18 : URA3 ARS68 his-l +
MatB ura3-302 leu2-270 ARS18 Ars68 : LEU2 + lys 1-23
Après sporulation, 38 tétrades ont été disséquées. Les résultats suivants ont été obtenus (tableau 1).
MatA ura3-302 leu2-270 ARS18 : URA3 ARS68 his-l +
MatB ura3-302 leu2-270 ARS18 Ars68 : LEU2 + lys 1-23
Après sporulation, 38 tétrades ont été disséquées. Les résultats suivants ont été obtenus (tableau 1).
TABLEAU 1
Analyse de tétrades
Couples de marqueurs DP DR TT
LEU2-URA3 14 24 0 LEU2-LYS11 10 5 23
LEU2-HIS 1 8 7 23
URA3-LYS 11 9 7 22
URA3-HIS 1 6 9 23 LYSîl-HISi 9 8 21
On constate que tous les couples de marqueurs testés présentent une ségrégation de type lDP: 1DR : 2TT sauf le couple
LEU2-URA3 marquant ARS68-ARS 18 pour lequel aucun tétratype n'est observé. Ces résultats démontrent que ARS68 et ARS18 sont étroitement liés à des centromères différents (DP=DR).
Analyse de tétrades
Couples de marqueurs DP DR TT
LEU2-URA3 14 24 0 LEU2-LYS11 10 5 23
LEU2-HIS 1 8 7 23
URA3-LYS 11 9 7 22
URA3-HIS 1 6 9 23 LYSîl-HISi 9 8 21
On constate que tous les couples de marqueurs testés présentent une ségrégation de type lDP: 1DR : 2TT sauf le couple
LEU2-URA3 marquant ARS68-ARS 18 pour lequel aucun tétratype n'est observé. Ces résultats démontrent que ARS68 et ARS18 sont étroitement liés à des centromères différents (DP=DR).
EXEMPLE 4: L'INTEGRATION D'ARS18 AU LOCUS LEU2 ENTRAINE UNE
CASSURE DES CHROMOSOMES.
CASSURE DES CHROMOSOMES.
Si le fragment BamHI-Sau3A portant ARS18 porte une fonction centromérique complète, son intégration doit générer un chromosome dicentrique instable.
3 plasmides ont été utilisés : pINA176, pINA232 et pINAil9 (voir figure 2) qui portent ARS18 et LEU2. Ils ont été digérés comme précisés ci-après et introduits dans une souche leu2-.
En digérant pINA232 par BamHI qui ne coupe qu'une fois dans ce plasmide, on dirige l'intégration au locus ARS18. Les fréquences de transformation sont aussi élevées qu'avec le plasmide non coupé (tableau 2) et la moitié des transformants sont instables : après 10 générations en milieu non sélectif, des clones Leu-apparaissent. Les clones instables résultent probablement d'une religation du plasmide sur lui-même in vivo.
Les clones stables ont été analysés par la technique de Southern avec une sonde ARS18. Deux types d'évènements sont attendus
1- une conversion de l'allèle leu2- vers LEU2+ sans
intégration du vecteur, générant une seule bande en
Southern correspondant au locus ARS18 résident, de 12 kb
après une digestion par l'enzyme EcoRI ou de 2,15 kb après
une digestion par BamHI.
1- une conversion de l'allèle leu2- vers LEU2+ sans
intégration du vecteur, générant une seule bande en
Southern correspondant au locus ARS18 résident, de 12 kb
après une digestion par l'enzyme EcoRI ou de 2,15 kb après
une digestion par BamHI.
2- une intégration du plasmide par recombinaison
homologue au locus ARS18 ce qui, si le chromosome
résultant est viable, générera une duplication d'ARS18
visualisée par deux bandes EcoRI (13 et 6 kb) et deux
bandes BamHI (11 et 2,5 kb).
homologue au locus ARS18 ce qui, si le chromosome
résultant est viable, générera une duplication d'ARS18
visualisée par deux bandes EcoRI (13 et 6 kb) et deux
bandes BamHI (11 et 2,5 kb).
TABLEAU 2
Cible Plasmide Fréquence de Nombre de Nombre de Conclusion
transformation clones analysés clones stables d'après Southern
ARS18 pINA232/BamHI 19 400 50 20 (40%) 1 conversion LEU2
19 intégrations du
plasmide à ARS18
ARS18 pINA176/BstBI 70 5 1 (20%) 1 conversion LEU2
LEU2 pINA176/Xhol 840 21 1 (5%) 1 intégration du
plasmide à LEU2
LEU2 pINA119/Apal 4 000 20 3 (19%) 2 conversions LEU2
1 intégration du
plasmide à LEU2
Sur la figure 4, on voit que sur 13 clones stables étudiés, 12 résultent d'une intégration à ARS18, 1 résulte d'une conversion (clone 3). I1 semble donc que la présence de 2 séquences CEN répétées en tandem à 9,2 kb de distance soit tolérée par le chromosome.On peut remarquer que chez
S. cerevisiae des chromosomes portant deux centromères séparés de quelques kb- sont stables pendant plusieurs générations, mais qu'ils sont rapidement cassés si la distance qui les sépare dépasse 40 kb (Haber et al.
Cible Plasmide Fréquence de Nombre de Nombre de Conclusion
transformation clones analysés clones stables d'après Southern
ARS18 pINA232/BamHI 19 400 50 20 (40%) 1 conversion LEU2
19 intégrations du
plasmide à ARS18
ARS18 pINA176/BstBI 70 5 1 (20%) 1 conversion LEU2
LEU2 pINA176/Xhol 840 21 1 (5%) 1 intégration du
plasmide à LEU2
LEU2 pINA119/Apal 4 000 20 3 (19%) 2 conversions LEU2
1 intégration du
plasmide à LEU2
Sur la figure 4, on voit que sur 13 clones stables étudiés, 12 résultent d'une intégration à ARS18, 1 résulte d'une conversion (clone 3). I1 semble donc que la présence de 2 séquences CEN répétées en tandem à 9,2 kb de distance soit tolérée par le chromosome.On peut remarquer que chez
S. cerevisiae des chromosomes portant deux centromères séparés de quelques kb- sont stables pendant plusieurs générations, mais qu'ils sont rapidement cassés si la distance qui les sépare dépasse 40 kb (Haber et al.
(1984) Genetics 106, 207-226). Alternativement, on peut penser que le fragment portant ARS18 ne porte pas une fonction centrométrique complète.
Nous avons donc essayé d'intégrer ARS18 au locus LEU2 qui n est pas a priori lié à un centromère. pINA176 et pINAll9 ont été digérés par XhoI ou ApaI qui linéarisent ces plasmides au niveau d'ARS18. On observe (tableau 2) une chute de la fréquence de transformation et une faible fréquence de clones stables. 4 clones stables ont été analysés comme précédemment, on observe 2 conversions et 2 intégrations, l'une avec pINA176, l'autre avec pINAl 19. Dans ces deux derniers cas, la structure du plasmide intégré n'apparaît pas remaniée. Les chromosomes de ces deux intégrants ont été séparés par électrophorèse en champs pulsés (technique
FIGE) en parallèle à ceux de la souche receveuse. Cette technique fait apparaître pour celle-ci 4 chromosomes, de taille intermédiaire entre ceux de S. cerevisiae et ceux de S. pombe (voir la figure 5). Dans le cas des deux transformants étudiés, on voit clairement apparaître une bande chromosomique supplémentaire. Cette bande hybride à une sonde ARS18.
FIGE) en parallèle à ceux de la souche receveuse. Cette technique fait apparaître pour celle-ci 4 chromosomes, de taille intermédiaire entre ceux de S. cerevisiae et ceux de S. pombe (voir la figure 5). Dans le cas des deux transformants étudiés, on voit clairement apparaître une bande chromosomique supplémentaire. Cette bande hybride à une sonde ARS18.
L'ensemble de ces résultats démontre que le fragment
BamHI-Sau3A de 1,3 kb présent dans pINA176 et pINAl l9 porte une fonction centrométrique complète en plus de la fonction ARS. I1 en va de même pour le fragment BamHl-BglII de 2,3 kb portant ARS68.
BamHI-Sau3A de 1,3 kb présent dans pINA176 et pINAl l9 porte une fonction centrométrique complète en plus de la fonction ARS. I1 en va de même pour le fragment BamHl-BglII de 2,3 kb portant ARS68.
EXEMPLE 5 : DISRUPTION D'ARS18 DANS LE CHROMOSOME.
La disruption d'un centromère chez S. cerevisiae conduit à la formation d'un chromosome acentrique instable qui est rapidement perdu.
Cet évènement est létal dans un haploïde et ne se détecte que par une forte baisse de la fréquence de transformation observée avec les vecteurs de disruption (en fait seuls les évènements de conversion sont observés).
Dans un diploîde, si un seul des deux centromères homologues est détruit, la souche devient rapidement monosomique.
Le plasmide de disruption d'ARS18, pINA293, a été construit comme suit (figure 6). Le fragment central BamHI portant ARS18 dans pINAll9 a été remplacé par un fragment d'ADN portant LEU2. Le plasmide pINA293 a été digéré par PstI et SphI et le fragment portant LEU2 a été purifié. Ce fragment, où LEU2 est flanqué par 1,8 kb et 0,5 kb de séquences adjacentes à ARS18, a été introduit dans une levure haploïde leu2- ou dans un diploïde homozygote leu2-/leu2-.
Le faible fréquence de transformation (300 clones Leu+ par llg d'ADN transformant) a été observée avec la souche haploïde. 21 clones
Leu+ ont été analysés par la technique de Southern : tous résultaient d'une conversion de leu2- vers LEU2+ sans qu'il y ait eu remplacement chromosomique d'ARS18. On en déduit que la délétion d'ARS18 est probablement létale dans l'haploïde.
Leu+ ont été analysés par la technique de Southern : tous résultaient d'une conversion de leu2- vers LEU2+ sans qu'il y ait eu remplacement chromosomique d'ARS18. On en déduit que la délétion d'ARS18 est probablement létale dans l'haploïde.
Une fréquence plus élevée (3000 clones Leu+/,ug d'ADN) a été observée avec la souche diploïde ; cette fréquence reste inférieure à celle observée avec un plasmide témoin au cours de la même expérience (18000 clon es Leu+/ug d'ADN). De plus les transformants apparaissent après 4 à 8 jours d'incubation, contre 3 à4 jours avec le plasmide témoin. Ceci suggère que les souches portant une disruption de ARS18 dans le chromosome présentent une croissance ralentie, peut être due à un chromosome instable.
La perte du chromosome acentrique se traduisant par un phénotype Leu-, il est possible que des évènements secondaires de conversion de Leu2- vers
LEU2+ aient lieu à basse fréquence dans les colonies instables et régénèrent des sous-clones Leu+ stables. Tous les clones analysés en
Southern résultaient d'une conversion de leu2.
LEU2+ aient lieu à basse fréquence dans les colonies instables et régénèrent des sous-clones Leu+ stables. Tous les clones analysés en
Southern résultaient d'une conversion de leu2.
Ces résultats sont compatibles avec l'hypothèse d'un rôle essentiel de la séquence ARS18 dans le maintien du chromosome.
EXEMPLE 6: SEGREGATION METOTIQUE DE VECTEURS ARS18.
Les plasmides ARS sont très instables chez S. cerevisiae et sont le plus souvent perdus à la méiose donnant des tétrades 0+:4- ou 1+:4préférentiellement. Au contraire les plasmides ARS-CEN chez cet organisme ségrègent préférentiellement comme des minichromosomes 2+:2ou 4+:0- (s'il y avait 2 copies ou plus du vecteur dans la cellule mère de la tétrade).
Pour tester le comportement en méiose de vecteurs portant des centromères chez Y. lipolytica, on a introduit un plasmide ARS18-LEU2 dans un diploïde pro-l/+, ura3/+, leu2-35/leu2-35. La viabilité des spores étant mauvaise, 2 tétrades complètes seulement ont été obtenues. Les ségrégations Leu+:Leu- observées étaient de 2+:2- et 4+:4-. Par analyse en masse, les rapports +:- suivants ont été observés : 20:12 pour LEU2, 19:13 pour URA3, 18:14 pour PRO-I. Ceci démontre que les plasmides centromériques ségrègent comme des marqueurs mendéliens et qu'ils ont donc chez Y. lipolytica les propriétés d'un minichromosome.
EXEMPLE 7 : COMPATIBILITE DE VECTEURS CENTROMERIQUES.
Une série de plasmides CEN a été construite. Ces plasmides contiennent le fragment BamHI-Sau3A de 1,3 kb portant ARS18 et CEN associé à un marqueur LEU2 ou URA3 (pINA176 et pINA311), ou le fragment BamHI-BgiII portant ARS68 et CEN associé à ces mêmes marqueurs (pINA386 et pINA443).
Dans une première série d'expériences, des souches ura3, leu2 ont été transformées par un plasmide ARS18-LEU2, ARS18-URA3 ou
ARS68-URA3. Ces plasmides ont une stabilité équivalente. Ces souches ont été ensuite surtransformées par des plasmides ARS portant l'autre marqueurs. Les transformants ont été sélectionnés pour la présence du nouveau (plasmide entrant) sur un milieu autorisant par ailleurs la perte du premier plasmide (plasmide résident) (voir tableau 3). Les transformants sont ensuite testés pour la présence du plasmide résident. On constate que dans près de la moitié des cas le plasmide entrant a chassé le plasmide résident.
ARS68-URA3. Ces plasmides ont une stabilité équivalente. Ces souches ont été ensuite surtransformées par des plasmides ARS portant l'autre marqueurs. Les transformants ont été sélectionnés pour la présence du nouveau (plasmide entrant) sur un milieu autorisant par ailleurs la perte du premier plasmide (plasmide résident) (voir tableau 3). Les transformants sont ensuite testés pour la présence du plasmide résident. On constate que dans près de la moitié des cas le plasmide entrant a chassé le plasmide résident.
TABLEAU 3
Chasse de plasmides par transformation
Plasmide Plasmide Sélection Nombre de Auxotrophes résident entrant sur clones testés ARS18LEU2 ARS18URA3 YNBleu 235 60% Leu
ARS68URA3 YNBleu 288 71% Leu
ARS18URA3 ARS18LEU2 YNBura 1032 50% Ura
ARS68URA3 ARS18LEU2 YNBura 1064 45% Ura
Dans une seconde série d'expériences, nous avons analysé la stabilité des transformants qui avaient conservé les plasmides entrant et résident. Comme on le voit sur le tableau 4, les plasmides ARS18-URA3 ou
ARS68-URA3 sont préférentiellement chassés par les plasmides ARS18-
LEU2 et leur instabilité mitotique (exprimée en pourcentage de perte par génération) devient très élevée, de l'ordre de celle des plasmides ARS ches
S. cerevisae.L'origine de cet effet de marqueur est inconnue. Ces résultats démontrent que les plasmides ARS-CEN sont peu compatibles chez Y.
Chasse de plasmides par transformation
Plasmide Plasmide Sélection Nombre de Auxotrophes résident entrant sur clones testés ARS18LEU2 ARS18URA3 YNBleu 235 60% Leu
ARS68URA3 YNBleu 288 71% Leu
ARS18URA3 ARS18LEU2 YNBura 1032 50% Ura
ARS68URA3 ARS18LEU2 YNBura 1064 45% Ura
Dans une seconde série d'expériences, nous avons analysé la stabilité des transformants qui avaient conservé les plasmides entrant et résident. Comme on le voit sur le tableau 4, les plasmides ARS18-URA3 ou
ARS68-URA3 sont préférentiellement chassés par les plasmides ARS18-
LEU2 et leur instabilité mitotique (exprimée en pourcentage de perte par génération) devient très élevée, de l'ordre de celle des plasmides ARS ches
S. cerevisae.L'origine de cet effet de marqueur est inconnue. Ces résultats démontrent que les plasmides ARS-CEN sont peu compatibles chez Y.
lipolytica.
TABLEAU 4
Coexistence de plasmides CEN
Plasmides coexistant Perte du plasmide par génération
1 2 1 2 ARS18LEU2 ARS18URA3 3% 14% ARS 18LEU2 ARS68URA3 0,4% 30%
EXEMPLE 8 : STABILITE DE PLASMIDES DICENTRIQUES.
Coexistence de plasmides CEN
Plasmides coexistant Perte du plasmide par génération
1 2 1 2 ARS18LEU2 ARS18URA3 3% 14% ARS 18LEU2 ARS68URA3 0,4% 30%
EXEMPLE 8 : STABILITE DE PLASMIDES DICENTRIQUES.
La plupart -des transformants Ura+ Leu+ décrits dans l'exemple 7 ségrègent des clones Leu-Ura+, Leu-Ura- et Leu+ura-. Certains clones cependant ont été observés qui ne ségrégeaient que des Ura-Leu-. La structure des plasmides présents dans ce type de clone a été analysée par la technique de Southern ou après extraction et réisolement dans E. coli.
A titre d'exemple, on examine les transformants obtenus avec
ARS68LEU2 (pINA386) et ARS18URA3 (pINA311) voir les figures 7 et 8).
ARS68LEU2 (pINA386) et ARS18URA3 (pINA311) voir les figures 7 et 8).
Les ADN totaux sont soit non digérés (puits 1 à 7) soit digérés par l'enzyme
HindIII (puits 8 à 15), et révélés par une sonde pBR322. Les poids moléculaires sont estimés à l'aide d'un standard (puits 16, ADN de lambda digéré par HindIII et par HIndIII et EcoRI). Les plasmides témoins pINA386 (puits 6 et 14) et pINA311 (puits 7 et 15) ont des profils identiques à ceux qu'on trouve dans 1'ADN total des transformants de levure par pINA386 (puits 4 et 12) ou pINA311 (puits 5 et 13). Trois clones transformants ou les marqueurs LEU2 ET URA3 coségrègent sont présentés dans les puits 1 à 3 et 8 à 10. On voit que ces clones contiennent un nouveau plasmide, pINA447 dont la taille (20 kb environ) correspond à la somme des tailles de pINA311 et pINA386 (10,4 et 9,4 kb). Le plasmide de 20 kb a été réisolé dans E. coli et sa carte de restriction a été établie (figure 8). Celle-ci montre que pINA447 est un dimère de pINA311+pINA386, résultant probablement d'une recombinaison homologue in vivo entre les deux plasmides ARS.
HindIII (puits 8 à 15), et révélés par une sonde pBR322. Les poids moléculaires sont estimés à l'aide d'un standard (puits 16, ADN de lambda digéré par HindIII et par HIndIII et EcoRI). Les plasmides témoins pINA386 (puits 6 et 14) et pINA311 (puits 7 et 15) ont des profils identiques à ceux qu'on trouve dans 1'ADN total des transformants de levure par pINA386 (puits 4 et 12) ou pINA311 (puits 5 et 13). Trois clones transformants ou les marqueurs LEU2 ET URA3 coségrègent sont présentés dans les puits 1 à 3 et 8 à 10. On voit que ces clones contiennent un nouveau plasmide, pINA447 dont la taille (20 kb environ) correspond à la somme des tailles de pINA311 et pINA386 (10,4 et 9,4 kb). Le plasmide de 20 kb a été réisolé dans E. coli et sa carte de restriction a été établie (figure 8). Celle-ci montre que pINA447 est un dimère de pINA311+pINA386, résultant probablement d'une recombinaison homologue in vivo entre les deux plasmides ARS.
pINA447 représente donc un exemple de plasmide dicentrique structurellement stable dans la levure. Sa stabilité mitotique a été comparée à celle des vecteurs monocentriques. Après 20 générations en milieu non sélectif, pINA311 est perdu dans 12% des clones, pINA386 dans 10% et pINA447 dans 25% des clones de levure. La stabilité des vecteurs dicentriques en mitose est donc moins bonne que celle des monocentriques correspondant.
Claims (9)
1) Séquence centromérique, caractérisée en ce qu'elle est génétiquement liée à une séquence ARS efficace chez Y. lipolytica.
2) Séquence centromérique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est portée par une séquence ARS18 de Y. lipolytica, de 1,3 kb.
3) Séquence centromérique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est portée par une séquence ARS68 de Y. lipolytica, de 2,3 kb.
4) ADN comportant une séquence centromérique selon l'une des revendications 1 à 3.
5) ADN comportant une séquence centromérique selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comporte en outre un promoteur inductible adjacent et contrôlant ladite séquence centromérique.
6) ADN comportant une séquence centromérique selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide comportant en outre des éléments permettant l'expression d'une protéine dans Y. lipolytica et en ce qu'il est maintenu dans une souche de Y.
lipolytica avec un nombre élevé de copies.
7) ADN comportant une séquence centromérique selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des séquences télomères à ses extrémités.
8) ADN selon l'une des revendications 4 à 7, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une séquence appartenant au génome de Y.
lipolytica, et en ce que cette séquence est modifiée.
9) ADN selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce qu'il comporte, dans une région adjacente à la séquence centromérique, une séquence permettant son insertion dans un site d'un chromosome de Y.
lipolytica.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9010337A FR2665908A1 (fr) | 1990-08-14 | 1990-08-14 | Sequence centromerique et adn comportant une telle sequence. |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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FR9010337A FR2665908A1 (fr) | 1990-08-14 | 1990-08-14 | Sequence centromerique et adn comportant une telle sequence. |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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FR2665908A1 true FR2665908A1 (fr) | 1992-02-21 |
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FR9010337A Pending FR2665908A1 (fr) | 1990-08-14 | 1990-08-14 | Sequence centromerique et adn comportant une telle sequence. |
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FR (1) | FR2665908A1 (fr) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US5698686A (en) * | 1994-10-20 | 1997-12-16 | Arch Development Corporation | Yeast telomerase compositions |
FR2782733A1 (fr) * | 1998-09-01 | 2000-03-03 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede de transformation non-homologue de yarrowia lipolytica |
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-
1990
- 1990-08-14 FR FR9010337A patent/FR2665908A1/fr active Pending
Patent Citations (1)
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EP0329501A1 (fr) * | 1988-01-28 | 1989-08-23 | Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) | Séquence ars efficace chez yarrowia lipolytica et procédé pour sa préparation |
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US6387619B1 (en) | 1994-10-20 | 2002-05-14 | Arch Development | Telomerase compositions and methods |
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WO2000012729A1 (fr) * | 1998-09-01 | 2000-03-09 | Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) | PROCEDE DE TRANSFORMATION NON-HOMOLOGUE DE $i(YARROWIA LIPOLYTICA) |
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