JPH0257917B2 - - Google Patents
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は新規なキトビアーゼの製造法に関す
る。 本発明者らは天然の土壤より数多くの微生物を
単離し、その生産物について種々研究を行つた結
果、今回本発明者によつて分離された細菌がキチ
ン分解酵素を多量に産生することを見出し、本発
明を完成した。 すなわち、本発明は新規なキトビアーゼの製造
法を提供するものである。 本発明のキトビアーゼを産生する細菌は次のよ
うな菌学的性質を有する。 (1) 形態 直状、球形末端を有する桿形、大きさ1.0〜
2.4μm、運動性あり、極単毛性で鞭毛を有す
る、グラム陰性 (2) 生育状態 0.2%コロイドキチン、0.1%ペプトン、0.1
%肉汁エキス、0.3%塩化ナトリウム及び2.0
%寒天含有(PH7.0)キチン−寒天平板培地
中、30℃で72時間インキユベーシヨンする
と、明確なコロニーを形成する。 肉汁液体培地中、37℃で生育する。 7.5%塩化ナトリウム含有肉汁液体培地中
で生育しない。 単一窒素源としてアンモニア、単一炭素源
としてグルコース、L−アルギニン、L−ア
スパラギン、L−ヒスチジン、L−グルタミ
ン酸、L−セリン又はL−アラニンを含有す
る無機培地中で生育する。 トリプチケースダイズ寒天培地上で褐色の
水溶性色素を生成しない。 アルギニン、アスパラギン、ロイシン及び
メチオニンを含有する混合培地中で生育す
る。 (3) 生理学的性質 硝酸塩の還元:陽性 V−Pテスト:陰性 インドールの生成:陽性(0.1%トリプト
フアン含有トリプトンブロス中) 硫化水素の生成:陽性(2.5%ペプトン水
中) デンプンの加水分解:陽性 ウレアーゼ:陰性 オキシダーゼ:陽性 カタラーゼ:陽性 チトクローム オキシダーゼ:陽性 生育の温度範囲:13〜42℃で生育し、27〜
30℃において最もよく生育 生育のPH範囲:5.5〜9.0 酸素に対する態度:通性嫌気性 糖類に対する資化性、酸およびガスの生成
(資化性、酸およびガスの生成があるもの、
ないものを、それぞれ+、−で示す):
る。 本発明者らは天然の土壤より数多くの微生物を
単離し、その生産物について種々研究を行つた結
果、今回本発明者によつて分離された細菌がキチ
ン分解酵素を多量に産生することを見出し、本発
明を完成した。 すなわち、本発明は新規なキトビアーゼの製造
法を提供するものである。 本発明のキトビアーゼを産生する細菌は次のよ
うな菌学的性質を有する。 (1) 形態 直状、球形末端を有する桿形、大きさ1.0〜
2.4μm、運動性あり、極単毛性で鞭毛を有す
る、グラム陰性 (2) 生育状態 0.2%コロイドキチン、0.1%ペプトン、0.1
%肉汁エキス、0.3%塩化ナトリウム及び2.0
%寒天含有(PH7.0)キチン−寒天平板培地
中、30℃で72時間インキユベーシヨンする
と、明確なコロニーを形成する。 肉汁液体培地中、37℃で生育する。 7.5%塩化ナトリウム含有肉汁液体培地中
で生育しない。 単一窒素源としてアンモニア、単一炭素源
としてグルコース、L−アルギニン、L−ア
スパラギン、L−ヒスチジン、L−グルタミ
ン酸、L−セリン又はL−アラニンを含有す
る無機培地中で生育する。 トリプチケースダイズ寒天培地上で褐色の
水溶性色素を生成しない。 アルギニン、アスパラギン、ロイシン及び
メチオニンを含有する混合培地中で生育す
る。 (3) 生理学的性質 硝酸塩の還元:陽性 V−Pテスト:陰性 インドールの生成:陽性(0.1%トリプト
フアン含有トリプトンブロス中) 硫化水素の生成:陽性(2.5%ペプトン水
中) デンプンの加水分解:陽性 ウレアーゼ:陰性 オキシダーゼ:陽性 カタラーゼ:陽性 チトクローム オキシダーゼ:陽性 生育の温度範囲:13〜42℃で生育し、27〜
30℃において最もよく生育 生育のPH範囲:5.5〜9.0 酸素に対する態度:通性嫌気性 糖類に対する資化性、酸およびガスの生成
(資化性、酸およびガスの生成があるもの、
ないものを、それぞれ+、−で示す):
【表】
【表】
(4) その他の性質
グルコン酸の酸化:陰性(グルコン酸オキ
シダーゼ試験) リジンの脱炭酸反応:陰性〔モラKg
(Moller)法〕 塩化ナトリウムの耐性:陽性(1.0%NaCl
含有ブロスにおいて生育最大) シアン化カリウムの耐性:陽性(モラー
法) フオスフアターゼ:陽性 カゼインの加水分解:陽性 ゼラチン溶解性:陽性 デオキシリボヌレアーゼ:陽性 リボヌクレアーゼ:陽性 アルギニン脱水素酵素:陽性 グルタミン酸の脱炭酸反応:陰性 ビブリオスタテイツク試薬、2,4−ジア
ミノ−6,7−ジイソプロプル プテリジン
(0/129)に対する反応性:陰性 2,3−ブタンジオールからアセトインが
生産されるが、グルコースからは生産されな
い。 ブキヤナン(Buchanan、P.)等(1974年)、
コワン(Cowan、S.T.)(1974年)、及びゲルハ
ルト(Gerhardt、P.)等(1981年)の系統的方
法により調べられた上記性状と本発明に係るキチ
ン溶解性に基づき、本細菌の種属を検索すると、
キチン分解性を有する生物としては、コワン
(1974年)のビブリオ(ベネツケア)・パラヘモリ
テイカス〔Viibrio(Beneckea)
parahemolyticus〕及びバウマン(Bauman、P.
L.)等のビブリオ(クロモバクテリウム)・アル
ギノリテイカス(V.(Chromobacterium)
alginolyticus〕が認められる〔ブキヤナン等
(1974)によれば、この2種の生物はビブリオ・
パラヘモリテイカスに分類されている〕。キチン
溶解性の細菌は既に報告があり、それらはセラテ
イア(Serratia)属〔モンリアル(Monreal、
J.)等(1969年)、レイド(Reid、J.D)等(1981
年)〕、ビブリオ属〔内田等(1979年)〕、ベネツケ
ア属〔高橋等(1982年)〕及びストレプトミセス
属〔レイノルズ(Reynolds、D.M.)(1954年)〕
であると記載されている〔ブキヤナン等(1974
年)に依ればベネツケアはビブリオ属に属すると
考えられている〕。これらを参考にすると、本細
菌はビブリオナセエ科に属するものと考えられ
る。因みに、本細菌はペプトンから硫化水素を生
成する能力があり、またビブリオスタテイツク
(Vibriostatic)試薬0/129に感作しない点でビ
ブリオ属とは全く相違する。 叙上の証拠より、本細菌は菌株アエロモナス・
ヒドロフイラ・亜アネロゲネス ATCC15467
(IFO13282)に類似する。なぜなら、本細菌はV
−P反応、グルコン酸オキシダーゼ試験が陰性で
あり、グリセリン及びグルコースからガスを生成
しない〔ブキヤナン等(1974年)〕。然し、本細菌
が強いキチン溶解活性を有するのに対し、上記菌
株はキチン溶解性を全く示さない点で全く相違す
る。そこで本発明者は、本細菌を公知の菌株と区
別するために、アエロモナス・ヒドロフイラ・亜
アネロゲネス A52(Aeromonas hydrophila
subsp.anaerogenesA52;以下において細菌52と
略称することがある)と命名し、工業技術院微生
物工業技術研究所に受託番号微工研菌寄7206号
(FERM P−7206)として寄託した。 本細菌は次の如くして分離、純化される。分離
は、0.2%コロイドキチン、0.1%ペプトン、0.1%
肉汁エキス、0.3%塩化ナトリウム及び2.0%寒天
含有キチン−寒天平板培地(PH7.0)で、試料の
懸濁液を1白金耳量画線する(画線平板法)こと
により行つた。30℃で72時間インキユベーシヨン
後、コロニーを採取し、上記と同組成の斜面キチ
ン−寒天培地に保存する。コロニーの周囲にはコ
ロイドキチンが溶解している明確な領域が形成さ
れる。分離したコロニーからの当該細菌の純化は
キチン−寒天培地及び普通ブロス−寒天培地上で
交互に6回平板培養することにより行う。最後に
47個の分離物のうち、キチン−寒天培地上で生育
が早く、大きく明確なコロニーを形成するものを
細菌A52として選択した。 斯くして得られた細菌は、1.0%肉汁エキス、
1.0%ペプトン、0.5%塩化ナトリウム、2.0%寒天
含有普通ブロス−傾斜培地(1N−NaOHでPH7.0
に調整)中、28℃で3日間培養した後室温で存在
し、1箇月ごとに新しい培地に植え継ぎ保存す
る。 本発明のキトビアーゼは、上記細菌を栄養源培
地に接種し培養せしめることにより製造される。
培養に用いられる培地としては、酵素誘導基質で
あるキチンと当該菌が利用する栄養源を含むもの
であれば何れでもよいが、例えば1.0%エビ殻キ
チン、0.2%ブドウ糖、0.5%ペプトン、1.0%酵母
エキス、0.7g/リン酸二水素カリウム、0.3%
塩化ナトリウムを含有(1N−NaOHでPH7.0に調
整)するものが挙げられる。 培養法としては、振盪培養が好適である。培養
に適当な温度は25〜30℃であるが多くの場合28℃
付近で培養する。2〜3日間培養後、培養液は次
の操作に付される。 キトビアーゼの単離は、後記実施例に示す如
く、キトビアーゼの理化学的性状を考慮して種々
の方法を適当に組合せることによつて行う。 すなわち、キトビアーゼは通常、培養液中に
存在するので、遠心分離又は過等の手段によつ
て培養物から細菌を分離した後、培養液に硫酸
アンモニウムを添加して塩析を行う。次いで塩析
により析出したタンパクの沈澱を0.1Mトリス−
塩酸緩衝液(PH7.0)に溶かし、これを遠心分離
してその上澄液を粗酵素液とする。粗酵素液はキ
トビアーゼ及びキチナーゼを含有する。 粗酵素液からキトビアーゼの単離は、キトビア
ーゼ及びキチナーゼのコロイドキチンへの吸着性
の相違を利用して行う。すなわち、粗酵素液及び
コロイドキチンをトリス−塩酸緩衝液と混ぜ、キ
チナーゼをコロイドキチンに吸着させた後遠心分
離し上清を得、これをキトビアーゼ画分とする。
なお、キチナーゼは遠心分離により得られた沈澱
から得られる。 キトビアーゼ画分から、キトビアーゼの分離精
製は、CM−セルロースクロマトグラフイー及び
DEAE−セフアデツクスA−50によるカラムクロ
マトグラフイーを利用して行なわれる。 以上の如くして得られたキトビアーゼは次のよ
うな理化学的性質を有する。 作用:キチナーゼと共に作用してキチンを分
解する。 至適PH:PH7.0 Km*:p−ニトロフエニル−N−アセチル
グルコサミニド0.17mM PH安定性:37℃で30分処理した場合、PH6.0
〜PH9.0において90%以上の残存活性を示す。 至適温度:PH7.0において、p−ニトロフエ
ニル−N−アセチルグルコサミニドを基質とし
た場合50℃付近にある。 温度安定性:p−ニトロフエニル−N−アセ
チルグルコサミニド基質で、PH7.0において、
0〜40℃、30分処理して80%以上の残存活性を
示す。 等電点**:PH6.8付近 分子量***:115000 *〔Km値の測定〕 5.0mM p−ニトロフエニル−N−アセチル
グルコサミニド0.2ml、50mMトリス−マレイン
酸緩衝液(PH7.0)0.7ml、及び酵素液0.1mlからな
る反応液を37℃で10分間インキユベートする。次
いで、この反応液に0.25M炭酸ナトリウム溶液
2.0mlを加え反応を停止し、同時にp−ニトロフ
エノールの発色を起こさせた。生成したN−アセ
チルグルコサミンはp−ニトロフエノールと等モ
ルであるから、405nmの吸光度を測り、p−ニ
トロフエノールの検量線からその量を求めた。キ
トビアーゼ活性は、p−ニトロフエニル−N−ア
セチルコサミニドから1分間に1μmolのN−アセ
チルグルコサミンを生成する酵素量を1単位とし
た。結果はラインウイーバー−バーク
(Lineweaver−Burk)プロツトからKm値を求
めた。なお、酵素液は精製キトビアーゼ標品を用
い、1反応液中の酵素量は0.054Uで行つた。 **〔等電点電気泳動〕 ポリアクリルアミドゲルデイスク等電点電気泳
動はデイビス、ビー.ジエー.Ann.N.Y.Acad.
Sci.、121、404(1964)に基き、7.5%ゲル、トリ
ス−グリシン緩衝液(PH8.4)中で行つた。チユ
ーブ一本あたり2〜4mAの電流を流し、5℃で
泳動した。 ***〔分子量〕 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
る。 斯くして得られる本発明のキトビアーゼは細胞
壁溶解酵素としてプロトプラストの形成等に利用
できるものである。 次に実施例及び参考例を挙げて説明する。 参考例 1 (1) エビ殻キチンの調製 冷凍エビ殻を解凍し、10分間ワーリングブレ
ンダー処理を行ない、水道水で3回以上水洗す
る。得られたエビ殻フレークを、1N水酸化ナ
トリウムに1晩浸漬して除タンパクを行ない、
水道水で3回以上水洗する。次いで得られた除
タンパクエビ殻フレークを1N塩酸に1晩浸漬
してカルシウム分を除く。以上の操作により得
られた精製エビ殻フレークを水道水で水洗後、
1N水酸化ナトリウムでPH7.0に調整後、10分間
ワーリングブレンダー処理し、乾物量を2%に
調整して、オートクレーブで120℃にて20分間
滅菌する。 (2) コロイドキチンの調製 (1)で得たエビ殻キチンをボールミルで約24時
間粉砕しボールミルキチンとした。このボール
ミルキチンを以下の操作に付しコロイドキチン
を得た。 a 冷却した乳鉢をアセトンで湿らせ、ボール
ミルキチンと濃塩酸をよく混合する。 b 大量の冷水中によく撹拌しながら滴下分散
させる。 c 18000gで10分間遠心分離することにより
水洗する。 d ワーリングブレンダーで10分間処理する。 e 18000gで10分間遠心分離してコロイドキ
チンを集め、更に0.025Mトリス−塩酸緩衝
液(PH7.2)で洗う。 斯くして得られたコロイドキチンは、適宜緩衝
液に分散させ使用に供される。 実施例 1 (1) 酵素生産のための培養 水道水1にペプトン15g、酵母エキス5
g、リン酸二水素カリウム0.68gを加え、1N
−水酸化ナトリウムでPH7.0に調整した前培養
培地を、綿栓試験管に5mlずつ入れ、常法に従
い滅菌する。次いでこれに保存培地から細菌
A52を一白金耳接種し、28℃で24時間振盪培養
を行なう。本培養は、水道水1に、エビ殻キ
チン10g、グルコース2g、ペプトン5g、酵
母エキス10g、リン酸二水素カリウム0.68g、
塩化ナトリウム3gを加え、1N−水酸化ナト
リウムでPH7.0に調整した本培養培地を、500ml
容フラスコに70mlずつ分注し、常法に従い滅菌
する。次いで、これに培養終了後の前培養培地
1mlを接種し、28℃で72時間振盪培養
(240rpm)した。 (2) 粗酵素液の調製 培養終了後、本培養培地から18000gで20分
間遠心分離することにより菌体を除いた後、細
菌による汚染を防ぐために最終濃度0.02%とな
るようにアジ化ナトリウムを加え培養液とし
た。次いで0℃冷却下、スターラーで静かに撹
拌しながら、培養液に80%飽和になるように
固形硫安を徐々に加え塩析を行つた。このと
き、培養液のPHが酸性側に傾かないように、
1N−水酸化ナトリウムでPH7.0付近に保持しな
がら行つた。塩析は0〜4℃に冷却しながら1
時間以上行つた。塩析により析出したタンパク
の沈澱は、18000gで20分間遠心分離して集め
た。この沈澱を培養液の10分の1容の0.1M
トリス−塩酸緩衝液(PH7.0)に溶かし、0〜
4に冷却して1時間静置後、不溶物を18000g
で20分間遠心分離で除き、上清を粗酵素液と
し、−20℃で凍結保存した。 (3) キチン吸着によるキチナーゼとキトビアーゼ
の分離 コロイドキチンに対する両酵素の親和力の違
いにより次の如くして分離した。 粗酵素液75ml(キチナーゼ約887U)と、コ
ロイドキチン2.5g(乾物重量)を含む25mM
トリス−塩酸緩衝液(PH7.2)300mlを混ぜ、
時々撹拌しながら氷冷下で1時間、キチナーゼ
をコロイドキチンに吸着させた。次いで18000
gで20分間遠心分離を行ない、上清をキトビア
ーゼ画分とした。 (4) キトビアーゼの精製 実施例1の(3)で得られたキトビナーゼ画分を
1mM PMSFの存在下でエバポレータ濃縮
後、5mMトリス−塩酸緩衝液(PH7.2)に対
して一晩透析した標品を、50mM酢酸緩衝液
(PH5.2)で平衡化したCM−セルロースのカラ
ム(2.6×45cm)でイオン交換した。なお、溶
出は塩化ナトリウム濃度勾配0→0.3Mで、流
速は40ml/時とした。次いで、溶出液を限外
過により濃縮・脱塩した後、0.05M塩化ナトリ
ウム含有25mMトリス−塩酸緩衝液(PH7.2)
で平衡化させたDEAE−セフアデツクスA−50
のカラムクロマトグラムに付し(カラムサイズ
2.6×45cm)精製キトビアーゼを得た。なお、
溶出は塩化ナトリウム濃度勾配0.05→0.2Mで、
流速は44ml/時とした。 以上の各操作段階におけるトキビアーゼの精製
度及び回収率を第1表に、またDEAE−セフアデ
ツクスA−50によるカラムクロマトグラムを第1
図に示す。第1表より明らかな如く、上記操作に
より粗酵素液中のキトビアーゼは144培に精製さ
れた。
シダーゼ試験) リジンの脱炭酸反応:陰性〔モラKg
(Moller)法〕 塩化ナトリウムの耐性:陽性(1.0%NaCl
含有ブロスにおいて生育最大) シアン化カリウムの耐性:陽性(モラー
法) フオスフアターゼ:陽性 カゼインの加水分解:陽性 ゼラチン溶解性:陽性 デオキシリボヌレアーゼ:陽性 リボヌクレアーゼ:陽性 アルギニン脱水素酵素:陽性 グルタミン酸の脱炭酸反応:陰性 ビブリオスタテイツク試薬、2,4−ジア
ミノ−6,7−ジイソプロプル プテリジン
(0/129)に対する反応性:陰性 2,3−ブタンジオールからアセトインが
生産されるが、グルコースからは生産されな
い。 ブキヤナン(Buchanan、P.)等(1974年)、
コワン(Cowan、S.T.)(1974年)、及びゲルハ
ルト(Gerhardt、P.)等(1981年)の系統的方
法により調べられた上記性状と本発明に係るキチ
ン溶解性に基づき、本細菌の種属を検索すると、
キチン分解性を有する生物としては、コワン
(1974年)のビブリオ(ベネツケア)・パラヘモリ
テイカス〔Viibrio(Beneckea)
parahemolyticus〕及びバウマン(Bauman、P.
L.)等のビブリオ(クロモバクテリウム)・アル
ギノリテイカス(V.(Chromobacterium)
alginolyticus〕が認められる〔ブキヤナン等
(1974)によれば、この2種の生物はビブリオ・
パラヘモリテイカスに分類されている〕。キチン
溶解性の細菌は既に報告があり、それらはセラテ
イア(Serratia)属〔モンリアル(Monreal、
J.)等(1969年)、レイド(Reid、J.D)等(1981
年)〕、ビブリオ属〔内田等(1979年)〕、ベネツケ
ア属〔高橋等(1982年)〕及びストレプトミセス
属〔レイノルズ(Reynolds、D.M.)(1954年)〕
であると記載されている〔ブキヤナン等(1974
年)に依ればベネツケアはビブリオ属に属すると
考えられている〕。これらを参考にすると、本細
菌はビブリオナセエ科に属するものと考えられ
る。因みに、本細菌はペプトンから硫化水素を生
成する能力があり、またビブリオスタテイツク
(Vibriostatic)試薬0/129に感作しない点でビ
ブリオ属とは全く相違する。 叙上の証拠より、本細菌は菌株アエロモナス・
ヒドロフイラ・亜アネロゲネス ATCC15467
(IFO13282)に類似する。なぜなら、本細菌はV
−P反応、グルコン酸オキシダーゼ試験が陰性で
あり、グリセリン及びグルコースからガスを生成
しない〔ブキヤナン等(1974年)〕。然し、本細菌
が強いキチン溶解活性を有するのに対し、上記菌
株はキチン溶解性を全く示さない点で全く相違す
る。そこで本発明者は、本細菌を公知の菌株と区
別するために、アエロモナス・ヒドロフイラ・亜
アネロゲネス A52(Aeromonas hydrophila
subsp.anaerogenesA52;以下において細菌52と
略称することがある)と命名し、工業技術院微生
物工業技術研究所に受託番号微工研菌寄7206号
(FERM P−7206)として寄託した。 本細菌は次の如くして分離、純化される。分離
は、0.2%コロイドキチン、0.1%ペプトン、0.1%
肉汁エキス、0.3%塩化ナトリウム及び2.0%寒天
含有キチン−寒天平板培地(PH7.0)で、試料の
懸濁液を1白金耳量画線する(画線平板法)こと
により行つた。30℃で72時間インキユベーシヨン
後、コロニーを採取し、上記と同組成の斜面キチ
ン−寒天培地に保存する。コロニーの周囲にはコ
ロイドキチンが溶解している明確な領域が形成さ
れる。分離したコロニーからの当該細菌の純化は
キチン−寒天培地及び普通ブロス−寒天培地上で
交互に6回平板培養することにより行う。最後に
47個の分離物のうち、キチン−寒天培地上で生育
が早く、大きく明確なコロニーを形成するものを
細菌A52として選択した。 斯くして得られた細菌は、1.0%肉汁エキス、
1.0%ペプトン、0.5%塩化ナトリウム、2.0%寒天
含有普通ブロス−傾斜培地(1N−NaOHでPH7.0
に調整)中、28℃で3日間培養した後室温で存在
し、1箇月ごとに新しい培地に植え継ぎ保存す
る。 本発明のキトビアーゼは、上記細菌を栄養源培
地に接種し培養せしめることにより製造される。
培養に用いられる培地としては、酵素誘導基質で
あるキチンと当該菌が利用する栄養源を含むもの
であれば何れでもよいが、例えば1.0%エビ殻キ
チン、0.2%ブドウ糖、0.5%ペプトン、1.0%酵母
エキス、0.7g/リン酸二水素カリウム、0.3%
塩化ナトリウムを含有(1N−NaOHでPH7.0に調
整)するものが挙げられる。 培養法としては、振盪培養が好適である。培養
に適当な温度は25〜30℃であるが多くの場合28℃
付近で培養する。2〜3日間培養後、培養液は次
の操作に付される。 キトビアーゼの単離は、後記実施例に示す如
く、キトビアーゼの理化学的性状を考慮して種々
の方法を適当に組合せることによつて行う。 すなわち、キトビアーゼは通常、培養液中に
存在するので、遠心分離又は過等の手段によつ
て培養物から細菌を分離した後、培養液に硫酸
アンモニウムを添加して塩析を行う。次いで塩析
により析出したタンパクの沈澱を0.1Mトリス−
塩酸緩衝液(PH7.0)に溶かし、これを遠心分離
してその上澄液を粗酵素液とする。粗酵素液はキ
トビアーゼ及びキチナーゼを含有する。 粗酵素液からキトビアーゼの単離は、キトビア
ーゼ及びキチナーゼのコロイドキチンへの吸着性
の相違を利用して行う。すなわち、粗酵素液及び
コロイドキチンをトリス−塩酸緩衝液と混ぜ、キ
チナーゼをコロイドキチンに吸着させた後遠心分
離し上清を得、これをキトビアーゼ画分とする。
なお、キチナーゼは遠心分離により得られた沈澱
から得られる。 キトビアーゼ画分から、キトビアーゼの分離精
製は、CM−セルロースクロマトグラフイー及び
DEAE−セフアデツクスA−50によるカラムクロ
マトグラフイーを利用して行なわれる。 以上の如くして得られたキトビアーゼは次のよ
うな理化学的性質を有する。 作用:キチナーゼと共に作用してキチンを分
解する。 至適PH:PH7.0 Km*:p−ニトロフエニル−N−アセチル
グルコサミニド0.17mM PH安定性:37℃で30分処理した場合、PH6.0
〜PH9.0において90%以上の残存活性を示す。 至適温度:PH7.0において、p−ニトロフエ
ニル−N−アセチルグルコサミニドを基質とし
た場合50℃付近にある。 温度安定性:p−ニトロフエニル−N−アセ
チルグルコサミニド基質で、PH7.0において、
0〜40℃、30分処理して80%以上の残存活性を
示す。 等電点**:PH6.8付近 分子量***:115000 *〔Km値の測定〕 5.0mM p−ニトロフエニル−N−アセチル
グルコサミニド0.2ml、50mMトリス−マレイン
酸緩衝液(PH7.0)0.7ml、及び酵素液0.1mlからな
る反応液を37℃で10分間インキユベートする。次
いで、この反応液に0.25M炭酸ナトリウム溶液
2.0mlを加え反応を停止し、同時にp−ニトロフ
エノールの発色を起こさせた。生成したN−アセ
チルグルコサミンはp−ニトロフエノールと等モ
ルであるから、405nmの吸光度を測り、p−ニ
トロフエノールの検量線からその量を求めた。キ
トビアーゼ活性は、p−ニトロフエニル−N−ア
セチルコサミニドから1分間に1μmolのN−アセ
チルグルコサミンを生成する酵素量を1単位とし
た。結果はラインウイーバー−バーク
(Lineweaver−Burk)プロツトからKm値を求
めた。なお、酵素液は精製キトビアーゼ標品を用
い、1反応液中の酵素量は0.054Uで行つた。 **〔等電点電気泳動〕 ポリアクリルアミドゲルデイスク等電点電気泳
動はデイビス、ビー.ジエー.Ann.N.Y.Acad.
Sci.、121、404(1964)に基き、7.5%ゲル、トリ
ス−グリシン緩衝液(PH8.4)中で行つた。チユ
ーブ一本あたり2〜4mAの電流を流し、5℃で
泳動した。 ***〔分子量〕 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
る。 斯くして得られる本発明のキトビアーゼは細胞
壁溶解酵素としてプロトプラストの形成等に利用
できるものである。 次に実施例及び参考例を挙げて説明する。 参考例 1 (1) エビ殻キチンの調製 冷凍エビ殻を解凍し、10分間ワーリングブレ
ンダー処理を行ない、水道水で3回以上水洗す
る。得られたエビ殻フレークを、1N水酸化ナ
トリウムに1晩浸漬して除タンパクを行ない、
水道水で3回以上水洗する。次いで得られた除
タンパクエビ殻フレークを1N塩酸に1晩浸漬
してカルシウム分を除く。以上の操作により得
られた精製エビ殻フレークを水道水で水洗後、
1N水酸化ナトリウムでPH7.0に調整後、10分間
ワーリングブレンダー処理し、乾物量を2%に
調整して、オートクレーブで120℃にて20分間
滅菌する。 (2) コロイドキチンの調製 (1)で得たエビ殻キチンをボールミルで約24時
間粉砕しボールミルキチンとした。このボール
ミルキチンを以下の操作に付しコロイドキチン
を得た。 a 冷却した乳鉢をアセトンで湿らせ、ボール
ミルキチンと濃塩酸をよく混合する。 b 大量の冷水中によく撹拌しながら滴下分散
させる。 c 18000gで10分間遠心分離することにより
水洗する。 d ワーリングブレンダーで10分間処理する。 e 18000gで10分間遠心分離してコロイドキ
チンを集め、更に0.025Mトリス−塩酸緩衝
液(PH7.2)で洗う。 斯くして得られたコロイドキチンは、適宜緩衝
液に分散させ使用に供される。 実施例 1 (1) 酵素生産のための培養 水道水1にペプトン15g、酵母エキス5
g、リン酸二水素カリウム0.68gを加え、1N
−水酸化ナトリウムでPH7.0に調整した前培養
培地を、綿栓試験管に5mlずつ入れ、常法に従
い滅菌する。次いでこれに保存培地から細菌
A52を一白金耳接種し、28℃で24時間振盪培養
を行なう。本培養は、水道水1に、エビ殻キ
チン10g、グルコース2g、ペプトン5g、酵
母エキス10g、リン酸二水素カリウム0.68g、
塩化ナトリウム3gを加え、1N−水酸化ナト
リウムでPH7.0に調整した本培養培地を、500ml
容フラスコに70mlずつ分注し、常法に従い滅菌
する。次いで、これに培養終了後の前培養培地
1mlを接種し、28℃で72時間振盪培養
(240rpm)した。 (2) 粗酵素液の調製 培養終了後、本培養培地から18000gで20分
間遠心分離することにより菌体を除いた後、細
菌による汚染を防ぐために最終濃度0.02%とな
るようにアジ化ナトリウムを加え培養液とし
た。次いで0℃冷却下、スターラーで静かに撹
拌しながら、培養液に80%飽和になるように
固形硫安を徐々に加え塩析を行つた。このと
き、培養液のPHが酸性側に傾かないように、
1N−水酸化ナトリウムでPH7.0付近に保持しな
がら行つた。塩析は0〜4℃に冷却しながら1
時間以上行つた。塩析により析出したタンパク
の沈澱は、18000gで20分間遠心分離して集め
た。この沈澱を培養液の10分の1容の0.1M
トリス−塩酸緩衝液(PH7.0)に溶かし、0〜
4に冷却して1時間静置後、不溶物を18000g
で20分間遠心分離で除き、上清を粗酵素液と
し、−20℃で凍結保存した。 (3) キチン吸着によるキチナーゼとキトビアーゼ
の分離 コロイドキチンに対する両酵素の親和力の違
いにより次の如くして分離した。 粗酵素液75ml(キチナーゼ約887U)と、コ
ロイドキチン2.5g(乾物重量)を含む25mM
トリス−塩酸緩衝液(PH7.2)300mlを混ぜ、
時々撹拌しながら氷冷下で1時間、キチナーゼ
をコロイドキチンに吸着させた。次いで18000
gで20分間遠心分離を行ない、上清をキトビア
ーゼ画分とした。 (4) キトビアーゼの精製 実施例1の(3)で得られたキトビナーゼ画分を
1mM PMSFの存在下でエバポレータ濃縮
後、5mMトリス−塩酸緩衝液(PH7.2)に対
して一晩透析した標品を、50mM酢酸緩衝液
(PH5.2)で平衡化したCM−セルロースのカラ
ム(2.6×45cm)でイオン交換した。なお、溶
出は塩化ナトリウム濃度勾配0→0.3Mで、流
速は40ml/時とした。次いで、溶出液を限外
過により濃縮・脱塩した後、0.05M塩化ナトリ
ウム含有25mMトリス−塩酸緩衝液(PH7.2)
で平衡化させたDEAE−セフアデツクスA−50
のカラムクロマトグラムに付し(カラムサイズ
2.6×45cm)精製キトビアーゼを得た。なお、
溶出は塩化ナトリウム濃度勾配0.05→0.2Mで、
流速は44ml/時とした。 以上の各操作段階におけるトキビアーゼの精製
度及び回収率を第1表に、またDEAE−セフアデ
ツクスA−50によるカラムクロマトグラムを第1
図に示す。第1表より明らかな如く、上記操作に
より粗酵素液中のキトビアーゼは144培に精製さ
れた。
第1図はCM−セルロースのカラムによりイオ
ン交換して得られたキトビアーゼ溶出液のDEAE
−セフアデツクスA−50によるカラムクロマトグ
ラムを示す図面である。
ン交換して得られたキトビアーゼ溶出液のDEAE
−セフアデツクスA−50によるカラムクロマトグ
ラムを示す図面である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 アエロモナス・ヒドロフイラ・亜アネロゲネ
スA25(微工研菌寄第7206号)を培地に培養し、
その培養物から下記の理化学的性質を有するキト
ビアーゼを採取することを特徴とするキトビアー
ゼの製造法。 作用:キチナーゼと共に作用してキチンを分
解する。 至適PH:PH7.0 Km:p−ニトロフエニル−N−アセチルグ
ルコサミニド0.17mM PH安定性:37℃で30分処理した場合、PH6.0
〜PH9.0において90%以上の残存活性を示す。 至適温度:PH7.0において、p−ニトロフエ
ニル−N−アセチルグルコサミニドを基質とし
た場合50℃付近にある。 温度安定性:p−ニトロフエニル−N−アセ
チルグルコサミニド基質で、PH7.0において、
0〜40℃、30分処理で80%以上の残存活性を示
す。 等電点:PH6.8付近 分子量:115000
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16296083A JPS6054682A (ja) | 1983-09-05 | 1983-09-05 | キトビアーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16296083A JPS6054682A (ja) | 1983-09-05 | 1983-09-05 | キトビアーゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6054682A JPS6054682A (ja) | 1985-03-29 |
JPH0257917B2 true JPH0257917B2 (ja) | 1990-12-06 |
Family
ID=15764547
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16296083A Granted JPS6054682A (ja) | 1983-09-05 | 1983-09-05 | キトビアーゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6054682A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS56140406A (en) * | 1980-04-03 | 1981-11-02 | Kubota Ltd | Automatic control device of agricultural machine |
-
1983
- 1983-09-05 JP JP16296083A patent/JPS6054682A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JOURNAL OF CLINICAL MICRODIOLOGY=1982 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6054682A (ja) | 1985-03-29 |
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