JPS63501096A - Small molecule immunoassay - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 小型分子の免疫測定法 発明の利用分野 本発明は、小型分子の２部位免疫測定の実施方法に関連するものである。ここで 用いる小型分子とは、２つの抗体分子を結合するには小さすぎるから、このタイ プの測定法を用いて検出できないと従来から一般に考えられていた免疫原または ハプテンのことである。[Detailed description of the invention] Small molecule immunoassay Field of application of invention The present invention relates to methods for performing two-site immunoassays for small molecules. here The small molecules used are too small to bind two antibody molecules; immunogens or It is about hapten.
本発明は、免疫測定の在来法のみならず、最近開発された方法をも含む実際上す べての免疫測定法に対して適用し得ると考える。The present invention covers virtually all methods of immunoassay, including conventional methods as well as recently developed methods. We believe that this method can be applied to all immunoassay methods.
好ましい測定法は１つの抗体が同相にあり、他の抗体が標識されて液相にあると いうものである。The preferred assay method is to have one antibody in the same phase and the other antibody labeled and in the liquid phase. That's what I mean.
本発明は、ステロイド、マイコトキシン、抗生物質。The present invention relates to steroids, mycotoxins, and antibiotics.
小型ホルモンおよび小型ペプチド等の農業と医学面で重要な低分子量分子の微小 量を正確に検出する方法を提供するものである。Small molecules of low molecular weight that are important in agriculture and medicine, such as small hormones and small peptides. It provides a method for accurately detecting the amount.
発明の背景 ２部位免疫測定法は、１部位法より、測定の感度、特異性、速さ、および安定性 が向上することの他に多くの有利性を持っている。（Ｗ、Ｈ，ハンター、特表昭 ６３−５０１０９６ （３） Ｊ、Ｅ、Ｔ、コリー編゛′臨床化学のための免疫測定・’１９８３年版５００頁 （ニブインバラ、ロンドン、メルボルン、ニューヨーク、チャーチル、リビング ストン）中のパステロイド免疫測定法のためのモノクローナル抗体″Ａ、ホワイ ト著〕。例えば、免疫放射定量分析法（ＬＲＭＡ）は、特にモノクローナル抗体 技法と併用すると、実施が容易であり、検出限界が低く、培養期間および計数時 間が短く、放射免疫３Ｉｌｌ定法（ＲＩ Ａ）よりも適用範囲が広い〔″免疫性 ジャーナル″第５０巻（１９８２年）１３３〜１４４頁″アルファ胎児性タンパ クの免疫放射定量分析に使用するモノクローナル抗体″Ｗ、Ｈ，ハンターら。免 疫法ジャーナル 第４５巻（１９８１年）２５５〜２７３頁″免疫放射定量分析 法 対 放射免疫測定法：押型型分析物としてアルファ胎児性タンパクを用いた 比較”Ｗ、Ｈ，ハンター、Ｐ、Ｓ 、プツト〕。Background of the invention Two-site immunoassays offer greater sensitivity, specificity, speed, and stability of measurement than single-site methods. In addition to improving performance, it has many advantages. (W, H, Hunter, Akira Tokuhyo 63-501096 (3) J. E. T. Colley (Eds.), Immunoassays for Clinical Chemistry, 1983 edition, 500 pages. (Nib Inburgh, London, Melbourne, New York, Churchill, Living monoclonal antibody for pasteloid immunoassay in Written by To]. For example, immunoradiometric assay (LRMA) is a method that specifically analyzes monoclonal antibodies. When used in conjunction with the technique, it is easy to perform, has low detection limits, and has a short incubation period and counting time. The period of time is short, and the range of application is wider than that of the standard radioimmunological method (RIA). Journal ``Vol. 50 (1982) pp. 133-144'' Alpha Fetal Protein Monoclonal antibodies used for immunoradiometric quantitative analysis of Epidemic Law Journal Vol. 45 (1981) pp. 255-273 "Immunoradiation Quantitative Analysis Method vs. radioimmunoassay: using alpha fetal protein as the embossed analyte Comparison “W, H, Hunter, P, S, Putt].
２つのモノクローナル抗体の組合せを用いて協同作・用的な免疫測定を構成でき ることが、近年、明らかにされた。すなわち、この免疫測定法では、特定の抗原 に対して培養されたモノクローナル抗体の混合物は、それぞれの抗体がその抗原 に対して個別にもつ親和性よりも、大きな親和性を持つという・ものである〔″ サイエンス″第２２１巻（１９８３年７月１５日発行）２７９〜２８１頁″協同 作用的な免疫測定：混合したモノクローナル抗体を用いた超高感度測定法”Ｐ、 Ｈ，エールリッヒ、Ｗ、Ｒ，モイル（以後、エールリッヒとモイルの゛サイエン ス″論文と呼ぶ）、“免疫法ジャーナル″第１２８巻（１９８２年） ２７０９ 〜２７１３頁１１２つのモノクローナル抗体の混合は抗原親和性を増大する”、 Ｐ、Ｈ，エールリッヒら（以後エールリッヒらの″免疫法ジャーナル″論文と呼 ぶ）〕。A cooperative immunoassay can be constructed using a combination of two monoclonal antibodies. This has been revealed in recent years. In other words, in this immunoassay, a specific antigen A mixture of monoclonal antibodies incubated against the antigen is It is said to have a greater affinity than the individual affinities for Science" Volume 221 (published July 15, 1983) pp. 279-281" Kyodo Effective immunoassay: ultra-sensitive assay using mixed monoclonal antibodies”P, H. Ehrlich, W. R. Moyle (hereinafter referred to as Ehrlich and Moyle's Science) ``Immunology Journal'' Vol. 128 (1982) 2709 ~page 2713 11 Mixing of two monoclonal antibodies increases antigen affinity”, P. H. Ehrlich et al. (hereinafter referred to as Ehrlich et al.'s ``Immunology Journal'' paper) bu)].
しかしながら、２部位免疫測定法では、その名が意味する通り、検定対象分子に 同時に２つの抗体が結合できる事が必要とされる。一般に考えられている事は、 １つの抗体が小さな免疫原またはパブテンの１つのエピトープに結合すると、そ の抗体は他の抗体が別のエピトープに結合するのを空間的にブロックできるから 。However, in two-site immunoassays, as the name implies, the molecules to be tested are It is required that two antibodies can bind at the same time. What is generally thought to be When one antibody binds to one epitope of a small immunogen or pabten, its antibodies can spatially block other antibodies from binding to different epitopes. .
２つの抗体を同時に結合させるには対象とする分子がある最少限度のサイズは持 っていなければならないと、いうことである、〔ニューヨーク、アカデミツク・ プレス（１９７５年）“抗体分子２６５頁Ａ・ニソノフら〕。In order to bind two antibodies simultaneously, the molecules of interest must have a certain minimum size. [New York, Academic] Press (1975) “Antibody Molecules, p. 265 A. Nisonov et al.”.
したがって、２つの抗体を同時に結合する必要があるから、２部位免疫測定法は 、今迄は大きな分子の検定にのみ使用されてきた。例えば、アルファ胎児性タン パクとヒト繊毛性性腺刺激ホルモンは前述の免疫放射定量分析法および協同作業 的な測定技法を用いてそれぞれ検定された。Therefore, since it is necessary to bind two antibodies at the same time, the two-site immunoassay is , so far it has only been used for assaying large molecules. For example, alpha fetal tan Park and human ciliary gonadotrophin are analyzed using the aforementioned immunoradiometric quantitative analysis method and collaborative work. Each was tested using a standard measurement technique.
もう一つの例としては、Ｈ，Ａ、ケータスらが心性に対する２つの異なるエピト ープを測定する″ダブル・サンドイッチ″放射免疫測定法を用いた〔分子免疫学 、第１９巻（１９８２年）４５１〜４５５頁“２つのモノクローナル抗体をダブ ル・サンドインチ検定に用いて、ヒト心臓性ミオシンの放射免疫測定における特 異性が増大″〕、デーピットとグレン（１９８３年３月８日発行米国特許第４， ３７６．１１０号）は、モノクローナル抗体を用いた多数の２部位免疫測定に関 して述べている。彼らは、多くの抗原部位をもつ大きな免疫原性プロティンの検 定にふれている。さらに、彼らは、広範囲の多価抗原物質の存在またはその濃度 の決定に彼らの発明が有用であると述べている。As another example, H.A., Ketas et al. A “double sandwich” radioimmunoassay method was used to measure the , Vol. 19 (1982), pp. 451-455 “Dubbing two monoclonal antibodies” Characteristics of radioimmunoassay of human cardiac myosin "Increased Heterosexuality"], De Pitt and Glenn (U.S. Pat. No. 4, issued March 8, 1983, No. 376.110) describes a number of two-site immunoassays using monoclonal antibodies. This is what he says. They detect large immunogenic proteins with many antigenic sites. It is in constant touch. In addition, they demonstrate the presence or concentration of a wide range of multivalent antigenic substances. states that their invention is useful in determining the
前述の通り、２部位免疫測定では、同一分子上゛に少なくても２つのエピトープ が存在し、２つの抗体が立体障害なしに同時に結合できるようこれらのエピトー プ間に十分な距離があることが必要である。立体干渉をさけ、そしてハプテンま たは免疫原が２つの抗体分子を結合できるのに必要な距離は最低２０〜２６オン グストロームであると考えら九る〔Ａ・ニソノフら、″抗体分子”、ニューヨー ク、アカデミツク・プレス（１９７５年）６５頁〕、シかし、これらの実験が二 機能を有するジニトロフェノール（ＤｎＰ）誘導体、ＤｎＰ−ｎ−ＤｎＰ上の空 間妨害をさけるのに必要とされる結合部位間の距離決定のために実施さ九たこと に留意しなければならない、このＤｎＰ−ｎ−ＤｎＰでは、ｎは。As mentioned above, in two-site immunoassay, at least two epitopes are detected on the same molecule. are present, and these epitopes are arranged so that the two antibodies can bind simultaneously without steric hindrance. There must be sufficient distance between the two groups. Avoiding steric interference and hapten or the distance required for the immunogen to bind two antibody molecules is at least 20 to 26 ions. [A. Nisonov et al., “Antibody Molecule”, New York] Academic Press (1975) p. 65], but these experiments were Functional dinitrophenol (DnP) derivative, DnP-n-DnP Nine things have been done to determine the distance between binding sites needed to avoid interfering with It must be noted that in this DnP-n-DnP, n is.
長さで変動するスペーサーを表わす。これらの合成ハプテンは実験用にのみデザ インされたちのマ必ずしも自然に産する小ハプテンを模倣しているとは限らない 。Represents a spacer that varies in length. These synthetic haptens are designed for experimental use only. Injected materials do not necessarily mimic naturally occurring small haptens. .
特に、これらの二機能性ジニトロフェノール誘導体の持ちうる配列の数が限られ ている点に関してそうであると言える。２６オングストロームよりもはるかに大 きな分子である二機能性ジニトロフェノール誘導体は、２部位免疫測定の実際上 の限界であると、一般に考えられている。In particular, the number of possible sequences of these bifunctional dinitrophenol derivatives is limited. It can be said that this is true in that respect. much larger than 26 angstroms Bifunctional dinitrophenol derivatives, which are important molecules, are useful in practical two-site immunoassays. It is generally believed that this is the limit.
例えば、ステロイドに体するモノクローナル抗体を用いた免疫測定法の記述に続 く解説の中でエキンスはモノクローナル抗体は２部位サンドインチ測定法を用い て大きな分子を検定することにのみ重要であるように思う、と述べている（Ｒ， Ｐ、エキンス″解説（１１，５章）”で引用：゛臨床化学のための免疫測定″″ Ｗ、Ｈ。For example, following the description of an immunoassay using monoclonal antibodies directed against steroids, In his detailed commentary, Ekins explains that monoclonal antibodies use the two-site sandwich assay method. (R, Quoted in P. Ekins' Commentary (Chapter 11, 5): ``Immunoassay for Clinical Chemistry'' W, H.
トン、メルボルン、ニューヨーク、チャーチル、リビングストン（１９８３年） ５００頁〕、２部位免疫測定を用いてテストされてきた最小で臨床的に重要な分 子は１分子量が約６０００のインシュリンである。２部位測定を用いてテストで きる最小分子は分子量約３２００以上のものであると、一般に考えられている。Tong, Melbourne, New York, Churchill, Livingston (1983) 500 pages], the smallest clinically important fraction that has been tested using a two-site immunoassay. The child is insulin with a molecular weight of about 6000. Tested using two-site measurements It is generally believed that the smallest molecules that can be produced are those with a molecular weight of about 3200 or greater.
しかし、マイコトキシンやステロイド等、農学、医学面で重要な小分子の存在ま たは濃度を決定するには。However, there are some small molecules that are important in agriculture and medicine, such as mycotoxins and steroids. or concentration.
免疫放射定量分析の免疫測定法。協同作用的な免疫測定法およびその他の２部位 免疫測定法によって与えられる感度や特異性をさらに上げる必要がある。これら の化合物は採取試料中にきわめて低い濃度で存在しているから感度と特異性の欠 如は、これらの物質の検出する際に制限因子となる。感度および特異性が向上す ると、高価で繁雑な抽出段階のいくつかを取り除くことができるので、これら各 種免疫測定法を改善することになる。抗体の１つが標識されている２部位免疫測 定を用いて、蛍光標識、酵素標識または放射標識で抗原を標識するのをさけると 、マイコトキシンやステロイドのような少ない抗原が破壊されるかもしれない段 階を除くことができる。ステロイドに対する抗体の交差反応性は、これらの化合 物の測定法が現在利用可能な測定法より感度が高く特異的でなければならない、 もう一つの理由である。各ステロイドの相対的存在度（比）を決定することは、 臨床的には有益である場合が多い、しかし、現在可能な検定法の不十分な特異性 発明の概要 本発明は、２部位免疫測定法を用いて検定するには小さすぎると従来考えられて いたサイズの小抗原および小ハプテンの検出またはこれらの濃度測定に、２部位 免疫測定が実施できるという発見に基づいている。Immunoassay for quantitative immunoradiometric analysis. Cooperative immunoassay and other two sites There is a need to further increase the sensitivity and specificity afforded by immunoassays. these These compounds are present at extremely low concentrations in the collected samples, resulting in a lack of sensitivity and specificity. is a limiting factor in the detection of these substances. Increased sensitivity and specificity Each of these can eliminate some of the expensive and complicated extraction steps. This will improve the seed immunoassay. Two-site immunoassay in which one of the antibodies is labeled Avoid labeling antigens with fluorescent, enzymatic, or radiolabels using , less antigens such as mycotoxins and steroids may be destroyed. Floors can be removed. The cross-reactivity of antibodies to steroids is due to the A method for measuring a substance must be more sensitive and specific than currently available methods; That's another reason. Determining the relative abundance (ratio) of each steroid is Often clinically beneficial, but insufficient specificity of currently available assays Summary of the invention The present invention demonstrates the ability of cells previously thought to be too small to be assayed using two-site immunoassays. For detection of small antigens and small haptens, or for measuring their concentration, two-site It is based on the discovery that immunoassays can be performed.
本発明の範囲内にある小分子は分子量が約２５０から２５００〜３０００、望ま しくは約２７５から１０００までのサイズのものである。最も望ましい範囲は分 子量２７５から５００までである。Small molecules within the scope of the invention have a molecular weight of about 250 to 2500-3000, preferably or approximately 275 to 1000 in size. The most desirable range is minutes. The molecular weight is from 275 to 500.
これらの変動の主要な理由は分子量が空間における分子の寸法を決定する唯一の パラメータではないことである。最大寸法において同じ長さであっても、小型の 球状分子の方が細長い分子よりも重い場合があるからである。さらに、２つの抗 体を結合するのに適した２つのエピトープが互いから最も遠い分子上の２点に位 置していない場合には、もしこれらの２つの結合部位が実際に研究対象の小分子 の反対の端にある場合よりも、分子の大きさが同時結合の起こる前でさらに大き いことが必要である。従って１本発明は分子量またはその他の簡単なパラメータ によって単純に束縛されるものではない、しかしながら、分子が多くの異なる配 列をとるとしても、分子量は少なくとも本発明の主題である小分子を説明するこ とになる。さらに、上述の分子量範囲にある分子が当業者にとって予期できない 領域内にあると我々は考える。The main reason for these variations is that molecular weight is the only determinant of a molecule's dimensions in space. It is not a parameter. Even if the length is the same in the maximum dimension, the smaller This is because spherical molecules may be heavier than elongated molecules. In addition, two anti- Two epitopes suitable for binding bodies are located at the two points on the molecule furthest from each other. otherwise, if these two binding sites are actually connected to the small molecule under study. The size of the molecule is larger before simultaneous binding occurs than at the opposite end of It is necessary to Therefore, 1 the present invention is based on molecular weight or other simple parameters. However, molecules are not simply constrained by However, molecular weight is at least sufficient to describe the small molecules that are the subject of this invention. It becomes. Moreover, molecules in the above-mentioned molecular weight range are unexpected to those skilled in the art. We think it is within the realm.
２部位免疫測定法が農業および医学分野で重要な小分子の存在の検出と濃度と測 定に特に有益であることを我々は発見した。臨床的に関連性があって、とりわけ ２部位免疫測定を用いて検査することのできる小分子には、アルドステロン、コ ルチゾン、エストラジオール、プロゲステロンおよびテストテロンのようなステ ロイド、トリヨードサイロニンおよび黄体化ホルモン放出因子（ＬＨ−ＲＨ）の ような小ホルモン、ゲンチミシンおよびペニシリンのような抗生物質が含まれる 。同様に、アフタ１−キシンおよびトリコセシンのようなマイコトキシンも２部 位法を用いてきわめて微小な濃度で検出可能である。そのため、これらの測定法 は穀物およびその他の農産物の検査に有益である。アスパルテームのような小ペ プチドおよび前述のホルモンもまた２部位法による検定に適している。Two-site immunoassays are used to detect the presence, concentration and measurement of small molecules important in agriculture and medicine. We have found that this is particularly beneficial in certain situations. clinically relevant, inter alia Small molecules that can be tested using two-site immunoassays include aldosterone, steroids such as lutisone, estradiol, progesterone and testosterone roid, triiodothyronine and luteinizing hormone releasing factor (LH-RH). Contains small hormones such as gentimicin and antibiotics such as penicillin . Similarly, mycotoxins such as aphtha-1-xin and trichothecin also have two parts. It can be detected at extremely small concentrations using the position method. Therefore, these measurement methods is useful for testing grains and other agricultural products. small amount like aspartame Peptides and the hormones mentioned above are also suitable for assay in a two-site method.
発明の詳細な説明 ２部位免疫測定法を用いて検定するには、小さすぎると従来考えられていた分子 の検定には、まず最初に。Detailed description of the invention Molecules previously thought to be too small to be assayed using two-site immunoassays First of all, for the test.
これらの分子に対する抗体を培養しなければならない。Antibodies against these molecules must be cultivated.
小分子が免疫原である場合は小分子の精製試料を複数の動物に注入して、２つの 別々の異なる抗血清を作らねばならない、同様に、−１二匹の動物を望ましい免 疫原性小分子で免疫することができる。こうして、最初にミルスタインとコーラ −によって報告されたように、モノクローナル抗体産出ハイブリドーマをつくる ための周知の方法を用いてモノクローナル抗体を得ることができる〔゛ネイチャ ー”第２５６巻（１９７５年）４９５〜４９７頁、Ｈ，ジータ、Ｄ、ブルックス 著″モノクローナル・ハイブリドーマ抗体の産出法と特性”Ｊ、Ｇ、Ｒ。If a small molecule is an immunogen, purified samples of the small molecule can be injected into multiple animals to produce two Similarly, separate and different antisera must be made; Can be immunized with small epidemiogenic molecules. Thus, first Milstein and Cora − Create monoclonal antibody-producing hybridomas as reported by Monoclonal antibodies can be obtained using well-known methods for -” Vol. 256 (1975), pp. 495-497, H. Zita, D. Brooks. Author: “Production method and characteristics of monoclonal hybridoma antibodies” J, G, R.
バレルＩ１１″モノクローナル・ハイブリドーマ抗体″、その技法と応用ボカレ ートン、フロリダ州、ＣＲＣプレ入社（１９８２年）１頁（以後、Ｈ，ジータ、 Ｄ、ブルソクス″法と呼ぶ）を参照〕。Barrel I11 ``monoclonal hybridoma antibody'', its technique and application Bokare Tom, Florida, joined CRC Pre (1982), p. 1 (hereinafter referred to as H. D. (referred to as the Bursox method)].
ここに述べる方法を用いて検定することのできる小分子の大部分はハプテンであ り、従って、プロティンまたはその他の適当な基とカップリングしないかぎり、 免疫原性ではない０本発見の対象である分子のサイズが小さいために、ある場合 には、２つの接合小分子を作成する必要が生じる。すなわち、検定する小分子は 、小分子上の２つの異なる部位にプロティンまたはその他の適切な基を付着させ る事によって、接合される６次いで、これらの２組の接合小分子は２匹のマウス または他の適当な動物を免疫するのに使用され、ポリクローナル抗血清または上 述のモノクローナル抗体を産出する。−匹のマウスまたはその他の適当゛な動物 は。The majority of small molecules that can be assayed using the method described here are haptens. Therefore, unless coupled with proteins or other suitable groups, In some cases, due to the small size of the molecule targeted for discovery that is not immunogenic. requires the creation of two conjugated small molecules. In other words, the small molecule to be assayed is , attaching proteins or other suitable groups to two different sites on a small molecule. These two sets of conjugated small molecules are then conjugated in two mice. or other suitable animals, using polyclonal antisera or The monoclonal antibodies described above are produced. - a mouse or other suitable animal; teeth.
２組の複合小分子を用いて免疫され、本発明を実行するのに適した２つのモノク ローナル抗体をつくることができる。接合ハプテンの作成法は技術上周知であり 。Two sets of complex small molecules are used to immunize two monochromes suitable for carrying out the invention. Local antibodies can be produced. The method for making conjugated haptens is well known in the art. .
対象ハプテンの特殊性に見合って変化することが多い。It often changes depending on the specificity of the target hapten.
ステロイド及びアルドステロン□に異なる位置での２つの接合体を作る手順は以 下の実験例で述べる。The procedure for making two conjugates at different positions for steroid and aldosterone □ is as follows. This will be explained in the experimental example below.
一対の組合せがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗血清、またはモノクロー ナル抗体とポリクローナル抗血清のいずれであれ、少なくとも一対の抗体が検定 する小分子に対して産出されると１次にこれらの抗体は本発明の教える所と調和 して検定する小分子への同時結合のためにテストされる。当業者に周知である多 数の異なる２部位免疫測定法をこの目的のために用いることができる０例えば免 疫放射定量分析測定法を用いることができる。さらに詳゛脱すれば、例えばＸが 小分子、ＡがＸに対して作成さ〉れたモノクローナル抗体、ＢがＸに対するモノ クローナル抗体でＡとは異なるものとする。簡単に言えば、免疫放射定量分析測 定は１次のような過程をたどる０、固体支持物に付着した抗体Ａを、既知量の小 分子又と混合した放射標識抗体Ｂと接触させる；小ハプテンと供に、抗体ＡとＢ の混合物は培養される；次いで、液相を固相から除去し洗浄する。固体支持物の 放射能をチェックする。抗体ＡとＢが両者とも小分子Ｘに同時に結合することが できるならば放射能は固体支持物にのみ認められる。The pairwise combination is a monoclonal antibody, polyclonal antiserum, or monoclonal At least one pair of antibodies, both null and polyclonal antisera, are assayed. These antibodies are consistent with the teachings of the present invention when raised against small molecules that and assayed for simultaneous binding to small molecules. Many known to those skilled in the art A number of different two-site immunoassays can be used for this purpose, e.g. Quantitative radiation analysis measurement methods can be used. If we go into more detail, for example, if X Small molecule, A is a monoclonal antibody made against X, B is a monoclonal antibody against X It is a clonal antibody and is different from A. Simply put, immunoradiometric quantitative analysis The determination follows a first-order process, in which a known amount of antibody A attached to a solid support is contact with radiolabeled antibody B mixed with molecules; antibodies A and B together with a small hapten; the mixture is incubated; the liquid phase is then removed from the solid phase and washed. solid support Check for radioactivity. Antibodies A and B can both bind to small molecule X at the same time. If possible, radioactivity is only seen on solid supports.
同時結合のテストに用いる同じ２部位免疫測定を、次に採取試料の検定に用いて 、試料中の小分子の存在−や１浪度を１決定することができる。免疫定量分析測 定法、゛に゛は多くの異なるタイプがきる。これら多数の免疫定量分析測定法に 利用とその方法については、米国特許ｆｆ５４，３７６．１１０号にデーピッド とグリーンが解説を加えている。The same two-site immunoassay used to test for simultaneous binding was then used to assay the collected samples. , the presence or degree of small molecules in a sample can be determined. immunoquantitative assay There are many different types of formal law, ゛ni゛. These numerous immunoquantitative assay methods U.S. Pat. No. FF 54,376.110 describes David Green added an explanation.
概説すれば、検定する液体中で不溶の固体支持体に結合していて標識されてない 抗体を若干量と、同相抗体、抗原および標識抗体間に形成される三元複合体の検 出そして／または計量を可能にする放射性同位元素等のラベルをもつ可溶性抗体 の若干量を、用いた検定であると彼らは述べている。Generally speaking, an unlabeled substance bound to a solid support that is insoluble in the liquid being assayed. A small amount of antibody is used to detect the ternary complex formed between the in-phase antibody, antigen, and labeled antibody. Soluble antibodies with a label such as a radioisotope that allows for detection and/or quantification They state that the test used a small amount of .
先行技術で周知である免疫分析測定法の中で、代表的には、固相に結合した抗体 を二重の同相抗体の形成によって抗原を試料から抽出するためにテスト試料にま ず接触させる゛′フォワード”測定法が用いられる。Among the immunoassay assays well known in the prior art, typically antibodies bound to a solid phase are used. is applied to the test sample in order to extract the antigen from the sample by the formation of double homologous antibodies. A ``forward'' measurement method is used, in which no contact is made.
この時、抗原複合体を使用する。適当な培養期間後、固体支持体は未反応抗原（ もしあれば）を含む溶液中の残留物を除去するために洗浄され次いで既知量の標 識抗体を含む溶液に接触させる。 ゛ 未標識抗原を介して固体支持体に結合した抗体と標識された抗体が複合するため の別の培養期間が終わった後、固体支持体は、未反応の標識抗体を除去するため に、２回目の洗浄を受ける。テスト試料中に抗原が存在するか否かを判定するた めの、単純な゛′イエス／ノー″検定で洗浄された固体支持体は１例えば標識が 放射性元素でされる場合は放射能を測定することによって、標識抗体を検出のた めにテストされる。検出された１ｓｒａ抗体量を抗原を持たないことがわかって いる陰性対照試料と比較する。陰性対照が示すバックグラウンド・レベルを著し く超える量の標識抗体の検出は抗原の存在が疑われることを示しているものとみ なされる。きわめて過剰な抗原はバックグラウンド示度を与えるので、抗原を含 む液体は数回希釈するのが最も望ましい、試料の希釈は、この可能性を効果的に 排除することになる。標識抗体量を、既知量の抗原を含む標準試料に対して得ら れる値と比較して定量的判定が可能になる。At this time, an antigen complex is used. After a suitable incubation period, the solid support is free of unreacted antigen ( (if any) and then a known amount of the standard. Contact with a solution containing a recognized antibody.゛ Due to the complexation between the labeled antibody and the antibody bound to the solid support via the unlabeled antigen. After another incubation period, the solid support is removed to remove unreacted labeled antibodies. Afterwards, it undergoes a second cleaning. to determine whether antigen is present in the test sample. For example, a solid support that has been washed in a simple "yes/no" assay is When using a radioactive element, the labeled antibody can be detected by measuring the radioactivity. will be tested. The amount of 1sra antibody detected was found to be without antigen. Compare with negative control sample. Significantly exceed the background level exhibited by the negative control. Detection of an amount of labeled antibody exceeding It will be done. A large excess of antigen will give a background reading; It is best to dilute the sample liquid several times; sample dilution effectively avoids this possibility. It will be excluded. The amount of labeled antibody was obtained against a standard sample containing a known amount of antigen. Quantitative judgment can be made by comparing with the value obtained.
この種の検定は、゛２部位″またはパサンドイッチ′″検定とよく呼ばれている 。これは抗原が異なる位置でその表面に結合する２つの抗体を持っているためで ある。これとその関連する技法はワイドによって記述されている〔カークハムと ハンター編、″放射免疫測定法″エディンバラ、Ｅ＆Ｓリビングストン（１９７ ０年）１９９〜２０６頁〕、ヒト繊毛性性線刺激ホルモン検出用にデザインされ たサンドイッチ検定は前述のエールリッヒらの“免疫ジャーナル”論文に述べら れている。This type of test is often referred to as a ``two-site'' or passandwich'' test. . This is because the antigen has two antibodies that bind to its surface in different positions. be. This and related techniques are described by Wide [Kirkham and Hunter, ed., “Radioimmunoassay”, Edinburgh, E&S Livingstone (197 0), pp. 199-206], designed for the detection of human ciliary gonadotropin. The sandwich assay was described in the above-mentioned “Immunology Journal” paper by Ehrlich et al. It is.
１固相／１液相で２部位免疫分析測定の特殊なシステムは、制限的なものではな くて、当業者は、さまざまな変法を考案することができるであろう。例えば塩化 ビニル樹脂のマイクロタイター板、濾紙、プラスチック・ビーズ、またはポリエ チレン、ポリスチレン、ポリプロピレンその他の適切な材料でできた試験管等の 多くの器具や、このタイプの検定の固相を固定化する支持体として適切である。The special system for two-site immunoassay measurements with one solid phase and one liquid phase is not limiting. Therefore, those skilled in the art will be able to devise various variations. For example, chloride Vinyl microtiter plates, filter paper, plastic beads, or polyethylene test tubes made of tyrene, polystyrene, polypropylene, or other suitable material. It is suitable as a support for immobilizing the solid phase of many instruments and assays of this type.
抗体もまた、アガロース、架橋デキストランおよびその他の多糖類のような特定 の物質に、米国特許第３，６４５，８５２号に述べられている抗体を多糖類に結 合する方法等の周知技法を用いて結合することができる。同様に、液体抗体を標 識するには多数の周知方法が存在する。Ｐ、Ｍ、クリンマンおよびＪ、Ｃ，ハワ ードの手法で、ヨー素１２５を用いて、液面抗体を放射標識する事ができる。〔 ″ハイブリドーマ抗体のＩｌｌのためのプロティンヨウ素化バイブリドニーヨー ク、プレナム・プレス（１９８０年）４０１〜４０２頁、これ以後、”Ｐ、Ｍ、 クリンマンとＪ、Ｃ，ハワード法″′と呼ぶ〕、同じく、この抗体は米国特許第 ３，９４０，４７５号の蛍光原性標識または米国特許第３，６４５，０９０号の 酵素マーカーを用いてＩｎｋすることができる。Antibodies can also be used with specific materials such as agarose, cross-linked dextran and other polysaccharides The antibody described in U.S. Pat. No. 3,645,852 was conjugated to the polysaccharide. The combination can be performed using well-known techniques such as merging methods. Similarly, label liquid antibodies. There are a number of well-known methods for determining this. Klinman, P. M. and Hawa, J. C. Iodine-125 can be used to radiolabel liquid surface antibodies in a conventional manner. [ “Protein iodinated hybrid knee for hybridoma antibody Ill Plenum Press (1980) pp. 401-402, hereafter referred to as “P, M, Klinman and J.C. Howard method''], this antibody is also described in U.S. Patent No. 3,940,475 or the fluorogenic label of U.S. Pat. No. 3,645,090. Ink can be performed using enzyme markers.
ある場合には、本適用の対象物質である小分子が同一抗体に対する２つの結合部 位を持つのに十分な配列や化学構造を持っており、それ故に上述のどんな２部位 免疫測定法も２つの異なる抗体の代わりに１つの抗体を用いて行なう事ができる 。本発明のこの特別な実施態様に適する小分子の実施例はメルフィリンである。In some cases, the small molecule that is the target of this application has two binding sites for the same antibody. It has sufficient sequence and chemical structure to have two positions, and hence any two positions mentioned above. Immunoassays can also be performed using one antibody instead of two different antibodies. . An example of a small molecule suitable for this particular embodiment of the invention is melfilin.
他の大部分の場合では、２つの異なる抗体、すなわち、同一のエピトープに結合 しない２つの抗体が必要となる。In most other cases, two different antibodies, i.e. binding to the same epitope, Two antibodies are required.
本発明に関連して使用するために考察された免疫放射分析測定の詳説は下記の実 施例３に述にら九でいる。A detailed description of immunoradiometric measurements contemplated for use in connection with the present invention is provided below. The details are as described in Example 3.
上述の免疫放射分析またはサンドイッチ検定以外の２部位免疫測定法もまた、こ の測定法を実施するのに適している。２つのモノクローナル抗体の混合物は前述 のエールリッヒおよびモイルの″サイエンス″論文。Two-site immunoassays other than the immunoradiometric or sandwich assays described above are also useful for this purpose. Suitable for carrying out measurement methods. The mixture of two monoclonal antibodies is as described above. Ehrlich and Moyle's ``Science'' paper.
およびエールリッヒらの゛′免疫ジャーナル″論文に記述されている協同作用的 な免疫測定法で測定することができるにのタイプの測定法を用いて共同的効果が 認められるならば、この結果は、２つのことなるモノクローナル抗体が同時に、 同一の小分子に結合することができることの例証としてみなすことができる。従 って、これらの特定の抗体および同じ測定手順を採取試料の検定に用いることが 可能である。特異的抗原に関して共同的効果を示す抗体は、その抗原ときわめて 安定な複合体を形成する事が多い。and the synergistic action described in the ``Immunology Journal'' article by Ehrlich et al. The synergistic effect can be determined using a type of assay that can be measured with a standard immunoassay. If accepted, this result would indicate that two different monoclonal antibodies simultaneously It can be seen as an illustration that it is possible to bind to the same small molecule. subordinate Therefore, these specific antibodies and the same measurement procedure can be used to assay collected samples. It is possible. Antibodies that exhibit a synergistic effect with respect to a specific antigen are Often forms stable complexes.
実施例 実施例１ サンドイッチ免疫検定に使用する小ステロイドに対する２つのモノクローナル抗 体は、ズインメーリングとその共同切究者の方法を用いて、−匹のマウス、また はその他の適切な動物の免疫によって作ることができる（Ｐ、Ｅ、ズインメーリ ングら、生化学・第６巻（１９６７年）１５４〜１６４頁〕、抗血清をこのよう にして作ると、モノクローナル抗体を、上述のＨ，ジータとり。Example Example 1 Two monoclonal anti-steroids for use in sandwich immunoassays Using the method of Zuinmehring and co-workers, the body was can be produced by immunization of other suitable animals (P, E, Zuinmeli Ng et al., Biochemistry, Vol. 6 (1967), pp. 154-164], the antiserum was prepared in this way. When prepared, monoclonal antibodies are prepared using the above-mentioned H.
ブルックスが述べた方法に従って産出する事ができる。It can be produced according to the method described by Brooks.
モノクローナル抗体を分離後、これらの抗体は、実施例３または実施例４に述べ る検定法で同時結合するのに検定される。After isolation of the monoclonal antibodies, these antibodies can be used as described in Example 3 or Example 4. Simultaneous binding is tested using the same assay method.
実施例２ 実施例１の方法で２つの異なる抗体を産出する事は。Example 2 The method of Example 1 produces two different antibodies.
必ずしも可能ではない、多くの場合、２つの異なるハプテン接合体を免疫原とし て使用しなければならない。In many cases, it is not always possible to use two different hapten conjugates as immunogens. must be used.
これは、小ハプテンのカップリング法が、同時に結合する事のできる２つの異な る抗体産出を許さないからである。−動物を２つの接合体で免疫する事は、２つ のタイプの抗体を産出する結果になる。しかし、抗血清の場合、抗体の２つの群 を分解できない場合がある。This is due to the fact that the small hapten coupling method has two different methods that can be combined at the same time. This is because it does not allow the production of antibodies. -Immunizing an animal with two zygotes can be done in two ways. This results in the production of antibodies of the type. However, in the case of antiserum, two groups of antibodies may not be able to be disassembled.
（または、少なくとも、かなりの努力が、分離に必要となる）、従って、２つの 異なる動物の使用が、２つの抗体群を分離しておく前便な方法であろう、モノク ローナル・ハイブリドーマ抗体に関しては、２つの接合体を一動物中に注入する 事ができる。これは、タイプの異なる抗体の分離は、細胞系統のクローニングに よってできるからである。(or at least considerable effort is required to separate them), so the two The use of different animals may be a convenient way to keep the two antibody groups separate; For local hybridoma antibodies, two conjugates are injected into one animal. I can do things. This is useful for isolation of different types of antibodies and cloning of cell lines. Therefore, it is possible.
一つのハプテンの２つの接合体の実施例として、アルドステロンが挙げられる。An example of two conjugates of one hapten is aldosterone.
アルドステロン−１８，２１−ジヘミサクシニルーウシ血清アルブミンは、エル ランガーラの方法によって調整する事ができる〔生化学ジャーナル、第２２８巻 （１９５７年）、７１３〜７２７頁〕、免疫プロトコールは、同論文に記述され ている。３−オキシム アルドステロン接合体産出は、Ｊ、Ｔ、マツケンジーと 、Ｊ、Ａ、クレメンツによってえ報告されている〔臨床内分泌・代謝ジャーナル 、第３８巻（１９７４年）、６２２頁〕、免疫原としての、この接合体の使用法 は、Ｔ。Aldosterone-18,21-dihemisuccinyl-bovine serum albumin It can be adjusted by Langara's method [Biochemistry Journal, Vol. 228] (1957), pp. 713-727], and the immunization protocol was described in that paper. ing. 3-Oxime aldosterone conjugate production is J, T, Kenji Matsu and , J. A. Clements [Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism] , Vol. 38 (1974), p. 622], use of this conjugate as an immunogen. Ha, T.
荻原らが報告している〔臨床内分泌・代謝ジャーナル。Ogihara et al. [Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism].
第４５巻（１９７７年）、７２６頁〕。炭素３、および炭素１８．２１における 反応によるアルドステロンの接合化は、アルドステロン分子の反対の端のキャリ ヤー分子についた２つの接合体を産出する。従って、こ九らの接合体によって産 出された抗体は、アルドステロンに同時に結合する事ができる。２つの抗面清、 １つの抗血清と１つのモノクローナル抗体、または２つのモノクローナル抗体等 、これらの接合体を用いて生成されたものは、両者のアルドステロンに対する結 合能を実施例３または実施例４に概説される手法を用いてテストすることができ る。Volume 45 (1977), page 726]. in carbon 3, and carbon 18.21 Conjugation of aldosterone by reaction involves the conjugation of carriers at opposite ends of the aldosterone molecule. yields two conjugates attached to the Yar molecule. Therefore, produced by the zygote of these The antibodies released can simultaneously bind to aldosterone. two anti-separations, One antiserum and one monoclonal antibody, or two monoclonal antibodies, etc. , those produced using these zygotes showed binding to aldosterone of both. Compatibility can be tested using the techniques outlined in Example 3 or Example 4. Ru.
実施例３ １つの同相抗体と１つの放射標識液相抗体を用いた免疫放射分析測定は、以下の ように実施することができる。小ハプテンＸ（実施例１および実施例２における ように）に対して産出したモノクローナル抗体ＡおよびＢを、上記に引用した、 Ｈ，ジータおよび、Ｄ、ブルックスの方法等の周知の手法により腹水液から精製 する。抗体ＡおよびＢの小ハプテンＸへの同時結合性を検定するために、リン酸 カリウム０．０１モル、塩化ナトリウム０．１５モル、アジ化ナトリウム０．０ ２％、ＰＨ７，５の混合液中にある０、１ｍｇ／ｍＱの抗体Ａ５０マイクロリッ トルを、塩化ビニール樹脂製マイクロタイター抜穴に４℃で一晩、培養する。抗 体Ｂは、前述のり、Ｍ。Example 3 Immunoradiometric measurements using one in-phase antibody and one radiolabeled liquid-phase antibody are as follows: It can be implemented as follows. Small hapten X (in Example 1 and Example 2) monoclonal antibodies A and B produced against Purified from ascites fluid by well-known methods such as those of H. Gita and D. Brooks. do. To assay the simultaneous binding of antibodies A and B to small hapten Potassium 0.01 mol, sodium chloride 0.15 mol, sodium azide 0.0 Antibody A50 microliquid at 0.1 mg/mQ in a mixture of 2% and pH 7.5. The cells were cultured overnight at 4°C in a microtiter hole made of vinyl chloride resin. anti Body B is the glue described above.
クリマンとＪ、Ｃ，ハロードの方法によって、ヨウ素１２５で放射標識する。抗 体Ａの溶液を、マイクロタイター板から取り出し、プレートの穴を蒸留水で３回 すすぎ、紙タオル上にプレー１−をたたきつけるようにして、六を乾燥させる。Radiolabel with iodine-125 by the method of Kliman and J.C. Harrod. anti Remove the solution of body A from the microtiter plate and soak the holes in the plate three times with distilled water. Rinse and pat dry Play 1-6 on a paper towel.
既知量の小ハプテンＸを含む試料は、放射標識された抗体Ｂと混合され、放射標 識抗体Ｂを約２０，０００〜５０，０ＯＯｃｐｏ＋含む混合物５０マイクロリツ トルをマイクロタイター板の各穴に加える。ｚｏ”ｃで約１７〜２４時間、室温 培養後、放射性溶液を吸上げ、穴を前と同じように洗う、各穴を、はさみでプレ ートから切り離し、ガンマ・カウンターで計算する。バックグラウンド・カウン ト以上の穴に付着した放射能（パックグラウンド・カウントは抗体Ｂがマイクロ タイターの穴に入れられる前に抗体Ｂと小ハプテンが混合しなか）たとしても、 結合した放射能量であろう）は。A sample containing a known amount of small hapten X is mixed with radiolabeled antibody B and radiolabeled. 50 microliters of a mixture containing approximately 20,000 to 50,0000 cpo+ of antibody B. Add tor to each hole of the microtiter plate. About 17 to 24 hours at room temperature in zo”c After incubation, suck up the radioactive solution, wash the holes as before, and clean each hole with scissors. Separate it from the root and calculate it with a gamma counter. background counter Radioactivity attached to more than one hole (packground count is a Even if antibody B and small hapten do not mix before being placed in the titer hole, amount of bound radioactivity).
抗体ＡおよびＢの小ハプテンＸへの同時結合能に依存する。各種濃度の小ハプテ ンＸを用いるのが最良の方法であろう。これは、ハプテンの量が過剰であると。It depends on the ability of antibodies A and B to simultaneously bind to small hapten X. Small haptes of various concentrations The best method would be to use the This means that the amount of hapten is excessive.
プラスティックに結合するバックグラウンド放射を生じさせるからである。濃度 のいずれかが、バックグラウンド放射能より高ければ、抗体ＡおよびＢは、ハプ テンＸに同時に結合する事ができる。This is because it creates background radiation that binds to the plastic. concentration is higher than background radioactivity, then antibodies A and B are haptic. Can be combined with Ten-X at the same time.
試料中の未知濃度の小ハプテンＸの存在は同様にして判定される。この試料を、 抗体Ａを固体支持体に吸着させながら、放射標識した抗体Ｂを混合する１次いで 、上記に挙げた一連の段階を実行する。穴に付着した放射能量は、試料中の小ハ プテン量に比例し、その濃度は、固体支持体に結合した放射能量を、既知濃度の 小ハプテン量とこのシステムで検定した時の結合した量とを比較して決定する。The presence of unknown concentrations of small hapten X in the sample is determined in a similar manner. This sample A first step in which radiolabeled antibody B is mixed while antibody A is adsorbed onto a solid support. , performs the sequence of steps listed above. The amount of radioactivity attached to the hole is due to the small halide in the sample. The amount of radioactivity bound to the solid support is proportional to the amount of protein, and its concentration is It is determined by comparing the amount of small hapten and the amount bound when assayed using this system.
実施例４ ２つの液相抗体を用いる協同作用的な免疫測定法は、最初に、放射標識した小ハ プテンＸ５０マイクロリツトルを用意し、測定する未標識の小ハプテン量含む試 料５０マイクロリツトル（両者とも、１％のウマの血清、９９％、 ０．０１モ ルのリン酸カリウム、 ０．１５モルの塩化す７．５） １００マイクロリツト ルと混合する０次に、同時に結合する事のできる２つの抗体の混合液１００マイ クロリツトルを加える（抗体混合液は、１％ウマの血清、９９％のリン酸緩衝波 塩水に希釈する）、混合液中の２つの抗体の同時結合能は、既知量の小ハプテン Ｘに対する、混合物の放射免疫測定における親和性が、抗体それぞれのまたは、 交互に、サンドインチ検定法におけるこれら抗体の使用能力によるものより高い 事を示すことによって確立される。これは、エルリッヒらの免疫ジャーナル論文 に述べられた手法にもとづいたものである。抗体混合物は、次のように構成され る。こない条件下で、放射標識した小ハプテンＸの５０％を結合させる事が前も って判定された各抗体量（各個別抗体は、抗体混合液と置き換えられている）を １：１の比で混合する。未標識ハプテンＸが存在しない条件下でここに述べる方 法によって放射１１ｍ小ハ小ハプテン量０〜５０％を結合させる事が前もって判 定されたこの混抗体、緩衝液および放射標識した、小ハプテン、未標識の小ハプ テンを、３７℃で１時間、次に５℃で１８時間、定温培養する。リン酸緩衝塩水 中の、正常マウスの５０％血清を各検定管に添加する。適当量のウサギの抗マウ スＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）抗血清を次に加える。（適当量は、未標識小ハプ テンを用いた上述の検定法を行い、ウサギの抗マウスＩｇＧ抗血清の量を変えて 決定する。最高の放射能量を沈降させた抗血清養し、次に、室温で１時間培養す る。沈降物は遠心分離により沈降させ、上澄みテ液を吸い上げ、沈降物中の放射 能をカウントする。試料中の小ハプテン量と比例する。すなわち、カウントが低 ければ、試料中の小ハプテンＸは高濃度である。Example 4 A cooperative immunoassay using two liquid-phase antibodies was first developed using a small radiolabeled antibody. Prepare 50 microliters of hapten X and prepare a sample containing the amount of unlabeled small hapten to be measured 50 microliters of serum (both 1% horse serum, 99%, 0.01 molar) of potassium phosphate, 0.15 moles of sodium chloride 7.5) 100 microliters Next, mix 100 ml of a mixture of two antibodies that can bind simultaneously. Add Chloritol (antibody mixture is 1% horse serum, 99% phosphate buffered) (diluted in saline), the simultaneous binding capacity of the two antibodies in the mixture is determined by The affinity of the mixture for X in the radioimmunoassay of each antibody or Alternately, due to the ability of these antibodies to be used in the sandwich assay, It is established by showing things. This is an Immunology journal paper by Erlich et al. It is based on the method described in . The antibody mixture is composed of: Ru. Previously, it was possible to bind 50% of radiolabeled small hapten X under these conditions. The amount of each antibody (each individual antibody is replaced by the antibody mixture) determined by Mix in a 1:1 ratio. The method described here under conditions where unlabeled hapten X is not present. It was determined in advance that 0 to 50% of the small hapten amount of the small hapten in the 11 m radiation would be combined by the method. This mixed antibody, buffer and radiolabeled small hapten, unlabeled small hapten The martens are incubated at 37°C for 1 hour and then at 5°C for 18 hours. phosphate buffered saline Add 50% normal mouse serum to each tube. appropriate amount of rabbit anti-mouse IgG (immunoglobulin G) antiserum is then added. (The appropriate amount is unlabeled small haptic The assay method described above was carried out using Ten, and the amount of rabbit anti-mouse IgG antiserum was varied. decide. The antiserum that precipitated the highest amount of radioactivity was incubated and then incubated for 1 hour at room temperature. Ru. The sediment is sedimented by centrifugation, the supernatant liquid is sucked up, and the radiation in the sediment is removed. Count Noh. It is proportional to the amount of small hapten in the sample. i.e. count is low If so, the concentration of small hapten X in the sample is high.
ここに解説し、そして主張する発明は、上述の実施例、又は１本適用例に記した 特定の小分子、小免疫原および小ハプテンに限定されない、これらの実施例と、 その選択は１本発明の態様を解説する目的で挙げたも□のにすぎないからである 。゛実際、ここに示し記述したものに加えて１種々の変法が前述の解説から当業 者によ）て明らかにされるであろう、そのような改良法はまた、添付の特許請求 の範■にもとづいてのみ限定される意図を持つ発明の範囲内に入る事が企図され る。The invention described and claimed herein is as described in the embodiments or one application example described above. These examples are not limited to specific small molecules, small immunogens and small haptens, and This is because the selection is only □, even though it is listed for the purpose of explaining the aspect of the present invention. . ``Indeed, there are several variations in addition to those shown and described herein that are known to those skilled in the art from the foregoing discussion.'' Such improvements, which may be revealed by is intended to fall within the scope of the invention which is intended to be limited only on the basis of Ru.
手続補正書（放） 昭和６３年 ２月 ９日 特許庁長官 小 川 邦 夫 殿 ２、発明の名称 小型分子の免疫測定法３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 エクス インコーホレーテッド４、代理人 住 所 （〒１００）東京都千代田区丸の内−丁目５番１号５、補正命令の日付 昭和６２年 １月２７日６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項 の規定による書面の特許出願人の欄及び外国語特許出願の適正な翻訳文並びに委 任状。Procedural amendment (release) February 9, 1988 Mr. Kunio Kogawa, Commissioner of the Patent Office 2. Title of the invention Small molecule immunoassay method 3. Person making the correction Relationship to the incident: Patent applicant Name: Ex Incorporated 4, Agent Address (100) Marunouchi-5-1-5, Chiyoda-ku, Tokyo, Date of amendment order January 27, 1986 6, Subject of amendment (1) Patent Law Article 184-5, Paragraph 1 The column of the patent applicant in the document pursuant to the provisions of the Letter of appointment.
７、補正の内容 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出 願人の欄の代表音名を補充し、外国語特許出願の明細書及び請求の範囲の翻訳文 のタイプ印書による浄書及び委任状（原国際調査報告 １ｍａｍｊｌｌａ＋ｖｌ Ａ１１ｌｌｌｅｌｌｌｏｎ Ｎ。Ｐ（ニーｌＵＳ８４ １０１１３１7. Contents of amendment (1) Document patent issuance pursuant to the provisions of Article 184-5, Paragraph 1 of the Patent Law Supplement the representative pitch name in the applicant column, and provide a translation of the foreign language patent application specification and claims. Typewritten engraving and power of attorney (original international search report) 1mamjlla+vl A11llellon N. P (nee lUS84 101131
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- 1984-10-29 EP EP19840904238 patent/EP0198826A4/en not_active Withdrawn
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| EP0198826A1 (en) | 1986-10-29 |
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