JPH0250425B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

本発明はハプテンの免疫化学的測定試薬および
測定方法に関する。 従来、血液、尿その他の体液中に存在する生物
学的活性を有する微量物質を、免疫化学的手段で
測定する方法は古くから知られている。かかる免
疫化学的測定法として、例えば赤血球を担体とし
て用い、これを抗原又は抗体で感作し、これを被
検液中の抗体又は抗原と反応させ、その際、免疫
化学的凝集又は凝集阻止反応を生起させて、該微
量物質を測定する方法も既に知られている。ま
た、担体として赤血球の代りに、非生物学的粒子
として例えば合成樹脂ラテツクス、ベントナイ
ト、コロジオン、コレステロール結晶、水晶等を
免疫化学反応における固体担体として用いること
も知られている（以上例えば特開昭50−82230号
公開公報）。 さらに、かかる免疫化学的測定法と関連して、
ハプテンの一種である例えばステロイドを蛋白の
リジン残基にアミド結合を介して化学的に結合さ
せたハプテン−キヤリヤー結合物を一種のハプテ
ン抗原として用い、ハプテンを免疫学的に測定す
ることも知られている〔Journal of Biological
Chemistry Vol.228、713−727頁（1957）〕。 また、遊離アミノ基を有する抗原蛋白にハプテ
ンの一種であるステロイドを結合させたものを用
いて哺乳動物に免疫して得られる抗体と、該抗原
蛋白以外の蛋白を該ステロイドに結合することに
より生成するステロイド蛋白複合体で感作して得
られる感作担体とを用いて、試料中のステロイド
（ハプテン）を免疫化学的に測定する方法も知ら
れている（特開昭50−123819号公報）。 上記公知のハプテンの免疫学的測定方法は、い
ずれもハプテンを感作した担体と液状の（未感作
の）ハプテン抗体とを用いるもので、慨して感度
が低く、低濃度でしかハプテンを含んでいない体
液中のハプテンを測定するためには、被検体液を
濃縮しなければならないという重大な欠点があ
る。 このような欠点を避ける方法として、最近に到
つて、ハプテン抗体を担体に感作した抗体感作担
体と、該ハプテン抗体と反応するハプテンを抗原
性のキヤリヤーに結合させたハプテン−キヤリヤ
ー結合物又はこの結合物感作担体とを用いるハプ
テンの免疫化学的測定法が提案されている（特開
昭53−41420号公報）。 しかし、この提案された方法は感度のある程度
は改善は達成されるが、ハプテン抗体を担体に感
作しなければならず、測定試薬の調製が煩雑とな
り、またコスト高にもなる。 そこで、本発明者らは、ハプテン抗体を担体に
感作することなく、また、被検体液の濃縮を必要
とすることなく、血液、尿その他の体液中に存在
する微量ハプテン類を免疫学的に鋭敏に且つ高感
度で測定する方法につき研究を行なつた結果、免
疫学的測定法として、ハプテン又はその化学的変
性物が架橋成分を介して結合した高分子ラテツク
スの未感作のハプテン抗体（抗血清）とを用いる
凝集阻止反応法を採用し、そして該凝集阻止反応
を特定量の水溶性アルカリ金属塩又は水溶性アン
モニウム塩の溶存下に実施することによつて、極
めて高感度に且つ鋭敏に体液中のハプテンを検出
測定することができることを見い出した。 かくして、本発明に従えば、ハプテン又はその
化学的変性物が架橋成分を介して結合した高分子
ラテツクスとハプテン抗体（抗血清）とを用い、
凝集阻止反応により検体中のハプテンを免疫学的
に測定する方法において、該凝集阻止反応を、
0.5〜15ｍmol／mlの水溶性アルカリ金属塩又は
水溶性アンモニウム塩の存在下に行なうことを特
徴とする方法が提供される。 本発明に従えば、血液、尿その他が体液中に微
量成分として存在するハプテンが、ハプテン又は
その化学的変性物が架橋成分（以下「スペーサ」
と呼ぶことがある）を介して結合した高分子ラテ
ツクス（以下（「ハプテン−スペーサ−ラテツク
ス」と呼ぶことがある）とハプテン抗体（抗血
清）とを用いて凝集阻止反応法により検出測定さ
れる。その具体的な測定法は後記実施例に譲ると
して、一般的な測定法を述べれば次のとおりであ
る。 すなわち、例えば、清浄なスライド板上に、１
滴の試験検体（適宜希釈することができる）を置
き、そこへ希釈したハプテン抗体（すなわち抗血
清）を滴下し、さらにハプテン−スペーサ−ラテ
ツクスの水性懸濁液を１滴加え、これら三者を混
合撹拌するか、或いは逆に、清浄なスライド板上
に１滴の検体を置き、先ずハプテン−スペーサ−
ラテツクスの水性懸濁液を１滴加え、次いで希釈
した抗血清を滴下し、これら三者を混合すること
により達成される。１〜３分で試験の結果が観察
され、凝集像を陰性、凝集阻止像（非凝集）を陽
性と判定する。検体中のハプテンの濃度は検体を
適宜希釈して試験を行ない、凝集阻止像を呈する
最高希釈倍数に試薬の測定感度を乗ずることによ
り求められる。 本発明が特徴とするところは、上記凝集阻止反
応において、反応系に水溶性アルカリ金属塩又は
水溶性アンモニウム塩を存在せしめ、かかる塩の
溶存下に免疫学的反応を行なう点にある。 本発明において使用しうる水溶性アルカリ金属
塩又は水溶性アンモニウム塩としては、免疫学的
に不活性であり、水に対する溶解度が少なくとも
0.1ｇ／ml、好ましくは0.3ｇ／ml以上のものであ
れば、無機塩でも有機塩でも使用することができ
るが、一般には無機塩の方が好適である。 しかして、水溶性アルカリ金属塩としては、例
えばナトリウム、カリウム、リチウム、セシウム
等のアルカリ金属の炭酸塩、炭酸水素塩、ハロゲ
ン化物、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸
塩、リン酸塩などの無機塩、或いは酢酸塩、シユ
ウ酸塩、クエン酸塩などの有機塩が挙げられ、具
体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
リチウム、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢
酸ナトリウムなどが好適である。 また、水溶性アンモニウム塩としては、例えば
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、或いは酢酸アンモニウム、シユウ酸アンモ
ニウム等の有機アンモニウム塩が包含され、中で
も塩化アンモニウム及び硫酸アンモニウムが好適
である。 これらアルカリ金属塩及びアンモニウム塩はそ
れぞれ単独で用いることができ、或いは必要に応
じて、２種又はそれ以上組合せて用いることもで
きる。 これらアルカリ金属塩又はアンモニウム塩の凝
集阻止反応系への導入は、好適には、検体及び／
又はハプテン抗体（抗血清）を希釈するための希
釈液（通常、生理食塩水又は緩衝溶液）中に該ア
ルカリ金属塩又はアンモニウム塩を後述する濃度
で予め溶解しておくか、及び／又はハプテン−ス
ペーサ−ラテツクスの水性懸濁液中に予め後記濃
度で溶解しておくことによつて行なうことができ
るが、該塩を混合前の検体、抗血清及びハプテン
−スペーサ−ラテツクスの水性懸濁液のうちの少
なくとも１つに直接該塩を混入せしめても支障は
ない。 しかしながら、本発明において測定試薬を調製
するに当つては、下記の濃度で水溶性アルカリ金
属塩又は水溶性アンモニウム塩を含有するハプテ
ン抗体の水性希釈液を用いることが有利であり、
また、検体希釈用の水性液体（通常生理食塩水又
は緩衝液）中にも下記濃度で上記のアルカリ金属
塩又はアンモニウム塩を含ませておくことが望ま
しい。 本発明によれば、前述したとおり、凝集阻止反
応系に前記アルカリ金属塩又はアンモニウム塩を
0.5〜15ｍmol／mlの濃度で存在せしめる時には、
検体中のハプテンの検出感度が格段に向上し、例
えば後記実施例から明らかなように、かかる塩を
積極的に添加しない凝集阻止反応系に比べて約10
倍以上も感度が高くなることが判明した。該アル
カリ金属塩又はアンモニウム塩の濃度の上限は厳
密に制限されるものではないが、必要以上に多く
用いても、それに伴うだけのメリツトはないの
で、通常は15ｍmol／ml以下の濃度で充分であ
り、好適な濃度範囲は１〜10ｍmol／ml、特に
1.5〜８ｍmol／mlである。上記塩は反応系内で
実質的に完全に溶解すべきであるが、必ずしも
100％完全に解離している必要はない。 かくして、本発明に従えばまた、0.5〜15ｍ
mol／ml、好ましくは１〜10ｍmol／mlの上記水
溶性アルカリ金属塩又は水溶性アンモニウム塩を
含有するハプテン抗体（抗血清）の水性希釈液よ
りなるハプテンの免疫学的測定試薬、並びに(A)
0.5〜15ｍmol／ml、好ましくは１〜10ｍmol／ml
の水溶性アルカリ金属塩又は水溶性アンモニウム
塩を含有するハプテン抗体（抗血清）の水性希釈
液と、(B)ハプテン又はその化学的変性物が架橋成
分（スペーサ）を介して結合した高分子ラテツク
ス（ハプテン−スペーサ−ラテツクス）と、(C)
0.5〜15ｍmol／ml、好ましくは１〜10ｍmol／ml
の水溶性アルカリ金属塩又は水溶性アンモニウム
塩を含有する希釈用水溶液とから成るハプテンの
免疫学的測定試薬系（キツド）が提供される。 以下これら試薬についてさらに詳細に説明す
る。 〔ハプテン〕 本発明においていうハプテンとは、低分子化合
物で、それ自体は抗原性を有しないが、抗原性を
有する物質、例えば蛋白質、多糖類の如き抗原性
を有する高分子化合物と結合して抗原性を示し、
このような抗原性物質で動物を免疫して生成した
抗体と反応性を有するものをいう。かかるハプテ
ンとして、特に、生体内に存在する成分（生理活
性成分およびその代謝産物を含む）および生体に
投与された薬物およびその代謝産物が本発明の対
象とするハプテンとして重要である。かかるハプ
テンとしては、例えば次の如きものが挙げられ
る。 例えば〔〕ステロイド系ハプテンとしては、 (i) 例えばエストロン、エストラジオール、エス
トリオール、エステトロール、エクイリン、エ
クイレニン等の卵胞ホルモン、 (ii) 例えば、プロゲステロン；プレグナンジオー
ル；プレグナントリオール；19−ノル−エチス
テロンおよび酢酸クロルマジノン等の合成黄体
ホルモン等の黄体ホルモン、 (iii) 例えば、テストステロン、デヒドロエピアン
ドロステロン、ジヒドロテストステロン、アン
ドロステロン、エチオコラノロン等の男性ホル
モン、 (iv) 例えばコルチゾール、コルチゾン、デオキシ
コルチコステロン、アルドステロン、テトラヒ
ドロ−アルドステロン、テトラヒドロコルチゾ
ール等の副腎皮質ホルモン、 (v) ビタミンＤ類；コレステロール；例えばコー
ル酸、デスオキシコール酸、ケノコール酸等の
胆汁酸；強心性ステロイド；サポニン；サポゲ
ニン等のその他のステロイド類、 をあげることができる。また、 〔〕生理活性アミン類としては、 (i) エピネフリン、ノルエピネフリン、ドパミ
ン、エフエドリン等のカテコールアミンおよび
それらの代謝産物； (ii) モルフイン、コデナン、ヘロイン、モルフイ
ングルクロナイド、コカイン、メスカリン、パ
パベリン、ナリコチン、ヨヒンビン、レセルピ
ン、エゴタミン、ストリキニーネ等の生理活性
アルカロイド類； (iii) LSD、アンフエタミン、メプロバメート、
メタアンフエタミン等、 の如きアミノ基含有薬物等をあげることができ
る。 さらにまた〔〕、その他のハプテン類として
は、TRH、LH−RHの如き抗原性を有しない低
分子ペプチド類；ジヨードサイロニン、トリヨー
ドサイロニン、サイロキシン等の甲状腺ホルモ
ン；プロスタグランジンE₂、プロスタグランジ
ンE₃、プロスタグランジンF₁α等のプロスタグラ
ンジン類；ビタミンＡ、ビタミンＢ類（例えばビ
タミンB₁、B₂、B₆、B₁₂等）、ビタミンＥ、ビタ
ミンＫ等のビタミン類；ペニシリン、アクチノマ
イシン、クロロマイセチン、テトラサイクリン等
の抗性物質；等々の生体内に存在する成分、生体
内に投与された薬物およびその代謝産物の数多く
のハプテン類をあげることができるが、本発明で
いうハプテン類は上記例示のハプテン類に限定さ
れるものではない。 〔ハプテンの化学的変性〕 本発明においては、上記ハプテンは、そのまま
で、又はそれを化学的に変性した後、スペーサに
化学的に結合せしめられる。 ハプテンの化学的変性法としては従来種々の方
法が知られている。本発明においては、ハプテン
が該スペーサの有する官能基例えばカルボキシル
基や水酸基と化学的に結合し得るように該ハプテ
ンを化学的に変性する如何なる変性法を採用して
もよい。かかるハプテンの変性法としては、特に
ハプテンにカルボキシル基、第１級又は第２級ア
ミノ基又は水酸基、就中カルボキシル基又は第１
級アミノ基を導入する化学的変性法が好適であ
る。かかる方法として例えば以下の如き変性法が
あげられる。 カルボニル基を有するハプテンに関しては、カ
ルボキシルメチルオキシムに変換することによつ
てカルボキシル基を導入することができ（例：
Journal of Biological Chemistry、Vol.234、
1090−1094頁（1959））、或いは、例えばブロム化
したのちチオグリコール酸と反応せしめて、カル
ボキシル基を持たせる〔例：Steroids、19巻357
−375頁（1972）〕こともできる。 カルボニル化合物のオキシムを還元すると一級
アミノ化合物になることは周知であるが、これも
ハプテンとして利用できる。 また水酸基を有するハプテンは、例えばモノク
ロル酢酸と反応させて、カルボキシメチルエーテ
ル化する方法〔例：Science、168巻、1347−1348
頁（1970）〕、或いは無水コハク酸と反応させてヘ
ミサクシネートとする方法〔例：Journal of
Clinical Endocrinology、33巻、775−782頁
（1971）〕等がある。 フエノール性水酸基を有するハプテンではその
水酸基のオルト又はパラ位に例えばパラカルボキ
シベンゼンジアゾニウム塩をジアゾカツプリング
させて、カルボキシル基を導入する〔例：
Steroids、18巻、555−563頁（1971）〕ことも可
能である。 さらにまたステロイド類の代謝物であるグルク
ロナイドは、そのカルボキシル基を利用すること
ができるし〔例：Journal of Steroid
Biochemistry、３巻、275−288頁（1972）〕、そ
のカルボキシル基を直接利用できなければ、適当
なジアミン誘導体と反応させて、アミノ化合物に
変換することもできる。 二級アミノ基をもつハプテンに於ては、例えば
そのアミノ基をＮ−保護アミノアルキルハロゲン
化合物でアルキル化したのち保護基を脱離すれば
一級アミン誘導体に変えることができ〔例：
FEBS Letters、36巻、339−342頁（1973）〕、或
いは例えばブロム酢酸エステルと反応させたのち
加水分解することにより、カルボキシル基をもた
せる〔例：Chemical and Pharmaceutical
Bulletin、25巻、838−840頁（1977）〕こともで
きる。 適当な官能基を持たないハプテンはまず例えば
微生物による水酸化反応のような手段を講じ、つ
いで上述の方法によつて、求むる官能基に変換す
ることもできる。 〔スペーサ〕 本発明において、上記ハプテン又はその化学的
変性物と高分子ラテツクス（担体粒子）とをつな
ぐ架橋成分となるスペーサとしては次に掲げる公
知又は新規なものを使用することができる。 (a) ハプテンの１種であるステロイドを結合する
ためのスペーサとして、例えば特開昭50−
123819号公報に記載された遊離アミノ基を有す
る蛋白を挙げることができる。このスペーサを
用いた感作担体は、該公報に記載されているよ
うに、ステロイドにスペーサとして用いた蛋白
以外の遊離アミノ基を有する抗原蛋白を結合さ
せたものを用いて哺乳動物に免疫して得た抗体
と組合せて、本発明の方法に使用することがで
きる。 かかる遊離アミノ基を有する蛋白としては、
例えば牛血清アルブミン（BSA）、家兎血清ア
ルブミン（RSA）、山羊血清アルブミン
（GSA）及び卵白アルブミン（EA）等が挙げ
られる。 (b) また、特開昭53−41420号公報において抗原
性のキヤリアーと称されているものも本発明に
おいてスペーサとして使用することができる。
かかるキヤリアーとしては、例えば、牛血清ア
ルブミン（BSA）、人血清アルブミン
（HSA）、牛γ−グロブリン（BGG）、破傷風
毒素、グルタミン酸、リジン・チロシンのコポ
リマー等が包含される。 (c) さらに、本発明者らが先に開発し提案した
（特願昭53−125710号明細書参照）、カルボキシ
ル基含有水溶性モノオレフイン系高分子化合物
を新規なスペーサとして挙げることができる。 該カルボキシル基含有水溶性モノオレフイン系
高分子化合物としては、カルボキシル基を含有す
る水溶性モノオレフイン系高分子化合物の如何な
るものでもよく、ここで「水溶性」とは該高分子
化合物の少なくとも１重量部を1000重量部の蒸留
水に添加した場合に透明な溶液を形成することを
いう。該高分子化合物の溶解度が上記下限を満足
する限り、その溶解度はいくら大であつてもよ
い。また該高分子化合物の平均重量分子量は約
10³〜10⁷又はそれ以上であつてもよく、通常数万
乃至数百万のものが好適に使用できる。またかか
る高分子化合物は、官能基としてカルボキシル基
の他に水酸基（−OH）を有していてもよく、こ
れらの官能基は、ハプテン又はその化学的変性物
の官能基および後述する高分子ラテツクスの有す
る官能基との化学的結合に関与すると共に、該高
分子化合物に水溶性をも付与するのに役立つ。 上記スペーサに使用するかかる高分子化合物
は、生理的には不活性物質と見られるものであつ
て、一般に抗原性を有しないものである。 また、かかる高分子化合物としては、例えば、
アクリル酸又はメタアクリル酸のホモ−又はコ−
ポリマー；マレイン酸と酢酸ビニルとの共重合体
又はそのケン化物、マレイン酸と例えばビニルア
ルコール、低級アルキルビニルエーテル、アクリ
ル酸又はその低級アルキルエステル、メタアクリ
ル酸又はその低級アルキルエステルとの共重合体
又は所望によりそれらの加水分解物があげられ
る。 これらの高分子化合物はまた、例えばアクリル
酸又はメタアクリル酸と、例えばアクリル酸のβ
−ヒドロキシエチルエステル又はアクリルアミド
との共重合物、或いは前記のモノマーを構成単位
として含有する三元重合体であつてもよい。 〔ハプテン又はその変性物とスペーサとの結合〕 上述したハプテン又はその化学的変性物とスペ
ーサとの結合は、アミド結合又はエステル結合に
よつて行なわれるが、特にアミド結合によつて行
うのが好適である。 かかる結は、従来既知のアミド結合反応又はエ
ステル結合反応を用いて行うことができる。 例えば、ハプテン又はその化学的変性物をハプ
テンで代表して説明すると、ハプテンが例えばア
ミノ基を有しそしてスペーサがカルボキシル基を
有する場合、又はその反対の場合、ハプテンとス
ペーサとを、それ自体公知の方法、例えばカルボ
ジイミド法、カルボニルジイミダゾール法、混合
酸無水物法、活性エステル法、アジド法、酸クロ
リド法、DPPA（ジフエニルホスホリルアジド）
法、等によりアミド結合により化学的に結合する
ことができる。例えば、好適なカルボジイミド法
又はDPPA法によれば、スペーサと、導入すべき
適当量のハプテンの溶液中にハプテンに対し等モ
ル又は僅かに過剰のカルボジイミド、もしくは
DPPAを加えDPPAの場合には有機塩基を加えて
反応せしめ、反応後に全反応液をセロフアンチユ
ーブ内にて水に対し透析すれば、未反応のハプテ
ン、試薬、副成物などは外液に逃げるので内液を
濃縮、或いは凍結乾燥することにより目的のハプ
テン（又はその変性物）−スペーサ結合物を得る
ことができる。 一方、ハプテン又はその化学的変性物が適当な
反応性水酸基を有しそしてスペーサがカルボキシ
ル基を有する場合又はその反応の場合、ハプテン
とスペーサとをエステル結合で化学的に結合する
こともできる。 エステル結合法の場合、ハプテン又はその化学
的変性物が水酸基を有し、スペーサがカルボキシ
ル基を有する場合には、カルボキシル基を例えば
塩化チオニルを作用させて酸クロリドに変え、或
いはスペーサが例えば無水マレイン酸を含む共重
合物ならばそのままで、ハプテンと反応させて、
エステル結合によるハプテン−スペーサ結合物を
得ることができる。 〔高分子ラテツクス〕 本発明においてハプテン−スペーサを結合（感
作）するための高分子ラテツクスとしては、平均
粒径が約0.01〜約２ミクロン、好ましくは約0.05
〜約1.5ミクロンの免疫学的に不活性な、免疫学
的測定において通常使用されているものが使用さ
れる。 かかる高分子ラテツクスとしては、例えば、ポ
リスチレン、スチレン−ブタジエン共重合物、ス
チレン−ジビニルベンゼン共重合物、ポリビニル
トルエン、ビニルトルエン−ターシヤリーブチル
スチレン等から成る高分子ラテツクス、或いは上
記重合体にカルボキシル基、第一級アミノ基又は
カルボアミド（−CONH₂）基などの官能基を導
入することにより得られる反応性高分子ラテツク
スが包含される。本発明において好適に使用しう
る市販の高分子ラテツクスとしては、ポリチレン
ラテツクス〔ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー
（the Dow Chemical Co.）〕、バクト−ラテツク
ス〔デイフコ・ラボラトリー（Difco
Laboratories）〕、アムスコ・レス（Amsco Res）
4150、アムスコ・レス3011〔アメリカン・ミネラ
ル・スピリツツ・カンパニイ（American
Mineral Spirits Co.）〕；ダウ・ラテツクス
（Dow Latex）815、ダウ・ラテツクス816、ダ
ウ・ラテツクス620、ダウ・ラテツクス859〔ザ・
ダウ・ケミカル・カンパニー（the Dow
Chemical Co.）〕；ハイカー（Hycar）1512、ハ
イカー1877×８、ハイカー2600×120〔グツドリツ
ジ・ケミカル・カンパニー（Goodrich
Chemical Co.）〕ゲルヴア（Gelva）900、ライ
トロン（Lytron）612、ライトロン624〔モンサン
ト（Monsacto）〕；ロプレツクス（Rhoplex）
LC40 3216、アンバーライト・ウルトラフアイン
（Amberlito Ultrafine）〔ローム・アンド・ハー
ス（Rohm and Haas）〕がある。 ハプテン−スペーサ結合物の上記高分子ラテツ
クスへの結合（感作）は、物理的吸着又は化学的
結合のいずれかの方法によつて行なつてもよい
が、一般には後者の化学的結合により行なう方が
望ましい。これら物理的吸着及び化学的結合によ
る高分子ラテツクスの感作法は既に公知であり、
それ自体公知の方法によつて、例えば前掲の特開
昭50−123819号公報、特開昭53−41420号公報、
特公昭53−12966号公報、Journal of Cell
Biology、第64巻第75〜88頁（1975）等の文献に
記載された方法、或いは前記特願昭53−125710号
明細書の第30〜35頁に記載された方法によつて行
なうことができる。 〔抗体の製造〕 本発明において用いるハプテン抗体（抗血清）
は公知の方法により作製することができる。ハプ
テンそれ自体又は前述した、その化学的変性物
を、抗原性を有する物質と結合させ、これを抗原
として常法により動物に免疫して抗血清を作製す
る。 この抗血清を作製するに際し使用する抗原とし
ては例えば、エストリオール−16，17−ジヘミサ
クシネート−BSA、エストリオール−６−（ｏ−
カルボキシメチル）−オキシム−BSA、デヒドロ
エピアンドロステロン−３−グルクロニド−
BSA、アンドロステロン−３−ヘミサクシネー
ト−BSA、コルチゾール−21−ヘミサクシネー
ト−BSA、等の他に、前述のハプテンに例えば
牛血清アルブミン或いは兎血清アルブミン等を結
合させたハプテン−タンパク結合体を使用するこ
ともでき、それらを例えばコンプリートフロイン
ドアジユバント等のアジユバントを併用するとよ
り有効に抗血清が作製される。動物としては家
兎、山羊、めん羊、モルモツト等の哺乳動物を使
用するのが通常である。得られた抗血清をハプテ
ンとの結合に用いた抗原性を有する物質により吸
収し、例えばアルコール沈殿又は塩析等の如き手
段によつてγ−グロブリンを分画し、ハプテン抗
体を得る。 抗原を作成する時に用いる抗原性を有する物質
としては、例えば牛血清アルブミン、家兎血清ア
ルブミン、人血清アルブミン、牛γ−グロブリ
ン、家兎γ−グロブリン、人γ−グロブリン、破
傷風毒素、肺炎球菌多糖体等を用いることができ
る。 上記の如く作成したハプテン抗体を、本発明に
従う測定試薬に調製するには、上記ハプテン抗体
を、通常の生理食塩水又は緩衝液で、或いは好ま
しくは0.5〜15ｍmol／ml、好ましくは１〜10ｍ
mol／ml濃度で前記アルカリ金属塩又はアンモニ
ウム塩を溶解含有する化理的水溶液により、通常
100〜500倍程度希釈することができる。 〔検体希釈用水溶液〕 本発明の方法において検体の希釈のために有利
に使用される水性液体としては、生理食塩水や、
グリシン緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、
トリス−塩酸緩衝液、ベロナール緩衝液などの緩
衝液に、前記水溶性アルカリ金属塩又は水溶性ア
ンモニウム塩を、溶液中濃度が0.5〜15ｍmol／
ml、好ましくは１〜10ｍmol／mlとなるように溶
解することにより調製したものが挙られる。しか
し、勿論通常の生理食塩水又は緩衝液を用いても
かまわない。このように調製された希釈用水溶液
は検体の倍々希釈のために使用することができ
る。 以上述べた本発明の測定法及び試薬を用いれ
ば、血液、尿その他の体液中に存在しうる極微量
のハプテンを極めて高感度に、例えば、前記した
如き塩を添加しない従来法に比べて実に10倍以上
の感度で検出することができる。従つて、本発明
の方法に従えば、検体を濃縮するという煩雑な操
作を必要とせず、少量の検体を採取するだけで、
極めて簡便に且つ経済的に、検体中のハプテンを
定量又は定性することができる。 次に実施例を挙げて本発明をさらに説明する。 実施例 １ （尿中エストロゲンの測定） (a) エストリオール−16−グルクロナイド・
BSAの製造 エストリオール−16−グルクロン酸40mgを
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液1.0mlに溶
解し、これに４℃以下でトリ−ｎ−ブチルアミ
ン20.6μ添加したのち、イソブチルクロロカ
ーボネート11.2μを加え30分間撹拌した。こ
れに予めBSA（牛血清アルブミン）117mgを2.8
mlの水に溶解したものにＮ−水酸化ナトリウム
液150μを加えたのちジメチルホルムアミド
20mlを加え、８℃に保たれた液を混合した。次
いでこれを８℃で撹拌し、１時間後にＮ−水酸
化ナトリウム液16.6μを加え、さらに3.5時間
撹拌したのち、セフアデツクスＧ−25で未反応
のエストリオール−16−グルクロナイド及びト
リ−ｎ−ブチルアミン等の低分子物質を分離し
た。さらにこれを精製水に水して透析したのち
凍結乾燥すると、エストリオール−16−グルク
ロナイド・BSAが得られた。 この凍乾末はコーベル反応により、BSA1モ
ル当りエストリオール−16−グルクロナイド27
〜30モルの結合が確認された。 (b) 抗エストリオール−16−グルクロナイド血清
の製造 前記(a)で製造したエストリオール−16−グル
クロナイド・BSA2mgを１mlの生理食塩液に溶
解し、同量のフロインドコンプリートアジユバ
ンドで乳化し、成熟家兎の足蹠および皮下に注
射した。この注射を１ケ月間隔で行い、抗体価
の上昇を確認後全採血を行い抗血清を得た。こ
の抗血清を56℃で30分間非働化した後BSAで
吸収し、抗エストリオール−16−グルクロナイ
ド血清を製造した。 (c) エストリオール−16−グルクロナイド・
RSAの製造 BSAの代りにRSA（家兎血清アルブミン）を
用いる以外、前記(a)と全く同じ方法でエストリ
オール−16−グルクロナイド・RSAを製造し
た。 (d) アミノモデイフアイドポリスチレンラテツク
スの製造 (d‐1) リジンラテツクスの製造 カルボキシルモデイフアイドポリスチレン
ラテツクス（ザ・ダウ・ケミカル・カンパニ
ー製）の10％懸濁液５mlにε−第三ブチルオ
キシカルボニルリジンメチルエステル260mg
をジメチルホルムアミド（DMF）３mlに溶
かした液を加え、０℃に冷却したのち撹拌し
つつ水溶性カルボジイミド、〔１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド塩酸塩〕243mgを加える。０℃にて
１時間、室温にて３時間撹拌をつづけたのち
室温に一夜放置し、遠心分離する。上清を捨
て、沈降物を50％DMF水溶液、ついで水で
洗浄する。 これに氷冷した濃塩酸５mlを加え、ときど
きふりまぜつつ０℃に15分間放置したのち氷
水で約倍量にうすめ遠心する。沈降物を洗液
が中性になるまで洗浄し、ついでトリエチル
アミンの10％水溶液10mlを加えて室温で15分
撹拌後遠心し、洗液が中性になるまで水洗を
くり返す。最後に10％懸濁液になるように濃
度を調整し所望のリジン・ラテツクスを得
た。本品はニンヒドリン反応陽性である。 (d‐2) ジアミノヘプタンラテツクスの製造 前記と同じカルボキシルモデイフアイドポ
リスチレンラテツクスの10％懸濁液2.5mlを
遠心し、沈降したラテツクスに0.01Mジアミ
ノヘプタン水溶液17.5mlを加えて懸濁させ
る。４℃に冷却したのち撹拌しつつ１−エチ
ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩33.4mgを加え、反応温度
を４℃に保ちつつ一夜撹拌をつづけた。反応
後遠心と水浮遊による洗浄を三回くりかえ
し、最後に濃度を調整して10％懸濁液とし、
所望のジアミノヘプタン・ラテツクスを得
た。本品はニンヒドリン反応陽性である。 (e) エストリオール−16−グルクロナイド・
RSA結合ラテツクスの製造 (c)で製造したエストリオール−16−グルクロ
ナイド・RSAを0.1％の濃度に蒸留水に溶解し、
この２mlを上記（ｄ−１）で製造した10％アミ
ノモデイフアイドポリスチレンラテツクス懸濁
液に加えて混合し、次いで１−エチル−３−
（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩の0.5％水溶液２mlを加えた。反応混合物
を一夜室温で撹拌したのち、10000rpmで遠心
分離して得た沈殿をグリシン緩衝化食塩水（PH
8.6）20mlにて３回遠心洗浄を行つた。沈殿を
0.1％RSAを含むグリシン緩衝化食塩液20mlに
て懸濁させ室温で１時間撹拌した。遠心分離し
た沈殿をグリシン緩衝化食塩液で遠心洗浄後、
0.05％RSAを含むグリシン緩衝化食塩液20mlに
懸濁させエストリオール−16−グルクロナイ
ド・RSA結合アミノモデイフアイドポリスチ
レンラテツクス懸濁液を製造した。 (f) 尿中エストロゲンの測定 妊婦尿を5.1ｍmol／mlの濃度にNaClを含む
グリシン緩衝液（PH9.2）で25倍、50倍、100倍
および200倍に希釈し、この希釈液各１滴ずつ
（0.03ml）をスライド板上に滴下し、これに上
記(b)で製造した抗血清を5.1ｍmol／mlのNaCl
を含むグリシン緩衝液で320倍に希釈した希釈
抗血清の１滴ずつ及び上記(e)で製造したエスト
リオール−16−グルクロナイド・RSA結合ア
ミノモデイフアイドラテツクスの１滴ずつを加
え、２分間揺動したのち、照明下肉眼で凝集
像、凝集阻止像を観察した。なお、本実施例に
おいては本発明の試薬の感度を0.2μｇ／mlに調
整してあるので各妊婦尿中のエストロゲン濃度
は第１表に示す値であつた。 本発明方法と従来法とを比較するため、従来
法としてグリシン緩衝液のみで妊婦尿及び抗血
清を希釈した以外、本発明方法と全く同様な測
定法による測定結果も第１表に併せて示す。 The present invention relates to a hapten immunochemical measurement reagent and a measurement method. Conventionally, methods for measuring trace amounts of biologically active substances present in blood, urine, and other body fluids by immunochemical means have been known for a long time. As such an immunochemical measurement method, for example, red blood cells are used as a carrier, sensitized with an antigen or antibody, and reacted with the antibody or antigen in the test solution, in which case an immunochemical agglutination or agglutination inhibition reaction is performed. A method for measuring a trace amount of a substance by causing it to occur is also already known. It is also known to use non-biological particles such as synthetic resin latex, bentonite, collodion, cholesterol crystals, and quartz crystals as solid carriers in immunochemical reactions instead of red blood cells as carriers (for example, Publication No. 50-82230). Furthermore, in connection with such immunochemical assays,
It is also known to immunologically measure haptens by using a hapten-carrier conjugate, which is a type of hapten, such as a steroid, chemically bonded to a lysine residue of a protein via an amide bond, as a type of hapten antigen. [Journal of Biological
Chemistry Vol. 228, pp. 713-727 (1957)]. In addition, antibodies obtained by immunizing mammals with an antigenic protein having a free amino group bound to a steroid, which is a type of hapten, and antibodies produced by binding a protein other than the antigenic protein to the steroid. A method of immunochemically measuring steroids (haptens) in a sample using a sensitized carrier obtained by sensitizing with a steroid protein complex is also known (Japanese Patent Application Laid-open No. 123819/1983). . All of the above-mentioned known immunoassay methods for hapten use carriers sensitized with hapten and liquid (unsensitized) hapten antibodies, which generally have low sensitivity and can only detect hapten at low concentrations. In order to measure haptens in non-containing body fluids, a significant drawback is that the body fluid being tested must be concentrated. As a method to avoid such drawbacks, recently, antibody-sensitized carriers in which the carrier is sensitized with hapten antibodies, and hapten-carrier conjugates in which a hapten that reacts with the hapten antibody is bound to an antigenic carrier, or An immunochemical assay method for hapten using this conjugate-sensitized carrier has been proposed (Japanese Patent Application Laid-open No. 41420/1983). However, although this proposed method achieves a certain degree of improvement in sensitivity, it requires sensitization of a hapten antibody to a carrier, which makes the preparation of measurement reagents complicated and increases costs. Therefore, the present inventors attempted to immunologically detect trace amounts of haptens present in blood, urine, and other body fluids without sensitizing hapten antibodies to a carrier and without requiring concentration of body fluids. As a result of conducting research on a method for sensitive and highly sensitive measurement of By employing an agglutination inhibition reaction method using (antiserum) and carrying out the agglutination inhibition reaction in the presence of a specific amount of water-soluble alkali metal salt or water-soluble ammonium salt, it is possible to achieve extremely high sensitivity and It has been discovered that haptens in body fluids can be detected and measured sensitively. Thus, according to the present invention, using a polymer latex to which a hapten or a chemically modified product thereof is bound via a crosslinking component and a hapten antibody (antiserum),
In a method for immunologically measuring hapten in a specimen by an agglutination inhibition reaction, the agglutination inhibition reaction is performed by
A method is provided, characterized in that it is carried out in the presence of 0.5 to 15 mmol/ml of a water-soluble alkali metal salt or a water-soluble ammonium salt. According to the present invention, haptens that exist as trace components in blood, urine, and other body fluids can be used as crosslinking components (hereinafter referred to as "spacers") or chemically modified products thereof.
It is detected and measured by an agglutination inhibition reaction method using a hapten antibody (antiserum) and a polymer latex (hereinafter sometimes referred to as "hapten-spacer-latex") bound via a The specific measuring method will be discussed in Examples below, but the general measuring method is as follows.
Place a drop of the test specimen (which can be diluted as appropriate), add a drop of diluted hapten antibody (i.e. antiserum), and add one drop of an aqueous suspension of hapten-spacer-latex; Mix and stir, or conversely, place a drop of sample on a clean slide and first add the hapten-spacer.
This is accomplished by adding one drop of an aqueous suspension of latex, followed by a drop of diluted antiserum, and mixing the three. The test results are observed in 1 to 3 minutes, and an agglutination image is determined to be negative, and an agglutination inhibition image (non-aggregation) is determined to be positive. The concentration of hapten in a specimen is determined by appropriately diluting the specimen and performing the test, and multiplying the highest dilution ratio that gives an agglutination inhibition pattern by the measurement sensitivity of the reagent. The present invention is characterized in that in the aggregation inhibition reaction, a water-soluble alkali metal salt or a water-soluble ammonium salt is present in the reaction system, and the immunological reaction is carried out in the presence of such a salt. The water-soluble alkali metal salt or water-soluble ammonium salt that can be used in the present invention is immunologically inactive and has at least a solubility in water.
Both inorganic and organic salts can be used as long as they have a concentration of 0.1 g/ml, preferably 0.3 g/ml or more, but inorganic salts are generally preferred. Examples of water-soluble alkali metal salts include carbonates, hydrogen carbonates, halides, nitrates, sulfates, hydrogen sulfates, borates, and phosphates of alkali metals such as sodium, potassium, lithium, and cesium. Examples include inorganic salts such as acetate, oxalate, and citrate; specific examples include sodium chloride, potassium chloride, lithium chloride, sodium carbonate, sodium sulfate, and sodium acetate. be. Examples of water-soluble ammonium salts include inorganic ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate, and organic ammonium salts such as ammonium acetate and ammonium oxalate, with ammonium chloride and ammonium sulfate being preferred. . These alkali metal salts and ammonium salts can be used alone, or in combination of two or more, if necessary. The introduction of these alkali metal salts or ammonium salts into the aggregation prevention reaction system is preferably carried out by
Alternatively, the alkali metal salt or ammonium salt is predissolved in a diluent (usually physiological saline or buffer solution) for diluting the hapten antibody (antiserum) at the concentration described below, and/or the hapten antibody (antiserum) is dissolved in advance. This can be carried out by previously dissolving the salt in an aqueous suspension of spacer latex at the concentration described below, but the salt is added to the sample, antiserum, and aqueous suspension of hapten spacer latex before mixing. There is no problem even if the salt is directly mixed into at least one of them. However, in preparing the measurement reagent in the present invention, it is advantageous to use an aqueous dilution of a hapten antibody containing a water-soluble alkali metal salt or a water-soluble ammonium salt at the following concentrations:
Further, it is desirable that the alkali metal salt or ammonium salt described above be included in the aqueous liquid (usually physiological saline or buffer solution) for diluting the specimen at the following concentration. According to the present invention, as described above, the alkali metal salt or ammonium salt is added to the aggregation inhibition reaction system.
When present at a concentration of 0.5 to 15 mmol/ml,
The detection sensitivity of haptens in specimens has been significantly improved, for example, as is clear from the examples below, compared to the agglutination inhibition reaction system in which such salts are not actively added.
It turned out that the sensitivity was more than twice as high. Although the upper limit of the concentration of the alkali metal salt or ammonium salt is not strictly limited, there is no merit in using more than necessary, so a concentration of 15 mmol/ml or less is usually sufficient. Yes, the preferred concentration range is 1-10 mmol/ml, especially
It is 1.5-8 mmol/ml. The salt should be substantially completely dissolved in the reaction system, but not necessarily
It doesn't have to be 100% completely dissociated. Thus, according to the invention it is also possible to
A hapten immunoassay reagent comprising an aqueous dilution of a hapten antibody (antiserum) containing the water-soluble alkali metal salt or water-soluble ammonium salt in an amount of mol/ml, preferably 1 to 10 mmol/ml, and (A)
0.5-15 mmol/ml, preferably 1-10 mmol/ml
(B) A polymer latex in which an aqueous diluted solution of a hapten antibody (antiserum) containing a water-soluble alkali metal salt or a water-soluble ammonium salt and (B) a hapten or a chemically modified product thereof are bonded via a crosslinking component (spacer). (hapten-spacer-latex) and (C)
0.5-15 mmol/ml, preferably 1-10 mmol/ml
A hapten immunoassay reagent system (kit) comprising a diluting aqueous solution containing a water-soluble alkali metal salt or a water-soluble ammonium salt is provided. These reagents will be explained in more detail below. [Hapten] In the present invention, a hapten is a low-molecular compound that does not itself have antigenicity, but which binds to a substance that has antigenicity, for example, a macromolecular compound that has antigenicity such as a protein or polysaccharide. exhibits antigenicity,
It refers to substances that are reactive with antibodies produced by immunizing animals with such antigenic substances. As such haptens, components existing in living bodies (including physiologically active components and their metabolites), drugs administered to living bodies, and their metabolites are particularly important as haptens targeted by the present invention. Examples of such haptens include the following. For example, steroidal haptens include (i) follicular hormones such as estrone, estradiol, estriol, estetrol, equilin, and equilenin; (ii) such as progesterone; pregnanediol; pregnanetriol; 19-nor-ethisterone and chlormadinone acetate. (iii) Male hormones such as testosterone, dehydroepiandrosterone, dihydrotestosterone, androsterone, etiocholanolone, (iv) cortisol, cortisone, deoxycorticosterone, aldosterone, tetrahydro - adrenocortical hormones such as aldosterone and tetrahydrocortisol; (v) vitamin D; cholesterol; bile acids such as cholic acid, desoxycholic acid, and chenocholic acid; cardiotonic steroids; saponins; other steroids such as sapogenin; can be given. []Physiologically active amines include (i) catecholamines such as epinephrine, norepinephrine, dopamine, and efuedrine and their metabolites; (ii) morphine, codenane, heroin, morphine glucuronide, ***e, mescaline, papaverine, Physiologically active alkaloids such as naricotin, yohimbine, reserpine, egotamine, strychnine; (iii) LSD, amphetamine, meprobamate,
Examples include amino group-containing drugs such as methamphetamine. Furthermore, other haptens include low molecular weight peptides without antigenicity such as TRH and LH-RH; thyroid hormones such as diiodothyronine, triiodothyronine, and thyroxine; prostaglandin E ₂ , prostaglandin E ₃ , prostaglandin F ₁ α, etc.; vitamin A, vitamin B (e.g. vitamin B ₁ , B ₂ , B ₆ , B ₁₂ etc.), vitamin E, vitamin K, etc. These include vitamins; antibiotic substances such as penicillin, actinomycin, chloromycetin, and tetracycline; and other components that exist in the body; drugs administered to the body; and numerous haptens of their metabolites. The haptens referred to in the invention are not limited to the haptens exemplified above. [Chemical Modification of Hapten] In the present invention, the hapten is chemically bonded to the spacer as it is or after being chemically modified. Various methods are conventionally known as methods for chemically modifying haptens. In the present invention, any modification method for chemically modifying the hapten so that the hapten can chemically bond to a functional group such as a carboxyl group or a hydroxyl group possessed by the spacer may be employed. In particular, methods for modifying such haptens include adding a carboxyl group, a primary or secondary amino group, or a hydroxyl group to the hapten, especially a carboxyl group or a primary amino group.
Chemical modification methods that introduce graded amino groups are preferred. Examples of such methods include the following modification method. For haptens having a carbonyl group, the carboxyl group can be introduced by converting to carboxylmethyl oxime (e.g.
Journal of Biological Chemistry, Vol.234,
1090-1094 (1959)), or, for example, after bromination, it is reacted with thioglycolic acid to have a carboxyl group [e.g., Steroids, Vol. 19, 357
-375 pages (1972)]. It is well known that reducing the oxime of a carbonyl compound results in a primary amino compound, which can also be used as a hapten. In addition, haptens having a hydroxyl group can be converted into carboxymethyl ether by reacting with monochloroacetic acid [e.g., Science, vol. 168, 1347-1348
(1970)], or by reacting with succinic anhydride to form hemisuccinate [e.g., Journal of
Clinical Endocrinology, Vol. 33, pp. 775-782 (1971)]. In the case of a hapten having a phenolic hydroxyl group, a carboxyl group is introduced by diazo coupling with, for example, a paracarboxybenzenediazonium salt at the ortho or para position of the hydroxyl group [Example:
Steroids, Vol. 18, pp. 555-563 (1971)]. Furthermore, glucuronides, which are metabolites of steroids, can utilize their carboxyl groups [e.g., Journal of Steroids].
Biochemistry, Vol. 3, pp. 275-288 (1972)], and if the carboxyl group cannot be used directly, it can be converted into an amino compound by reacting with a suitable diamine derivative. Haptens with a secondary amino group can be converted into primary amine derivatives by, for example, alkylating the amino group with an N-protected aminoalkyl halogen compound and then removing the protecting group [e.g.
FEBS Letters, Vol. 36, pp. 339-342 (1973)] or, for example, by reacting with bromoacetic acid ester and then hydrolyzing it to provide a carboxyl group [e.g., Chemical and Pharmaceutical
Bulletin, Vol. 25, pp. 838-840 (1977)]. Haptens that do not have a suitable functional group can be converted into the desired functional group by first undergoing a hydroxylation reaction using a microorganism, and then by the method described above. [Spacer] In the present invention, the following known or novel spacers can be used as the spacer serving as a crosslinking component that connects the hapten or its chemically modified product and the polymer latex (carrier particles). (a) As a spacer for binding a steroid, which is a type of hapten, for example,
Examples include proteins having free amino groups described in Japanese Patent No. 123819. As described in the publication, the sensitized carrier using this spacer is prepared by immunizing mammals with a steroid bound to an antigenic protein having a free amino group other than the protein used as the spacer. It can be used in the method of the present invention in combination with the obtained antibody. Proteins having such free amino groups include:
Examples include bovine serum albumin (BSA), rabbit serum albumin (RSA), goat serum albumin (GSA), and ovalbumin (EA). (b) Furthermore, what is referred to as an antigenic carrier in JP-A-53-41420 can also be used as a spacer in the present invention.
Such carriers include, for example, bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), bovine gamma-globulin (BGG), tetanus toxin, glutamic acid, lysine-tyrosine copolymers, and the like. (c) Furthermore, a carboxyl group-containing water-soluble monoolefin polymer compound, which was previously developed and proposed by the present inventors (see Japanese Patent Application No. 125710/1982), can be mentioned as a new spacer. The carboxyl group-containing water-soluble mono-olefin polymer compound may be any water-soluble mono-olefin polymer compound containing a carboxyl group, and "water-soluble" herein means that at least 1% by weight of the polymer compound When 1 part is added to 1000 parts by weight of distilled water, a clear solution is formed. As long as the solubility of the polymer compound satisfies the above lower limit, the solubility may be as high as desired. The average weight molecular weight of the polymer compound is approximately
The number may be 10 ³ to 10 ⁷ or more, and usually tens of thousands to several million can be suitably used. In addition, such a polymer compound may have a hydroxyl group (-OH) in addition to a carboxyl group as a functional group, and these functional groups can be used as a functional group of a hapten or a chemically modified product thereof and a polymer latex as described below. It participates in chemical bonding with the functional groups of the polymer and also serves to impart water solubility to the polymer compound. The polymer compound used in the spacer is considered to be a physiologically inert substance and generally has no antigenicity. In addition, examples of such polymer compounds include, for example,
Homo- or co-acrylic acid or methacrylic acid
Polymer; a copolymer of maleic acid and vinyl acetate or a saponified product thereof, a copolymer of maleic acid and, for example, vinyl alcohol, lower alkyl vinyl ether, acrylic acid or its lower alkyl ester, methacrylic acid or its lower alkyl ester, or If desired, their hydrolysates may be used. These polymeric compounds can also be used, for example, with acrylic acid or methacrylic acid, and with β of acrylic acid, for example.
-A copolymer with hydroxyethyl ester or acrylamide, or a terpolymer containing the above monomer as a constituent unit. [Bonding of a hapten or its modified product and a spacer] The above-mentioned hapten or its chemically modified product and a spacer are bound to each other through an amide bond or an ester bond, and it is particularly preferable to perform the bond through an amide bond. It is. Such a linkage can be performed using a conventionally known amide bonding reaction or ester bonding reaction. For example, if a hapten or a chemically modified product thereof is represented by a hapten, if the hapten has, for example, an amino group and a spacer has a carboxyl group, or vice versa, the hapten and the spacer can be referred to as known per se. methods such as carbodiimide method, carbonyldiimidazole method, mixed acid anhydride method, active ester method, azide method, acid chloride method, DPPA (diphenylphosphorylazide)
They can be chemically bonded via an amide bond by a method such as a method. For example, according to the preferred carbodiimide method or DPPA method, an equimolar or slight excess of carbodiimide relative to the hapten is introduced into a solution of the spacer and the appropriate amount of hapten to be introduced;
If DPPA is added and an organic base is added in the case of DPPA to cause the reaction, and after the reaction the entire reaction solution is dialyzed against water in a cellophane tube, unreacted haptens, reagents, by-products, etc. will be released into the external solution. The target hapten (or modified product)-spacer conjugate can be obtained by concentrating or freeze-drying the internal solution. On the other hand, if the hapten or its chemically modified product has a suitable reactive hydroxyl group and the spacer has a carboxyl group, or in the case of a reaction thereof, the hapten and the spacer can also be chemically bonded through an ester bond. In the case of the ester bonding method, if the hapten or its chemically modified product has a hydroxyl group and the spacer has a carboxyl group, the carboxyl group is converted to an acid chloride by the action of thionyl chloride, or the spacer is converted to an acid chloride by the action of, for example, maleic anhydride. If it is a copolymer containing an acid, it can be left as is and reacted with a hapten.
A hapten-spacer conjugate via an ester bond can be obtained. [Polymer latex] In the present invention, the polymer latex for binding (sensitizing) the hapten-spacer has an average particle size of about 0.01 to about 2 microns, preferably about 0.05 microns.
~1.5 microns, immunologically inert and commonly used in immunoassays, are used. Examples of such polymer latexes include polymer latexes made of polystyrene, styrene-butadiene copolymer, styrene-divinylbenzene copolymer, polyvinyltoluene, vinyltoluene-tert-butylstyrene, etc., or polymers containing carboxyl groups in the above polymers. , a reactive polymer latex obtained by introducing a functional group such as a primary amino group or a carboxamido (-CONH ₂ ) group. Commercially available polymer latexes that can be suitably used in the present invention include polyethylene latex (The Dow Chemical Co.), Bacto-latex (Difco Laboratory)
Laboratories], Amsco Res
4150, Amsco Res. 3011 [American Mineral Spirits Company]
Dow Latex 815, Dow Latex 816, Dow Latex 620, Dow Latex 859
The Dow Chemical Company
Goodrich Chemical Co.); Hycar 1512, Hycar 1877 x 8, Hiker 2600 x 120
Chemical Co.) Gelva 900, Lytron 612, Lytron 624 [Monsacto]; Rhoplex
There is LC40 3216, Amberlito Ultrafine (Rohm and Haas). The binding (sensitization) of the hapten-spacer conjugate to the polymer latex may be carried out by either physical adsorption or chemical bonding, but the latter is generally used. It is preferable. These methods of sensitizing polymer latex through physical adsorption and chemical bonding are already known.
By a method known per se, for example, the above-mentioned JP-A-50-123819, JP-A-53-41420,
Special Publication No. 53-12966, Journal of Cell
Biology, Vol. 64, pp. 75-88 (1975), or the method described in the specification of Japanese Patent Application No. 125710/1983, pp. 30-35. can. [Production of antibody] Hapten antibody (antiserum) used in the present invention
can be produced by a known method. The hapten itself or a chemically modified product thereof as described above is combined with a substance having antigenicity, and an animal is immunized with this as an antigen by a conventional method to prepare an antiserum. Antigens used in preparing this antiserum include, for example, estriol-16,17-dihemisuccinate-BSA, estriol-6-(o-
carboxymethyl)-oxime-BSA, dehydroepiandrosterone-3-glucuronide-
In addition to BSA, androsterone-3-hemisuccinate-BSA, cortisol-21-hemisuccinate-BSA, etc., hapten-protein conjugates in which bovine serum albumin, rabbit serum albumin, etc. are bound to the above-mentioned hapten may be used. Antiserum can be produced more effectively by using these in combination with an adjuvant such as Complete Freund's Adjuvant. As animals, mammals such as rabbits, goats, sheep, and guinea pigs are usually used. The obtained antiserum is absorbed by the antigenic substance used for binding to the hapten, and γ-globulin is fractionated by means such as alcohol precipitation or salting out to obtain a hapten antibody. Examples of antigenic substances used in preparing antigens include bovine serum albumin, rabbit serum albumin, human serum albumin, bovine γ-globulin, rabbit γ-globulin, human γ-globulin, tetanus toxoid, and pneumococcal polysaccharide. The body etc. can be used. To prepare the hapten antibody produced as described above into a measurement reagent according to the present invention, the hapten antibody is mixed with normal physiological saline or a buffer solution, or preferably 0.5 to 15 mmol/ml, preferably 1 to 10 mmol/ml.
Usually by a chemical aqueous solution containing the alkali metal salt or ammonium salt dissolved in a concentration of mol/ml.
It can be diluted approximately 100 to 500 times. [Aqueous solution for diluting specimen] The aqueous liquid advantageously used for diluting the specimen in the method of the present invention includes physiological saline,
glycine buffer, phosphate buffer, borate buffer,
The water-soluble alkali metal salt or water-soluble ammonium salt is added to a buffer such as Tris-HCl buffer or Veronal buffer at a concentration of 0.5 to 15 mmol/solution.
ml, preferably 1 to 10 mmol/ml. However, of course, normal saline or a buffer solution may also be used. The dilution aqueous solution prepared in this way can be used for multiple dilution of the specimen. By using the above-mentioned measurement method and reagent of the present invention, it is possible to detect minute amounts of hapten that may be present in blood, urine, and other body fluids with extremely high sensitivity, for example, compared to the conventional method that does not add salt, as described above. It can be detected with more than 10 times the sensitivity. Therefore, according to the method of the present invention, there is no need for the complicated operation of concentrating the specimen, and only a small amount of the specimen can be collected.
It is possible to quantitatively or qualitatively quantify haptens in a specimen very simply and economically. Next, the present invention will be further explained with reference to Examples. Example 1 (Measurement of urinary estrogen) (a) Estriol-16-glucuronide
Production of BSA 40 mg of estriol-16-glucuronic acid was dissolved in 1.0 ml of N,N-dimethylformamide solution, and 20.6 μ of tri-n-butylamine was added thereto at 4°C or below, followed by 11.2 μ of isobutyl chlorocarbonate. Stir for a minute. Add 2.8 mg of BSA (bovine serum albumin) to this in advance.
After adding 150μ of N-sodium hydroxide solution to the solution dissolved in ml of water, dimethylformamide was added.
20 ml was added and the liquid kept at 8°C was mixed. Next, this was stirred at 8°C, and after 1 hour, 16.6μ of N-sodium hydroxide solution was added, and after further stirring for 3.5 hours, unreacted estriol-16-glucuronide and tri-n-butylamine were removed using Sephadex G-25. We separated low-molecular substances such as Furthermore, this was dialyzed against purified water, and then freeze-dried to obtain estriol-16-glucuronide/BSA. This freeze-dried powder is processed by Kobel reaction to produce 27 estriol-16-glucuronide per mole of BSA.
~30 molar binding was confirmed. (b) Production of anti-estriol-16-glucuronide serum 2 mg of estriol-16-glucuronide/BSA produced in (a) above was dissolved in 1 ml of physiological saline, and emulsified with the same amount of Freund's Complete Adjuvant. It was injected into the footpad and subcutaneously of adult rabbits. This injection was performed at monthly intervals, and after confirming an increase in antibody titer, whole blood was collected to obtain antiserum. This antiserum was inactivated at 56°C for 30 minutes and then absorbed with BSA to produce anti-estriol-16-glucuronide serum. (c) Estriol-16-glucuronide
Production of RSA Estriol-16-glucuronide/RSA was produced in exactly the same manner as in (a) above, except that RSA (rabbit serum albumin) was used instead of BSA. (d) Production of amino-modified polystyrene latex (d-1) Production of lysine latex Add 5 ml of a 10% suspension of carboxyl-modified polystyrene latex (manufactured by The Dow Chemical Company) to Tributyloxycarbonyllysine methyl ester 260mg
was dissolved in 3 ml of dimethylformamide (DMF), and after cooling to 0°C, water-soluble carbodiimide, [1-ethyl-
Add 243 mg of 3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride. After stirring for 1 hour at 0°C and 3 hours at room temperature, the mixture was left at room temperature overnight and centrifuged. Discard the supernatant and wash the precipitate with 50% DMF aqueous solution and then with water. Add 5 ml of ice-cold concentrated hydrochloric acid to this, stir occasionally and leave at 0°C for 15 minutes, then dilute to approximately double the volume with ice water and centrifuge. Wash the sediment until the washing solution becomes neutral, then add 10 ml of a 10% aqueous solution of triethylamine, stir at room temperature for 15 minutes, centrifuge, and repeat washing with water until the washing solution becomes neutral. Finally, the desired lysine latex was obtained by adjusting the concentration to a 10% suspension. This product has a positive ninhydrin reaction. (d-2) Production of diaminoheptane latex Centrifuge 2.5ml of a 10% suspension of the same carboxyl-modified polystyrene latex as above, and add 17.5ml of 0.01M diaminoheptane aqueous solution to the sedimented latex to suspend it. . After cooling to 4°C, 33.4 mg of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride was added with stirring, and stirring was continued overnight while maintaining the reaction temperature at 4°C. After the reaction, centrifugation and washing with water suspension were repeated three times, and finally the concentration was adjusted to make a 10% suspension.
The desired diaminoheptane latex was obtained. This product has a positive ninhydrin reaction. (e) Estriol-16-glucuronide
Production of RSA-bonded latex Estriol-16-glucuronide RSA produced in (c) was dissolved in distilled water to a concentration of 0.1%.
2 ml of this was added to the 10% aminomodified polystyrene latex suspension prepared in (d-1) above and mixed, and then 1-ethyl-3-
2 ml of a 0.5% aqueous solution of (dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride was added. After stirring the reaction mixture overnight at room temperature, the precipitate obtained by centrifugation at 10,000 rpm was dissolved in glycine-buffered saline (PH
8.6) Centrifugal washing was performed three times in 20 ml. precipitation
The suspension was suspended in 20 ml of glycine buffered saline containing 0.1% RSA and stirred at room temperature for 1 hour. After centrifugally washing the centrifuged precipitate with glycine-buffered saline,
The mixture was suspended in 20 ml of glycine buffered saline containing 0.05% RSA to prepare an estriol-16-glucuronide/RSA-bound aminomodified polystyrene latex suspension. (f) Measurement of urinary estrogen Pregnant women's urine was diluted 25 times, 50 times, 100 times and 200 times with glycine buffer (PH9.2) containing NaCl to a concentration of 5.1 mmol/ml, and 1 portion of each of these diluted Add dropwise (0.03 ml) onto the slide plate, add the antiserum prepared in (b) above and add 5.1 mmol/ml NaCl.
Add one drop each of diluted antiserum diluted 320 times with a glycine buffer solution containing 20% and one drop each of the estriol-16-glucuronide/RSA-conjugated aminomodified latex prepared in (e) above, and incubate for 2 minutes. After rocking, the agglutination image and agglutination inhibition image were observed with the naked eye under illumination. In this example, the sensitivity of the reagent of the present invention was adjusted to 0.2 μg/ml, so the estrogen concentration in the urine of each pregnant woman was the value shown in Table 1. In order to compare the method of the present invention with the conventional method, Table 1 also shows the measurement results using the same measurement method as the method of the present invention, except that the pregnant urine and antiserum were diluted only with glycine buffer as the conventional method. .

【表】 以下に示す実施例においても同様とする。 上記第１表の結果から、本発明方法は、従来法
に比べ10倍以上優れた感度を有していることがわ
かる。 実施例 ２ （プレグナンジオールの測定） (a) プレグナンジオール−３−グルクロナイド・
BSAの製造 エストリオール−16−グルクロナイドの代り
にプレグナンジオール−３−グルクロナイドを
用いること以外、前記実施例１(a)と全く同様に
してプレグナンジオール−３−グルクロナイ
ド・BSAを製造した。 (b) 抗プレグナンジオール−３−グルクロナイド
血清の製造 上記(a)で製造したプレグナンジオール−３−
グルクロナイド・BSA2mgを１mlの生理食塩液
に溶解し、同量のフロインド完全アジユバンド
で乳化し、山羊の皮下に注射した。この注射を
１ケ月間隔で行い、抗体価の上昇を確認後全採
血を行い抗血清を得た。得られた抗血清を56℃
で30分間加熱し非働化した後BSAで吸収し抗
プレグナンジオール−３−グルクロナイド血清
を製造した。 (c) プレグナンジオール−３−グルクロナイド・
GSAの製造 エストリオール−16−グルクロナイドの代り
にプレグナンジオール−３−グルクロナイド及
びBSAの代りに山羊血清アルブミン（GSA）
を用いる以外、前記実施例１(a)と全く同様な方
法でプレグナンジオール−３−グルクロナイ
ド・GSAを製造した。 (d) プレグナンジオール−３−グルクロナイド・
GSA結合カルボキシアミノモデイフアイドポ
リスチレンラテツクスの製造 実施例（ｄ−２）で製造したジアミノヘプタ
ンラテツクス懸濁液２mlに上記(c)で製造したプ
レグナンジオール−３−グルクロナイド・
GSA水溶液（濃度２mg／２ml）を加えて混合
し、次いで１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド・ハイドロクロ
ライドの0.5％水溶液を２mlを加えて一晩室温
で撹拌した。反応終了後、遠心分離して得た沈
殿をグリシン緩衝化食塩液（PH9.6）で３回遠
心洗浄を行つた、得られた沈殿を0.1％GSAを
含むグリシン緩衝化食塩液10mlに懸濁させ、室
温で１時間撹拌したのち遠心分離により沈殿を
得た。該沈殿を上記グリシン緩衝化食塩液で遠
心洗浄後、0.005％GSAを含むグリシン緩衝化
食塩液10mlに懸濁させプレグナンジオール−３
−グルクロナイド・GSA結合カルボキシアミ
ノモデイフアイドラテツクスを製造した。 (e) 尿中プレグナンジオールの測定 妊婦尿を生理食塩液で50倍、100倍、200倍及
び400倍に希釈し、各希釈尿１滴をスライド上
に滴下し、これに上記(b)で製造した抗血清を
7.1ｍmol／mlのKClを含むリン酸緩衝液で150
倍に希釈し、その希釈抗血清を１滴ずつ及び上
記(d)で製造したプレグナンジオール−３−グル
クロナイド・GSA結合カルボキシアミノモデ
イフアイドポリスチレンラテツクスの１滴ずつ
を加えて２分間スライドを揺動した後、照明下
肉眼で凝集像又は凝集阻止像を観察した。な
お、本実施例では本発明の試薬の感度を0.1μ
ｇ／mlに調整してあるので各妊婦尿中のプレグ
ナンジオールの濃度は第２表に示す値であつ
た。 本発明方法と従来法とを比較するため、従来
法として生理食塩液とグリシン緩衝液で各々妊
婦尿及び抗血清を希釈した以外、本発明方法と
全く同様な測定法による測定結果も第２表に併
せて示す。[Table] The same applies to the examples shown below. From the results in Table 1 above, it can be seen that the method of the present invention has a sensitivity that is 10 times or more superior to that of the conventional method. Example 2 (Measurement of pregnanediol) (a) Pregnanediol-3-glucuronide.
Production of BSA Pregnanediol-3-glucuronide/BSA was produced in exactly the same manner as in Example 1(a) except that pregnanediol-3-glucuronide was used instead of estriol-16-glucuronide. (b) Production of anti-pregnanediol-3-glucuronide serum Pregnanediol-3- produced in (a) above
2 mg of glucuronide/BSA was dissolved in 1 ml of physiological saline, emulsified with the same amount of Freund's complete adjuvant, and injected subcutaneously into a goat. This injection was performed at monthly intervals, and after confirming an increase in antibody titer, whole blood was collected to obtain antiserum. The obtained antiserum was incubated at 56°C.
After inactivation by heating for 30 minutes, the serum was absorbed with BSA to produce anti-pregnanediol-3-glucuronide serum. (c) Pregnanediol-3-glucuronide.
Preparation of GSA Pregnanediol-3-glucuronide instead of estriol-16-glucuronide and goat serum albumin (GSA) instead of BSA
Pregnanediol-3-glucuronide/GSA was produced in exactly the same manner as in Example 1(a) except that . (d) Pregnanediol-3-glucuronide.
Production of GSA-bonded carboxyamino modified polystyrene latex Add pregnanediol-3-glucuronide produced in (c) above to 2 ml of the diaminoheptane latex suspension produced in Example (d-2).
A GSA aqueous solution (concentration 2 mg/2 ml) was added and mixed, then 2 ml of a 0.5% aqueous solution of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride was added and stirred overnight at room temperature. After the reaction, the precipitate obtained by centrifugation was centrifuged and washed three times with glycine buffered saline (PH9.6).The resulting precipitate was suspended in 10 ml of glycine buffered saline containing 0.1% GSA. After stirring at room temperature for 1 hour, a precipitate was obtained by centrifugation. The precipitate was centrifugally washed with the above glycine buffered saline, suspended in 10 ml of glycine buffered saline containing 0.005% GSA, and pregnanediol-3
- A glucuronide/GSA-conjugated carboxyamino modified latex was produced. (e) Measurement of urinary pregnanediol Pregnant women's urine was diluted 50 times, 100 times, 200 times, and 400 times with physiological saline, and one drop of each diluted urine was placed on a slide, and the urine prepared in (b) above The antiserum
150 in phosphate buffer containing 7.1 mmol/ml KCl.
Add one drop of the diluted antiserum and one drop of the pregnanediol-3-glucuronide/GSA-conjugated carboxyamino modified polystyrene latex prepared in (d) above and rock the slide for 2 minutes. After that, an agglutination image or an agglutination inhibition image was observed with the naked eye under illumination. In addition, in this example, the sensitivity of the reagent of the present invention was set to 0.1μ.
The concentration of pregnanediol in the urine of each pregnant woman was the value shown in Table 2 since the concentration was adjusted to g/ml. In order to compare the method of the present invention with the conventional method, Table 2 also shows the measurement results using the same method as the method of the present invention, except that the pregnant urine and antiserum were diluted with physiological saline and glycine buffer as the conventional method. It is also shown in .

【表】 上記第２表の結果から、本発明方法は従来法
に比べ10倍以上優れた感度を有していることが
わかる。 実施例 ３ （モルフインの測定） (a) カルボキシメチルモルフイン・BSAの製造 100mgのBSAを25mlの蒸留水に溶解し、この
溶液にカルボキシメチルモルフイン80mgを溶解
させ、PH5.5に調整後80mgの１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩を添加溶液、室温で一夜撹拌下に反応
させたのち、反応液を蒸留水に対して透析し、
透析内液を凍結乾燥してカルボキシメチルモル
フイン・BSAを製造した。 (b) 抗カルボキシメチルモルフイン血清の製造 エストリオール−16α−グルクロナイド・
BSAの代りに上記(a)で製造したカルボキシメ
チルモルフイン・BSAを用いる以外、実施例
１(b)と全く同様な方法で抗カルボキシメチルモ
ルフイン血清を製造した。 (c) カルボキシメチルモルフイン結合ポリアクリ
ル酸結合ラテツクスの製造 (c‐1) カルボキシメチルモルフイン結合ポリアク
リル酸の製造 (イ) カルボキシメチルモルフイン−リジン誘
導体 カルボキシメチルモルフイン51.5mg、ε
−第三ブチルオキシカルボニルリジンメチ
ルエステル酢酸塩61mgをジメチルホルムア
ミド（DMF）10mlに溶解し、氷冷下撹拌
しながらジフエニルホスホリルアジド49
ml、次いでトリエチルアミン0.042mlを加
える。０℃で１時間撹拌したのち室温に48
時間放置、次いで反応液を40℃以下にて減
圧乾固し、残渣を調製用薄層クロマトグラ
フイに付し、カルボキシメチルモルフイ
ン・リジン誘導体66.7mgを得た。 (ロ) 上記(イ)で得たリジン誘導体40mgを98％蟻
酸５mlに溶解し室温に２時間放置したのち
40℃以下で減圧乾固する。さらに水酸化カ
リウム上に24時間減圧に保つ。これを
DMF5mlに溶解し、トリエチルアミン0.02
mlを加えたのちポリアクリル酸100mgと
DMF3mlを加え、さらにジシクロヘキシル
カルボジイミド（DCC）21mgを加えて48
時間反応させた。反応終了後、反応液をセ
ロフアンチユーブに移し、蒸留水中で80
時間透析した。透析内液を過したのち
液を濃縮してカルボキシメチルモルフイン
結合ポリアクリル酸溶液10ml（カルボキシ
メチルモルフイン含有量2.0mg／ml）を得
た。 (c‐2) カルボキシメチルモルフイン結合ポリアク
リル酸結合ラテツクスの製造 前記実施例１（ｄ−１）で製造したリジン
ラテツクス0.1ｇを１mlの蒸留水にて懸濁さ
せ、これに上記（ｃ−１）で製造したカルボ
キシメチルモルフイン結合ポリアクリル酸水
溶液１mlを加えて混合し、次いで１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩10mgを加え、撹拌下一夜反
応を行う。反応終了後遠心分離して得た沈殿
をグリシン緩衝化食塩液（PH9.6）10mlで３
回洗浄後、沈殿を0.05％にRSA（ウサギ血清
アルブミン）を含むグリシン緩衝化食塩液30
mlに懸濁させ、カルボキシメチルモルフイン
結合ポリアクリル酸結合ラテツクスを製造し
た。 (d) モルフインの測定 モルフインを2.8ｍmol／mlの炭酸ナトリウ
ムを含むグリシン緩衝液で第３表に示す濃度に
溶解し、各希釈液１滴をスライド板上に滴下
し、次いで上記(b)で製造した抗カルボキシメチ
ルモルフイン血清を上記炭酸ナトリウム含有グ
リシン緩衝液で300倍に希釈し、その0.3mlをそ
れぞれに添加し混合撹拌後、上記（ｃ−２）で
製造したカルボキシメチルモルフイン結合ポリ
アクリル酸結合ラテツクス溶液の１滴ずつを加
え、２分間揺動したのち、照明下肉眼で凝集
像、凝集阻止像を観察した。なお本実施例にお
いては本発明の試薬の測定感度を50nｇ／mlに
調整してあり、各試料の判定像は第３表に示す
通りであつた。従来法としてモルフイン及び抗
体をグリシン緩衝液で希釈した時の結果も第３
表に併せて示す。[Table] From the results in Table 2 above, it can be seen that the method of the present invention has a sensitivity that is 10 times or more superior to that of the conventional method. Example 3 (Measurement of Morphine) (a) Production of carboxymethylmorphine/BSA Dissolve 100mg of BSA in 25ml of distilled water, dissolve 80mg of carboxymethylmorphine in this solution, adjust the pH to 5.5, and then dissolve 80mg of BSA. 1-ethyl-3-
(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride was added to the solution and reacted with stirring at room temperature overnight, and then the reaction solution was dialyzed against distilled water.
Carboxymethylmorphine/BSA was produced by freeze-drying the dialyzed fluid. (b) Production of anti-carboxymethylmorphine serum Estriol-16α-glucuronide
Anti-carboxymethylmorphine serum was produced in exactly the same manner as in Example 1(b) except that carboxymethylmorphine/BSA produced in (a) above was used instead of BSA. (c) Production of carboxymethylmorphine-bonded polyacrylic acid-bonded latex (c-1) Production of carboxymethylmorphine-bonded polyacrylic acid (a) Carboxymethylmorphine-lysine derivative Carboxymethylmorphine 51.5 mg, ε
- Dissolve 61 mg of tert-butyloxycarbonyl lysine methyl ester acetate in 10 ml of dimethylformamide (DMF), and add 49% of diphenylphosphoryl azide while stirring under ice-cooling.
ml and then 0.042 ml of triethylamine. After stirring at 0°C for 1 hour, bring to room temperature.
After standing for a while, the reaction solution was dried under reduced pressure at 40° C. or below, and the residue was subjected to preparative thin layer chromatography to obtain 66.7 mg of a carboxymethylmorphine-lysine derivative. (b) After dissolving 40 mg of the lysine derivative obtained in (a) above in 5 ml of 98% formic acid and leaving it at room temperature for 2 hours,
Dry under reduced pressure below 40℃. Further keep under vacuum for 24 hours over potassium hydroxide. this
Triethylamine 0.02 dissolved in DMF5ml
ml and then 100mg of polyacrylic acid.
Add 3 ml of DMF and further add 21 mg of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) to 48
Allowed time to react. After the reaction is complete, transfer the reaction solution to a cellophane tube and incubate in distilled water for 80 minutes.
Dialyzed for hours. After the dialysis solution was filtered, the solution was concentrated to obtain 10 ml of a carboxymethylmorphine-bound polyacrylic acid solution (carboxymethylmorphine content: 2.0 mg/ml). (c-2) Production of carboxymethylmorphine-bonded polyacrylic acid-bonded latex 0.1 g of the lysine latex produced in Example 1 (d-1) was suspended in 1 ml of distilled water, and the above (c) 1 ml of the aqueous solution of carboxymethylmorphine-bound polyacrylic acid prepared in -1) is added and mixed, then 10 mg of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride is added, and the reaction is carried out overnight with stirring. After the reaction was completed, the precipitate obtained by centrifugation was mixed with 10 ml of glycine buffered saline (PH9.6) for 30 minutes.
After washing twice, remove the precipitate in glycine-buffered saline containing 0.05% RSA (rabbit serum albumin) for 30 min.
ml to produce a carboxymethylmorphine-bonded polyacrylic acid-bonded latex. (d) Measurement of morphine Morphin was dissolved in a glycine buffer containing 2.8 mmol/ml of sodium carbonate to the concentration shown in Table 3, one drop of each diluted solution was dropped onto a slide plate, and then the procedure described in (b) above was carried out. The produced anti-carboxymethylmorphine serum was diluted 300 times with the above sodium carbonate-containing glycine buffer, 0.3 ml of it was added to each, and after mixing and stirring, the carboxymethylmorphine-conjugated polyamide prepared in (c-2) above was diluted. One drop of the acrylic acid-bound latex solution was added, and after rocking for 2 minutes, the aggregation image and the aggregation inhibition image were observed with the naked eye under illumination. In this example, the measurement sensitivity of the reagent of the present invention was adjusted to 50 ng/ml, and the judgment images of each sample were as shown in Table 3. The results obtained when morphin and antibodies were diluted with glycine buffer as a conventional method were also shown in the third table.
It is also shown in the table.

【表】 上記第３表の結果から、本発明方法は従来法
に比べ８倍以上優れた感度を有していることが
わかる。 実施例 ４ （サイロキシンの測定） (a) サイロキシン・BSAの製造 BSA50mgを25mlの蒸留水に溶解し、この溶
液に30mgの１−シクロヘキシル−３−（２−モ
ルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・メ
ト−ｐ−トルエンスルホネート（MCDI）を加
え、さらに５mlのジメチルホルムアミドに溶解
したサイロキシンを撹拌下加えて室温にて一夜
撹拌した。反応終了後、反応液をセロフアンチ
ユーブに移し蒸留水２中で48時間透析し、凍
結乾燥してサイロキシン・BSAを製造した。 (b) 抗サイロキシン血清の製造 エストリオール−16−グルクロナイド・
BSAの代りに上記(a)で製造したサイロキシ
ン・BSAを用いる以外、実施例１(b)と全く同
様な方法で抗サイロキシン血清を製造した。 (c) サイロキシン・BSA感作ポリスチレンラテ
ツクスの製造 上記(a)で製造したサイロキシン・BSAを0.08
％の割合にグリシン緩衝液（PH8.6）に溶解し、
その５mlを２％ポリスチレンラテツクス粒子
〔ザ・ダウケミカル・カンパニー製（0.234μ）〕
懸濁液２mlに徐々に加え、37℃で２時間撹拌し
た。反応終了後、5000rpmで10分間遠心分離
し、残渣を10mlのグリシン緩衝液で洗浄したの
ち0.1％RSA溶液10mlに懸濁させ、37℃で２時
間撹拌した。反応終了後、10000rpmで50分間
遠心分離し、グリシン緩衝液で遠心洗浄し、残
渣をグリシン緩衝液に再懸濁させ、サイロキシ
ン・BSA感作ラテツクスを製造した。 (d) サイロキシン（T₄）の測定 正常男子血清４例に８−アニリノ−１−ナフ
タレンスルフオン酸を添加混合し、硫酸アンモ
ニウム2.3ｍmol／mlを含むリン酸緩衝液で２
倍、４倍及び８倍に希釈し、各希釈血清１滴ず
つをスライド板上に滴下した。これに上記(c)で
製造したサイロキシン・BSA感作ポリスチレ
ンラテツクスを１滴ずつ及び硫酸アンモニウム
2.3ｍmol／mlを含むグリシン緩衝液で250倍に
希釈した上記(b)で製造した抗血清の希釈溶液の
１滴ずつを加え混合後、２分間スライド板を揺
動したのち、照明下肉眼で凝集像又は凝集阻止
像を観察した。本実施例における本発明の試薬
の感度は30nｇ／mlに調整してあるので血清中
T₄の濃度は第４表に示す値であつた。なお、
本発明方法と従来法を比較するため、従来法と
して抗血清の希釈にグリシン緩衝液を用いる以
外、上記(d)におけると全く同様に測定した結果
も第４表に併せて示す。[Table] From the results in Table 3 above, it can be seen that the method of the present invention has a sensitivity that is 8 times or more superior to that of the conventional method. Example 4 (Measurement of thyroxine) (a) Production of thyroxine/BSA 50 mg of BSA was dissolved in 25 ml of distilled water, and 30 mg of 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimide meth- p-Toluenesulfonate (MCDI) was added, and then thyroxine dissolved in 5 ml of dimethylformamide was added under stirring, and the mixture was stirred at room temperature overnight. After the reaction was completed, the reaction solution was transferred to a cellophane tube, dialyzed in distilled water 2 for 48 hours, and freeze-dried to produce thyroxine/BSA. (b) Production of antithyroxine serum Estriol-16-glucuronide
Anti-thyroxine serum was produced in exactly the same manner as in Example 1(b), except that thyroxine-BSA produced in (a) above was used instead of BSA. (c) Production of thyroxine/BSA sensitized polystyrene latex Thyroxine/BSA produced in (a) above was added to 0.08
Dissolved in glycine buffer (PH8.6) to a proportion of %
5 ml of the 2% polystyrene latex particles [manufactured by The Dow Chemical Company (0.234μ)]
It was gradually added to 2 ml of the suspension and stirred at 37°C for 2 hours. After the reaction was completed, the mixture was centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes, and the residue was washed with 10 ml of glycine buffer, suspended in 10 ml of 0.1% RSA solution, and stirred at 37°C for 2 hours. After the reaction was completed, the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 50 minutes, centrifugally washed with glycine buffer, and the residue was resuspended in glycine buffer to produce thyroxine/BSA sensitized latex. (d) Measurement of thyroxine (T ₄ ) 8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid was added and mixed to four normal male serum samples, and the mixture was mixed with a phosphate buffer containing 2.3 mmol/ml of ammonium sulfate.
The serum was diluted 1-fold, 4-fold, and 8-fold, and one drop of each diluted serum was dropped onto a slide plate. Add one drop each of the thyroxine/BSA-sensitized polystyrene latex produced in (c) above and ammonium sulfate.
Add one drop at a time of the diluted solution of the antiserum prepared in (b) above diluted 250 times with glycine buffer containing 2.3 mmol/ml, mix, and then shake the slide for 2 minutes. An agglutination image or an agglutination inhibition image was observed. In this example, the sensitivity of the reagent of the present invention was adjusted to 30 ng/ml, so
The concentration of T ₄ was as shown in Table 4. In addition,
In order to compare the method of the present invention with the conventional method, Table 4 also shows the results of measurements carried out in exactly the same manner as in (d) above, except that a glycine buffer was used to dilute the antiserum as the conventional method.

【表】 従来法における方法ではT₄濃度が検出感度
以下であるため測定することができなかつた。 実施例 ５ メタネフイリンの測定 (a) メタネフイリン・BSAの製造 エストリオール−16−グルクロナイドの代り
にメタネフイリンを用いる以外、実施例１(a)と
全く同様な方法でメタネフイリン・BSAを製
造した。 (b) 抗メタネフイリン血清の製造 エストリオール−16−グルクロニド・BSA
の代りにメタネフイリン・BSAを用いる以外、
実施例１(b)と全く同様な方法で抗メタネフイリ
ン血清を製造した。 (c) メタネフイリン結合ビニルメチルエーテル無
水マレイン酸共重合物（PVMMA）結合ラテ
ツクスの製造 (c‐1) メタネフイリン結合PVMMAの製造 PVMMA100mgをDMF5mlに加温して溶解
し、表記メタネフイリン30mgを加え、溶液を
室温に４日間放置した。反応液をセロフアン
チユーブに移し、蒸留水２中にて80時間透
析したのち、透析内液を過し、次いで液
を濃縮してメタネフイリン結合ビニルエチル
エーテル無水マレイン酸共重合物溶液を得
た。 (c‐2) メタネフイリン結合PVMMA結合ラテツク
スの製造 前記実施例１（ｄ−２）で製造したジアミ
ノヘプタンラテツクス0.1ｇを１mlの蒸留水
に懸濁させ、これに上記（ｃ−１）で製造し
たカルボキシメチルメタネフイリン結合
PVMMA水溶液１mlを加えて混合し、次い
で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩10mgを加え、
撹拌下一夜反応を行つた。反応終了後遠心分
離して得た沈殿をグリシン緩衝化食塩液（PH
9.6）10mlで３回洗浄後、沈殿を0.05％に
RSAを含むグリシン緩衝化食塩液30mlに懸
濁させ、メタネフイリン結合PVMMA結合
ラテツクスを製造した。 (d) メタネフイリンの測定 正常男子尿３例について塩化リチウム7.1ｍ
mol／ml含有生理食塩液で1.5倍、２倍及び３
倍に希釈し、各希釈血清１滴ずつをスライド板
上に滴下した。これに上記(c)で製造したメタネ
フイリン結合ビニルメチルエーテル無水マレイ
ン酸共重合体結合ラテツクスを１滴ずつ及び上
記塩化リチウム7.1ｍmol／ml含有グリシン緩
衝液で200倍に希釈した上記(b)で製造した希釈
抗血清溶液の１滴ずつを加え、２分間揺動した
のち、照明下肉眼で凝集像、凝集阻止像を観察
した。なお、本実施例における本発明の試薬の
測定感度は20nｇ／mlに調整してあるので測定
値は第５表に示す値であつた。なお、本発明方
法と従来法を比較するため、従来法として正常
男子尿及び抗血清の希釈に生理食塩液及びグリ
シン緩衝液を用いる以外、上記(d)におけると全
く同様に測定した結果も第５表に併せて示す。[Table] In the conventional method, the T ₄ concentration could not be measured because it was below the detection sensitivity. Example 5 Measurement of metanephilin (a) Production of metanephilin/BSA Metanephilin/BSA was produced in exactly the same manner as in Example 1(a) except that metanephilin was used instead of estriol-16-glucuronide. (b) Production of anti-metanephilin serum Estriol-16-glucuronide/BSA
Other than using metanephilin/BSA instead of
Anti-metanephilin serum was produced in exactly the same manner as in Example 1(b). (c) Production of metanephilin-bound vinyl methyl ether maleic anhydride copolymer (PVMMA)-bound latex (c-1) Production of metanephilin-bound PVMMA Dissolve 100 mg of PVMMA in 5 ml of DMF by heating, add 30 mg of metanephilin, and dissolve the solution. It was left at room temperature for 4 days. The reaction solution was transferred to a cellophane tube and dialyzed against distilled water 2 for 80 hours, and the dialyzed solution was filtered and then concentrated to obtain a solution of metanephilin-bound vinyl ethyl ether maleic anhydride copolymer. (c-2) Production of metanephilin-bound PVMMA-bonded latex 0.1 g of the diaminoheptane latex produced in Example 1 (d-2) above was suspended in 1 ml of distilled water, and the mixture produced in (c-1) above was suspended in 1 ml of distilled water. carboxymethylmetanephilin binding
Add 1 ml of PVMMA aqueous solution and mix, then add 10 mg of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,
The reaction was carried out overnight with stirring. After the reaction was completed, the precipitate obtained by centrifugation was diluted with glycine buffered saline (PH
9.6) After washing 3 times with 10ml, reduce the precipitate to 0.05%.
Metanephilin-conjugated PVMMA-conjugated latex was prepared by suspending it in 30 ml of glycine-buffered saline containing RSA. (d) Measurement of metanephilin Lithium chloride 7.1 m for 3 normal male urine cases
1.5 times, 2 times and 3 times with physiological saline containing mol/ml
The serum was diluted twice and one drop of each diluted serum was dropped onto a slide plate. Add one drop of the metanephilin-bound vinyl methyl ether maleic anhydride copolymer-bound latex produced in (c) above and dilute it 200 times with the glycine buffer containing 7.1 mmol/ml of lithium chloride. After adding one drop of the diluted antiserum solution and shaking for 2 minutes, the agglutination image and the agglutination inhibition image were observed with the naked eye under illumination. In addition, since the measurement sensitivity of the reagent of the present invention in this example was adjusted to 20 ng/ml, the measured values were the values shown in Table 5. In addition, in order to compare the method of the present invention with the conventional method, the results of measurements carried out in exactly the same manner as in (d) above, except that physiological saline and glycine buffer were used as the conventional method to dilute normal male urine and antiserum, are also presented. It is also shown in Table 5.

【表】 従来法における方法ではメタフイリン濃度が
検出感度以下であるため測定することができな
かつた。 実施例 ６ 17−KSの測定 (a) エチオコラノロン−３−ヘミサクシネート・
BSAの製造 エストリオール−16−グルクロナイドの代り
にエチオコラノロン−３−ヘミサクシネートを
用いる以外、実施例１(a)と全く同様にしてエチ
オコラノロン−３−ヘミサクシネート・BSA
を製造した。 (b) 抗エチオコラノロン−３−ヘミサクシネート
血清の製造 エストリオール−16−グルクロナイド・
BSAの代りにエチオコラノロン−３−ヘミサ
クシネート・BSAを用いる以外、実施例１(b)
と全く同様にして抗エチオコラノロン−３−ヘ
ミサクシネートを製造した。 (c) エチオコラノロン−３−ヘミサクシネート・
RSAの製造 エストリオール−16−グルクロナイドの代り
にエチオコラノロン−３−ヘミサクシネート
を、BSAの代りにRSAを用いる以外、実施例
１(a)と全く同様にしてエチオコラノロン−３−
ヘミサクシネート・RSAを製造した。 (d) エチオコラノロン−３−ヘミサクシネート・
RSA結合カルボキシアミノモデイフアイドポ
リスチレンラテツクスの製造 プレグナンジオール−３−グルクロナイド・
GSAの代りにエチオコラノロン−３−ヘミサ
クシネート・RSAを用いる以外、実施例２(d)
と全たく同様にして、エチオコラノロン−３−
ヘミサクシネート・RSA結合カルボキシアミ
ノモデイフアイドポリスチレンラテツクスを製
造した。 (e) 尿中17−KSの測定 正常男子尿２例を塩化カリウム7.1ｍmol／
mlを含有するリン酸緩衝液（PH6.4）で20倍、
40倍、80倍及び160倍に希釈し、抗体希釈液を
５ｍmol／mlの塩化ナトリウムを含有するリン
酸緩衝液を用いる以外、実施例１(e)と同様な方
法で尿中の17−KSを測定した。本実施例にお
いては本発明の試薬の感度を0.05μｇ／mlに調
整してあるので測定値は第６表に示す値であつ
た。なお、本発明方法と従来法を比較するため
に、従来法としてリン酸緩衝液を使用して抗体
を希釈した以外、本発明方法と全く同様な測定
法による測定結果も第６表に併せて示す。[Table] In the conventional method, it was not possible to measure the metaphyllin concentration because it was below the detection sensitivity. Example 6 Measurement of 17-KS (a) Ethiocholanolone-3-hemisuccinate.
Production of BSA Ethiocholanolone-3-hemisuccinate/BSA was prepared in exactly the same manner as in Example 1(a) except that etiocholanolone-3-hemisuccinate was used instead of estriol-16-glucuronide.
was manufactured. (b) Production of anti-ethiocholanolone-3-hemisuccinate serum Estriol-16-glucuronide.
Example 1(b) except that etiocholanolone-3-hemisuccinate BSA is used instead of BSA.
Anti-ethiocholanolone-3-hemisuccinate was produced in exactly the same manner. (c) Ethiocholanolone-3-hemisuccinate.
Production of RSA Ethiocholanolone-3-hemisuccinate was used instead of estriol-16-glucuronide, and RSA was used instead of BSA in the same manner as in Example 1(a).
Manufactured hemisuccinate RSA. (d) Ethiocholanolone-3-hemisuccinate.
Production of RSA-bonded carboxyamino modified polystyrene latex Pregnanediol-3-glucuronide.
Example 2(d) except that etiocholanolone-3-hemisuccinate RSA is used instead of GSA.
In exactly the same manner, etiocholanolone-3-
A hemisuccinate/RSA-bonded carboxyamino modified polystyrene latex was produced. (e) Measurement of urinary 17-KS Two normal male urine samples were treated with potassium chloride 7.1 mmol/
20x with phosphate buffer (PH6.4) containing ml
17-KS in urine was diluted 40 times, 80 times, and 160 times, and the antibody dilution solution was used in a phosphate buffer containing 5 mmol/ml sodium chloride in the same manner as in Example 1(e). was measured. In this example, the sensitivity of the reagent of the present invention was adjusted to 0.05 μg/ml, so the measured values were as shown in Table 6. In addition, in order to compare the method of the present invention and the conventional method, Table 6 also shows the measurement results using a measurement method that is exactly the same as the method of the present invention, except that the antibody was diluted using a phosphate buffer as the conventional method. show.

【表】 上記第６表の結果から、本発明方法は従来法
に比べ14倍以上の感度を有することががわかつ
た。 実施例 ７ (a) エストリオール測定試薬の調製 前記実施例１の(a)、(b)、(c)、（ｄ−１）及び
(f)に記載の方法と全く同様にして、エストリオ
ール−16−グルクロナイド・RSA結合ラテツ
クス及び抗エストリオール−16−グルクロナイ
ド血清を製造した。 (b) エストロゲンの測定 下記表に示した濃度となるようにエストリオ
ールをグリシン緩衝液（PH9.2）に溶解し、標
準エストリオール溶液を作製した。この標準エ
ストリオール溶液の各１滴（0.03ml）をスライ
ド板上に滴下し、これに、測定時のNaCl濃度
が下記表に示した濃度となるようにNaClを含
有せしめたグリシン緩衝液（PH9.2）で320倍に
希釈した抗エストリオール血清を各１滴及びエ
ストリオール−16−グルクロナイド・RSA結
合ラテツクスの各１滴を加え、２分間揺動した
のち、照明下肉眼で凝集像、凝集阻止像を観察
した。その結果を下記第７表に示す。[Table] From the results in Table 6 above, it was found that the method of the present invention has a sensitivity 14 times or more compared to the conventional method. Example 7 (a) Preparation of estriol measurement reagent (a), (b), (c), (d-1) and
Estriol-16-glucuronide/RSA-conjugated latex and anti-estriol-16-glucuronide serum were produced in exactly the same manner as described in (f). (b) Measurement of estrogen A standard estriol solution was prepared by dissolving estriol in a glycine buffer (PH9.2) to the concentrations shown in the table below. One drop (0.03 ml) of each of these standard estriol solutions was dropped onto a slide plate, and added to a glycine buffer (PH9) containing NaCl so that the NaCl concentration at the time of measurement was as shown in the table below. Add 1 drop each of anti-estriol serum diluted 320 times in step 2) and 1 drop each of estriol-16-glucuronide/RSA-conjugated latex, shake for 2 minutes, and observe the aggregation image and agglutination with the naked eye under illumination. The stop image was observed. The results are shown in Table 7 below.

【表】 ラテツクス凝集阻止反応によるハプテンの定
量は凝集阻止像をもつて判定するが、その判定
の難易は凝集像の強さが要因となつている。 上記第７表に示す結果から明らかなとおり、
塩濃度を0.5〜15ｍmol／mlとすることにより
凝集像が明瞭となると共に、ハプテンの検出感
度が高くなり、極めて有意義に被検体中のハプ
テンを検出することが可能である。[Table] Quantification of hapten by latex agglutination inhibition reaction is determined based on the agglutination inhibition image, but the difficulty of this determination is due to the strength of the agglutination image. As is clear from the results shown in Table 7 above,
By setting the salt concentration to 0.5 to 15 mmol/ml, the agglutination image becomes clear and the detection sensitivity of hapten becomes high, making it possible to detect hapten in the specimen in a very meaningful manner.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １ ハプテン又はその化学的変性物が架橋成分を
介して結合した高分子ラテツクスとハプテン抗体
（抗血清）とを用い、凝集阻止反応により検体中
のハプテンを免疫学的に測定する方法において、
該凝集阻止反応を、0.5〜15ｍmol／mlの水溶性
のアルカリ金属塩又は水溶性アンモニウム塩の存
在下に行なうことを特徴とする方法。 ２ (A) 0.5〜15ｍmol／mlの水溶性アルカリ金
属塩又は水溶性アンモニウム塩を含有するハプ
テン抗体（抗血清）の水性希釈液と、 (B) ハプテン又はその化学的変性物が架橋成分を
介して結合した高分子ラテツクスと (C) 0.5〜15ｍmol／mlの水溶性アルカリ金属塩
又は水溶性アンモニウム塩を含有する希釈用水
溶液 とから成ることを特徴とするハプテンの凝集阻止
反応による免疫学的測定試薬キツド。[Claims] 1. Immunological measurement of hapten in a specimen by an agglutination inhibition reaction using a polymer latex to which hapten or its chemically modified product is bound via a crosslinking component and a hapten antibody (antiserum). In the method of
A method characterized in that the aggregation inhibition reaction is carried out in the presence of 0.5 to 15 mmol/ml of a water-soluble alkali metal salt or water-soluble ammonium salt. 2 (A) an aqueous dilution of a hapten antibody (antiserum) containing 0.5 to 15 mmol/ml of a water-soluble alkali metal salt or a water-soluble ammonium salt; An immunoassay based on a hapten aggregation inhibition reaction, characterized by comprising a polymer latex bound to a hapten and (C) an aqueous dilution solution containing 0.5 to 15 mmol/ml of a water-soluble alkali metal salt or a water-soluble ammonium salt. Reagent kit.