JPH02504073A

JPH02504073A - ヒトまた動物体液を検査するための方法およびそのための試薬

Info

Publication number: JPH02504073A
Application number: JP1501860A
Authority: JP
Inventors: ハスフェルト，ヴォルフガング; スモレン，ヨゼフ; スタイナー，ギュンター
Original assignee: ヨゼフ　スモレン
Priority date: 1988-02-18
Filing date: 1989-02-15
Publication date: 1990-11-22
Also published as: DK518189A; DK518189D0; DE58906204D1; AU3039589A; WO1989007764A1; EP0363449B1; FI894852A0; EP0363449A1; ATA38988A; ATE97497T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトまた動物体液を検査するための方法およびそのための試薬本発明は、リウマチ性および炎症性障害、とくに慢性関節リウマチに特異的な抗体の存在について、ヒトまたは動物体液とくに血清を検査するための方法、ならびにこの検査に使用するための、細胞抽出液から得られる試薬の製造方法に関する。

人口の約半分は、生涯の様々な時期に、リウマチ性疾患に罹患している。その約１０％は炎症性になり、大部分は慢性である。これらの疾患は、関節の炎症、疼痛および運動障害を招くのみでなく、たとえば慢性関節リウマチ（ＲＡ＞の場合のように、固定に至るまでの手足の欠陥を生じ、生命に必須の臓器が冒された場合には早期の死を招くこともある。

多くの炎症性障害で類似の臨床症状が現れるので、単に医学的診察、装置を用いる方法たとえばＸ線検査、および慣用される臨床検査のみでは、確実な診断を下すことができない場合が多い。しかしながらさらに血清学的解析を加えると、これらの疾患のより明瞭な識別が可能になる。

この理由から、血清学的検査はリウマチ学的診断に広く使用されてきた。すなわち、血清について抗体の存在が検耐される。これらの疾患では、免疫系が自己抗原に対する抗体を産生する。これらの抗体は、この理由から、自己抗体とも呼ばれる。

２群の自己抗体が主として、診断に重要であることが示されてきた。ｔなわち、リウマトイド因子（ＲＦ）および抗核抗体（ＡＮＡ）である。リウマトイド因子は類似の免疫グロブリンに対する自己抗体であり、抗−免疫グロブリン抗体ともいわれ、一方、抗核抗体は細胞核のＩＩ造に対する自己抗体である。

リウマトイド因子も、また抗核抗体も、残念ながら、特定の障害に特異的なものではない。すなわち、リウマトイド因子は、全ＲＡ１！者の７０〜８０％に現れるが、またウィルス性、寄生虫性および慢性ｉ菌疾患、慢性肝および肺疾患、多くの癌様疾患、ならびに他のリウマチ性炎症性障害、たとえば５ＬＥ（患者の約３０％）、強皮症（約２５％）、シエーグレン症候群（７０％まで）にも見出される。さらに、ｔ＆集団の１０％までにも加齢によってこれらの抗体が生じる。

しかも、リウマトイド因子は、ＲＡ患者の約２０〜３０％には認められない。したがって、この血清陰性ＲＡ患者群は、リウマトイド因子が存在するリウマチ性疾患に対してのみでなく、特質としてリウマトイド因子を伴わないリウマチ性疾患、たとえば転置性関節炎、反応性関節炎、ライター病、または時には変性性関節疾患、関節症に対しても臨床的に鑑別しなければならない。

抗核抗体も、ＲＡを含めたすべてのリウマチ性自己免役疾患、ならびに非すウマチ性＆患患者そして時には健康個体にも検出できる。

これらの抗核抗体が向けられる抗原構造をさらに正確に特性づける試みによって、疾患の特異的診断への割りっけの改善が可能になってきた。これらの抗核抗体サブタイプの多くは、今日では、疾患特異的なものとさえ考えられている。

エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）に感染した細胞からの核抗原に対する抗核抗体を検出する方法が、これまで、ＲＡのｉＩ認の補助とされてきた。この抗核抗体サブタイプはＲＡｌ、ｍ高頻度に認められる。しかしながｇ染症息者にも検出され、したがってＲＡ特異的ではない。

本発明の目的は、診断の可能性を改善することにあり、慢性ｔｇｉｅリウマチに典型的な抗体の存在をヒトまたは動物血清について検査する方法の開発の問題に関する。

この問題は、本発明により、検査すべき体液のサンプルを、その体液中に存在する可能性がある抗体と結合反応を起こす分子量１５〜４０ｋＤの範囲の単一または複数個の特異的抗原分画を含有する、ｌＩｌ胞抽出液からの試薬と接触させることによって解決される。

これらの分子量は、ＡＩＩｅｒＳｈａ１社型録番号ＣＦＡ６２６の１４ｃｍメチル化タンパク質分子量標準１４．３−２０ＯｋＤを用い、変性および還元条件、抽出液のＲＮ　Ａ　ｓｅ処理下にＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって求める。

とくに、ＲＡ患者の抗体と反応できる特異的抗原は、２０．２５．３１，３３および３６ｋＤの分子量を有することが明らかにされた。３３ｋＤの分子量を有する抗原（ＲＡ３３）は最も高頻度に存在する抗原である。

さらに他の以下の性質がこれらの抗原に特徴的である。

−還元および非還元条件での移動速度は等しい。

−ｐＨ１〜９のＩ）Ｈ範囲で３０分インキュベーションして安定である。

一５６℃で３０分および９６℃で５分の条件で抗原性は保持される。

ｍ−７０℃から凍結−解凍を反復しても（少なくとも３回解凍）抗原性は保持される。

ＲＡ３３に対して特異的な抗核抗体は、以下の第１表から明らかなように、実際ＲＡＭ！ｉの血清中にのみ見出され、他の自己免疫疾患の患者には認められない。

第１表慢性関節リウマチ　　　　　　　１１６　　　　　　３７　　　　　　−囮対照　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　〇　　　　　　−他のリウマチ性疾患　　　　　　　８７　　　　　　　〇　　　　　　−乾り性関節炎　　　　　　　　　　１２　　　　　０　　　　　−ベクテレフ病　　　　　　　　　　１４　　　　　　０　　　　　−関節症　　　　　　　　　　　　　１２　　　　　　〇　　　　　　−３ＬＥ　　　　　　　　　　　　　　３０　　　　　　０　　　２２Ｒｏ／ＳＳＡ、６Ｌａ／ＳＳＢ。

６Ｓａ、　ｔＰｃＮＡ、　１ｓｎＲＮＰ。

ｒＲＨＰシエーグレン症候群　　　　　　　３　　　　　　０　　　３Ｒｏ／ＳＳＡ、３ＬＡ／ＳＳＢ混合型結合繊病（ＭＣＴＤ）　　　　　５　　　　　　０　　　５ＳｎＲＮＰ強皮症　　　　　　　　　　　　　　１１　　　　　　　０　　　２Ｓｃ１７０試験したＲＡ血清１１６中３７例（−３２％）において、ＲＡ３３に対する抗体がイムノプロット法によって検出できた。明らかなように、すべての他の自己免疫疾患の場合の試験結果は陰性であった。表に掲げた疾患のほかに、フレスト症候群、多発性筋炎、ウェブネル病、ホイップル病、ＥＢＶ感染症患者からの血清についても調べた。この場合も、ＲＡ３３に対する抗核抗体は検出できなかった。

ＢＡ３３は、異なる免疫学的方法たとえばイムノプロット、ＥＬＩＳＡＪ５よびオフテルロ二−二重拡散洗を用い、特異的基渠面清によって示１ことができるように、他の既知自己抗原と同一ではない。

第２表には、ＲＡ３３との交差反応性について検討し、ＲＡ３３との同一性を否定できた自己抗原を掲げる。

第２表自己抗原　　　　　　　ＭＷ（ｋＤ）　　　　　　　疾患との関連Ｒｏ　（ＳＳＡ）　　　　　　　５７　　　　　　　　　３ＬＥ、原発性シエグレンＬａ　（ＳＳＢ）　　　　　　　５０．４３　　　　　　　　ＳＬＥ、’Ｒ発性シＩ’ｊＬｉンＳｍ　　　　　　　　　　　　２５，２６　　　　　　　　ＳＬＥ。

５ｎＲＮＰ　（ＵＩＲＮＰ）　　６８，３ａ、３２　　　　　　ＳＬＥ、ＭＣＴＤヒス１−ン　　　　　　　　１１〜２４．３１　　　　　３ＬＥ、薬剤性ＬＥｒＲＮＰ　　　　　　　　　　１６／１７，３８　　　　　　ＳＬＥ、薬剤性ＬＥＰＣＮＡ　　　　　　　　　　３６　　　　　　　　　５ＬＥＳＣＬ７０　　　　　　　　７０　　　　　　　　　強皮症核ｆａｍｉｎｅ　　　　　　　６０．７０　　　　　　　　強皮症Ｊ　Ｏ−１５０多発性関節炎動原体　　　　　　　　　　１４．２０．２３．２４　　　　フレスト症候群１ −ａｕｘ　　　　　　　　　　＆３　　　　　　　　　硬化性皮膚炎関節炎ＫＵ　　　　　　　　　　　　７０．８０　　　　　　　　硬化性皮膚炎関節炎Ｒａｎａ　　　　　　　　　　８０　　　　　　　　　　ＥＢＶ感染症、ＲＡ本発明はまた、上述の検討のための試薬として適当な細胞抽出液の製造方法を包含する。この方法は、−ヒトまた動物起源の細胞を、細胞核を露出させるためにホモジナイズし、一分畷された細胞核を低張性の！ｌ！ｉ溶液で処理して、細胞核を膨潤させ、一ついでこの懸濁液を轟張性の緩衝溶液で処理して易溶性のｉｌＢ胞核成核成分液中に溶解させ、−個体物質を遠心分離によって分−し、ついで、−上清溶液を試薬として製剤化することからなる。

この方法の有利な変法としては、分離された細胞核を集め、これらを主として凍結によって保存可能な形とし、ｍ成核分画の中間的保存後にのみ抽出を行う方法がある。

試薬としての製剤化にもまた、反応性抗原をたとえばクロマトグラフィー分離操作によって単離し、ついで保存可能な形とする分画化を包含する。

したがって、本発明はまた、じトまたは動物の体液たとえば血清について、リウマチ性または炎症性疾患とくに慢性関節リウマチに特異的な抗体の存在を検討するための試薬であって、その体液中に存在する可能性がある抗体と結合反応を起こし、１５〜４０ｋＤの範囲の分子量を有する単一のまたは複数個の特異的抗原分画を含有する試薬を包含する。

この反応性抗原はついで、マトリックス上に固定化し、体液と接触させることができる。抗体は、以下の操作によって検出することができる。

１３　　ＥＬＩＳＡ：抗原は、合成表面、有利にはマイクロタイター板に、非共有結合的に結合される。これはホウｍｉ緩衝液（４℃でＤＨ８，２，１００＠ｍｏｌ／　１ボウ酸、２５ｍｍｏｌ／１四ホウ酸ナトリウム塩、７５ｓｉｏｌ／ｊＮａｃｊり中で数時間インキュベートすることにより行う。

遊離結合部位を、３％低脂肪乾燥乳含有ホウＩ！塩！ｌ衝液または１％ＢＳＡ含有ホウ酸塩！１衝液とともにインキュベートして飽和する。数回の洗浄工程後、ホウ！！塩緩Ｗｉ液中に溶解した血清とともにインキュベーションを行う（２時間、３７℃）。ＲＡ３３に対する抗体は、ヒト１ａＧの１０部分に対する抗体で、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼとカップリングさせた抗体によって検出される。この酵素の基賀としてはｐ−ニトロフェニルホスフェートまたは０−アニシジンが使用される。生成した色の強度は、抗体の結合に正比例する。

２）　ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡＬ：煩似の操作で抗原をポリスチレンヒーズに結合させる。

検出は、ウェスタンプロットと同様にＩＱＧの１０部分に対するウサギ−抗−ヒト−抗体とインキユーベーションし、ついで１２５１−標識抗−ウサギー抗体とインキュベーションすることによって行う。ビニズを数回洗浄し、結合した放射能の量を測定する。測定された放射能は、抗体の存在の直接の指標となる。

３）ストリップ試験：抗原を担体（たとえばニトロセルロース、ナイロンＷ）上に固定し、ついで血清と接触させる。ついでＲＡ３３に対する抗体の検出はウェスターンプロットの操作の場合と同様に、放射化学的に、またはＥＬＩＳＡ法の場合に記載した操作と同様に測光法的に行われる。

４〕　凝集試ｗＡ：この操作では、抗原は粒子たとえばラテックスに吸着させる。希釈患者血＠１８１１をスライド上、１滴のラテックス懸濁液と接触させる。これを細い棒でよく混合し、２〜５分後、凝集を調べ、対照血清と比較する。抗体力価は陽性血清の適当な希釈により半定量的に測定することができる。

同様に、赤血球を抗原で感作し、抗体によって凝集させることもできる。

５）二重免疫拡散：この方法では、抗原−抗体複合体の沈降を担体メジウム好ましくはアガロース中で検出する。この目的では、アガロース中に孔を打ち抜き、中央の孔には抗原を、放射線上の孔には血清を満たす。沈降線は抗体の存在を示す。単特異性対照血清と比較することによってそれらの同一性を調べることもできる。

本発明による血清の検定方法のとくに好ましい変法は、−ｉ胞抽出液中に含まれる成分を担体メジウム中のそれらの移動速度によって電気泳動的に分画し、含まれる単一または複数の抗原に相当する分子１１５〜４０ｋＤの分画を青、一電気泳動的に分離した分画を担体メジウムからニトロセルロース股に移送し、一遊頗結合部位を飽和したのち、膜を検定すべき体液と接触させ、体液中に存在する抗体と抗原の免疫反応が陽性の場合には、結合反応を、この抗体と反応するｍｓ試薬によって句視化する、ことからなる。

本発明の方法、すなわちＲＡ３３に対する抗体の検定は、リウマトイド因子の存在に比較して、さらに補助的な診断的価値を有する。第３表から明らかなように、血清中にリウマトイド因子が検出できないＲＡ患者の半数以上でＲＡ３３に対する抗体がきわめて明瞭に見出された。

！−≦Ｌ−１慢性関節リウマチ息者５０例中におけるリウマトイド因子（ＲＦ）およびＲＡ３３に対する抗体の存在（リウマトイド因子はワーラー・Ｏ−ズおよびラテックス試験で測定した）ＲＦ陰性　　ＲＦ陽性ＲＡ３３陽性　　　　　　　８　　　１２”ＲＡＮＡ”（慢性関節リウマチ核抗原）に対する抗体、分子１８０ｋＤのＥＢＶ−関達核抗原は、リウマトイド因子と同様の頻度でＲＡに見出されるが、同時に多数の他の患者ならびに比較的効率にａｍ人にも生じる。

第４表は、倹約したＲＡ患＠１６名中、約７０％がＲＡＮＡに対する抗体を有し、５０％がＲＡ３３に対する抗体をもつことを示している。ＲＡ３３−１性態者中２例では、ＲＡＮＡに対する抗体は検出されなかった。

第　　４　　表慢性関節リウマチ１６例中におけるＲＡ３３およびＲＡＮＡ　（慢性関節リウマチ核抗原、ＥＢＡ関連タンパク質に対する抗体の発生）ＲＡ３３陽性　　ＲＡ３３陰性ＲＡＮＡ陽性　　　　　６５核抽出物の製造の一方法は以下の例に記述する。

原料としては白血球または細胞系を使用できる。細胞系は、大部分均一なＩＢｆ１１集団を提供するという利点があるが、１−あたり１〜２万の密度に生育するまで、特定の条件下に数日間培養する必要がある。

この例では、細胞は遠心分離（１５分、３．ＯＯＯｇ）によッテ収穫し、等強性！！衝液［１Ｑ　ａｍｏｌ／　Ｉ　　Ｈｅｐｅｓ。

Ｄ）１７．９　　、１　４０ｎｏｌ／ｊ　　　　ＫＣ１１１，５−馳０１／　１ＭｏＣｚ２．０．５１１０１／Ｊ！ジチオスレイトール（ＤＴＴ）　、０．５ｕｉｏｌ／ｊフエニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）］中で１回況浄し、ついで同じＷＡ＊Ｈニ再ｍＦｆ４シｔ：　（１０”　１Ｂ１１／１２＊Ｉ衝１）　、　Ｗｊ胞をガラスホモジナイザー中注意深く、＄１胞核が細胞質からＭＩｌｌするまでホモジナイズした。これは細胞ホモジネートを鏡検に付してチェックした。一般にホモジナイズする時間を３０分で十分である。

ホモジネートを３．０ＯＯ９で３分間遠心分離し、細胞膜とミクロソームを含むｍ脂質上清を除去し、主として細胞核からなる遠心分離沈降物を再び２０，０００！９で３０分間遠心分離した。上溝を捨て、核を低張性１１！！ｉ液　（２０ＥＩＯＩ／　Ｊ≧　　　Ｈｅｐｅｓ、　　ｐＨ７、９、１、５１ｓｏｌ／　　ＩＭＯＣＩ２．０．４ｍｍｏｌ／矛エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、０．５ｍｍｏｌ／ｆ　　ＤＴＴ、２５％ｖ／ｖグリセロール）に懸濁した（核１０９個／ｄ緩衝液）。次に、氷上で緩やかに攪拌しながら３０分間インキュベートした。ついで同容量の高張性Ｍ’ｌｊＪ液（２０ｗ＋ｍｏｌ／　ＩＨｅｐｅｓ、　ｐＨ７，９，３ｉｍｏｌ／ｊ！　　ＭＱＣｊ２．０．４１！＋０１／７　　ＥＤＴＡ、　０．５ｉｍｏｌ／Ｊ！　　ＤＴＴ、８８０Ｉ１ｍｏｌ／Ｊ　　ＮＨ４Ｃ！、　２５％ｖ／ｖグリセロール）を加え、混合物を氷上で攪拌しながらさらに４５分間インキュベートし、ついで５０．０００９で２０分＠遠心分離した。上清は可溶性の核抽出液で、透析！ｉｔｉ液（２０ｔｍｏｌ／　Ｉ　　Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７、９，１００１Ｈｏｌ／Ｊ　　ＫＣｊ！、０．４１ｉｏｌ／Ｊ　　ＥＤＴＡ％０．５１ｉｏ１／ｊ　　ＤＴＴ。

１ｗ１ｏｌ／Ｊ　　ＰＭＳＦ、２０％■ハグリセロール）に対して透析し、少量ずつに分番プて一７０℃で保存し、以後の自己抗体の検出に使用した。

別の操作によれば、核は低張性１１Ｉｉ液に再懸濁したのち、−２０℃で凍結することもできる。所望の保存期間後、細胞核を上述したのと同様に、高張性！ｌｌ液液抽出する。付加的な抗原は、この改良操作によって、細胞核から抽出される。

核抽出物の成分の抗原性は、この例にお番プるように、イムノプロット法（ウェスタンプロット）によって明らかにすることができる。この目的には、抽出物を等強性！！副液でタンパク質８１度約１０■／ｄに希釈し、４倍のサンプルｌｌ（支）液（単純サンプル！１ＩＦｉ液：　１２５ｍｍｏｆ／ＪＴｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　ｐＨ８，３，２，３％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５％メルカプトエタノール、１０％グリセＯ−ル）で処理し、電気泳動に付した。１２％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル、ｐＨ８，３を５％積層ゲル、ｐ）１６．８および電気泳動Ｗ液液（２５ｔ＋ａｏｌ／　Ｊ７ｒｉｓ、１９２　ｗｌｏｌ／　１グリシン、０．１％ＳＤＳ、ｐｉ（８，３）とともに使用した。

タンパク質を、水で冷却して攪拌しながらアンペア数２０ｍＡで１４時間、その相対分子ｆｉ　（ＭＷ）によって９閣し、ついでニトロセルロース！Ｉ　（ＮＧ）上に移した（プロットした）。このトランスファーは、プロッティング・チャンバー内において、トランスファー緩衝液（２５ｍｍｏｌ／Ｊ　　Ｔｒｉｓ、１９Ｑｉａｍｏｌ／Ｊ！グリシン、２０％ｖ／ｖメタノール、ｐｌ＋］、３）の電場中一定電流２５０ｍＡで１５０分間行った。

次に、ニトロセルロースをストリップに切断し、非特異的結合部位は、３％低脂肪乾燥乳を含有するホウ！ｌｌ塩緩％１（１００ｉｉｏｌ／ｌホウ酸、２５１１０１／　１四ホウ酸すトリウム、７５ｉｍｏｌ／Ｊ　　ＮａＣＪ！、ｐＨ８，２）（ＢＭＩＩ衝液）液液り、室温で３０分間飽和させた。ついでＮＧを、検査すべきヒト内情とＶ温で３０分間、穏やかに［ｉしながらインキュベートし、血清は８Ｍｆ１衝液で１：１０に希釈した。抗原に結合しなかった内溝抗体はホウ酸緩１１ｉ液で３回洗浄して除去した。

次にＮＣを、ＩｇＧのＦｃ領域に対するウサギ−抗−ヒト抗体と（８Ｍ緩衝液で１：５００に希釈）室温で１時間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。

ホウ酸！ｌ罰液による洗浄工程後にＮＣストリップを１２５１−８！識ロバ−抗 −ウサギ−ＩＱ−抗体（比活性１８５〜７４０ｋＢＱ／μ９．８Ｍ緩衝液で１：５００に希釈）とインキュベートし、ＮＣストリップに結合したヒト自己抗体をオートラジオグラフィーによって可視化した。インキュベーションは、室温で１時間、穏やかに振盪しながら実施した。

ホウ酸Ｍ液液で３回洗浄したのち、ＮＣストリップを乾燥し、カードに張りつけ、Ｘ線カセット内でオートラジオグラフィーフィルムに暴露した。現像後、黒ずんだ部位（バンド）は、放射性抗体の結合部位、したがって核抽出物の抗原に対する抗体の存在を間接的に指示した。

分子量を確立するためには、一定の分子量をもつ１４Ｃ−！識タンパク質（ＭＷママ−−）をＮＧに抽出物とともにプロットして使用した。

結果は添付したオートラジオグラフ（第１図）に示ず。

これは１３個のＮＣストリップのオートラジオグラフィーバンドを示すもので、レーン１〜１３に相当し、それと分子量マーカーのレーン（Ｍ）である。レーン１は正常ヒト血清により対照として得られた。レーン２〜７．１０および１２はＲＡ３３に対する抗体を含有するＲＡ血清に由来したものである。黒ずんだ部位（バンド）は約３３ｋＤに認められる。レーン８．９．１１および１３はＲＡ３３に対する抗体は存在しなかったＲＡ血清から得られた。

前述した改変操作によれば、核分画は抗原物質の抽出に先立って凍結した。この場合は、オートラジオグラフィーに、３３ｋＤのバンドに加えてざらに２０．２５．３１および３６ｋＤのバンドが観察された。これを第２図に示す。

第２図においては、分子量マーカーのレーンはＭで示した。レーン１は正常ヒト血清により対照として得られた。レーン２はＲＡ３３に対する抗体に加えて２０．２５および３ｉｋＤの抗原に対する抗体も存在したＲＡＩｆｌｌ清に由来したものであり、レーン３は１５〜４０ｋＤの領域の抗原に対する抗体は検出できなかったＲＡ血清によるものであった。

この付加的なバンドは、抗１ｆｆｌＲＡ３３に関係するバンドと常に一緒に出瑣する。

抗−ＲＡ３３免疫グロブリンサブクラスの原理的に、免疫グロブリンサブクラスは、適当な第二の試薬を選択することによりイムノプロット操作を用いても検出できるはずであり、これを抗−ＲＡ３３について実施した。この目的では、患者の血清とのインキュベーションまでのイムノプロットのプロトコールを実施し、ついでニトロセルロースのストリップをＩＱＧ−Ｆｃ領域に対するウサギ抗体（アフィニティークロマトグラフィーでｔｉｌｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｃｏｃｈｒａｎｖｉ　＋　ｌｅ／　ＵＳＡ　）および、それぞれ、Ｉ　ｏＭ−μ 鎖に対づるウサギ抗体とインキュベートし、アフィニティークロマトグラフィー（Ｊａｃｋｓｏｎ　）によって精製した。

ついで洗浄したのち、ニトロセルロースストリップを、ウサギ免疫グロブリンに対する１２５１−標識抗体（ロバー抗−ウサギ−）Ｑ１アフイニテイークＯマドグラフィーにより精製）とともに室温で４０分間インキュベートした。以後の工程は前例において示したプロトコールと同一とした。この一連の検討結果は、抗 −ＲＡ３３がＩＱＧクラスのみでなく１０Ｍクラスにも属するものであることを示した。

滑液（関節液）中における　−ＲＡ３３の検出その後の検討段階で、抗〜ＲＡ３３は慢性関節リウマチ患者の血清のみに生じるのか、また滑液中にも生じるのかという疑問が起こった。この目的では、上記操作に相当するイムノプロットを、患者血清に代えて滑液を用いて実施した。検討した６例の滑液中３例に、抗−ＲＡ３３抗体を見出すことができた。

国際調査報告国際調査報告ＣＨε９０００２５ＳＡ　　２６７０３

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトまたは動物体液たとえば血清について、リウマチ性および炎症性疾患とくに慢性関節リウマチに特異的な抗体の存在を検査するにあたり、検査すべき液体サンプルを、その体液中に存在する可能性がある抗体と結合反応を起こす分子量約３３ｋＤを有する特異的抗原または特異的抗原分画の存在ならびに分子量１５〜４０ＫＤの範囲とくに分子量約２０°、２５、３１および３６ＫＤを有する付加的な特異的抗原または特異的抗原分画の、場合による存在を特徴とする核抽出物からの試薬と接触させる方法
２．請求項（１）に記載の検査用試薬として適当な核抽出物を製造するにあたり、 −ヒトまたは動物起源の細胞をホモジナイズして細胞核を露出させ、 −分離された細胞核を低張性の緩衝液で処理して細胞核を膨潤させ一ついでこの懸濁液を高張性の緩衝液で処理して易溶性の細胞核成分を溶液中に溶解させ、一個体物質を遠心分離によつて分離し、ついで−上清溶液を試薬として製剤化することを特徴とする方法
３．分離した細胞核を集め、とくに凍結によつて保存型とし、細胞核の中間的保存後にのみ抽出を行うことを特徴とする請求項（２）記載の方法。
４．一細胞抽出物中に含まれる成分を担体メジゥム中のそれらの移度速度によつて電気泳動的に分離し、含まれる単一または複数の抗原に相当する分子量１５〜４０ｋＤの分画を得、一電気泳動的に分離した分画を担体メジウムからニトロセルロース膜に移し、一遊離結合部位を飽和させたのち、膜を検定すべき体液と接触させ、体液中に存在する抗体と抗原の免疫反応が場性の場合には、結合反応をこの抗体と反応する標識試薬によつて可能にすることからなる請求項（１）記載の方法。
５．ヒトまたは動物体液たとえは血清にっいて、リウマチ性および炎症性疾患とくに慢性関節リウマチに特異的な抗体の存在を検査する試薬であつて、体液中に存在する可能性がある抗体と結合反応を起こす分子量約３３ｋＤを有する特異的抗原または特異的抗原分画を含有〜し、また分子量１５〜４０ｋＤの範囲とくに分子量杓２０、２５、３１および３６ＫＤを有する付加的な特異的抗原または特異的抗原分画を、場合により含有する試薬。