JPH0254907B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 要 約 この発明は、生細胞の化学的或は物理的な特性
または動態を基準として生細胞の集団を識別して
選別する方法と装置に、関するものである。この
発明の生細胞選別方法は、不所望の細胞（分離し
て得ようとはしない細胞）を破壊するため、及
び／または、細胞集団中において所望の細望（分
離して得ようとする細胞）の周辺域を分断するた
めに、放射光線（radiant energy beam）を用い
るものである。 従来技術 一般に復合混合物の化学分析の中心課題は、特
定の成分を分離し精製することにある。精製され
た均質の成分は次いで、その物理的な特性により
特徴付けられる。過去において細胞生化学でこの
ことは、ゲル・クロマトグラフイによる酵素或は
レセプターたん白質の細胞からの分離を意味し、
細胞の破壊を伴なつていた。 新たな培養技術と培地の出現に伴ない、培養物
中に全ゆるタイプの細胞系を増殖させることが可
能となつて来ている。これによつて、細胞及び膜
成分についての生化学的分析を行なうのに十分な
量の細胞を増殖させて得ることが、できるように
なつている。しかしこのアプローチ法での主要な
問題として、比較的特定した細胞フアミリー或は
集団内においても異別の機能へと連らなる細胞表
面構造の多様性の問題がある。例えば免疫系のＴ
細胞は、異なつた特性及び機能を持つ細胞亜集団
を有する。このことからして研究者は、上述した
たん白質の分離と精製についてのアプローチ法に
直接的に類似した方法で、限定した特徴を基準と
して細胞を各別の亜集団へと分離するための方法
論と器械装置化とを目指して来ている。混合ポリ
マー法が表面特性に基づき細胞を分離するために
採用されて来ており、また細胞電気泳動法が表面
電荷により細胞を分離するために使用されて来て
おり、さらに固相レクチン及び抗体が、細胞分離
のために膜たん白質中の異別構造決定要素を識別
するために開発されて来ている。 最近、螢光測定細胞鑑別器が市販されるように
なつている。この種の鑑別方法及び装置の大きな
利点は、結合した螢光標識ないし螢光プローブ
（通常は共有結合で結び付いた螢光色素を含む抗
体またはレクチン）の差異に基づいて細胞が大き
な集団へと分離される点にある。この従来装置で
の稼動パラメーターの選択法は、即に確立されて
いる。細胞は、螢光或は他の光の作用による挙動
差に基いて分離管中へと選別される。選別された
細胞は、それを一層富化するために長い時間、装
置中を移動可能である。この方法で約１×10⁷個
の細胞、つまり特徴付けのために分析するのに十
分な量の細胞を、約１時間から２時間で選別して
得るこができる。 螢光活性細胞選別器（fluorescence
activatedcell sorter）（アメリカ合衆国、カリホ
ルニア州、サニーペールのベクトン・デイキンソ
ン社−Becton Dickinson−及びアメリカ合衆国、
フロリダ州、ヒアリーのクールタ・エレクトロニ
ツクインコーポレーテツド−Coulter
Electronic，Inc.−のFACSシステム）は、コン
ピユータにより集中制御され、螢光、サイズ（寸
法）及び生存性を基準として個別的な細胞を分析
及び分離可能である単一レザー・ユニツトを用い
ている。電子工学的に行なわれ記録される測定
が、細胞の選別と共に、或は同選別なしに、なさ
れ得る。選別は、流動系内での個々の細胞につい
ての静電誘導により達成される。レーザーは、螢
光用の光源として用いられている。サイトフルオ
ログラフ・システム（cytofluorograph system）
（アメリカ合衆国、マサチユーセツツ州、ウエス
トウツドのオルソ・ダイアグノスチツク・システ
ムズ・インコーポレーテツド−Ortho
Diagnostic Systems，Inc.）は、２個のレーザー
光線を同様の態様で利用しサイズ、螢光及び／ま
たは屈折率の測定に基づき静電誘導により分離し
ている。 この従来の方法論と装置は化学的な特性を基準
として細胞の均質な集団を得ることに関し主要な
技術上の突破口を代表するものではあるが、その
有用性は次のように制限される。 (1) これらは全て貫流システムであることからし
て、ポンプの影響を受け易いと共にどのような
流体系においてもみられる詰まりの問題を有す
る。 (2) 細胞を貫流させる長尺のプラスチツク管内を
減菌状態に維持することが、極めて困難であ
る。 (3) 装置内を貫流する細胞が受ける衝撃及び衝突
が細胞膜に有害な影響を及ぼし、細胞の未知の
応動が結果すると共に、或る場合には細胞が死
滅する。 (4) たいていの場合に細胞の鑑別が細胞に付され
た構造上の標識（マーカー）によつてのみ行な
われ、細胞表面成分の回転及び並進拡散の差の
ような膜特性の差に基づく細胞の単離及び選別
を行なう能力を有しない。膜特性は、例えばホ
ルモンとか成長因子のように細胞刺激現象にお
いて重要であることが示されている。 (5) 貫流細胞測定装置の主要な欠点は、分離のた
めに細胞を懸濁させて用いる必要がある点にあ
る。これよりして本技法は、プレートないし面
上に載置された培養物中で増殖しつつある細胞
を鑑別し分離するといつた利用法を、排除する
ものとなつている。細胞の特性は形状により劇
的に変わり得る。したがつて正常の形状に極力
近い形状で細胞を選別することが肝心である。
また細胞形状と最終機能間には高い相関々係が
あり、この両者は細胞が増殖する面によつて影
響される。特定の面上で増殖しつつある間に細
胞を分離するのが望ましいこと、明らかであ
る。市販の装置ではそれが不可能である。 コペル（Koppel）等はBiophysics Journal
28，281−291（1979）において、プレート上にの
せられた細胞を、細胞の表面に光点を集中させる
のに十分な光エネルギーでもつて照射し、次いで
螢光標識された分子が露光領域へと移動する過程
を追跡するのに、レーザーを使用することを開示
している。 このコペル等の装置では、場合によつては細胞
が偶然にレーザー光線で殺されうるが、同装置は
露光法を実施するためにのみ適したものである。
細胞に対し栄養培地を供給するような機構は設け
られておらず、また細胞が殺害された場合にそれ
を、酵素及び他の細胞成分は後に残して除去する
ような手段も、設けられていない。死滅細胞成分
は、残された生存細胞に対し重大に影響する。コ
ペル等の装置は、細胞を選別する方法において決
つして使用できるものではない。 他の従来技術としてはレーザーエネルギーによ
る細胞或は細胞成分の破壊法があり、同技術を開
示した文献としては(1)Higgins et.al.，J.
Neurosc.Meth.，３，１，1980.(2)Bessis in
Advances in Biological and Medical
Physics，Academic Press，New York，1970.
(3)Mosley et.al.，in Proc.Natl.Acad.Sci.78，
９，1981.(4)Lepock et.al.，Biochem.Biophys.
Res.Comm.91，３，1979.(5)Berns，in Jour.Cell
Biol.75，３，1975がある。 これらは全て紫外線或は凝集照射線の破壊力
を、選択した標的を破壊する目的で利用するもの
であつて、生命を維持する環境内で細胞を生存し
たままで選別する目的のものではない。この従来
技術を適用できる領域としては消耗（アブレーシ
ヨン）研究、細胞自滅研究（消極的選別）、器管
顕微手術、治療的細胞破壊、及び他の細胞鑑別と
は関係のない領域がある。 目 的 したがつてこの発明の一つの目的は、最も理想
的な細胞条件の下で細胞を選別するために、電磁
的な放射線を発生させる手段であつて不所望の細
胞を破壊するため及び／または所望の細胞を分別
するための減光手段を備えた手段を用い、細胞を
生存状態で積極的に選別する生細胞選別方法及び
装置を、提供するにある。 この発明の他の目的は、放射光線による細胞破
壊をコンピユータ制御により行なうようにした生
細胞選別装置を、提供するにある。別の目的は、
環境制御されたプレート上に設けられた細胞を選
別可能である装置を、提供するにある。 この発明の他の一つの目的は、細胞の選別基準
として細胞の特性及び標識検知を利用する装置
を、提供するにある。 この発明の別の一つの目的は、細胞鑑別の基準
として細胞の経時的な挙動態様、つまり動態を利
用できる長期間選別法を実施可能とする装置を、
提供するにある。 この発明の他の目的は、細胞の選別基準として
１より多細胞パラメーターを利用できることとし
てある装置を、提供するにある。すなわち例え
ば、未熟な細胞の場合には物理的特性に基づく選
別を、成熟したものである場合は膜特性に基づく
選別を、それだれ行なえることとし、また細胞成
長期の如何に拘らずより精密な選別を達成するた
めに順次的に多次元探査を行なう能力を有せしめ
ようとするものである。 別の目的は、細胞を乱すことなくその自然な形
態において選別することを効果的、且つ、十分に
達成する生細胞選別法を、提供するにある。 別の目的は、従来の輸送選別法を適用しえない
タイプの細胞について有効である装置を、提供す
るにある。 最後にもう一つの目的は、順次的な救命或は破
壊過程により細胞の死滅が決定されて、培養中の
個別細胞の変化を、細胞を破壊することなしに鑑
視する能力を有する装置を、提供するにある。 この発明の諸目的及び特徴とするところは、以
下の記述と図面とを参照することにより、より明
確となる。 一般的な説明 この発明の生細胞選別方法は、所望の代謝しつ
つある生細胞を選別する方法であつて、 (a) 細胞を個別的に逐次、或は一連の細胞を同時
に検視する対物レンズを備えた顕微鏡下に、潅
流する液体増殖培地を含むプレート上或は該プ
レート上にのせた可塑性フイルム上に細胞を固
定して設け、 (b) 上記対物レンズを通して細胞に照射する光線
を、所望の細胞が減光されていない光線で照射
されないように、且つ、所望の細胞が減光され
た光線に対する光学的反応に基づき鑑別される
ように、選択的に減光すると共に、 (c) 上記対物レンズを通して個別的な細胞或は一
連の細胞に対し、或は同細胞の周辺域に対し、
上記プレート上の不所望の細胞を殺すか上記フ
イルム上の所望の細胞を分別するようなエネル
ギーを有する集中放射光線を、選択的に照射し
て、所望の細胞を上記したプレート或はフイル
ム上に残して不所望の細胞を除去する、 ことを特徴としてなる。 またこの発明の生細胞選別装置は、不均質な生
細胞集団から所望の生細胞集団を、生細胞の化学
的或は物理的特性または動態を基準として選別す
るための生細胞選別装置であつて、 (a) プレート１７，３３１上或は該プレート上に
除去可能にのせたフイルム３１２上に固定され
た細胞の不均質な集団を座標系に沿つて、或は
個別的に逐次、走査するための対物レンズ１５
ａを備えた顕微鏡１４であつて、上記したプレ
ート或はフイルム上に液体増殖培地を潅流させ
る手段を備えている顕微鏡１４と、 (b) 生細胞の特定の化学的或は物理的特性または
動態に基づいて個別的な生細胞を、上記対物レ
ンズを介して識別する検出手段２７，１０６
と、 (c) 集中放射光線１１，１５を発生するための放
射光線発生手段１０，１１，１２，１３であつ
て、上記プレート１７，３３１上で個別的な細
胞或は一連の細胞に対し、或は同細胞の周辺域
に対し、上記対物レンズを通して放射光線を集
中させるように、上記顕微鏡１４と組合せてあ
る集中放射光線発生手段１０，１１，１２，１
３と、 (d) 上記放射光線を選択的に減光するための可動
の減光手段１２であつて、上記放射光線の径路
中に出入りするように制御され該径路外へと位
置せしめられると上記したプレート或はフイル
ム上の個別的な細胞を殺すか分別するような強
度で上記放射光線がプレート上を照射すること
とする減光手段１２と、 を備えて成る。 さらにこの発明は、不均質な生細胞集団から所
望の生細胞集団を、生細胞の化学的或は物理的特
性または動態を基準として選別するための生細胞
選別装置であつて、 (a) プレート１７，３３１上或は該プレート上に
除去可能にのせたフイルム３１２上に固定され
た細胞の不均質な集団を座標系に沿つて、或は
個別的に逐次、走査して不均質な細胞集団を検
視するための対物レンズ１５ａを備えた顕微鏡
１４であつて、上記したプレート或はフイルム
上に液体増殖培地を潅流させる手段を備えてい
る顕微鏡１４と、 (b) 上記プレート或は対物レンズまたは光線の少
なくとも何れかを、対物レンズ１５ａが不均質
な細胞集団中の各細胞を走査し検視するよう
に、ｘ−ｙ座標面内で移動させるための駆動手
段１００と、 (c) 生細胞の特定の化学的或は物理的特性または
動態に基づいて個別的な生細胞を、上記対物レ
ンズを介して識別する検出手段２７，１０６
と、 (d) 集中放射光線１１，１５を発生するための放
射光線発生手段１０，１１，１３であつて、上
記放射光線を、上記対物レンズ１５ａを通して
該対物レンズにより検視される個別的細胞或は
一連の細胞に対し、或は同細胞の周辺域に対
し、照射するように誘導するためのレンズ２２
及びミラー１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ，
１３ｅを備えている放射光線発生手段１０，１
１，１３と、 (e) 上記放射光線を選択的に減光するために該放
射光線の径路中へと可動の減光手段３２，３
３，３４，３５，３６と、 (f) 上記減光手段を上記した放射光線の径路中へ
と選択的にもたらすように作動を制御される移
動手段３２，３３，３４，３５，３６と、 を備えており、上記移動手段によつて上記減光手
段が放射光線の径路中へともたらされたときに上
記検出手段が残すべき細胞を識別し、また集中放
射光線により不所望の細胞を殺すか、所望の細胞
の周辺域で上記フイルムを溶融するか或は該フイ
ルムを上記プレートへと除去可能に粘着した状態
で切断するように、上記減光手段が上記移動手段
により放射光線の径路外へと移動せしめられるよ
うに、構成された生細胞選別装置を、提供するも
のである。 上記した装置は、放射光線の径路から減光手段
を取去ることにより選択的に、放射光線によつて
不所望の細胞を殺すか或は所望の細胞を切り離し
て分別するようにして、細胞を選別するように用
い得る。 このような装置使用法によるとき、プレート上
の一連の細胞を、ｘ軸に沿い、次いでｙ軸に沿
い、完全に走査した上で、放射光線の径路から減
光手段を取去つて座標系を再走査し上記した一連
の細胞を選別するように、装置を使用できる。 明細な説明 光学系 第１，２図に示すように、レーザー１０のよう
な放射光線発生手段が光線１１を発生する。レー
ザー１０は、アルゴン型のものであることが望ま
しく、約300−560ナノメートル間の波長の光を発
生しうる。光線１１は、該光線１１の径路中に設
けられた減光手段１２により過される。第２図
に図示のミラー１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ
及び１３ｅのような光線偏向手段１３が、顕微鏡
１４内へ光線を附与するのに用いられる。集中光
線（focussed beam）１５は、対物レンズ１５ａ
により附与される。この集中光線１５は、例えば
直径が約10ミクロンの核を有する直径40ミクロン
の細胞のようにずつと寸法が大である細胞と対比
して、直径が約１ミクロンである。 顕微鏡のステージ１６は、運動抑制細胞（図示
せず）を支持するためのプレート１７を支持して
いる。このステージ１６は後に第５図を参照して
説明するように、集中光線１５に対し垂直なｘ−
ｙ座標面で可動である。ミラー１３ｃ及び１３ｄ
は、集中光線１５によりｘ−ｙ座標面内でプレー
ト１７を走査するように、モータ１８及び１８ａ
により移動せしめられる。ステージ１６が後述す
るように移動するとすれば、モータ１８，１８ａ
が不要となる。ダイヤフラム１９及び２０を、被
覆シヤツター２１として光線を制御するのに使用
できる。レンズ２２はミラー１３ｃ，１３ｄが動
くとき、光線１５がｘ軸或はｙ軸上で曲がること
なく移動することを設ける。 ミラー１３ｅは二色性ミラーであり、プレート
１７からの発射先２３は同ミラー１３ｅを透過す
る。バリアー・フイルタ２４は、選択された螢光
のみを通過させる。発射光２３の径路には、ミラ
ーないし格子部材２５を設けてある。シヤツター
２６は、光が瞬時的に増倍型光電管（光電子増倍
管）２７方向へと通過するのを許容する。 図示のレーザー顕微鏡装置の基本的な構成要素
は、減光手段１２及び後述するように独特の動き
をするステージ１６を除いては、前述したコペル
（Koppel）の論文に詳細に記載されている。レー
ザーはアメリカ合衆国、カリホルニア州、サニー
ペールのレクセル・インコーポレーテツド
（Lexel，Inc.）から入手でき、顕微鏡はアメリカ
合衆国、ニユージヤージイ州、ロツクレイのライ
ツ・インコーポレーーテツド（Leiz，Inc.）から
入手でき、また可動のミラー１３ｃ，１３ｄはア
メリカ合衆国、マサチユーセツツ州、ウオータス
タウンのゼネラル・スキヤニング・インコーポレ
ーテツド（General Scanning，Inc.）から入手
できる。 減光手段１２は、流体圧作動アクチユエータ３
２，３３，３４及び３５により光線１１の径路に
出入りするように動かされるフイルタ２８，２
９，３０及び３１を有している。フイルタ２８は
第２図に破線で示すように、アクチユエータ３２
により光線１１の径路外の位置２８ａへ動かされ
る。残りのフイルタ２９−３１も、同様の態様で
動かされる。バルブＶによりアクチユエータ３２
−３５の作動が制御される。空気圧ライン３６に
よりアクチユエータ３２−３５に対し、圧縮空気
が供給される。 顕微鏡は通例の双眼視検手段３７、サポート３
８及び手動調整ノブ３９を、備えている。 電子制御系 第１図及び第３図には、本発明装置の電子制御
系の要素を図示してある。ステージ１６には後に
詳述する電子作動制御手段１００が設けられてい
て、同手段１００により光線１１に垂直なｘ−ｙ
面上でステージ１６が移動せしめられる。逆にミ
ラー１３ｃ及び１３ｄ用のモータ１８及び１８ａ
を電気的に動かすことも、可能である。ステージ
１６の動きは、デイスク１０２に貯えてあるプロ
グラムに従い作動するコンピユータ１０１によつ
て、制御される。コンピユータ１０１は、ビデ
オ・デイスプレイ１０３と端子１０４に接続され
た記録計（図示せず）を備えている。顕微鏡１４
は、ステージ１６からの螢光収集ユニツト１０５
として機能する。前記した増倍型光電管２７は螢
光検出器１０６として機能し、螢光を積算及び／
または測定する手段１０６ａを備え、その積算値
ないし測定値はコンピユータ１０１により記録さ
れる。したがつてコンピユータ１０１は、ステー
ジ１６の動きを制御すると共にプレート１７上の
螢光の有無を記録する。比較的ゆつくりと作動さ
せるのであればコンピユータ１０１を設けないシ
ステムを使用できようが、このときは精度がずつ
と落ちると共に速度が無いのも同然に遅くなろ
う。レンズ１５ａは光線１１を集光させ、ミラー
１３ａ−１３ｅは光線を偏向させて方向付け、減
光手段１２は前述したように光線を過して減光
する。 第３図に示すように検出器ないし増倍型光電管
２７はコンピユータ１０１に対してスイツチ１０
７を介し、(a)アメリカ合衆国、コネクチカツト
州、グロトンのプレシツシヨン・プロダクツ・イ
ンコーポレーテツド（Precision Products，
Inc.）製の波高弁別回路１０８とカウンタ１０９
とを経て、入力装置（インタフエース）１１０を
介しコンピユータ１０１へ、或は(b)アナログ増巾
器１１１を用いる比率測定回路（rate
measuring circuit）と12ビツトのAD変換器１１
２とを経て、上記入力装置１１０を介しコンピユ
ータ１０１へ、接続されることとされている。こ
れらの回路構造自体は既に周知である。 細胞環境制御 第４，５及び６図は、ステージ１６上で細胞環
境制御を行なうのに適したプレート１７を示して
いる。容器２００には容器２０２及び２０３から
細胞増殖培地の混合物がライン２０１を通し、容
器２０２，２０３をライン２０１へと接続するラ
イン２０４，２０５中のバルブＶにより制御され
つつ、供給される。容器２０６は容器２００に対
し必要なガスを、ライン２０７中のバルブＶを通
して供給する。ポンプＰは容器２００の混合培地
と気体とを、ライン２０６を介しプレート１７へ
と供給するもので、その詳細は第５，６図に示さ
れている。ライン２０９は、費消された培地を廃
物容器２１０へと放出する。培地の諸特性を鑑視
することは、温度、二酸化炭素、酸素及び水素イ
オン濃度を感知する複数個の変換器（トランスデ
ユーサ）により行なわれ、これらの変換器はユニ
ツト２１１へと接続される。 ステージ１６は、ｘ軸方向への移動のためのモー
タ３００とｙ軸方向への移動のためのモータ３０
１とを備えている。同移動は、ネジ軸３００ａ及
び３０１ａにより行なわれる。ネジ軸３００ａ，
３０１ａはそれぞれ、基台３０５上でｘ軸方向に
スライドする第１の可動ホルダ３０４及びこの第
１の可動ホルダ３０４上でｙ軸方向にスライドす
る第２の可動ホルダ３０６へと、板３０２，３０
３を介して接続されている。このようなステージ
は、アメリカ合衆国、マサチユーセツツ州、サウ
ス・ナチツクのイーリング（Ealing）社から入手
可能である。 第２の可動ホルダ３０６には、サポート３０７
の基部３０７′ａを嵌合支持する凹溝３０６ａが
設けられている。サポート３０７には間欠配置し
て溝穴３０７ａ，３０７ｂ，３０７ｃを形成して
あり、第４図に図示の前記ライン２０８，２０９
へと接続される入口導管３０９及び出口導管３１
０を有する容器３０８が、上記溝穴３０７ａ，３
０７ｂ，３０７ｃにてサポート３０７に受け支持
させてある。容器３０８は一体的な台座３０８
ａ，３０８ｂ及び３０８ｃを有し、増殖する細胞
を担持するスライドグラス３１１ａ，３１１ｂ及
び３１１ｃが該台座３０８ａ，３０８ｂ，３０８
ｃに支持される。サポート３０７には、対物レン
ズ１５ａにより細胞を検視しないときに容器３０
８を完全に覆うようにサポート３０７上でカバー
グラス３１３の位置拘束を行なうための締め金具
３１２を、備えている。スライドグラス３１１ａ
−３１１ｃ上の細胞を対物レンズ１５ａにより検
視する間はカバーグラス３１３が取除かれるが、
容器３０８を横切つて培地の流れはなお可能であ
る。 第６ａ，６ｂ及び６ｃ図に示すように、本発明
に従つた変形例では細胞を担持するスライドグラ
ス３１１ａ上に載せた薄いフイルム３１２が利用
され、不所望の細胞を該フイルム３１２と共に除
くために、光線１５により所望の細胞の周辺域で
同フイルム３１２が切断されるかスライドグラス
３１１ａへと融合される。第６ａ図ではフイルム
３１２を備えた１枚のスライドグラス３１１ａが
図示されている。フイルム３１２は一般に約５−
200ミクロン厚のもので、スライドグラス３１１
ａと接触させてあり、細胞はフイルム３１２とは
反対の側で増殖する。フイルム３１２は、ポリ塩
下ビニルのような熱可塑性物質から成るものであ
るのが、望ましい。フイルム３１２はまた、所望
する細胞の周辺域で同フイルム３１２を光線１５
が切断して不所望の細胞がスライドグラス３１１
ａからフイルム３１２と共に除去されうるよう
に、接着剤によりスライドグラス３１１ａに対し
除去可能に結合することもできる。逆にフイルム
３１２の一部を光線１５により融かさせてスライ
ドグラス３１１ａへと融合させるようにすること
も、できる。何れの場合にも、スライドグラス３
１１ａ上へと融合されたフイルム３１２から、所
望する細胞を担持する円盤状部分３１３を後に残
して、不所望の細胞及びフイルム３１２部分を剥
ぎ取ることができる。 この発明に従つて改良された方法は、多数の細
胞中から少数の所望の細胞を選別するのに大きく
役立つ。何故なら同方法は、所望する細胞に影響
を及ぼし得る細胞屑をほとんど生ぜしめないから
である。細胞集団中に不所望の細胞が僅かしかい
ない場合には、不所望細胞殺害法を採用するのが
望ましい。 光吸収物質をスライドグラス３１１ａ上に、フ
イルム３１２を用いるときは該フイルム３１２の
下方で、設けることができる。このような物質
は、光線を利用しての細胞殺害或はフイルム３１
２の切断または溶融を容易とする。 光線を用いての切断或は溶融による所望細胞の
分別を含む方法を、不所望細胞の殺害を含む方法
と組合せうるべとが、理解されるできである。１
分別手順のためにそのような組合せを利用するこ
とは、増殖培地中で所望細胞に対し影響を及ぼす
細胞屑の関与からして、特別の利点はない。 操作と作用 この発明は生体膜内での拡散の特徴把握のため
に定量技術を利用するものであり、これによつ
て、構造的及び／または物理的パラメーターの差
異に基いて細胞の特定亜集団を鑑別することを可
能とする走査システムを開発する上で、レーザー
技術の採用を可能ならしめた。細胞は、それがス
ライドグラス３１１ａ−３１１ｃ或はフイルム３
１２上で支持されていることから動きえず、また
細胞の生存能力を保つのに最大限に有利な状態で
保持される。かかる方法の中心概念は、所望特性
を有する細胞はフイルム３１２上にあるとき細胞
を破壊可能な高強度レーザー光線１５のパルスか
ら免れて区分されるといつた点に、ある。このよ
うにして限定した特性を有する細胞が高濃度に富
化される。本システムの意義ある特長は、スライ
ドグラス３１１或はフイルム３１２上で培養され
た細胞が富化のために使用される点にある。これ
よりして結果する選別細胞の化学分析により得ら
れる最終的な生物学的情報の適切性が、大きく高
められる。 光線１１の強度は空気圧にて作動されるアクチ
ユエータ３２−３５により光線１１の径路に対し
出入りせしめられる１或は複数個の濃度フイルタ
２８−３１にて制御され、上記アクチユエータ３
２−３５はコンピユータ１０１により望ましくは
互いに異なる16の減光レベルが得られるように制
御される。光線についての減光を得るために使用
できる他の機器としては、周波数フイルタ
（acousto−optical）及び／または電気光学フイ
ルタ（electro−optical）がある。一連のダイヤ
フラム１９，２０及びミラー１３ａ−１３ｅは、
外部螢光照明可能な顕微鏡１４の背後へと光線１
５を誘導する。対物レンズ１５ａは、レーザー光
線１５の最終焦点を細胞が存在する面へと調整す
る。二色性ミラー１３ｅは、レーザー光線１５が
対物レンズ１５ａを通して下方へ反射せしめられ
るようにすると共に、熱電的に冷却されたハウジ
ング２７ａ中に設置してある前記増倍型光電管２
７へと試料レミネツセンスが伝達されることを可
能とする。光電管２７の前面に設置してある前記
電子シヤツター２６は、高レベルの照射を受けな
いように光電管２７を保護する。増倍型光電管２
７からの信号は、処理及び出力のためにコンピユ
ータ１０１へと供給される。 本発明に従つた細胞選別の主要な特長は、選別
サイクル中に最適の増殖条件を保持する点にあ
る。微潅流容器３０８によつて細胞のための制御
された環境が提供され、同環境はさらにコンピユ
ータ１０１により制御できる。上記した容器３０
８は金属質のものであるが好ましく、第４図に図
示のシステムにおいて温度制御のための熱貯蔵
器、潅流選択容器、及び培地流とガス混合のため
の制御バルブを提供する。同容器３０８はまた、
例えば不連続の成長物質添加とか間欠的な露光と
かいつた、時間的に変動させるパラメーターを附
与するための容器としても、機能する。増殖する
培養物の無雑菌性は、容器３０８の潅流性により
維持される。作動距離が短かい対物レンズ１５ａ
は、使用前に減菌されて増殖培地中に置かれる。
作動距離が長い対物レンズは浸漬する必要がな
い。細胞は容器３０８中で潅流する培地に常時ひ
たりつつ、約144mm²であることが望ましい領域で
増殖せしめられる。 細胞選別のために３種類の手法を利用できる。
すなわち螢光標識の探知に基づく細胞選別、測定
される物理的特性に基づく細胞選別、及び測定さ
れる動態特性（経時的な変動特性）に基づく細胞
選別の３手法を利用できる。 選別は次のように行なわれる。すなわち、細胞
がスライドグラス３１１ａ−３１１ｃ上で増殖さ
れる。スライドグラス３１１ａ−３１１ｃ上には
フイルム３１２を載せてもよい。これらのスライ
ドグラス３１１ａ−３１１ｃ（またはフイルム３
１２）の端縁に強螢光物質を塗布する。低強度の
探査光線１５を、視界のｘ軸に沿い移動させる。
同軸上で復帰移動時に、不所望の細胞を殺すかフ
イルム３１２上に所望の細胞を分別するように高
強度の光線１５へと切替える。しかし探査光線の
移動中において螢光が検出されたならば、光線１
５は復帰過程で減光される。増倍型光電管２７に
よる分別信号の積極的な検出により、選択された
細胞の生存が確保される。スライドグラス３１１
ａ−３１１ｃ上の端縁螢光物質の検出は、レーザ
ー光線１５の走査領域の境界を確認させる。オペ
レーターは、プレート１７上に減光された探査光
線をセツトするのみでよい。この点から全領域の
走査がコンピユータ１０１により自動的に、且
つ、制御されつつ行なわれる。 積極的細胞選別は、内部螢光及び偏光解消のよ
うな物理的特性の測定と標識探知とに基づいて行
なえる。より複雑な用途に対しては、実際の短か
い実験を行ない、しかる後、例えば回転拡散及
び／または並進拡散の差とか微粘度といつた膜特
性に基づいて選別が行なえる。何れの場合にもこ
のような過程により、機械的な摂動なしに選別を
受けた生存細胞亜集団ないし機能クローンが分離
される。 このような測定手法を装置化しようとする場
合、最も単純な型式のものからより複雑な型式の
ものへと３つの型式に分けることができる。 第１型式−この型式の装置は、例えば抗体、レク
チン、DNA−RNA間挿染料（DNA−
RNAintercalatingdyes）のように螢光的に標識
付けられた、内部指向或は外部指向の位置特定プ
ローブに対する細胞の親和性に基づき選別を行な
うものに、設計される。この装置の基本的な構成
要素は、アルゴン或アルゴン−クリプトン・チユ
ーナブルレーザー１０と、光線偏向手段１３ａ−
１３ｅ及びシヤツター２１と、顕微鏡１４と、二
次元移動ステージ１６と、光子ないし比率カウン
タ１０６ａとで、ある。同装置はコンピユータ１
０１により制御される。 第２型式−第１型式の装置に増倍型光電管２７よ
り前で発射光線２３の径路に入射光励起偏光計と
モノクロメーター（以上、図示せず。）を附加し
て、各種の螢光偏光解消性染料（例えばDPH）
の偏光値に基づき細胞分別を行なえることとする
と共に、細胞に結合或は吸収された染料について
異なつた螢光発光プロフイルを有する細胞を鑑別
する手段を研究者に提供する。細胞選別は今や、
単に構造要素の存在或は欠除の関数としてよりむ
しろ、細胞の物理的状態の実変動に基づいて、行
なわれることとなる。 第３型式−細胞膜の動的特性の変動は細胞活動
性と密接に関連していることが実証されているこ
とからして、第３型式の装置は並進或は回転拡散
を求める実在時間実験（経時的な動態の観察）に
基づき細胞選別を行なうものに設計される。この
型式の細胞選別は従来の貫流選別システムでは、
前述したようになしえなかつた。細胞が生存可能
な環境におかれ同環境中に保持されることから、
個別の細胞をその動態について探査することに基
づいた長期間選別が可能である。この型式の装置
は第２型式の装置と、主としてコンピユータ１０
１のソストウエア及びデータ処理能力において異
なる。 操作上の限定可能なパラメーター オペレーターにより制御は、打鍵命令により達
成される。選別作業の開始及び終了に加えて、以
下のパラメーターをプログラム制御により設定で
きる。 ａ ２次元で可動のステージ１６の移動につい
て、各移動時の移動量及び移動頻度ないし周
期。 ｂ 分析（探査）用及び破壊（殺害）もしくは溶
融用の光線１１の強度。 ｃ 光線１１の発射強度。 ｄ 鑑別手法−標識測定によるか動態の測定によ
るか。 ｅ 応答の開始点。 ｆ 単一の領域走査か連続的な選別作業か。 ｇ 方法選択−細胞を破壊するか分離するか。 ｈ 下記のステージ１６の条件制御の全て。 温度 培地の混合と潅流 ガス噴射 増殖用添加物の添加制御 露光 予定時間で加える補助的パラメーター 選別分析は今や癌免疫学、血液学、細胞サイク
ル分析学、病理学、生化学、一般免疫学及び定量
細胞学を含むいくつかの学術分野において主要な
研究技術となつている。鑑別分析法に対し興味を
もつ新たな領域は細胞生物学、生薬学、毒物学、
微生物学及び細胞遺伝学において日時、現われつ
つある。細胞選別技術を用いて研究が行なわれて
いる病疾としては白血病、リンパ腫及びその他の
癌、感染症、自己免疫性疾患及び遺伝性疾患があ
る。この発明の装置は、上記したような各種分野
の研究において信頼度の高い細胞選別を可能とす
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の方法を実施するために使
用される生細胞選別装置の好ましい一具体例を示
すブロツク線図である。第２図は、この発明の装
置例におけるレーザー、減光手段及び顕微鏡を示
す模式図である。第３図は、上記した装置例にお
ける検出手段とコンピユータ間の入力機構を示す
ブロツク線図である。第４図は、上記した装置例
における栄養培地を含みうるように構成されてい
るプレート上の細胞に対し栄養培地を連続した流
れとして供給するための手段を示す模式図であ
る。第５図は、第２図に図示したプレートの分解
斜視図であつて、同プレート用のｘ−ｙ座標系で
可動のステージを併せ図示してある。第６図は、
第５図に図示したプレートの縦断正面図である。
第６ａ，６ｂ及び６ｃ図はそれぞれ、所望の細胞
を放射光線により周辺域で切離し所望の細胞を担
持する円盤状部分を残して不所望の細胞をフイル
ムと共に取除きうるようにフイルムを載せてある
スライドグラスを示す模式図である。 １０……レーザー、１１……放射光線、１２…
…減光手段、１３……光線偏向手段、１３ａ，１
３ｂ，１３ｃ，１３ｄ，１３ｅ……ミラー、１４
……顕微鏡、１５……集中光線、１５ａ……対物
レンズ、１６……ステージ、１７……プレート、
１８，１８ａ……モータ、１９，２０……ダイヤ
フラム、２１……被覆シヤツター、２２……レン
ズ、２３……発射光、２４……バリアー・フイル
タ、２６……シヤツター、２７……増倍型光電
管、２８，２９，３０，３１……フイルタ、３
２，３３，３４，３５……流体圧作動アクチユエ
ータ、３６……空気圧ライン、１００……電子作
動制御手段、１０１……コンピユータ、１０６…
…螢光検出器、３０８……容器、３０９……入口
導管、３１０……出口導管、３１１ａ，３１１
ｂ，３１１ｃ……スライドグラス、３１２……フ
イルム、３１３……円盤状部分。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 所望の代謝しつつある生細胞を選別す方法で
   あつて、 (a) 細胞を個別的に逐次、或は一連の細胞を同時
   に検視する対物レンズを備えた顕微鏡下に、潅
   流する液体増殖培地を含むプレート上或は該プ
   レート上にのせた可塑性フイルム上に細胞を固
   定して設け、 (b) 上記対物レンズを通して細胞に照射する光線
   を、所望の細胞が減光されていない光線で照射
   されないように、且つ、所望の細胞が減光され
   た光線に対する光学的応答に基づき鑑別される
   ように、選択的に減光すると共に、 (c) 上記対物レンズを通して個別的な細胞或は一
   連の細胞に対し、或は同細胞の周辺域に対し、
   上記プレート上の不所望の細胞を殺すか上記フ
   イルム上の所望の細胞を分別するようなエネル
   ギーを有する集中放射光線を、選択的に照射し
   て、所望の細胞を上記したプレート或はフイル
   ム上に残し不所望の細胞を除去する、 ことを特徴としてなる、生細胞選別方法。 ２ 不均質な生細胞集団から所望の生細望集団
   を、生細胞の化学的或は物理的特性または動態を
   基準として選別するための生細胞選別装置であつ
   て、 (a) プレート１７，３３１上或は該プレート上に
   除去可能にのせたフイルム３１２上に固定され
   た細胞の不均質な集団を座標系に沿つて、或は
   個別的に逐次、走査するための対物レンズ１５
   ａを備えた顕微鏡１４であつて、上記したプレ
   ート或はフイルム上に液体増殖培地を潅流させ
   る手段を備えている顕微鏡１４と、 (b) 生細胞の特定の化学的或は物理的特性または
   動態に基づいて個別的な生細胞を、上記対物レ
   ンズを介して識別する検出手段２７，１０６
   と、 (c) 集中放射光線１１，１５を発生するための放
   射光線発生手段１０，１１，１２，１３であつ
   て、上記プレート１７，３３１上で個別的な細
   胞或は一連の細胞に対し、或は同細胞の周辺域
   に対し、上記対物レンズを通して放射光線を集
   中させるように、上記顕微鏡１４と組合せてあ
   る集中放射光線発生手段１０，１１，１２，１
   ３と、 (d) 上記放射光線を選択的に減光するための可動
   の減光手段１２であつて、上記放射光線の径路
   中に出入りするように制御され該径路外へと位
   置せしめられると上記したプレート或はフイル
   ム上の個別的な細胞を殺すか分別するような強
   度で上記放射光線がプレート上を照射すること
   とする減光手段１２と、 を備えている生細胞選別装置。 ３ 不均質な生細胞集団から所望の生細胞集団
   を、生細胞の化学的或は物理的特性または動態を
   基準として選別するための生細胞選別装置であつ
   て、 (a) プレート１７，３３１上或は該プレート上に
   除去可能にのせたフイルム３１２上に固定され
   た細胞の不均質な集団を座標系に沿つて、或は
   個別的に逐次、走査して不均質な細胞集団を検
   視するための対物レンズ１５ａを備えた顕微鏡
   １４であつて、上記したプレート或はフイルム
   上に液体増殖培地を潅流させる手段を備えてい
   る顕微鏡１４と、 (b) 上記プレート或は対物レンズまたは光線の少
   なくとも何れかを、対物レンズ１５ａが不均質
   な細胞集団中の各細胞を走査し検視するよう
   に、ｘ−ｙ座標面内で移動させるための駆動手
   段１００と、 (c) 生細胞の特定の化学的或は物理的特性または
   動態に基づいて個別的な生細胞を、上記対物レ
   ンズを介して識別する検出手段２７，１０６
   と、 (d) 集中放射光線１１，１５を発生するための放
   射光線発生手段１０，１１，１３であつて、上
   記放射光線を、上記対物レンズ１５ａを通して
   該対物レンズにより検視される個別的細胞或は
   一連の細胞に対し、或は同細胞の周辺域に対
   し、照射するように誘導するためのレンズ２２
   及びミラー１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ，
   １３ｅを備えている放射光線発生手段１０，１
   １，１３と、 (e) 上記放射光線を選択的に減光するために該放
   射光線の径路中へと可動の減光手段３２，３
   ３，３４，３５，３６と、 (f) 上記減光手段を上記した放射光線の径路中へ
   と選択的にもたらすように作動を制御される移
   動手段３２，３３，３４，３５，３６と、 を備えており、上記移動手段によつて上記減光手
   段が放射光線の径路中へともたらされたときに上
   記検出手段が残すべき細胞を識別し、また集中放
   射光線により不所望の細胞を殺すか、所望の細胞
   の周辺域で上記フイルムを溶融するか或は該フイ
   ルムを上記プレートへと除去可能に粘着した状態
   で切断するように、上記減光手段が上記移動手段
   により放射光線の径路外へと移動せしめられるよ
   うに、構成された生細胞選別装置。 ４ 特許請求の範囲第３項に記載の生細胞選別装
   置であつて、コンピユータ１０１を設けてそれに
   より、前記駆動手段１００による前記したプレー
   ト、放射光線もしくは顕微鏡のｘ−ｙ座標面に沿
   つた移動を指示させ、前記検出手段２７，１０６
   による、細胞走査への応答を鑑視させ、また細胞
   が所望のものであるか不所望のものであるかを決
   定するように前記減光手段１２を作動させるよう
   に、構成してなる生細胞選別装置。 ５ 特許請求の範囲第３項に記載の生細胞選別装
   置であつて、前記検出手段２７，１０６を、減光
   された放射光線により生ぜしめられた細胞ルミネ
   ツセンスであつて特定の細胞とは結合し他の細胞
   とは結合しない化学物質を不均質な細胞集団に添
   加することに基づく細胞ルミネツセンスの存在を
   検出する検出装置に構成して、生細胞の選別を該
   ルミネツセンスの有無により検出するように、構
   成してなる生細胞選別装置。 ６ 特許請求の範囲第３項に記載の生細胞選別装
   置であつて、前記検出手段２７，１０６を、減光
   された放射光線により生ぜしめられた細胞ルミネ
   ツセンスを、螢光もしくは燐光の少なくとも何れ
   かの強度或は特性の差を識別可能に検出する検出
   装置に、構成してなる生細胞選別装置。 ７ 特許請求の範囲第３項に記載の生細胞選別装
   置であつて、前記放射光線発生手段がレーザー光
   線１１，１５を発生するレーザー１０を、備えて
   いる生細胞選別装置。 ８ 特許請求の範囲第７項に記載の生細胞選別装
   置であつて、前記レーザー１０がアルゴンを含む
   ガスレーザーであつて約300−560ナノメートルの
   波長のレーザー光線を発生するものである生細胞
   選別装置。 ９ 特許請求の範囲第３項に記載の生細胞選別装
   置であつて、光線強度の減光度を異にする複数個
   の前記減光手段３２，３３，３４，３５，３６
   を、設けてある生細胞選別装置。 １０ 特許請求の範囲第３項に記載の生細胞選別
   装置であつて、前記検出手段２７，１０６が、個
   別的な細胞或は一連の細胞からのルミネツセンス
   の強度を検出して個別的な細胞或は一連の細胞の
   ｘ−ｙ座標系上での位置を確定する増倍型光電管
   を備えており、また前記プレートが、前記検出手
   段によるｘ−ｙ座標面の探査時に探査すべき面の
   末端位置を識別させる螢光帯片を備えている、生
   細胞選別装置。 １１ 特許請求の範囲第１０項に記載の生細胞選
   別装置であつて、前記増倍型光電管２７を、放射
   光線が減光されたときにのみ該光電管へのルミネ
   ツセンスの入力を許容するシヤツター手段２６に
   より、保護してある生細胞選別装置。 １２ 特許請求の範囲第１０項に記載の生細胞選
   別装置であつて、前記検出手段２７，１０６が、
   ｘ軸に沿い、次にｙ軸に沿い、一連の細胞を全て
   検出し、次いで前記減光手段３２，３３，３４，
   ３５，３６が放射光線の径路外へともたらされた
   状態で座標系の走査が反復されて放射光線により
   一連の細胞の選別が行なわれるように、構成して
   ある生細胞選別装置。 １３ 特許請求の範囲第３項に記載の生細胞選別
   装置であつて、 (a) 前記したプレート、顕微鏡もしくは放射光線
   のｘ−ｙ座標面内での移動を指示し、前記検出
   手段による応答を鑑視し、細胞が所望のもので
   あるか不所望のものであるかを決定するように
   前記減光手段の移動を指示するコンピユータ１
   ０１と、 (b) 不均質の生細胞集団に細胞と結合する化学物
   質を作用させることにより生ぜしめられる個別
   的な細胞ルミネツセンスの存在を検出する増倍
   型光電管２７であつて、前記検出手段を構成す
   る増倍型光電管２７と、 (c) 細胞に対し減光された放射光線が照射されて
   いる間のみ、上記倍増型光電管によるルミネツ
   センス検出を可能とするシヤツター手段２６
   と、 を設けてある生細胞選別装置。 １４ 特許請求の範囲第１３項に記載の生細胞選
   別装置であつて、前記プレート１７に設けられた
   液体増殖培地用の容器３０８であつて、細胞の選
   別前及び選別中における温度、溶存ガス圧、光及
   び増殖培地組成を含む環境条件を常時鑑視し選択
   することを可能とする容器３０８を、備えている
   生細胞選別装置。 １５ 特許請求の範囲第１４項に記載の生細胞選
   別装置であつて、環境条件をコンピユータ１０１
   により制御するように、構成してある生細胞選別
   装置。 １６ 特許請求の範囲第１３項に記載の生細胞選
   別装置であつて、前記放射光線発生手段がレーザ
   ー光線１１，１５を発生するアルゴンガスレーザ
   ー１０を、備えている生細胞選別装置。 １７ 特許請求の範囲第１３項に記載の生細胞選
   別装置であつて、前記減光手段１７，１０６が可
   動フイルタ２８，２９，３０，３１を備えてお
   り、前記移動手段が、上記可動フイルタを放射光
   線の径路中に出入りさせる流体圧作動アクチユエ
   ータ３２，３３，３４，３５を備えている、生細
   胞選別装置。 １８ 特許請求の範囲第３項に記載の生細胞選別
   装置であつて、前記検出手段が光検出用の増倍型
   光電管２７を備えており、該光電管に近接位置さ
   せて前記顕微鏡内に、極性及び波長に依存する応
   答を細胞から上記光電管へと提供させる偏光手段
   或はモノクロメータフイルタ２４を、設けてある
   生細胞選別装置。 １９ 特許請求の範囲第３項に記載の生細胞選別
   装置であつて、先ず細胞を個別的に逐次、ｘ−ｙ
   座標面内で走査及び検視し、次いでｘ−ｙ座標面
   内で次の細胞の探査に移る前に検視された個別的
   な細胞を選別するように、構成してある生細胞選
   別装置。