JPH02504073A - ヒトまた動物体液を検査するための方法およびそのための試薬 - Google Patents
ヒトまた動物体液を検査するための方法およびそのための試薬Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒトまた動物体液を検査するための方法およびそのための試薬
本発明は、リウマチ性および炎症性障害、とくに慢性関節リウマチに特異的な抗
体の存在について、ヒトまたは動物体液とくに血清を検査するための方法、なら
びにこの検査に使用するための、細胞抽出液から得られる試薬の製造方法に関す
る。
人口の約半分は、生涯の様々な時期に、リウマチ性疾患に罹患している。その約
10%は炎症性になり、大部分は慢性である。これらの疾患は、関節の炎症、疼
痛および運動障害を招くのみでなく、たとえば慢性関節リウマチ(RA>の場合
のように、固定に至るまでの手足の欠陥を生じ、生命に必須の臓器が冒された場
合には早期の死を招くこともある。
多くの炎症性障害で類似の臨床症状が現れるので、単に医学的診察、装置を用い
る方法たとえばX線検査、および慣用される臨床検査のみでは、確実な診断を下
すことができない場合が多い。しかしながらさらに血清学的解析を加えると、こ
れらの疾患のより明瞭な識別が可能になる。
この理由から、血清学的検査はリウマチ学的診断に広く使用されてきた。すなわ
ち、血清について抗体の存在が検耐される。これらの疾患では、免疫系が自己抗
原に対する抗体を産生する。これらの抗体は、この理由から、自己抗体とも呼ば
れる。
2群の自己抗体が主として、診断に重要であることが示されてきた。tなわち、
リウマトイド因子(RF)および抗核抗体(ANA)である。リウマトイド因子
は類似の免疫グロブリンに対する自己抗体であり、抗−免疫グロブリン抗体とも
いわれ、一方、抗核抗体は細胞核のII造に対する自己抗体である。
リウマトイド因子も、また抗核抗体も、残念ながら、特定の障害に特異的なもの
ではない。すなわち、リウマトイド因子は、全RA1!者の70〜80%に現れ
るが、またウィルス性、寄生虫性および慢性i菌疾患、慢性肝および肺疾患、多
くの癌様疾患、ならびに他のリウマチ性炎症性障害、たとえば5LE(患者の約
30%)、強皮症(約25%)、シエーグレン症候群(70%まで)にも見出さ
れる。さらに、t&集団の10%までにも加齢によってこれらの抗体が生じる。
しかも、リウマトイド因子は、RA患者の約20〜30%には認められない。し
たがって、この血清陰性RA患者群は、リウマトイド因子が存在するリウマチ性
疾患に対してのみでなく、特質としてリウマトイド因子を伴わないリウマチ性疾
患、たとえば転置性関節炎、反応性関節炎、ライター病、または時には変性性関
節疾患、関節症に対しても臨床的に鑑別しなければならない。
抗核抗体も、RAを含めたすべてのリウマチ性自己免役疾患、ならびに非すウマ
チ性&患患者そして時には健康個体にも検出できる。
これらの抗核抗体が向けられる抗原構造をさらに正確に特性づける試みによって
、疾患の特異的診断への割りっけの改善が可能になってきた。これらの抗核抗体
サブタイプの多くは、今日では、疾患特異的なものとさえ考えられている。
エプスタイン−バールウィルス(EBV)に感染した細胞からの核抗原に対する
抗核抗体を検出する方法が、これまで、RAのiI認の補助とされてきた。この
抗核抗体サブタイプはRAl、m高頻度に認められる。しかしながg染症息者に
も検出され、したがってRA特異的ではない。
本発明の目的は、診断の可能性を改善することにあり、慢性tgieリウマチに
典型的な抗体の存在をヒトまたは動物血清について検査する方法の開発の問題に
関する。
この問題は、本発明により、検査すべき体液のサンプルを、その体液中に存在す
る可能性がある抗体と結合反応を起こす分子量15〜40kDの範囲の単一また
は複数個の特異的抗原分画を含有する、lIl胞抽出液からの試薬と接触させる
ことによって解決される。
これらの分子量は、AIIerSha1社型録番号CFA626の14cmメチ
ル化タンパク質分子量標準14.3−20OkDを用い、変性および還元条件、
抽出液のRN A se処理下にSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て求める。
とくに、RA患者の抗体と反応できる特異的抗原は、20.25.31,33お
よび36kDの分子量を有することが明らかにされた。33kDの分子量を有す
る抗原(RA33)は最も高頻度に存在する抗原である。
さらに他の以下の性質がこれらの抗原に特徴的である。
−還元および非還元条件での移動速度は等しい。
−pH1〜9のI)H範囲で30分インキュベーションして安定である。
一56℃で30分および96℃で5分の条件で抗原性は保持される。
m−70℃から凍結−解凍を反復しても(少なくとも3回解凍)抗原性は保持さ
れる。
RA33に対して特異的な抗核抗体は、以下の第1表から明らかなように、実際
RAM!iの血清中にのみ見出され、他の自己免疫疾患の患者には認められない
。
第1表
慢性関節リウマチ 116 37 −囮対照
40 〇 −他のリウマチ性
疾患 87 〇 −乾り性関節炎
12 0 −ベクテレフ病
14 0 −関節症 12
〇 −3LE 30
0 22Ro/SSA、6La/SSB。
6Sa、 tPcNA、 1snRNP。
rRHP
シエーグレン症候群 3 0 3Ro/SSA、3
LA/SSB混合型結合繊病(MCTD) 5 0 5
SnRNP強皮症 11 0 2
Sc170試験したRA血清116中37例(−32%)において、RA33に
対する抗体がイムノプロット法によって検出できた。明らかなように、すべての
他の自己免疫疾患の場合の試験結果は陰性であった。表に掲げた疾患のほかに、
フレスト症候群、多発性筋炎、ウェブネル病、ホイップル病、EBV感染症患者
からの血清についても調べた。この場合も、RA33に対する抗核抗体は検出で
きなかった。
BA33は、異なる免疫学的方法たとえばイムノプロット、ELISAJ5よび
オフテルロ二−二重拡散洗を用い、特異的基渠面清によって示1ことができるよ
うに、他の既知自己抗原と同一ではない。
第2表には、RA33との交差反応性について検討し、RA33との同一性を否
定できた自己抗原を掲げる。
第2表
自己抗原 MW(kD) 疾患との関連Ro (SS
A) 57 3LE、原発性シエグレンLa (
SSB) 50.43 SLE、’R発性シI’j
LiンSm 25,26 SLE。
5nRNP (UIRNP) 68,3a、32 SLE、MCT
Dヒス1−ン 11〜24.31 3LE、薬剤性LE
rRNP 16/17,38 SLE、薬剤性L
EPCNA 36 5LESCL70
70 強皮症核famine 60
.70 強皮症J O−150多発性関節炎
動原体 14.20.23.24 フレスト症候群1
−aux &3 硬化性皮膚炎関節炎KU
70.80 硬化性皮膚炎関節炎Ra
na 80 EBV感染症、RA本発明
はまた、上述の検討のための試薬として適当な細胞抽出液の製造方法を包含する
。この方法は、−ヒトまた動物起源の細胞を、細胞核を露出させるためにホモジ
ナイズし、
一分畷された細胞核を低張性の!l!i溶液で処理して、細胞核を膨潤させ、
一ついでこの懸濁液を轟張性の緩衝溶液で処理して易溶性のilB胞核成核成分
液中に溶解させ、−個体物質を遠心分離によって分−し、ついで、−上清溶液を
試薬として製剤化する
ことからなる。
この方法の有利な変法としては、分離された細胞核を集め、これらを主として凍
結によって保存可能な形とし、m成核分画の中間的保存後にのみ抽出を行う方法
がある。
試薬としての製剤化にもまた、反応性抗原をたとえばクロマトグラフィー分離操
作によって単離し、ついで保存可能な形とする分画化を包含する。
したがって、本発明はまた、じトまたは動物の体液たとえば血清について、リウ
マチ性または炎症性疾患とくに慢性関節リウマチに特異的な抗体の存在を検討す
るための試薬であって、その体液中に存在する可能性がある抗体と結合反応を起
こし、15〜40kDの範囲の分子量を有する単一のまたは複数個の特異的抗原
分画を含有する試薬を包含する。
この反応性抗原はついで、マトリックス上に固定化し、体液と接触させることが
できる。抗体は、以下の操作によって検出することができる。
13 ELISA:
抗原は、合成表面、有利にはマイクロタイター板に、非共有結合的に結合される
。これはホウmi緩衝液(4℃でDH8,2,100@mol/ 1ボウ酸、2
5mmol/1四ホウ酸ナトリウム塩、75siol/jNacjり中で数時間
インキュベートすることにより行う。
遊離結合部位を、3%低脂肪乾燥乳含有ホウI!塩!l衝液または1%BSA含
有ホウ酸塩!1衝液とともにインキュベートして飽和する。数回の洗浄工程後、
ホウ!!塩緩Wi液中に溶解した血清とともにインキュベーションを行う(2時
間、37℃)。RA33に対する抗体は、ヒト1aGの10部分に対する抗体で
、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼとカップリングさせた抗体に
よって検出される。この酵素の基賀としてはp−ニトロフェニルホスフェートま
たは0−アニシジンが使用される。生成した色の強度は、抗体の結合に正比例す
る。
2) ラジオイムノアッセイ(RIAL:煩似の操作で抗原をポリスチレンヒー
ズに結合させる。
検出は、ウェスタンプロットと同様にIQGの10部分に対するウサギ−抗−ヒ
ト−抗体とインキユーベーションし、ついで1251−標識抗−ウサギー抗体と
インキュベーションすることによって行う。ビニズを数回洗浄し、結合した放射
能の量を測定する。測定された放射能は、抗体の存在の直接の指標となる。
3)ストリップ試験:
抗原を担体(たとえばニトロセルロース、ナイロンW)上に固定し、ついで血清
と接触させる。ついでRA33に対する抗体の検出はウェスターンプロットの操
作の場合と同様に、放射化学的に、またはELISA法の場合に記載した操作と
同様に測光法的に行われる。
4〕 凝集試wA:
この操作では、抗原は粒子たとえばラテックスに吸着させる。希釈患者血@18
11をスライド上、1滴のラテックス懸濁液と接触させる。これを細い棒でよく
混合し、2〜5分後、凝集を調べ、対照血清と比較する。抗体力価は陽性血清の
適当な希釈により半定量的に測定することができる。
同様に、赤血球を抗原で感作し、抗体によって凝集させることもできる。
5)二重免疫拡散:
この方法では、抗原−抗体複合体の沈降を担体メジウム好ましくはアガロース中
で検出する。この目的では、アガロース中に孔を打ち抜き、中央の孔には抗原を
、放射線上の孔には血清を満たす。沈降線は抗体の存在を示す。単特異性対照血
清と比較することによってそれらの同一性を調べることもできる。
本発明による血清の検定方法のとくに好ましい変法は、−i胞抽出液中に含まれ
る成分を担体メジウム中のそれらの移動速度によって電気泳動的に分画し、含ま
れる単一または複数の抗原に相当する分子115〜40kDの分画を青、
一電気泳動的に分離した分画を担体メジウムからニトロセルロース股に移送し、
一遊頗結合部位を飽和したのち、膜を検定すべき体液と接触させ、体液中に存在
する抗体と抗原の免疫反応が陽性の場合には、結合反応を、この抗体と反応する
ms試薬によって句視化する、
ことからなる。
本発明の方法、すなわちRA33に対する抗体の検定は、リウマトイド因子の存
在に比較して、さらに補助的な診断的価値を有する。第3表から明らかなように
、血清中にリウマトイド因子が検出できないRA患者の半数以上でRA33に対
する抗体がきわめて明瞭に見出された。
!−≦L−1
慢性関節リウマチ息者50例中におけるリウマトイド因子(RF)およびRA3
3に対する抗体の存在(リウマトイド因子はワーラー・O−ズおよびラテックス
試験で測定した)
RF陰性 RF陽性
RA33陽性 8 12”RANA”(慢性関節リウマチ核抗
原)に対する抗体、分子180kDのEBV−関達核抗原は、リウマトイド因子
と同様の頻度でRAに見出されるが、同時に多数の他の患者ならびに比較的効率
にam人にも生じる。
第4表は、倹約したRA患@16名中、約70%がRANAに対する抗体を有し
、50%がRA33に対する抗体をもつことを示している。RA33−1性態者
中2例では、RANAに対する抗体は検出されなかった。
第 4 表
慢性関節リウマチ16例中におけるRA33およびRANA (慢性関節リウマ
チ核抗原、EBA関連タンパク質に対する抗体の発生)
RA33陽性 RA33陰性
RANA陽性 65
核抽出物の製造の一方法は以下の例に記述する。
原料としては白血球または細胞系を使用できる。細胞系は、大部分均一なIBf
11集団を提供するという利点があるが、1−あたり1〜2万の密度に生育する
まで、特定の条件下に数日間培養する必要がある。
この例では、細胞は遠心分離(15分、3.OOOg)によッテ収穫し、等強性
!!衝液[1Q amol/ I Hepes。
D)17.9 、1 40nol/j KC111,5−馳01/ 1
MoCz2.0.51101/J!ジチオスレイトール(DTT) 、0.5u
iol/jフエニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)]中で1回況浄し
、ついで同じWA*Hニ再mFf4シt: (10” 1B11/12*I衝1
) 、 Wj胞をガラスホモジナイザー中注意深く、$1胞核が細胞質からMI
llするまでホモジナイズした。これは細胞ホモジネートを鏡検に付してチェッ
クした。一般にホモジナイズする時間を30分で十分である。
ホモジネートを3.0OO9で3分間遠心分離し、細胞膜とミクロソームを含む
m脂質上清を除去し、主として細胞核からなる遠心分離沈降物を再び20,00
0!9で30分間遠心分離した。上溝を捨て、核を低張性11!!i液 (20
EIOI/ J≧ Hepes、 pH7、9、1、51sol/ I
MOCI2.0.4mmol/矛エチレンジアミン四酢酸(EDTA) 、0.
5mmol/f DTT、25%v/vグリセロール)に懸濁した(核109
個/d緩衝液)。次に、氷上で緩やかに攪拌しながら30分間インキュベートし
た。ついで同容量の高張性M’ljJ液(20w+mol/ IHepes、
pH7,9,3imol/j! MQCj2.0.41!+01/7 ED
TA、 0.5imol/J! DTT、880I1mol/J NH4C
!、 25%v/vグリセロール)を加え、混合物を氷上で攪拌しながらさらに
45分間インキュベートし、ついで50.0009で20分@遠心分離した。上
清は可溶性の核抽出液で、透析!iti液(20tmol/ I Hepes
、pH7、9,1001Hol/J KCj!、0.41iol/J ED
TA%0.51io1/j DTT。
1w1ol/J PMSF、20%■ハグリセロール)に対して透析し、少量
ずつに分番プて一70℃で保存し、以後の自己抗体の検出に使用した。
別の操作によれば、核は低張性11Ii液に再懸濁したのち、−20℃で凍結す
ることもできる。所望の保存期間後、細胞核を上述したのと同様に、高張性!l
l液液抽出する。付加的な抗原は、この改良操作によって、細胞核から抽出され
る。
核抽出物の成分の抗原性は、この例にお番プるように、イムノプロット法(ウェ
スタンプロット)によって明らかにすることができる。この目的には、抽出物を
等強性!!副液でタンパク質81度約10■/dに希釈し、4倍のサンプルll
(支)液(単純サンプル!1IFi液: 125mmof/JTr i 5−H
CI pH8,3,2,3%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、5%メルカプ
トエタノール、10%グリセO−ル)で処理し、電気泳動に付した。12%5D
S−ポリアクリルアミドゲル、pH8,3を5%積層ゲル、p)16.8および
電気泳動W液液(25t+aol/ J7ris、192 wlol/ 1グリ
シン、0.1%SDS、pi(8,3)とともに使用した。
タンパク質を、水で冷却して攪拌しながらアンペア数20mAで14時間、その
相対分子fi (MW)によって9閣し、ついでニトロセルロース!I (NG
)上に移した(プロットした)。このトランスファーは、プロッティング・チャ
ンバー内において、トランスファー緩衝液(25mmol/J Tris、1
9Qiamol/J!グリシン、20%v/vメタノール、pl+]、3)の電
場中一定電流250mAで150分間行った。
次に、ニトロセルロースをストリップに切断し、非特異的結合部位は、3%低脂
肪乾燥乳を含有するホウ!ll塩緩%1(100iiol/lホウ酸、2511
01/ 1四ホウ酸すトリウム、75imol/J NaCJ!、pH8,2
)(BMII衝液)液液り、室温で30分間飽和させた。ついでNGを、検査す
べきヒト内情とV温で30分間、穏やかに[iしながらインキュベートし、血清
は8Mf1衝液で1:10に希釈した。抗原に結合しなかった内溝抗体はホウ酸
緩11i液で3回洗浄して除去した。
次にNCを、IgGのFc領域に対するウサギ−抗−ヒト抗体と(8M緩衝液で
1:500に希釈)室温で1時間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。
ホウ酸!l罰液による洗浄工程後にNCストリップを1251−8!識ロバ−抗
−ウサギ−IQ−抗体(比活性185〜740kBQ/μ9.8M緩衝液で1:
500に希釈)とインキュベートし、NCストリップに結合したヒト自己抗体を
オートラジオグラフィーによって可視化した。インキュベーションは、室温で1
時間、穏やかに振盪しながら実施した。
ホウ酸M液液で3回洗浄したのち、NCストリップを乾燥し、カードに張りつけ
、X線カセット内でオートラジオグラフィーフィルムに暴露した。現像後、黒ず
んだ部位(バンド)は、放射性抗体の結合部位、したがって核抽出物の抗原に対
する抗体の存在を間接的に指示した。
分子量を確立するためには、一定の分子量をもつ14C−!識タンパク質(MW
ママ−−)をNGに抽出物とともにプロットして使用した。
結果は添付したオートラジオグラフ(第1図)に示ず。
これは13個のNCストリップのオートラジオグラフィーバンドを示すもので、
レーン1〜13に相当し、それと分子量マーカーのレーン(M)である。レーン
1は正常ヒト血清により対照として得られた。レーン2〜7.10および12は
RA33に対する抗体を含有するRA血清に由来したものである。黒ずんだ部位
(バンド)は約33kDに認められる。レーン8.9.11および13はRA3
3に対する抗体は存在しなかったRA血清から得られた。
前述した改変操作によれば、核分画は抗原物質の抽出に先立って凍結した。この
場合は、オートラジオグラフィーに、33kDのバンドに加えてざらに20.2
5.31および36kDのバンドが観察された。これを第2図に示す。
第2図においては、分子量マーカーのレーンはMで示した。レーン1は正常ヒト
血清により対照として得られた。レーン2はRA33に対する抗体に加えて20
.25および3ikDの抗原に対する抗体も存在したRAIfll清に由来した
ものであり、レーン3は15〜40kDの領域の抗原に対する抗体は検出できな
かったRA血清によるものであった。
この付加的なバンドは、抗1fflRA33に関係するバンドと常に一緒に出瑣
する。
抗−RA33免疫グロブリンサブクラスの原理的に、免疫グロブリンサブクラス
は、適当な第二の試薬を選択することによりイムノプロット操作を用いても検出
できるはずであり、これを抗−RA33について実施した。この目的では、患者
の血清とのインキュベーションまでのイムノプロットのプロトコールを実施し、
ついでニトロセルロースのストリップをIQG−Fc領域に対するウサギ抗体(
アフィニティークロマトグラフィーでtill、Jackson Re5ear
ch Laboratories。
Cochranvi + le/ USA )および、それぞれ、I oM−μ
鎖に対づるウサギ抗体とインキュベートし、アフィニティークロマトグラフィー
(Jackson )によって精製した。
ついで洗浄したのち、ニトロセルロースストリップを、ウサギ免疫グロブリンに
対する1251−標識抗体(ロバー抗−ウサギ−)Q1アフイニテイークOマド
グラフィーにより精製)とともに室温で40分間インキュベートした。以後の工
程は前例において示したプロトコールと同一とした。この一連の検討結果は、抗
−RA33がIQGクラスのみでなく10Mクラスにも属するものであることを
示した。
滑液(関節液)中における −RA33の検出その後の検討段階で、抗〜RA3
3は慢性関節リウマチ患者の血清のみに生じるのか、また滑液中にも生じるのか
という疑問が起こった。この目的では、上記操作に相当するイムノプロットを、
患者血清に代えて滑液を用いて実施した。検討した6例の滑液中3例に、抗−R
A33抗体を見出すことができた。
国際調査報告
国際調査報告
CHε900025
SA 26703
Claims (5)
- 1.ヒトまたは動物体液たとえば血清について、リウマチ性および炎症性疾患と くに慢性関節リウマチに特異的な抗体の存在を検査するにあたり、検査すべき液 体サンプルを、その体液中に存在する可能性がある抗体と結合反応を起こす分子 量約33kDを有する特異的抗原または特異的抗原分画の存在ならびに分子量1 5〜40KDの範囲とくに分子量約20°、25、31および36KDを有する 付加的な特異的抗原または特異的抗原分画の、場合による存在を特徴とする核抽 出物からの試薬と接触させる方法
- 2.請求項(1)に記載の検査用試薬として適当な核抽出物を製造するにあたり 、 −ヒトまたは動物起源の細胞をホモジナイズして細胞核を露出させ、 −分離された細胞核を低張性の緩衝液で処理して細胞核を膨潤させ 一ついでこの懸濁液を高張性の緩衝液で処理して易溶性の細胞核成分を溶液中に 溶解させ、 一個体物質を遠心分離によつて分離し、ついで−上清溶液を試薬として製剤化す る ことを特徴とする方法
- 3.分離した細胞核を集め、とくに凍結によつて保存型とし、細胞核の中間的保 存後にのみ抽出を行うことを特徴とする請求項(2)記載の方法。
- 4.一細胞抽出物中に含まれる成分を担体メジゥム中のそれらの移度速度によつ て電気泳動的に分離し、含まれる単一または複数の抗原に相当する分子量15〜 40kDの分画を得、 一電気泳動的に分離した分画を担体メジウムからニトロセルロース膜に移し、 一遊離結合部位を飽和させたのち、膜を検定すべき体液と接触させ、体液中に存 在する抗体と抗原の免疫反応が場性の場合には、結合反応をこの抗体と反応する 標識試薬によつて可能にする ことからなる請求項(1)記載の方法。
- 5.ヒトまたは動物体液たとえは血清にっいて、リウマチ性および炎症性疾患と くに慢性関節リウマチに特異的な抗体の存在を検査する試薬であつて、体液中に 存在する可能性がある抗体と結合反応を起こす分子量約33kDを有する特異的 抗原または特異的抗原分画を含有〜 し、また分子量15〜40kDの範囲とくに分子量杓20、25、31および3 6KDを有する付加的な特異的抗原または特異的抗原分画を、場合により含有す る試薬。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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