JPH0258501A - リポ多糖およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規な低毒性リボ多糖（１４叩０ｐＯ１ｙＳ
ｎＣｃｈａｒｉｄｅ　；以下　ＬＰＳ　　と記す）なら
びにこの新規な低毒性ｒ、　ｐ　ｓを有効成分とするイ
ンターフェロン誘起剤、腫よう壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　
Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｆ、ｏｒ　　以下ＴＮＦと記
す）誘起剤および制癌剤に関する。さらに詳しくは、グ
ラ１１陰性の細菌々体に含有されている低毒性のＬ　Ｐ
　Ｓに関する。このＬ　Ｐ　Ｓはレンチナン、サイクロ
ホスファマイトのような免疫賦活剤と併用すると一層高
い制癌作用を発揮するのみならず、インターフェロンお
よびＴＮＦの誘起能を有し、癌やウィルス感染症などの
治療剤として用いられる。

［従来の技術］ 近年、癌の化学療法のひとつとして、生体が本来もって
いる免疫能を強化することにより癌を異物として認識さ
せて排除して治療する免疫療法に関心が寄せられている
。

そのような機能を有する薬剤として、たとえばカワラタ
ケの菌糸体より熱水抽出された、クレスチン、椎茸より
熱水抽出された免疫賦活機能をもつレンチナン、抗悪性
腫よう溶連菌製剤であるビシバニール、結核菌の生菌ワ
クチンであるＢＣＧ等の免疫賦活剤が知られ、既に臨床
に使用されている。

しかしながら、これらの免疫賦活剤のみでは実用上十分
でなく、この抗腫よう効果を増大させるために、従来の
治療法と併用する併用療法での効果について検討がなさ
れている。たとえば、レンチナンと大腸菌ＬＰｓとを併
用してＣ３）１／Ｈｅマウス鼠径部皮下にＭＭ４６１１
！よう細胞を移植し、移植後１２日１に１回投与し、７
０％ものマウスが完全に治癒するという好成績が得られ
ている（特開昭５６−４６８１８）　。

その他、このＬＰＳと併用することにより併用効果がみ
られるものとして、ポリ！−ポリＣ，ＴＣ１３ＡＳＢ母
マンナンなどが明らかにされている（Ｓ、Ａｂｅ　ｅｔ
　ａｌ、：ＧａｎｎＪ、’３．９１〜９６；Ｆｅｂｒｕ
ａｒｙ、１９８２〉。

−・方、これと平行して免疫担当細胞間の内因性物質で
あるリンホカインとしてたとえば、インターフェロン、
およびｉ’　Ｎ　Ｆなどが注目されてきた。

すなわち、インターフェロンは生体にウィルス感染防書
能を付与する糖蛋白であり、ウィルス粒子、細菌菌体あ
るいはインターフェロンインデューサーなどの刺激によ
って生体が産生ずる物質であり、その作用は抗ウィルス
作用ばかりでなく、抗微生物活性、抗細胞増殖活性、食
細胞のどん食能増強作用を示すことが知られるようにな
った。さらに一部の腫ように対して抗腫よう活性を示す
ことが報告されるにおよんで、ウィルス感染症及び抗腫
よう治療薬として脚光をあび、すでに臨床応用が始めら
れている。　また’ｒ　Ｎ　Ｆは１９７５イＴ’　Ｌ、
Ｊ、０１ｄ等によって発見された分子量的４００００の
糖蛋白であり、マウス、ウサギ等の動物をＢＣＧ、コリ
ネバクテリウノ、　バルバム、ザイモザンなどで一次刺
激し、１０〜１４日後■、ＰＳで二次刺激すると、血中
に産生きれ℃くることは周知のこととなっている。この
ようにして得られた血液の血清を担癌動物に段う・する
と著しい出血壊死を引き起すことから臨床応用が期待さ
れるようになった。しかし、これらを治療薬として用い
る治療方法としては、インターフェロンは大金培養可能
なヒト二倍体細胞にウィルスを作用させ、培地中に放出
されたインターフェロン、あるいは組換えＤＮＡにより
微生物に作らせたインターフェロンを直接患１者に投与
、する方法であり、またＴＮＦの場合は、ウサギなどに
一次および二次刺激を施した後採取した血清、あるいは
適当な動物細胞を培養した培看液などから精製したＴＮ
Ｆを直接患者に投与する方法であり、いずれも外的手段
により製造された該物質を直接患者に投与する方法であ
った。また、ｌ、ＰＳを投う・してインターフェロンや
ＴＮＦを内生させることによりウィルス感染症や癌を治
療するアイデアはあったが、この場合にも従来のＬＰＳ
は毒性が強いためにＩｌ！床に使用することができなか
った。

［発明が解決しようとする問題点］ 従来のＬＰＳは大ｌｌ！菌やサルモネラ菌から得られた
ものであり、これらはは乳動物に対する毒性が強いため
癌の併用また法やインターフェロンあるいは′ｒＮ　ｌ
”の誘起剤として臨床に使用することが′Ｃきなかった
。

［問題点を解決するための手段、作用］木発明者らは、
は乳動物に対する毒性が低く、臨床応用の可能な、癌の
併用療法剤、インターフェロン誘起剤、ＴＮＦ誘起剤を
開発するために研究をかさね、メタノール資化性細菌群
のなかに低奏性のＬ　Ｐ　Ｓを有する菌群が存在し、こ
れらからのり、　ｐ　ｓが毒性が低くかつ、他の免疫賦
活剤と併用することにより強力な制癌作用を発揮し、ま
た、インターフェロンおよびＴＮＦのそれぞれの誘起能
を持つことを見い出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は２−ケト−３−デオキシオクトネー
トを含有せず、は乳動物に対する毒性が低いことを特徴
とする。Ｊ菌々体由来の新規なリボ多糖ならびにこの新
規なリボ多糖を有効成分として含有することを特徴とす
るインターフェロン誘起剤、腫よう壊死因子誘起剤およ
び抗腫よう剤に関するものである。

本発明の新規な低毒性Ｌ　Ｐ　Ｓを含有する菌はグラム
陰性のメタノール資化性細菌であれば特に制限はないが
、代表的な菌株を例示すれば次の通りである。すなわち
、 （ＭＧ−１００９）　：シュードモナス　エクストロク
エンス（Ｐｓｅｕｄｏｎ＋ｏｎａｓ　ｅｘｔｒｏｑｕｅ
ｎｓ）　ＮＣＩＢ９３９９［Ｊ、Ｇｅｎ、Ａｐｐｌ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２５．３４３（１９７９）参照
コ （’ＩＧ−１０２１）　ニブロタミノバクター　ルーバ
ー（Ｐｒｏｔａ細菌ｎｏｂａｃｔｅｒ　ｒｕｂｅｒ）　
　ＮＣｌ８２８７９［Ｊ、Ｇｅｎ、　Ａｐｐｌ、Ｍｉｃ
ｒｏｂｔｏｌ、、　２５．、３４３（１９７９）参照］ （呂Ｇ−１０２３）：シュードモナス　エスピー（Ｐｓ
ｅｕｄｏｎｏｎａｓ　ｓｐ、）　　ＮＣＩＢ９６８６［
８ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　９２，６０９　（１９６４）
参照］（ＭＧ−１０３９）：メチロモナス　メタノリカ
（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ
）　ＮＲＲｌ、　Ｂ−５４５８［Ｐｒｏｃ、４ｔｈ　Ｉ
Ｆｓ：Ｆｅｒｍｅｎｔ、Ｔｅｃｈｎｏｌ’ｒｏｄａｙ　
、　ｐ４９７（１９７２）　参照］（’ＩＧ−１０９０
）：シュードモナス　メチロトロファ（１’Ｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｍｃｔ、ｈｙｌｏｔｒｏｐｈａ）　ＮＣ１
［０５１／Ｉ［ｌ’ｒｏｃ、　Ｉｎｔ、ｓｙｍｐ、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ　、Ｇｒｏｗｔｈｏｎ　　Ｃ３−Ｃｏｍ
ｐｄ、　ｐ、２３（１９７５）、特公昭５５−１０３８
容照］ （ＭＧ−１０９１）　：シュードモナス　メチロトロフ
ァ（ｆ’ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　　ｍｅｔｈｙｌｏｔ
ｒｏｐｈａ）ＮＣＩＢＩＯ５９２［Ｉ’ｒｏｃ、　Ｉｎ
ｔ、Ｓｙｍｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｇｒｏｗｔｈｏｎ
　Ｃ１−Ｃｏｍｐｄ、　ｐ、２３　（１９７５）、特公
昭５５−１０３８参照］ （ＭＧ−１１０５）　：ミクロチクルス　アクアチフス
（Ｍｉｃｒｏｃｙｃｌｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）　　
ＡＴＣＣ２５３９６［Ｊ、Ｇｅｎ、八ｐｐ１．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏ１．．　２５．　３４３（＋９７９）参照コお
よび （ＭＧ−１２８４）：バラコツカス　デニトリフィカン
ス（１’ａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａ
ｎｓ）ＩＦＯ］３３０１［ｌｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、＋９，３７５（１９６９）参ｎ、！ｊ
コ などが挙げられる。

なお、前記の菌株名の中の（ＭＧ−）は発明者らの所有
している菌株の番号を示す。

（＋）１．、ＰＳの調製 これらの低毒性Ｌ　Ｐ　Ｓ生産菌から、たとえば、ン欠
のようにしてイ氏毒性Ｌ　Ｐ　Ｓが得られる。

■低毒性ｔ、　ｐ　ｓ生産菌の培養 低毒性［、ＰＳ生産菌であるメタノール資化性細菌の培
養法は、それ自体公知のメタノール資化性細菌の培養法
であればよく、とくに制限はないが、実用上、たとえば
特開昭５４−１１７９０．特開昭５４−１２９１８２、
特公昭５３−６２７７、特公昭５６−：３５１５などに
開示された方法によって培養される。すなわち、つぎに
示す組成の培地を用いて培養を行う。

（ＮＨ４）２５０４　　　　３　　　ｇＫｌ１２ＰＯ４
］　、４　３ Ｎｓ２ＰＯ４２，１ｇ ’１．５（＋４・７１１，２０　　　　０．２　　：Ｃ
ａＣｌ２−２８２０　　　３０　　　ｍｇＦｃＣ（、ｌ
ｌｒ、（１７・Ｘ１１２０　　３０　　　ｍ３Ｍ、Ｃ１
２・４８２０　　　　５　　　ｍｇＺ、５（１４・７）
１２０　　　　５　　　ｍｇ。

ＣｕＳＯ４・５１１２０　　　　　０．５　　ｍ３ビタ
ミン混合液　　１　　　ｍｌ メタノール　　　１０　　　名 純水　　　　　　　ｌ ｒ＋８７．０ なお、前記の培地においてビタミン混合液のＮ月収は、
蒸溜水あるいは純水１１中にビオチン２０μｇ、パント
デン故カルシウｌｘ　４ｍ３、菓酸２０７ｔ２、イノシ
トール２０ｍ８、ニコチン酸４ｍｚ、ピリドキシン塩故
塩４Ｂ、チアミンｊｈ酸坦４＋Ｂ、パラ−アミノ安息香
ＦＡＩＬ　２”Ｓ：、リボフラビン２Ｂを添加したもの
である。

培養ζこ使用する培地は、前記のようなメタノールを主
たる炭對源とするものが好ましいが、メタノール以外の
たとえば、グルコースのような糖質を資化できる細菌の
場合にはメタノール以外の資化できる炭素源を使用する
こともできる。メタノールを炭溺源として用いる場合に
は、培養法中のメタノール濃度は６重りＩ以下が好まし
く、菌の生育の良好さからは２重ＭＺ以下であることが
好ましい、窒素源としては、例えばアンモニウノ、塩、
硝酸塩などの無ｉ窒宏化合物又は、例えば尿２そ、コー
ンスチーブ・リカー、カゼイン、ペプトンなどの有機窒
素含有物がもちいられる。その他、無機塩類化合物とし
て、例えば、カルシラノ、塩、マグネシウム塩、カリウ
Ｊ１塩、ナトリウノ、塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛
塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩、ホウ素化
合物、ヨウ素化合物などが用いられる。

培養条件はたとえば温度２０〜４０℃程度、好ましくは
２５〜３７℃程度およびｐ）Ｉは５〜９程度、好ましく
は６〜８程度である。このような条件で好気的に培養を
おこなう。また、培養液中の溶存酸素濃度にはとくに制
限はないが、通常は０．５〜２０ｐｐｍ程度が好ましい
。そのために通気量を調節したり、攪はんしたり、また
、培養槽内の圧力を高めるなどの手段が採用される。ま
た、培養方式は回分培養又は連ｖｃ培査のいずれでもよ
い。

このように培養して得られた培Ｂ液から、たとえば、遠
心分離機およびろ過などの通常の菌体分離手段により菌
体を分離する。分離された湿潤菌体は凍結乾燥、または
噴霧乾燥などの方法で乾ＱｔハＴ、　Ｐ　Ｓの調製に供
するまでは、たとえば、４”ＣＮ度の低温下で保存され
る。

■Ｌ　Ｐ　Ｓの抽出と精製 本発明において、面体よりＬＰＳを抽出するには、細菌
４体からＬＰＳを抽出する通常の方法を適用し得るが、
たとえば水−フェノール法およびトリクロル酢酸法が好
ましい。水−フェノール法として、たとえばＷｅｓｔｐ
ｈａｌ　ｅｔ　ａｌ［Ｚ、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ７ｂ
、＋４８　（１９５２）］によって開発された方法があ
る。

え、攪はん後、室温まで冷却して遠心分離し、上層の水
Ｊごを採取して透析後凍結乾頒することにより粗Ｌ　Ｆ
’　Ｓを得る。

また、トリクロル酢酸法としては、たとえば「細菌内毒
紫　木間逼　他編集　講談社発行」に記載されている方
法がある。すなわち、菌体を水ζこ懸濁しこれに４℃に
冷却したこれと等量の０．５Ｎ　）リクロル酢酸水溶７
αを加え振どう抽出ずろ。遠心後の上層に冷エタノール
を加えて生じた沈殿を集め、水りこ溶かした水溶液を透
析して凍結乾仰する。

これらの方法により得られた粗Ｌ　Ｐ　Ｓは、必要に応
じてリボヌクレアーゼを用いた酵累法、ゲル［１過法、
あるいはＩｆｉ遠心分離法などによってさらに精製され
る。

（２）１．、Ｆ’Ｓの物性 本発明の代表的な低毒性Ｌ　Ｐ　Ｓ生産菌ＭＧ１０２３
株から、前記のようにして得られたり、　ｐ　ｓは以ド
の物性を有する。

なお、参考として、大腸菌０１２７８８１．　Ｐ　Ｓ　
（デイフコ社製）の物性を併せて示す。

■化学組成 全ｖＪ量（フェノール硫酸法により測定）、蛋白量（１
，、ｏ　ｗ　ｒ　ｙ法により測定）、ヘキソサミン量（
Ｅ　ｒ　ｓ　ｏ　ｎ−Ｍｏ　ｒ　ｇａｎ法により測定）
、全リン量（Ｃｈｅｎ法により測定）および脂質量（Ｌ
ｒ’Ｓを６Ｍ１（Ｃ１で１００℃、２／１時間加水分解
後クロロホルｌ、で抽出、秤αして測定）をそれぞれ表
−１に示す。

表−ＩＬＰＳの化学組成 ■構成単糖 ＬＰＳを硫酸で加水分解して遊離した中性糖を、アビセ
ルセルロースプレートを用いた薄層クロマトグラフィー
（屏・間溶媒は９０％フェノール／１％アンモニア水＝
４／１）で分なして検出された屯糖は、ラムノース、リ
ボース、グルコース、ガラクトースおよび、その他、Ｒ
ｆ＝０．８２　　およびＲｆ”０．６４の糖であった。

ただし、後二者は構造不明であった。

また、高速液体クロマトグラフィーで定量した、前記東
糖類の含量を表−２に示す。

表−２ＬＰＳの構成糖及び含量 ■２−ケトー３−デオキシオクトネート（以下　ｒＫＩ
）Ｏ」　と略記する） ＫＤＯはＬ　Ｐ　Ｓを構成する多糖類とリビドΔの結合
にあずかる特異的糖として大腸菌ＬＰＳ’等で検出され
ている。ＫＤＯは過ヨウ素酸−チオバルビツール酸法に
よって定性分析および定量分析ができ、その発色液は５
５０止に極大吸収（λ□、）をもつ。しかしながら、本
発明の低毒性ＬＰＳの発色液の極大吸収波長は５３５ｎ
ｍであり、低毒性Ｌ　ＰＳは分子中にＫｌ）Ｏを含有し
ていない。

■横・成、脂肪酸 Ｉ、　Ｐ　Ｓを３％ＨＣｌ−メタノール溶液として、１
０５℃で２４時間加温しメチルエステル体とした後、ガ
スクロマトグラフィーで検出された脂肪酸を、表−３に
示す。

（単位はＬ　Ｐ　Ｓの乾燥重量に占める割合）表−３Ｌ
Ｉ）Ｓの構成脂肪酸 ■分子量 ゲル口過法により求めた分子量は、３０万ダルトンのも
のと３０万ダルトンより大きいものの２秤類である。

（３）ＬＰＳの毒性 １、　Ｐ　Ｓの毒性はカブトガニ血球成分を用いるり１
１ラスｇ験（Ｂｕｌｌ、Ｊｏｈｎｓ　ｌ１ｏｐｋｉｎｓ
　１ｌｏｓｐ、　９８３２５（１９５６）Ｌｅｖｉｎ、
Ｊ　　Ｂａｎ３．Ｆ、［＋、）あるいはマウスなどを用
いる急性毒性試験などによって知ることができる。

リムラス試験はカブトガニ血球成分の入ったバイアルに
種々の濃度のＬ　Ｐ　Ｓ溶液を加え３７℃で１時間静ｄ
；後、バイアルをゆっくりと１８０度転倒させて、ゲル
のくずれを観察する試験法であり、ゲルが固まり転倒し
ても崩れなくなる１°ル小のＬＰＳ濃度で毒性を判定す
る方法である。このゲルの固型化の強さは■、ＰＳの毒
性の強さに比例して、毒性が強いほど少量のＬ　Ｐ　Ｓ
てゲルが固まる。

大腸菌のＬＰＳは１０〜５μｇ／ｍ　ｌの極めて低濃度
でゲルが固化するのに対して、本発明のＬＰＳは、固化
する最低濃度が】Ｏ−２μ８／ｍ）であり、最も毒性の
低いものは１０−’μ８７ｍ１でも固化せず、大ｒｉｊ
Ｊ菌１゜ＰＳの１００倍以上毒性の低いＬＰＳである。

また、マウスを用いた急性毒性試験によっても毒性を知
ることができるが、この方法によっても本発明のＬ　Ｐ
　Ｓの毒性は大腸菌１−　Ｐ　Ｓの毒性の１１５０〜Ｉ
／１２０以下であり、その毒性は極めて小さい。

（／１）インターフェロンの誘導法 本発明の低毒性ｒ、　ｐ　ｓは、過密の製剤化干９段に
よって任意の含量の経口または非経口段う、剤として用
いることができる。

すなわち、たとえば本発明の低毒性ＬＰＳ製剤を用いて
インターフェロンを誘導するには、ＬＰＳ量として０．
０３〜３０ｍｇ／　ｋｇ体重、好ましくは０．０３〜３
ｍｇ／ｋｇ体重の割合で経口的または非経口的、好まし
くは静脈内に投与する。

（５）ＴＮＦの誘導法 本発明の低毒性ＬＰＳｆｉＡ剤を用いてＴＮＦを誘導す
るには、コリネバクテリウノ、　バルバム１〜２００ｍ
ｇ　／　ｋｇ体重あるいはザイモザン１〜１００ｍｇ／
ｌ（８体重を経口的あるいは非経口的に投与、シて、１
０〜１４日間経過後、本発明のｒ−ｐ　ｓ製剤を、ｒ−
ｐ　ｓ爪として０．０３〜３０１Ｔ１８／ｋｇ１好まし
くは０．３〜３Ｂ／に８の割合で経口的または非１Ｙ、
口約、好ましくは静脈内に投与する。

（６）腫ようの抑制法 本発明の低毒性ＬＰＳ製剤を免疫賦活剤と併用して抗腫
よう剤として用いる場合には、たとえば、免疫賦活剤と
してレンチナンを使用する場合には、レンチナンを皮下
注射で−・・日当り０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体矩りｒ
：ｌ＜は０．０５〜ｌ０ｍ３／ｋｇ体重投句、する。−
方、本発明の低毒性１、ＰＳは皮下注射で一日当り０．
０００１〜Ｉｍｐ／ｋｇ体重好ましくは０．００１〜Ｏ
，！＋ｎ３／１り名体重投′デする・ ［実施例コ 以下実施例により本発明をさらにｉ′ｆｍに説明する。

実施例１　　ＭＧ−１０２３株からのＴ、　ＰＳの調製
１’ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、ＮｃｌＢ９６８６（
ＭＧ−１０２３）を前記の培＋１　ｔ　すｈ　チ、培養
液１１あたり（Ｎ）１４）２ｓ０４３８、Ｋ１１２１’
０４１．４３．　　Ｎａ２ＰＯ４２，１ｇ−ＭｅＳＯ４
”７１１２（］　０．２８、（：ａＣＩ２・２ｔ１２Ｑ
　　３０ｍ３、Ｆ、Ｃ６１１５０７・ＸｌＩ２０　３０
ｍ３、Ｍ、Ｃｌ２−／１１１２０５ｍ２Ｂ、　７．．５
Ｏ４−７Ｈ２０５ｍｇ、Ｃ，５Ｏ４−５１１，（１０，
５Ｂ、ビタミン混合ｔα１ｍｌ、メタノールｒａｇを含
む培地で培養して、溶着液２０１より約１８０３の乾燈
菌体を１！）た。この乾燥菌体１００ｇを６５〜７５℃
の温水３５００ｍｌに懸２周して分散せしめ同温度で保
温した。

この菌体懸濁液に、６５〜７５℃に加温した９０％フェ
ノール水溶７αをこの菌体懸濁液と等量加え、同温度に
保った。この混合液を１０分間激しく振とうした。振ど
う後、混合液をステンレス製容器に移し６５〜７５°Ｃ
に再度加温した。ついでこの液を、再び１０分分間上う
した。このような操作を１０分間ずつ３回くりかえし、
ｒ−ｐ　ｓに結合した蛋白を十分変性させて遊離せしめ
ると同時に、目的とするＬＰＳを混合液中に溶出させた
。振とう攪はんを終えた混合液を、４℃まで冷却後、遠
心分離（８０ＱＯＸｇ、２０分）し、氷原、不′ｉｆｊ
層、フェノール層の３層に分離した。ｒ、　ｐ　ｓを含
む上ばの水層部を静かにｔ采取した。残液を再度６５〜
７５℃にまで加温し、等量の６５〜７５℃の水を加え前
記の抽出操作をくり返し遠心分離後、水層を採取した。

１回目と２回目に採取した水層を混合して透析牧に移し
、流水に対して２昼夜透析した。得られた透析内液を、
減圧下４０℃で約２００ｍ　ｌまで濃縮した。

濃縮液は、このままでは不純物として核酸を含むため酵
素法（リボヌクレアーゼ）で脱核酸処理を行った。即ち
、前記の濃縮液の所定量に、団トリスー塩酸緩？＋ｉ液
ｐ］（８を加えて０．０５１’ｌの潤度に調整した。こ
れに前記の緩面液１ｍｌに１町の割合で溶解したリボヌ
ク１ノアーゼΔ（ＳＩＧ混製）を（濃縮後２００ｍ１の
場合、約４０ｍ１の割合）加え反応液とし、これを３７
℃で２〜３３時間インキュベートした。ついでこの反応
液を６５〜７５℃まで加温し、これに同温度まで加温し
た９０％フェノール水溶液を反応液と等量加えて振とう
した。この操作により、酵素反応を停止させると同時に
酵玄蛋白を変性せしめフェノール層へ移行させた。振ど
う液を４℃まで冷却後、遠心分離して水層を回収した。

この水層部を透析してフェノールおよび低分子核酸を除
去したのち透析内液を凍結１ｒｉ燥して約４ｇの精製Ｌ
　ＰＳを得た。

実Ｆｔ例２　　ｈ＋ｃ−＋ｏ３ｑ株のＬ　Ｐ　Ｓの調製
’１ｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ　ｍｅｔ、ｈａｎｏｌｉｃ
ａ　ＮＲＲＩ、　Ｂ−５４５８（ＭＧ−１０３９）を実
施例】と同様に培養して、乾燥面体を得た。この乾燥菌
体８ｇを用いて、実施例１と同様にして粗ＬＰＳ１．６
ｇを得た。この粗り、　Ｐ　Ｓを１〜３％のもフ；度の
水溶液として、１１０５０００ｘで２０時間遠心して淡
黄色の寒天状の沈殿を得た。この沈殿を凍結乾炸して精
製１．ＰＳ＋、ｏｉ３を得た。

実施例３ＬＰＳのリノ、ラス試験 種々の何体から得られたＬ　Ｐ　Ｓの生理食塩水溶液を
調製し、これを順次１０倍ずつ希釈して、】０−１〜３
Ｏ−５ｚ／ｍｌの溶液とした。これらのそれぞれをリム
ラスキット（和光純薬製）のカブトガニ血球成分の入っ
たバイアルに０．２ｍｌずつ加えて３７℃で１時間静置
したのち、バイアルを平板上で静かに倒置してゲル化の
有無を観察した。

結果を表−４に示した。

大腸菌ＬＰＳは１０−５μｇ／ｍｌの濃度でゲル化を起
こしたのに対して、本発明のＬ　Ｐ　Ｓのゲル化濃度は
１０−】〜１０−２μｇ／ｍｌ、あるいはそれ以上であ
った。

また本発明のＬ　Ｐ　Ｓでは全くゲル化しないＬ　Ｐ　
Ｓもあり、またその毒性は大腸菌Ｌ　Ｐ　Ｓの＋　／　
１０００以下であった。

表−／Ｉ　　１．ＰＳのリムラス試験 （十ニゲル化する。

ニゲル化しない） 実施例／ｌ　　ＬＰＳの急性毒性試駐 大開菌しＰ　Ｓを対照として急性毒性試験を行い、その
ＬＤ５．値から毒性の強さを比較した。すなわち、Ｌ　
Ｐ　Ｓを生理食塩水に溶解して、６〜７週令のＳＰＦ　
ｄｄｙマウス雄（−群４〜８匹）の腹腔内および、堅靜
脈にそれぞれ投与して、投与後の死亡経過からＬＤ、、
値を求めた。これらの結果を表−５および表−６に示す
。

表−５から大ｆｌｉ［ＬＰｓはＬ　Ｄ　５ｏ１４〜３１
Ｂ／に；の値となったが、本発明のＬＰＳはここで試験
した最高段ｌｙ−量１６９０ｍｚ／に３でも全く死亡例
は認められず、Ｌｒ）Ｓｏ値１６９０ｍｇ／に２以上と
なり、大腸菌ＬＰＳの毒性と比較すると、高くとも１１
５０倍から１／１２０倍の毒性で極めて低かった。

表−５１，Ｉ’ｓの２、性毒性試験（腹腔内投り、）ま
た、表−６から大腸菌Ｌ　Ｐ　ＳのＬＤ５０値が７．９
〜１５．７ｍｇ／ｋｇであるのに対して、嘱−１０３９
のＬＰＳは、試験した最高投与量の６２．９ｍｇ／Ｊで
も全く死亡例は認められず、１．、Ｄｌ、値は６２．９
ｍ８／Ｊ以上であり、大ｌｌ１１５菌ＬＰＳと比較する
と１０倍以上の値となった。リムラス試験の結果をもあ
わせ考えるとＭＧ−１０３９のＬ　Ｐ　Ｓは実質的に無
毒である。

表−６１，Ｐｓの急性母性試験（尾静脈段り）実施例５
　インターフェロンの誘導 本発明の低毒性しＰＳを生産する種々の細菌から水−フ
ェノール法によって得られたＬ　ｌ）　Ｓを用いてイン
ターフェロンの誘導を行った。すなわち、■マウス（ｄ
　ｄ　ｙ、雄７週令、体重：３０〜；う５８）尾静脈か
ら、Ｌ　Ｐ　ＳとしてそれぞれＩＯμｇおよび１００１
Ｌｙｅ／マウスとなるようにＬ　Ｉ）　Ｓの生理食塩水
溶ｉｉ０．１ｍｌを投与して、２時間後に心臓より０．
３　〜０．７ｍｌの血液を採取し、３７℃で３０分放置
後、３０００回転で１０分間遠心分離した上清をとり、
インターフェロン活性を測定した。

■インターフェロン活性は、Ｌ−９２９細胞とウシ水泡
性口内炎ウィルス（以下■Ｓ■と記す）を用い、５０％
プラーク減少法で測定した（増補版インターフェロンｐ
ｌ＋　　小林茂保著　講談社すイエンティフィク、　最
新医学２９　ｐ６６０１９７４　　飯塚雅彦）。

すなわち、９６六マイクロプレートに２ｘｌＯ’ｃｅｌ
１１０．１ｍｌ／ウェルとなるようり、−９２９細胞を
接種し、−８％培着してモルイヤー層とした。次いで、
ウェル内の培養液を除去し、牛胎児血清（Ｆ　ＣＳ）１
％加ミニマムエッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ培地）
で洗浄後、１．２ｘｌＯ３ＰＦＵ７ｍｌのＶＳＶを含む
ＦＣ３無添加ＭＥＭ培地を２５μｍ加え（３０ＰＦＵ／
ウエル）、３７℃の炭酸ガス培養器で２時間培養した。

２時間後アスピレーターで未吸着のウィルス液を除いて
、０．５％メチルセルロース液を１００μｍ添加して、
３７°Ｃ炭酸ガス培石器で２日培養した。ＶＳ■感染感
染２メ後メチルセルローススビレターで除き、１％クリ
スタルバイオレットを各ウェルに加え細胞を固定染色し
た。これを２時間後水洗し、風乾して実体顕微鏡でプラ
ーク数を数えた。横軸に血清の希釈倍数、縦軸にプラー
ク数をとり、コントｒｌ−ルのプラーク数を１００とし
て５０％プラーク数をう・える血清の希釈倍率をもとめ
、次の■で予め作成しておいた標準検量線からインター
フェロン力価を算出した。

■標準検量線は、インターフェロン標品（国際ｍ位ＩＵ
で活性の表示されたもの）を適当に希釈して３種の濃度
のインターフェロン希釈標準品を調製し、各希釈棟亭品
が５０％プラーク形成を５える希釈倍数を求めた。縦軸
に５０％プラーク数を与える希釈倍数を、横軸にインタ
ーフェロン力価をとり、各インターフェロン力価の与え
る５０％プラーク形成阻止希釈倍数をプロットして標準
検量線を作成した。

表−７に各細菌から得られたＬＰＳのインターフェロン
誘導活性を示す。ＩＯｔｔｇ／マウスの投写部で対照の
大腸菌ＬＰＳと同等もしくはそれ以上の活ヤ１を示した
。本発明のＬＰＳは低毒性であるので投勺尾を増すこと
が可能であった。すなわち大腸菌からの１．　Ｐ　Ｓの
投与については、］０７１３／マウスの場合にはインタ
ーフェロン誘導活性を示したがｌ００７Ｌ５／マウスの
場合にはマウスが立毛、鎮静、眼けん下垂、よろめき歩
行などの毒性症状を示したため測定は行わなかった。こ
れに対して本発明のＬ　Ｐ　Ｓの投り、についてはｌＯ
μｇ／マウスの場合には高いインターフェロン誘導活性
を示したが、１００ノＬ３／マウスの場合でも衰弱など
の毒性症状はなんら認められず依然としてインターフェ
ロンを誘導することが可能であった。なお、本発明の１
゜ＰＳの投り・について、インターフェロンの誘導活性
が、１０１．ｔ３／マウスの場合には大１１！Ｍからの
Ｉ−ＰＳのそれよりも劣ったが、１００μｇ／マウスの
場合には増加して、大’ＩＱＭからのＬＰＳの１０μｇ
／マウスの場合に比較して２倍近くに達したものもあっ
た。

表−７インターフェロン誘導活性 実施例６　ＴＮＦの誘導 本発明で得られたＬＰＳを用いてＴ　Ｎ　Ｆ’の誘導を
行った。

５週令のｄｄＹ系雌マウス（体毛２５〜３０８）の腹腔
内にコリネバクテリウノ、・バルバノ、ＩＩＩ＋８をｔ
２　’ｙ−して１０日間飼育後、ＬＰＳとしてそれぞれ
１０　）ｔ　Ｂ／マウス、１００μｓ／マウスおよび１
０００μｇ／マウスとなるようにり、　Ｐ　Ｓの生理食
塩水溶液０．１ｍｌを尾静脈から投与、した。投ｔｙ−
２時間後に心臓より０．３〜０．７ｍｌの血液を採取し
、３７℃で３０分放置後、３０００回転で３０分間遠心
分離した上清を採取し、下記のように上清のＴＮＦ活性
を測定した。

すなわち、９６穴マイクロプレートに８Ｘ１０４ｃｅｌ
ｆ１０．１ｍｌ／ウェルとなるようにＬ−９２９細胞を
接種し、３時間静置した。ついで、希釈した血清５０μ
ｍを加え一晩培養した。培若後の細胞を１％クリスタル
バイオレット（エタノール溶液）で染色し、室温で乾燥
後０．５％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を１００μｍ／
ウェル加え３時間溶出後回収し、回収液の吸光度をλ＝
５９０ｒ＋ｍで測定した。

Ｌ−９２９細胞に血清を加えずに培養した後、前記と同
様にして処狸して求めた対照の吸光度の１／２の吸光度
を与える血清の希釈倍率をＴ　ＮＦ誘導活性とした。

表−８に各１＝　Ｐ　ＳのＴＮＦ誘導活性を示す。なお
対照として大腸菌０１２７８８のＬＰＳで誘導された活
性もあわせて示した。

表−８ＬＰＳのＴＮＦ誂導活性 スの場合には高いＴ　ＮＦ誘尋活性を示したが、１００
　）ｉ　３／マウスおよび１ｏｏＯＢ３／マウスの場合
には前記したような、立毛、眼けん下垂、鎮静、よろめ
き歩行などの明らかな毒性症状を示したため測定は行わ
なかった。一方、本発明のＬＰＳの投与に大腸菌からの
Ｌ　ｐ　ｓの投与については１０μｇｌマウた］　００
０　ｕ　ｇ／マウスという投与量は、実用に適さなみ い投与・量であるため、拭上にＭＧ−１２８４−点につ
いて活性を測ったものであるが、このような高投与ｍで
もなんら数件症状は認められず、依然として１’　Ｎ　
Ｆが誘導可能でｊう７た。

実施例７　制癌効果 実施例１で得られたＬ　Ｐ　ＳについてＬ　Ｐ　Ｓ　弔
独の場合およびレンチナンと併用したときの制癌活性を
調べた。比較のため、大腸菌０１２７　ｆ１８１．、　
ＰＳについても同様に試験を行った。

すなわち、６週令のｄｄＹ系雄マ′ウスの右そけい部に
３ＸＩ０６個のエールリッヒ癌細胞を移植し、１２日間
飼育後、！、　Ｐ　Ｓを生理食塩水に溶解して腹腔内に
ｔ々与、した。投与後２３８目に１！！ようを描出し、
その徂量を対照群と比較し、腫ようｉ１１正率を算出ず
ろとともに腫ようの完全消失数を１！１察した。これら
の結果を表−９および表−１０にそれぞれ示す。

ＭＧ−１０２３（７）Ｌ　Ｐ　Ｓ　ヲ屯独で投Ｉ５２シ
たときの腫よう阻止率は、レンチナンおよび大腸菌ｒ、
、　ｐ　ｓにおよばなかったが、ＭＧ−１０２３のり、
　Ｐ　Ｓをレンチナンと併用したときには、大ＩＩ！菌
■、ＰＳとレンチナンとを併用した場合と同様に顕著な
腫よう阻止効果を示した。今回、−回投与の効果を比較
したものであるが、実用１ノベルで考えると、反復段ワ
・して用いることが常であり、そのような場合、本発明
の１．　］）Ｓは参性がなく、くりかえして用いること
かできる点において、大腸菌Ｌ　ｌ）Ｓより有利である
。

表−９ レンチナンと大腸ｍＬＰｓ併用による効果”　標準偏差 検体 １　生理食塩水 ２　レンチナン　　６．２５ｍｇ／ｋｙ。

３　大ａ＝菌ｒ、　Ｐ　Ｓ　　０．５ｍ８／ｋｇ４　レ
ンチナン６．２５ｍｇ／に８＋大腸菌Ｔ、ＰＳ５　　　
　　〃　　　　　＋　　〃 ６　　　　　〃　　　　　＋　　〃 ７　　　　　　ｔｔ−−４−ｔｔ ｏ、５ｍｇ／ｋｇ Ｏ８０５…ｚ／に３ ０．００５ｍ３／に５ ０．０００５＋ｎごハ（： 表−１０レンチナンとＭＧ−＋０２３　ＬＰＳ併用によ
る効果［発明の効果コ 本発明の１．　Ｐ　Ｓは、低用量でインターフエ［ｌン
およびＴＮＦなどを誘導し、さらに癌に対しても、免疫
賦活剤との併用効果を示す点では従来の１．　ＰＳと同
じであるが、毒性が極めて低いことが従来のＬ　Ｐ　Ｓ
と大きく異なるものであり、実際の臨床面での使用を可
能ならしめるものである。

９　標準偏差；　０　試験中１匹死亡 検体 １　生理食塩水 ２　レンチナン　６．２５ｍｇ／ｋｚ ８ＭＧ−１０２３ＬＰＳ　１．Ｏｍｚ／に３９　レンチ
ナン６．２５ｎ＋３／ｋｇ＋　ＭＧ−１０２３１，ＰＳ
　１．０ｍ３／に３１０　　　　　　／／　　　　　　
　　　　　＋　　　　ｔｔ　　　　　Ｏ，Ｉｍｇ／ｋｇ
１１　　　　　／／　　　　　　　　　　＋　　　　ｔ
ｔ　　　　（）、０１ｍ３ハ＜８　。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）２−ケト−３−デオキシオクトネートを含有せず
   、ほ乳動物に対する毒性が低いことを特徴とする細菌々
   体由来のリボ多糖
2. （２）２−ケト−３−デオキシオクトネートを含有せず
   、ほ乳動物に対する毒性が低い細菌々体由来のリボ多糖
   を有効成分として含有することを特徴とするインターフ
   エロン誘起剤
3. （３）２−ケト−３−デオキシオクトネートを含有せず
   、ほ乳動物に対する毒性が低い細菌々体由来のリボ多糖
   を有効成分として含有することを特徴とする腫よう壊死
   因子誘起剤（４）２−ケト−３−デオキシオクトネート
   を含有せず、ほ乳動物に対する毒性が低い細菌々体由来
   のリボ多糖を有効成分として含有することを特徴とする
   抗腫よう剤