JP3518501B2 - 酸化還元酵素遺伝子、同遺伝子のクローニングおよび同酵素の製造方法 - Google Patents
酸化還元酵素遺伝子、同遺伝子のクローニングおよび同酵素の製造方法Info
- Publication number
- JP3518501B2 JP3518501B2 JP2000306503A JP2000306503A JP3518501B2 JP 3518501 B2 JP3518501 B2 JP 3518501B2 JP 2000306503 A JP2000306503 A JP 2000306503A JP 2000306503 A JP2000306503 A JP 2000306503A JP 3518501 B2 JP3518501 B2 JP 3518501B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- glu
- ile
- transformant
- oxidoreductase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規オリゴヌクレ
オチド、同オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い
た新規酸化還元酵素遺伝子の増幅・クローニング法、同
遺伝子を含有する組換えベクター、同組換えベクターに
より形質転換された形質転換体、および同形質転換体に
よる酸化還元酵素の製造方法に関する。
オチド、同オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い
た新規酸化還元酵素遺伝子の増幅・クローニング法、同
遺伝子を含有する組換えベクター、同組換えベクターに
より形質転換された形質転換体、および同形質転換体に
よる酸化還元酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ジケトン化合物に対し還元能を有
する酸化還元酵素産生微生物としては、サッカロミセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が知られて
いる。しかし、当該サッカロミセス セレビシエで、た
とえば芳香族ジケトン化合物の１種であるベンジル（be
nzil）を還元した場合には、ラセミ体のベンゾインが生
成する。このため、当該微生物産生酵素は立体選択性が
低いという難点がある（Chemistry Letters、１１９１
〜１１９２頁、１９８８年）。芳香族ジケトン化合物で
あるベンジルに対し不斉還元能を有する酸化還元酵素を
産生する微生物としては、キサントモナス オリゼー
（Xanthomonas oryzae）も知られている。同酵素産生微
生物でベンジルを不斉還元した場合には、還元生成物と
して立体選択的に（Ｒ）−ベンゾインを生成する（Chem
istry Letters、1111〜1112頁、1985年）。
する酸化還元酵素産生微生物としては、サッカロミセス
セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が知られて
いる。しかし、当該サッカロミセス セレビシエで、た
とえば芳香族ジケトン化合物の１種であるベンジル（be
nzil）を還元した場合には、ラセミ体のベンゾインが生
成する。このため、当該微生物産生酵素は立体選択性が
低いという難点がある（Chemistry Letters、１１９１
〜１１９２頁、１９８８年）。芳香族ジケトン化合物で
あるベンジルに対し不斉還元能を有する酸化還元酵素を
産生する微生物としては、キサントモナス オリゼー
（Xanthomonas oryzae）も知られている。同酵素産生微
生物でベンジルを不斉還元した場合には、還元生成物と
して立体選択的に（Ｒ）−ベンゾインを生成する（Chem
istry Letters、1111〜1112頁、1985年）。
【０００３】また、サッカロミセス セレビシエは、脂
肪族ジケトン化合物である４−クロロアセト酢酸エステ
ルを還元して４−ヒドロキシブタン酸エステルとする７
種類の酵素を産生することが知られているが、これら７
種酵素の全ての遺伝子は単離されるに至っておらず（化
学と生物、第35号、590〜598頁、1997年）、それらのア
ミノ酸配列も、２種類の酵素についてサッカロミセス
セレビシエのゲノム配列から類推されているにすぎない
（Biosci. Biotech. Biochem.、第60号、1538〜1539
頁、1996年）。
肪族ジケトン化合物である４−クロロアセト酢酸エステ
ルを還元して４−ヒドロキシブタン酸エステルとする７
種類の酵素を産生することが知られているが、これら７
種酵素の全ての遺伝子は単離されるに至っておらず（化
学と生物、第35号、590〜598頁、1997年）、それらのア
ミノ酸配列も、２種類の酵素についてサッカロミセス
セレビシエのゲノム配列から類推されているにすぎない
（Biosci. Biotech. Biochem.、第60号、1538〜1539
頁、1996年）。
【０００４】バチラス セリウス（Bacillus cereus）
に関しては、非ジケトン化合物である９−フルオレノン
のカルボニル基に対し還元能を示すことが知られている
が（Biosci. Biotechnol. Biochem.、第62号、814〜815
頁、1998年）、当該微生物の芳香族ジケトン化合物に対
する還元能はこれまで全く報告されていない。
に関しては、非ジケトン化合物である９−フルオレノン
のカルボニル基に対し還元能を示すことが知られている
が（Biosci. Biotechnol. Biochem.、第62号、814〜815
頁、1998年）、当該微生物の芳香族ジケトン化合物に対
する還元能はこれまで全く報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、前記の
状況下、種々研究を重ねた結果、バチラス セリウスＴ
ｉｍ−ｒ０１（通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４２１０）が芳香族
ジケトン化合物に対し還元能を有し、たとえばベンジル
を不斉還元して（Ｓ）−ベンゾインを生成する、新規酸
化還元酵素を産生することを見出した。しかし、当該菌
株の生菌体を用いた場合、その培養条件によって当該酸
化還元酵素の発現量は大きく影響される。また、当該生
菌体を用いて長時間酸化還元反応を実施すると、逆反応
が起こり不斉還元生成物の収量が減少するなどの欠点を
有していた。
状況下、種々研究を重ねた結果、バチラス セリウスＴ
ｉｍ−ｒ０１（通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４２１０）が芳香族
ジケトン化合物に対し還元能を有し、たとえばベンジル
を不斉還元して（Ｓ）−ベンゾインを生成する、新規酸
化還元酵素を産生することを見出した。しかし、当該菌
株の生菌体を用いた場合、その培養条件によって当該酸
化還元酵素の発現量は大きく影響される。また、当該生
菌体を用いて長時間酸化還元反応を実施すると、逆反応
が起こり不斉還元生成物の収量が減少するなどの欠点を
有していた。
【０００６】そこで本発明者らは、先の出願において、
バチラス セリウスＦＥＲＭ Ｐ−１４２１０菌株の染
色体ＤＮＡから酸化還元酵素をコードする新規遺伝子お
よび同遺伝子のオープンリーディングフレーム（以下Ｏ
ＲＦと略称する）を同定の上、当該微生物由来の酸化還
元酵素、同酵素をコードする新規遺伝子、同遺伝子を含
有するベクターおよび同ベクターにより形質転換した形
質転換体を各々提供した（特願２０００−２５７８２
９）。
バチラス セリウスＦＥＲＭ Ｐ−１４２１０菌株の染
色体ＤＮＡから酸化還元酵素をコードする新規遺伝子お
よび同遺伝子のオープンリーディングフレーム（以下Ｏ
ＲＦと略称する）を同定の上、当該微生物由来の酸化還
元酵素、同酵素をコードする新規遺伝子、同遺伝子を含
有するベクターおよび同ベクターにより形質転換した形
質転換体を各々提供した（特願２０００−２５７８２
９）。
【０００７】本発明者らは、このような研究成果をもと
に更に研究を重ねた結果、先の出願（特願２０００−２
５７８２９）でその塩基配列を決定した新規酸化還元酵
素遺伝子の特定配列部位をプライマーとして利用すれ
ば、各種微生物から酸化還元酵素の遺伝子を得ることが
でき、また同遺伝子を含む形質転換体を利用すれば、芳
香族ジケトン化合物に対し不斉還元能を示す酸化還元酵
素を工業的有利に製造し得ることを見出し、本発明を完
成したものである。
に更に研究を重ねた結果、先の出願（特願２０００−２
５７８２９）でその塩基配列を決定した新規酸化還元酵
素遺伝子の特定配列部位をプライマーとして利用すれ
ば、各種微生物から酸化還元酵素の遺伝子を得ることが
でき、また同遺伝子を含む形質転換体を利用すれば、芳
香族ジケトン化合物に対し不斉還元能を示す酸化還元酵
素を工業的有利に製造し得ることを見出し、本発明を完
成したものである。
【０００８】したがって、本発明は、酸化還元酵素遺伝
子の増幅に利用できる新規オリゴヌクレオチド、同オリ
ゴヌクレオチドを用いる新規酸化還元酵素遺伝子の増幅
・クローニング法、同遺伝子を含有する組換えベクタ
ー、同組換えベクターにより形質転換された形質転換
体、ならびに同形質転換体による酸化還元酵素の製造方
法を提供することを目的とする。
子の増幅に利用できる新規オリゴヌクレオチド、同オリ
ゴヌクレオチドを用いる新規酸化還元酵素遺伝子の増幅
・クローニング法、同遺伝子を含有する組換えベクタ
ー、同組換えベクターにより形質転換された形質転換
体、ならびに同形質転換体による酸化還元酵素の製造方
法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、以下に示
す発明を提供することで、前記課題を解決するものであ
る。
す発明を提供することで、前記課題を解決するものであ
る。
【００１０】（１）配列表の配列番号９に示した酸化還
元酵素遺伝子の５´末端２〜２２個の塩基配列と実質的
に同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。 （２）配列表の配列番号９に示した酸化還元酵素遺伝子
の３´末端２〜２３個の塩基配列と実質的に相補的な塩
基配列を有するオリゴヌクレオチド。 （３）前記（１）記載のオリゴヌクレオチドの５´末端
側に制限酵素の認識配列を含むオリゴヌクレオチド。 （４）前記（２）記載のオリゴヌクレオチドの５´末端
側に制限酵素の認識配列を含むオリゴヌクレオチド。 （５）配列表の配列番号１、２、３または４に示した塩
基配列を有するオリゴヌクレオチド。 （６）（ａ）前記（１）、（２）、（３）、（４）およ
び（５）記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なく
とも１つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、試
料に含まれる標的酸化還元酵素遺伝子を増幅し、（ｂ）
増幅された当該遺伝子をベクターに挿入して組換えベク
ターを調製した後、（ｃ）当該ベクターにより形質転換
された形質転換体を得ることを特徴とする酸化還元酵素
遺伝子含有形質転換体の製法。 （７）酸化還元酵素遺伝子を含有する試料が、バチラス
属に属する菌株から得られた染色体ＤＮＡ、当該染色体
のＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーまたは当
該遺伝子を含む組換えベクターであることを特徴とする
前記（６）記載の酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体の
製法。 （８）酸化還元酵素遺伝子を含有する試料が、バチラス
セリウスから得られた染色体ＤＮＡ、当該染色体のＤ
ＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーまたは当該遺
伝子を含む組換えベクターであることを特徴とする前記
（６）記載の酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体の製
法。 （９）前記（３）および（４）記載の２種のオリゴヌク
レオチドをプライマーとして用いることを特徴とする前
記（６）、（７）または（８）記載の酸化還元酵素遺伝
子含有形質転換体の製法。 （10）配列表の配列番号２および４記載の２種のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いることを特徴とす
る前記（６）、（７）または（８）記載の酸化還元酵素
遺伝子含有形質転換体の製法。 （11）形質転換する宿主細胞が微生物であることを特徴
とする前記（６）、（７）、（８)、（９）または（1
0）記載の酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体の製法。 （12）ベクターがｐＵＣ１９であり、形質転換する宿主
細胞が大腸菌であることを特徴とする前記（６）、
（７）、（８）、（９）または（10）記載の酸化還元酵
素遺伝子含有形質転換体の製法。 （13）前記（１）、（２）、（３）、（４）および
（５）記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくと
も１つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた
ポリメラーゼ連鎖反応により得られ、配列表の配列番号
５、７、１０、１２、１４、１６、１８または２０に示
した塩基配列を有する酸化還元酵素遺伝子。 （14）前記（１）、（２）、（３）、（４）および
（５）記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくと
も１つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた
ポリメラーゼ連鎖反応により得られ、配列表の配列番号
６、８、１１、１３、１５、１７、１９または２１に示
したアミノ酸配列をコードする酸化還元酵素遺伝子。 （15）前記（13）または（14）記載の遺伝子に規定され
た酸化還元酵素。 （16）前記（13）記載の遺伝子の塩基配列と相補的な塩
基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまた
はオリゴヌクレオチド。 （17）前記（13）記載の遺伝子の塩基配列と相補的な塩
基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡでコ
ードされるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリ
ペプチド。 （18）前記（13）記載の遺伝子の塩基配列と相補的な塩
基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを発
現させることによって得られるタンパク質またはポリペ
プチド。 （19）前記（13）または（14）記載の遺伝子を含有する
組換えベクター。 （20）ベクターがｐＵＣ１９である前記（19）記載の組
換えベクター。 （21）前記（19）または（20）記載の組換えベクターに
より形質転換された形質転換体。 （22）宿主細胞が微生物である前記（21）記載の形質転
換体。 （23）微生物が大腸菌である前記（21）記載の形質転換
体。 （24）前記（６）、（７）、（８）、（９）、（10）、
（11）または（12）記載の方法で得られる酸化還元酵素
遺伝子含有形質転換体を培養し、培養物から酸化還元酵
素を採取することを特徴とする酸化還元酵素の製造方
法。
元酵素遺伝子の５´末端２〜２２個の塩基配列と実質的
に同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。 （２）配列表の配列番号９に示した酸化還元酵素遺伝子
の３´末端２〜２３個の塩基配列と実質的に相補的な塩
基配列を有するオリゴヌクレオチド。 （３）前記（１）記載のオリゴヌクレオチドの５´末端
側に制限酵素の認識配列を含むオリゴヌクレオチド。 （４）前記（２）記載のオリゴヌクレオチドの５´末端
側に制限酵素の認識配列を含むオリゴヌクレオチド。 （５）配列表の配列番号１、２、３または４に示した塩
基配列を有するオリゴヌクレオチド。 （６）（ａ）前記（１）、（２）、（３）、（４）およ
び（５）記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なく
とも１つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、試
料に含まれる標的酸化還元酵素遺伝子を増幅し、（ｂ）
増幅された当該遺伝子をベクターに挿入して組換えベク
ターを調製した後、（ｃ）当該ベクターにより形質転換
された形質転換体を得ることを特徴とする酸化還元酵素
遺伝子含有形質転換体の製法。 （７）酸化還元酵素遺伝子を含有する試料が、バチラス
属に属する菌株から得られた染色体ＤＮＡ、当該染色体
のＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーまたは当
該遺伝子を含む組換えベクターであることを特徴とする
前記（６）記載の酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体の
製法。 （８）酸化還元酵素遺伝子を含有する試料が、バチラス
セリウスから得られた染色体ＤＮＡ、当該染色体のＤ
ＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーまたは当該遺
伝子を含む組換えベクターであることを特徴とする前記
（６）記載の酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体の製
法。 （９）前記（３）および（４）記載の２種のオリゴヌク
レオチドをプライマーとして用いることを特徴とする前
記（６）、（７）または（８）記載の酸化還元酵素遺伝
子含有形質転換体の製法。 （10）配列表の配列番号２および４記載の２種のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いることを特徴とす
る前記（６）、（７）または（８）記載の酸化還元酵素
遺伝子含有形質転換体の製法。 （11）形質転換する宿主細胞が微生物であることを特徴
とする前記（６）、（７）、（８)、（９）または（1
0）記載の酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体の製法。 （12）ベクターがｐＵＣ１９であり、形質転換する宿主
細胞が大腸菌であることを特徴とする前記（６）、
（７）、（８）、（９）または（10）記載の酸化還元酵
素遺伝子含有形質転換体の製法。 （13）前記（１）、（２）、（３）、（４）および
（５）記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくと
も１つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた
ポリメラーゼ連鎖反応により得られ、配列表の配列番号
５、７、１０、１２、１４、１６、１８または２０に示
した塩基配列を有する酸化還元酵素遺伝子。 （14）前記（１）、（２）、（３）、（４）および
（５）記載のオリゴヌクレオチドから選ばれた少なくと
も１つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた
ポリメラーゼ連鎖反応により得られ、配列表の配列番号
６、８、１１、１３、１５、１７、１９または２１に示
したアミノ酸配列をコードする酸化還元酵素遺伝子。 （15）前記（13）または（14）記載の遺伝子に規定され
た酸化還元酵素。 （16）前記（13）記載の遺伝子の塩基配列と相補的な塩
基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡまた
はオリゴヌクレオチド。 （17）前記（13）記載の遺伝子の塩基配列と相補的な塩
基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡでコ
ードされるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリ
ペプチド。 （18）前記（13）記載の遺伝子の塩基配列と相補的な塩
基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを発
現させることによって得られるタンパク質またはポリペ
プチド。 （19）前記（13）または（14）記載の遺伝子を含有する
組換えベクター。 （20）ベクターがｐＵＣ１９である前記（19）記載の組
換えベクター。 （21）前記（19）または（20）記載の組換えベクターに
より形質転換された形質転換体。 （22）宿主細胞が微生物である前記（21）記載の形質転
換体。 （23）微生物が大腸菌である前記（21）記載の形質転換
体。 （24）前記（６）、（７）、（８）、（９）、（10）、
（11）または（12）記載の方法で得られる酸化還元酵素
遺伝子含有形質転換体を培養し、培養物から酸化還元酵
素を採取することを特徴とする酸化還元酵素の製造方
法。
【００１１】本発明にかかる前記オリゴヌクレオチド、
酸化還元酵素遺伝子、同遺伝子を含有する組換えベクタ
ー、同組換えベクターにより形質転換された形質転換
体、酸化還元酵素は、以下に説明する実施の態様に基づ
いて得ることができ、また当該形質転換体の製法および
酸化還元酵素の製法も、以下に示す実施の態様に基づい
て実施することができる。以下、本発明について詳細に
説明する。
酸化還元酵素遺伝子、同遺伝子を含有する組換えベクタ
ー、同組換えベクターにより形質転換された形質転換
体、酸化還元酵素は、以下に説明する実施の態様に基づ
いて得ることができ、また当該形質転換体の製法および
酸化還元酵素の製法も、以下に示す実施の態様に基づい
て実施することができる。以下、本発明について詳細に
説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明にかかる新規オリゴヌクレ
オチド、すなわち「課題を解決するための手段」の項
（１）および（２）に記載したオリゴヌクレオチド、は
本発明者らが先の出願（特願２０００−２５７８２９）
でその塩基配列を決定した配列番号９記載の酸化還元酵
素遺伝子に基づいて設定することができる。とくに酸化
還元酵素遺伝子のＯＲＦ全長をクローニングするために
は、配列番号９の５´または３´末端側の約２０塩基に
基づいて設定するのが好ましく、たとえば配列番号１ま
たは３に示すオリゴヌクレオチドを設定することができ
る。
オチド、すなわち「課題を解決するための手段」の項
（１）および（２）に記載したオリゴヌクレオチド、は
本発明者らが先の出願（特願２０００−２５７８２９）
でその塩基配列を決定した配列番号９記載の酸化還元酵
素遺伝子に基づいて設定することができる。とくに酸化
還元酵素遺伝子のＯＲＦ全長をクローニングするために
は、配列番号９の５´または３´末端側の約２０塩基に
基づいて設定するのが好ましく、たとえば配列番号１ま
たは３に示すオリゴヌクレオチドを設定することができ
る。
【００１３】これらのオリゴヌクレオチドは、さらにそ
の５´末端側に制限酵素の認識配列、ヒスチジンタグも
しくはフラッグ（ＦＬＡＧ）タグのようなタグまたはグ
リーン蛍光タンパク質などを含んでいてもよい。増幅さ
れた遺伝子を以後の過程で制限酵素により切り出す場合
には、オリゴヌクレオチドの５´末端側にＩＩ型制限酵
素の認識配列を付加しておくのが好ましい。オリゴヌク
レオチドが制限酵素の認識配列を含む場合、付加する制
限酵素の認識配列はベクターのクローニング部位に合わ
せて適宜選択することができる。当該制限酵素として
は、認識配列の出現する位置でＤＮＡ鎖を正確に消化す
ることができるという点で、ＩＩ型制限酵素、たとえば
制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｋ
ｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＳａｐＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩまたはＸｂａＩ
などの認識配列を選択するのが好ましい。当該制限酵素
認識配列に加え、制限酵素による消化を助けるクランプ
（clamp）とよばれる数個の塩基を付加してもよい。ま
た、たとえばｐＵＣ系ベクター、ｐＴＹＢ系ベクター
（ニューイングランドＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）（NE
W ENGLAND BioLabs）社製）またはｐＧＥＸ系ベクター
（アマシャムファルマシアバイオテク社（amersham pha
rmacia biotech）製）など、使用ベクターの種類によっ
ては、制限酵素の認識配列と酸化還元酵素をコードする
オリゴヌクレオチドとの間に、数塩基を付加することも
できる。このような本発明にかかるオリゴヌクレオチド
の具体例としては、配列番号２または４に示した塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
の５´末端側に制限酵素の認識配列、ヒスチジンタグも
しくはフラッグ（ＦＬＡＧ）タグのようなタグまたはグ
リーン蛍光タンパク質などを含んでいてもよい。増幅さ
れた遺伝子を以後の過程で制限酵素により切り出す場合
には、オリゴヌクレオチドの５´末端側にＩＩ型制限酵
素の認識配列を付加しておくのが好ましい。オリゴヌク
レオチドが制限酵素の認識配列を含む場合、付加する制
限酵素の認識配列はベクターのクローニング部位に合わ
せて適宜選択することができる。当該制限酵素として
は、認識配列の出現する位置でＤＮＡ鎖を正確に消化す
ることができるという点で、ＩＩ型制限酵素、たとえば
制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｋ
ｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、Ｓ
ａｌＩ、ＳａｐＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩまたはＸｂａＩ
などの認識配列を選択するのが好ましい。当該制限酵素
認識配列に加え、制限酵素による消化を助けるクランプ
（clamp）とよばれる数個の塩基を付加してもよい。ま
た、たとえばｐＵＣ系ベクター、ｐＴＹＢ系ベクター
（ニューイングランドＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）（NE
W ENGLAND BioLabs）社製）またはｐＧＥＸ系ベクター
（アマシャムファルマシアバイオテク社（amersham pha
rmacia biotech）製）など、使用ベクターの種類によっ
ては、制限酵素の認識配列と酸化還元酵素をコードする
オリゴヌクレオチドとの間に、数塩基を付加することも
できる。このような本発明にかかるオリゴヌクレオチド
の具体例としては、配列番号２または４に示した塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１４】本発明にかかる当該オリゴヌクレオチド
は、これ自体公知の方法、たとえば亜リン酸−トリエス
テル法で合成することができる。プライマー合成の際に
はプライマー合成機を用いることができ、たとえばＤＮ
ＡシンセサイザＭｏｄｅｌ３８０Ａ、同３８１Ａまたは
同３９４（商品名、ピーイーアプライドバイオシステム
ズ社（PE Applied Biosystems）製）を用いることがで
きる。
は、これ自体公知の方法、たとえば亜リン酸−トリエス
テル法で合成することができる。プライマー合成の際に
はプライマー合成機を用いることができ、たとえばＤＮ
ＡシンセサイザＭｏｄｅｌ３８０Ａ、同３８１Ａまたは
同３９４（商品名、ピーイーアプライドバイオシステム
ズ社（PE Applied Biosystems）製）を用いることがで
きる。
【００１５】本発明にかかる遺伝子の増幅用試料として
は、標的とする酸化還元酵素遺伝子を含むものであれ
ば、制限なく使用することができる。たとえば標的とす
る酸化還元酵素遺伝子を含む微生物菌体から、必要に応
じて当該菌体を溶菌処理、たとえばＧｅｎとるくん（商
品名、宝酒造株式会社製）を用いた処理、により調製さ
れた染色体ＤＮＡ、当該菌株の染色体ＤＮＡライブラリ
ー、ｃＤＮＡライブラリー、および標的遺伝子を含むベ
クターなどを適宜用いることができる。試料の例として
は、バチラス属に属する菌株を用いることができる。具
体的には、たとえばバチラス セリウスＦＥＲＭ Ｐ−
１４２１０、財団法人発酵研究所から入手可能なバチラ
ス セリウスＩＦＯ３００１、同ＩＦＯ３００２、同Ｉ
ＦＯ３００３、同ＩＦＯ３１３２、同ＩＦＯ３４５７、
同ＩＦＯ３４６６、同ＩＦＯ３５１４、同ＩＦＯ３５６
３、同ＩＦＯ３８３６、同ＩＦＯ１３４９４、同ＩＦＯ
１３５９７、同ＩＦＯ１３６９０および同ＩＦＯ１５３
０５、ならびに東京大学分子細胞生物学研究所から入手
可能なＩＡＭ１０２９、同ＩＡＭ１１１０、同ＩＡＭ１
６５６および同ＩＡＭ１７２９から得られる染色体ＤＮ
Ａ、同染色体のＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラ
リーまたは同遺伝子を含むプラスミドなどが挙げられ
る。該菌体のベンジル還元活性を調べたところ、全ての
菌体がＦＥＲＭＰ−１４２１０菌体と同程度のベンジル
の不斉還元能を有していた。
は、標的とする酸化還元酵素遺伝子を含むものであれ
ば、制限なく使用することができる。たとえば標的とす
る酸化還元酵素遺伝子を含む微生物菌体から、必要に応
じて当該菌体を溶菌処理、たとえばＧｅｎとるくん（商
品名、宝酒造株式会社製）を用いた処理、により調製さ
れた染色体ＤＮＡ、当該菌株の染色体ＤＮＡライブラリ
ー、ｃＤＮＡライブラリー、および標的遺伝子を含むベ
クターなどを適宜用いることができる。試料の例として
は、バチラス属に属する菌株を用いることができる。具
体的には、たとえばバチラス セリウスＦＥＲＭ Ｐ−
１４２１０、財団法人発酵研究所から入手可能なバチラ
ス セリウスＩＦＯ３００１、同ＩＦＯ３００２、同Ｉ
ＦＯ３００３、同ＩＦＯ３１３２、同ＩＦＯ３４５７、
同ＩＦＯ３４６６、同ＩＦＯ３５１４、同ＩＦＯ３５６
３、同ＩＦＯ３８３６、同ＩＦＯ１３４９４、同ＩＦＯ
１３５９７、同ＩＦＯ１３６９０および同ＩＦＯ１５３
０５、ならびに東京大学分子細胞生物学研究所から入手
可能なＩＡＭ１０２９、同ＩＡＭ１１１０、同ＩＡＭ１
６５６および同ＩＡＭ１７２９から得られる染色体ＤＮ
Ａ、同染色体のＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラ
リーまたは同遺伝子を含むプラスミドなどが挙げられ
る。該菌体のベンジル還元活性を調べたところ、全ての
菌体がＦＥＲＭＰ−１４２１０菌体と同程度のベンジル
の不斉還元能を有していた。
【００１６】本発明によれば、所望の酸化還元酵素遺伝
子の増幅は、それ自体公知の方法、たとえばポリメラー
ゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）、で実施するこ
とができる。ＰＣＲ法で増幅する場合は、標的遺伝子を
含有する試料を、遺伝子増幅用プライマーとしてのオリ
ゴヌクレオチド、耐熱性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（デオ
キシＡＴＰ、デオキシＴＴＰ、デオキシＧＴＰおよびデ
オキシＣＴＰ）および反応用緩衝液を含む溶液に加え、
標的遺伝子にオリゴヌクレオチドをアニーリングさせて
増幅することができる。ここで、耐熱性ポリメラーゼと
は、至適温度が７０℃以上で、９０℃でも不活しにくい
ＤＮＡ依存性５´→３´ＤＮＡ合成酵素である。当該遺
伝子のＰＣＲ条件は、たとえば９４℃で１分間インキュ
ベーションした後、９４℃で１分間および７２℃で３分
間を１サイクルとしてこれを１０サイクル、さらに９４
℃で１分間、６５℃で２分間および７２℃で１分間を１
サイクルとしてこれを１０サイクル、その上さらに９４
℃で１分間、６０℃で２分間および７２℃で１分間を１
サイクルとしてこれを１５サイクル行うことで実施する
ことができる（Genes to Cells、第５号、111〜125頁、
2000年）。
子の増幅は、それ自体公知の方法、たとえばポリメラー
ゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）、で実施するこ
とができる。ＰＣＲ法で増幅する場合は、標的遺伝子を
含有する試料を、遺伝子増幅用プライマーとしてのオリ
ゴヌクレオチド、耐熱性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（デオ
キシＡＴＰ、デオキシＴＴＰ、デオキシＧＴＰおよびデ
オキシＣＴＰ）および反応用緩衝液を含む溶液に加え、
標的遺伝子にオリゴヌクレオチドをアニーリングさせて
増幅することができる。ここで、耐熱性ポリメラーゼと
は、至適温度が７０℃以上で、９０℃でも不活しにくい
ＤＮＡ依存性５´→３´ＤＮＡ合成酵素である。当該遺
伝子のＰＣＲ条件は、たとえば９４℃で１分間インキュ
ベーションした後、９４℃で１分間および７２℃で３分
間を１サイクルとしてこれを１０サイクル、さらに９４
℃で１分間、６５℃で２分間および７２℃で１分間を１
サイクルとしてこれを１０サイクル、その上さらに９４
℃で１分間、６０℃で２分間および７２℃で１分間を１
サイクルとしてこれを１５サイクル行うことで実施する
ことができる（Genes to Cells、第５号、111〜125頁、
2000年）。
【００１７】前記遺伝子増幅反応は、前述したオリゴヌ
クレオチドの１つを用いて実施することができる。ま
た、２つ以上のオリゴヌクレオチドを組み合わせて用い
ることもできる。２つ以上のオリゴヌクレオチドの組合
せとしては、たとえば［Ａ］（１）配列番号９に示した
酸化還元酵素の５´末端２〜２２個の塩基配列と実質的
に同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと（２）配
列番号９に示した酸化還元酵素遺伝子の３´末端２〜２
３個の塩基配列と実質的に相補的な塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドとの組合せ、または好ましくは［Ｂ］
（１）配列番号９に示した酸化還元酵素の５´末端２〜
２２個の塩基配列と実質的に同じ塩基配列を有し、かつ
５´末端側に制限酵素の認識配列を含むオリゴヌクレオ
チドと（２）配列番号９に示した酸化還元酵素の３´末
端２〜２３個の塩基配列と実質的に相補的な塩基配列を
有し、かつ５´末端側に制限酵素の認識配列を含むオリ
ゴヌクレオチドとの組合せを用いて実施することができ
る。当該オリゴヌクレオチドの組合せの具体例として
は、たとえば配列番号２に示した塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドと配列番号４に示した塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドの組合せが挙げられる。さらに当該
遺伝子増幅反応は、市販の耐熱性ポリメラーゼを用いて
実施することができる。このようなポリメラーゼの具体
例としては、たとえばＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（商
品名、宝酒造株式会社製）が挙げられる。該ポリメラー
ゼを用いたＰＣＲで目的の酸化還元酵素遺伝子を増幅す
ることができない場合、その原因としては目的遺伝子の
塩基配列とプライマーの塩基配列との間のミスマッチが
考えられる。このような場合には、優れた校正機能を有
したＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＫＯＤ ＤＮＡ ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、東洋紡績株式会社製）、
ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ（商品名、東洋紡績株式会社製）またはＰｙｒｏｂ
ｅｓｔ（商品名）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品
名、宝酒造株式会社製）、好ましくはＫＯＤＤＮＡ ｐ
ｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、東洋
紡績株式会社製）またはＰｙｒｏｂｅｓｔ（商品名）Ｄ
ＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、宝酒造株式会社
製）、より好ましくはＰｙｒｏｂｅｓｔ（商品名）ＤＮ
Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、宝酒造株式会社
製）を用いることにより、該原因を回避することができ
る。たとえばＩＦＯ３００１、ＩＦＯ３００２、ＩＦＯ
３００３、ＩＦＯ３５６３、ＩＦＯ３８３６、ＩＦＯ１
３５９７およびＩＦＯ１５３０５、ならびにＩＡＭ１６
５６およびＩＡＭ１７２９菌体を試料として用いた場合
は、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（商品名、宝酒造株式
会社製）により目的遺伝子を増幅することができる。し
かし、ＩＦＯ３１３２、ＩＦＯ３４５７、ＩＦＯ３４６
６、ＩＦＯ３５１４、ＩＦＯ１３４９４、ＩＦＯ１３６
９０、ＩＡＭ１０２９およびＩＡＭ１１１０はＴａＫａ
Ｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（商品名、宝酒造株式会社製）で増
幅することができない。このうちＩＦＯ３４６６、ＩＦ
Ｏ１３４９４およびＩＡＭ１０２９は、ＫＯＤ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、東洋紡績株式会社
製）を用いることにより該菌株から目的遺伝子を増幅す
ることができる。ＩＦＯ３１３２、ＩＦＯ３４５７、Ｉ
ＦＯ３５１４、ＩＦＯ１３６９０およびＩＡＭ１１１０
は、ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた場
合でも目的遺伝子を増幅することができなかったが、Ｐ
ｙｒｏｂｅｓｔ（商品名）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ（商品名、宝酒造株式会社製）を用いることにより増
幅することができる。
クレオチドの１つを用いて実施することができる。ま
た、２つ以上のオリゴヌクレオチドを組み合わせて用い
ることもできる。２つ以上のオリゴヌクレオチドの組合
せとしては、たとえば［Ａ］（１）配列番号９に示した
酸化還元酵素の５´末端２〜２２個の塩基配列と実質的
に同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと（２）配
列番号９に示した酸化還元酵素遺伝子の３´末端２〜２
３個の塩基配列と実質的に相補的な塩基配列を有するオ
リゴヌクレオチドとの組合せ、または好ましくは［Ｂ］
（１）配列番号９に示した酸化還元酵素の５´末端２〜
２２個の塩基配列と実質的に同じ塩基配列を有し、かつ
５´末端側に制限酵素の認識配列を含むオリゴヌクレオ
チドと（２）配列番号９に示した酸化還元酵素の３´末
端２〜２３個の塩基配列と実質的に相補的な塩基配列を
有し、かつ５´末端側に制限酵素の認識配列を含むオリ
ゴヌクレオチドとの組合せを用いて実施することができ
る。当該オリゴヌクレオチドの組合せの具体例として
は、たとえば配列番号２に示した塩基配列を有するオリ
ゴヌクレオチドと配列番号４に示した塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドの組合せが挙げられる。さらに当該
遺伝子増幅反応は、市販の耐熱性ポリメラーゼを用いて
実施することができる。このようなポリメラーゼの具体
例としては、たとえばＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（商
品名、宝酒造株式会社製）が挙げられる。該ポリメラー
ゼを用いたＰＣＲで目的の酸化還元酵素遺伝子を増幅す
ることができない場合、その原因としては目的遺伝子の
塩基配列とプライマーの塩基配列との間のミスマッチが
考えられる。このような場合には、優れた校正機能を有
したＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＫＯＤ ＤＮＡ ｐ
ｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、東洋紡績株式会社製）、
ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅ（商品名、東洋紡績株式会社製）またはＰｙｒｏｂ
ｅｓｔ（商品名）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品
名、宝酒造株式会社製）、好ましくはＫＯＤＤＮＡ ｐ
ｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、東洋
紡績株式会社製）またはＰｙｒｏｂｅｓｔ（商品名）Ｄ
ＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、宝酒造株式会社
製）、より好ましくはＰｙｒｏｂｅｓｔ（商品名）ＤＮ
Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、宝酒造株式会社
製）を用いることにより、該原因を回避することができ
る。たとえばＩＦＯ３００１、ＩＦＯ３００２、ＩＦＯ
３００３、ＩＦＯ３５６３、ＩＦＯ３８３６、ＩＦＯ１
３５９７およびＩＦＯ１５３０５、ならびにＩＡＭ１６
５６およびＩＡＭ１７２９菌体を試料として用いた場合
は、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（商品名、宝酒造株式
会社製）により目的遺伝子を増幅することができる。し
かし、ＩＦＯ３１３２、ＩＦＯ３４５７、ＩＦＯ３４６
６、ＩＦＯ３５１４、ＩＦＯ１３４９４、ＩＦＯ１３６
９０、ＩＡＭ１０２９およびＩＡＭ１１１０はＴａＫａ
Ｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（商品名、宝酒造株式会社製）で増
幅することができない。このうちＩＦＯ３４６６、ＩＦ
Ｏ１３４９４およびＩＡＭ１０２９は、ＫＯＤ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、東洋紡績株式会社
製）を用いることにより該菌株から目的遺伝子を増幅す
ることができる。ＩＦＯ３１３２、ＩＦＯ３４５７、Ｉ
ＦＯ３５１４、ＩＦＯ１３６９０およびＩＡＭ１１１０
は、ＫＯＤ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた場
合でも目的遺伝子を増幅することができなかったが、Ｐ
ｙｒｏｂｅｓｔ（商品名）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ（商品名、宝酒造株式会社製）を用いることにより増
幅することができる。
【００１８】遺伝子の増幅反応後、たとえば１．５％の
アガロースゲルを用いる電気泳動にてＰＣＲ産物を展開
し、約８００ｂｐのバンドを含む画分を切り出す。つい
で、たとえばＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、バイオラッド社
（BIO-RAD）製）を用いることにより、目的のＰＣＲ断
片を精製することができる。
アガロースゲルを用いる電気泳動にてＰＣＲ産物を展開
し、約８００ｂｐのバンドを含む画分を切り出す。つい
で、たとえばＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、バイオラッド社
（BIO-RAD）製）を用いることにより、目的のＰＣＲ断
片を精製することができる。
【００１９】制限酵素の認識配列を含むオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いる場合は、増幅された遺伝
子のＤＮＡ断片に対して、当該オリゴヌクレオチドプラ
イマーに含まれる制限酵素の認識配列を認識する制限酵
素を作用させ、所望の遺伝子断片を得ることができる。
チドをプライマーとして用いる場合は、増幅された遺伝
子のＤＮＡ断片に対して、当該オリゴヌクレオチドプラ
イマーに含まれる制限酵素の認識配列を認識する制限酵
素を作用させ、所望の遺伝子断片を得ることができる。
【００２０】酸化還元酵素遺伝子を含有する組換えベク
ターは、前記の遺伝子断片とべクターを２〜５：１のモ
ル比で混合してライゲーションすることにより調製する
ことができる。すなわち、まずベクターに制限酵素を作
用させて実質的に完全に消化し、ＤＮＡ断片を挿入する
ためのベクターを得る。制限酵素による消化反応の反応
温度、反応時間などの反応条件は、選択した酵素に応じ
て適宜条件設定することができる。
ターは、前記の遺伝子断片とべクターを２〜５：１のモ
ル比で混合してライゲーションすることにより調製する
ことができる。すなわち、まずベクターに制限酵素を作
用させて実質的に完全に消化し、ＤＮＡ断片を挿入する
ためのベクターを得る。制限酵素による消化反応の反応
温度、反応時間などの反応条件は、選択した酵素に応じ
て適宜条件設定することができる。
【００２１】組換えに用い得るベクターに制約はなく、
たとえばプラスミドベクター、バクテリオファージベク
ター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベク
ターまたはパピローマウイルスベクターなどをいずれも
用いることができる。具体的には、たとえばｐＵＣ１９
ＤＮＡ（宝酒造株式会社製）、ｐＴＹＢ−１またはｐＴ
ＹＢ−１１（ニューイングランドＢｉｏＬａｂｓ（登録
商標）社製）を用いるのが好ましい。これらのベクター
は、必要とあればフェノール抽出などの精製手段により
精製し、さらにたとえばエタノール沈殿法などの濃縮手
段により濃縮することができる。また、ベクター断片の
セルフライゲーションを防ぐために、たとえば仔牛小腸
由来のアルカリホスファターゼなどによるホスファター
ゼ処理を行ってもよい。ついで、前工程で得た増幅され
た遺伝子とベクターを混合し、これにリガーゼ、たとえ
ばＴ４ＤＮＡリガーゼ、を作用させて組換えベクターを
得ることができる。具体的には、ライゲーションキッ
ト、たとえばＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．１（商品名、宝酒造株式会社製）またはＬｉｇａｔ
ｉｏｎ ｈｉｇｈ（商品名、東洋紡績株式会社製）、を
用いて規定の条件にてライゲーションを行うことによ
り、組換えベクターを得ることができる。
たとえばプラスミドベクター、バクテリオファージベク
ター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベク
ターまたはパピローマウイルスベクターなどをいずれも
用いることができる。具体的には、たとえばｐＵＣ１９
ＤＮＡ（宝酒造株式会社製）、ｐＴＹＢ−１またはｐＴ
ＹＢ−１１（ニューイングランドＢｉｏＬａｂｓ（登録
商標）社製）を用いるのが好ましい。これらのベクター
は、必要とあればフェノール抽出などの精製手段により
精製し、さらにたとえばエタノール沈殿法などの濃縮手
段により濃縮することができる。また、ベクター断片の
セルフライゲーションを防ぐために、たとえば仔牛小腸
由来のアルカリホスファターゼなどによるホスファター
ゼ処理を行ってもよい。ついで、前工程で得た増幅され
た遺伝子とベクターを混合し、これにリガーゼ、たとえ
ばＴ４ＤＮＡリガーゼ、を作用させて組換えベクターを
得ることができる。具体的には、ライゲーションキッ
ト、たとえばＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．１（商品名、宝酒造株式会社製）またはＬｉｇａｔ
ｉｏｎ ｈｉｇｈ（商品名、東洋紡績株式会社製）、を
用いて規定の条件にてライゲーションを行うことによ
り、組換えベクターを得ることができる。
【００２２】制限酵素の認識配列が含まれていないオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合は、ＰＣ
Ｒによる増幅断片をクローニングするために適した市販
のベクター、たとえばｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａ
ｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍＩ（商品名、プロメ
ガ社（Promega）製）に含まれている、ｐＧＥＭ（登録
商標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒを用いることがで
きる。当該ベクターおよびＴ４リガーゼを用いれば、Ｐ
ＣＲによる増幅産物およびベクターの制限酵素処理をせ
ずにライゲーションを行うことができ、酸化還元酵素遺
伝子を含有する組換えベクターを調製することができ
る。
ゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合は、ＰＣ
Ｒによる増幅断片をクローニングするために適した市販
のベクター、たとえばｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａ
ｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ ＳｙｓｔｅｍＩ（商品名、プロメ
ガ社（Promega）製）に含まれている、ｐＧＥＭ（登録
商標）−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒを用いることがで
きる。当該ベクターおよびＴ４リガーゼを用いれば、Ｐ
ＣＲによる増幅産物およびベクターの制限酵素処理をせ
ずにライゲーションを行うことができ、酸化還元酵素遺
伝子を含有する組換えベクターを調製することができ
る。
【００２３】また、制限酵素の認識配列が含まれている
オリゴヌクレオチドと含まれていないオリゴヌクレオチ
ドの組合せをプライマーとして用いる場合にも、ＰＣＲ
断片クローニング用ベクターを用いることにより、前記
同様に制限酵素処理をせずに酸化還元酵素遺伝子を含有
する組換えベクターを調製することができる。
オリゴヌクレオチドと含まれていないオリゴヌクレオチ
ドの組合せをプライマーとして用いる場合にも、ＰＣＲ
断片クローニング用ベクターを用いることにより、前記
同様に制限酵素処理をせずに酸化還元酵素遺伝子を含有
する組換えベクターを調製することができる。
【００２４】前記の組換えベクターを、既知の形質転換
法により宿主に導入する。この形質転換は常法（たとえ
ばMethods Enzymol.、第204号、63〜113頁、1991年）に
より、好適に実施することができる。本発明における宿
主細胞としては、前記組換えベクターが複製可能なもの
であれば制限なく使用することができる。宿主細胞の具
体例としては、たとえば大腸菌および酵母のような微生
物、ｓｆ９株のような昆虫細胞、またはＣＯＳ細胞のよ
うな動物細胞などを挙げることができる。具体的には、
大腸菌ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＥＲ２５６６またはＥｐ
ｉｃｕｒｉａｎＣｏｌｉ（登録商標）ＢＬ２１−Ｃｏｄ
ｏｎＰｌｕｓ（商品名）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ
ｓ（商品名、東洋紡績株式会社製）を用いるのが好まし
い。
法により宿主に導入する。この形質転換は常法（たとえ
ばMethods Enzymol.、第204号、63〜113頁、1991年）に
より、好適に実施することができる。本発明における宿
主細胞としては、前記組換えベクターが複製可能なもの
であれば制限なく使用することができる。宿主細胞の具
体例としては、たとえば大腸菌および酵母のような微生
物、ｓｆ９株のような昆虫細胞、またはＣＯＳ細胞のよ
うな動物細胞などを挙げることができる。具体的には、
大腸菌ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＥＲ２５６６またはＥｐ
ｉｃｕｒｉａｎＣｏｌｉ（登録商標）ＢＬ２１−Ｃｏｄ
ｏｎＰｌｕｓ（商品名）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ
ｓ（商品名、東洋紡績株式会社製）を用いるのが好まし
い。
【００２５】次に必要とあれば、かくして得られた形質
転換体に含まれる酸化還元酵素遺伝子の塩基配列および
同遺伝子によってコードされる酸化還元酵素のアミノ酸
配列を適宜決定することができる。具体的には、たとえ
ば形質転換体を培養後、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商品名）
Ｋｉｔ（商品名、アマシャムファルマシアバイオテク社
（amersham pharmacia biotech）製）を用いて、該菌体
からプラスミドＤＮＡを調製し、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ
（商品名） ＢｉｇＤｙｅ（商品名） Ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄ
ｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、ピーイーアプ
ライドバイオシステムズ社）によりその塩基配列を決定
することができる。当該配列決定方法に準拠して、本発
明者らは、バチラス セリウスＩＦＯ３００１、ＩＦＯ
３００３、ＩＦＯ３１３２、ＩＦＯ３５６３、ＩＦＯ１
３５９７、ＩＦＯ１５３０５、ＩＡＭ１０２９およびＩ
ＡＭ１１１０菌株から得た酸化還元酵素遺伝子の塩基配
列を決定し、同時にそれら遺伝子でコードされた酸化還
元酵素がコードするアミノ酸配列を推定した。
転換体に含まれる酸化還元酵素遺伝子の塩基配列および
同遺伝子によってコードされる酸化還元酵素のアミノ酸
配列を適宜決定することができる。具体的には、たとえ
ば形質転換体を培養後、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商品名）
Ｋｉｔ（商品名、アマシャムファルマシアバイオテク社
（amersham pharmacia biotech）製）を用いて、該菌体
からプラスミドＤＮＡを調製し、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ
（商品名） ＢｉｇＤｙｅ（商品名） Ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄ
ｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、ピーイーアプ
ライドバイオシステムズ社）によりその塩基配列を決定
することができる。当該配列決定方法に準拠して、本発
明者らは、バチラス セリウスＩＦＯ３００１、ＩＦＯ
３００３、ＩＦＯ３１３２、ＩＦＯ３５６３、ＩＦＯ１
３５９７、ＩＦＯ１５３０５、ＩＡＭ１０２９およびＩ
ＡＭ１１１０菌株から得た酸化還元酵素遺伝子の塩基配
列を決定し、同時にそれら遺伝子でコードされた酸化還
元酵素がコードするアミノ酸配列を推定した。
【００２６】本発明のさらなる実施態様によれば、本発
明に係る酸化還元酵素は、前記酸化還元酵素遺伝子を含
有する組換えベクターにより形質転換された形質転換体
を培養することによって、工業的に有利に製造すること
ができる。
明に係る酸化還元酵素は、前記酸化還元酵素遺伝子を含
有する組換えベクターにより形質転換された形質転換体
を培養することによって、工業的に有利に製造すること
ができる。
【００２７】当該酵素生産に使用する形質転換体として
は、前記組換えベクターによる形質変換体をそのまま用
いることができる。また、前記組換えベクターの挿入断
片を新たな別の発現ベクターにサブクローニングしても
よいし、あるいは前記組換えベクターを新たな宿主細胞
に導入した形質転換体を用いることもできる。これらの
場合は、適当な宿主細胞とベクターの選択、および使用
方法などは当業者に既知であり、それらの中から本発明
に係る酸化還元酵素遺伝子の発現に適した系を任意に選
択することができる。たとえばベクターと宿主細胞とし
ては、前記遺伝子クローニング工程で例示したものから
選択することができる。
は、前記組換えベクターによる形質変換体をそのまま用
いることができる。また、前記組換えベクターの挿入断
片を新たな別の発現ベクターにサブクローニングしても
よいし、あるいは前記組換えベクターを新たな宿主細胞
に導入した形質転換体を用いることもできる。これらの
場合は、適当な宿主細胞とベクターの選択、および使用
方法などは当業者に既知であり、それらの中から本発明
に係る酸化還元酵素遺伝子の発現に適した系を任意に選
択することができる。たとえばベクターと宿主細胞とし
ては、前記遺伝子クローニング工程で例示したものから
選択することができる。
【００２８】当該形質転換体の培養条件は、宿主細胞に
より適宜選択でき、特定の条件に限定されるわけではな
い。培養は通常この技術分野で用いられる培地および培
養条件下で行うことができる。たとえば炭素源として
は、グルコース、グリセロール、でんぷんなどを、窒素
源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩、トリプト
ン、ペプトンなどを用いることができる。その他微量の
無機金属類、ビタミン類、成長促進因子、たとえばチア
ミン、ビオチンを含む酵母エキスなどを添加してもよ
い。これらの培地成分は本微生物の生育を阻害しない濃
度であればよい。培地は通常ｐＨ７．０〜７．５に調整
し、滅菌して使用する。培養温度の範囲は本微生物が生
育し得る温度であればよく、通常は３０〜３７℃で培養
するのが好ましい。本微生物を液体培養する場合は、振
とう培養または通気撹拌培養が好ましい。培養時間は種
々の培養条件によって異なるが、振とう培養または通気
撹拌培養の場合は１２〜３６時間培養するのが適当であ
る。または、５５０〜６００ｎｍの吸光度が１〜６にな
るまで１５〜３７℃で培養した後、イソプロピルチオガ
ラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えてさらに培養することに
より、酵素の発現を誘導してもよい。
より適宜選択でき、特定の条件に限定されるわけではな
い。培養は通常この技術分野で用いられる培地および培
養条件下で行うことができる。たとえば炭素源として
は、グルコース、グリセロール、でんぷんなどを、窒素
源としては硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸
アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸塩、トリプト
ン、ペプトンなどを用いることができる。その他微量の
無機金属類、ビタミン類、成長促進因子、たとえばチア
ミン、ビオチンを含む酵母エキスなどを添加してもよ
い。これらの培地成分は本微生物の生育を阻害しない濃
度であればよい。培地は通常ｐＨ７．０〜７．５に調整
し、滅菌して使用する。培養温度の範囲は本微生物が生
育し得る温度であればよく、通常は３０〜３７℃で培養
するのが好ましい。本微生物を液体培養する場合は、振
とう培養または通気撹拌培養が好ましい。培養時間は種
々の培養条件によって異なるが、振とう培養または通気
撹拌培養の場合は１２〜３６時間培養するのが適当であ
る。または、５５０〜６００ｎｍの吸光度が１〜６にな
るまで１５〜３７℃で培養した後、イソプロピルチオガ
ラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えてさらに培養することに
より、酵素の発現を誘導してもよい。
【００２９】培養終了後、遠心分離、濾過または共沈な
どの通常の方法によって、培養液から菌体細胞壁などの
不溶物を除去した粗酵素液を得ることができる。あるい
は当業者に公知の手段により、該粗酵素液の濃縮液を得
ることもできる。このようにして得られた粗酵素液は、
さらに硫安分画法、有機溶媒分画法、透析、等電点沈殿
法またはカラムクロマトグラフィーなどの通常の酵素精
製法を単独または組み合わせて用いることにより、精製
することもできる。また、市販のタンパク質精製システ
ム、たとえばＩＭＰＡＣＴ（商品名）−ＣＮ（商品名、
ニューイングランドＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）社
製）、を用いて精製してもよい。
どの通常の方法によって、培養液から菌体細胞壁などの
不溶物を除去した粗酵素液を得ることができる。あるい
は当業者に公知の手段により、該粗酵素液の濃縮液を得
ることもできる。このようにして得られた粗酵素液は、
さらに硫安分画法、有機溶媒分画法、透析、等電点沈殿
法またはカラムクロマトグラフィーなどの通常の酵素精
製法を単独または組み合わせて用いることにより、精製
することもできる。また、市販のタンパク質精製システ
ム、たとえばＩＭＰＡＣＴ（商品名）−ＣＮ（商品名、
ニューイングランドＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）社
製）、を用いて精製してもよい。
【００３０】なお、本発明において、遺伝子増幅に用い
たオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号９に示し
た酸化還元酵素遺伝子の塩基配列をもとにして設定した
ものであり、当該酸化還元酵素遺伝子の塩基配列は、本
発明者らの先願である特願２０００−２５７８２９に記
載のとおり、以下の手順で決定された。
たオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号９に示し
た酸化還元酵素遺伝子の塩基配列をもとにして設定した
ものであり、当該酸化還元酵素遺伝子の塩基配列は、本
発明者らの先願である特願２０００−２５７８２９に記
載のとおり、以下の手順で決定された。
【００３１】すなわち、バチラス セリウスＦＥＲＭ
Ｐ−１４２１０菌株の菌体を溶菌し、公知の方法で染色
体ＤＮＡを回収する。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素
Ｓａｕ３ＡＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動法
により２〜４ｋｂのＤＮＡ断片混合物を得た。当該ＤＮ
Ａ断片は、２つ以上の挿入断片によるライゲーションを
防ぐ目的で、ＤＮＡの突出末端の一部をクレノウフラグ
メント（Klenow fragment）を用いて埋めた。
Ｐ−１４２１０菌株の菌体を溶菌し、公知の方法で染色
体ＤＮＡを回収する。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素
Ｓａｕ３ＡＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動法
により２〜４ｋｂのＤＮＡ断片混合物を得た。当該ＤＮ
Ａ断片は、２つ以上の挿入断片によるライゲーションを
防ぐ目的で、ＤＮＡの突出末端の一部をクレノウフラグ
メント（Klenow fragment）を用いて埋めた。
【００３２】ついで、予め制限酵素ＳａｌＩで完全に消
化しクレノウフラグメントで前処理して得たベクターｐ
ＵＣ１９と前記ＤＮＡ断片混合物とを混合し、公知のラ
イゲーションを行うことにより組換えベクターを得た。
化しクレノウフラグメントで前処理して得たベクターｐ
ＵＣ１９と前記ＤＮＡ断片混合物とを混合し、公知のラ
イゲーションを行うことにより組換えベクターを得た。
【００３３】このようにして得た組換えベクターを、常
法（Methods Enzymol.、第204号、63〜113頁、1991年）
にしたがい大腸菌に形質転換した。
法（Methods Enzymol.、第204号、63〜113頁、1991年）
にしたがい大腸菌に形質転換した。
【００３４】つぎに、ベンジルを含む寒天培地上に形質
転換体のコロニーを形成させ、コロニーの周囲に形成さ
れるハローによって酸化還元酵素遺伝子ＤＮＡを含む形
質転換体を選択した。
転換体のコロニーを形成させ、コロニーの周囲に形成さ
れるハローによって酸化還元酵素遺伝子ＤＮＡを含む形
質転換体を選択した。
【００３５】このようにして選択された形質転換体から
組換えベクター（本発明者らは、当該組換えベクターを
ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１と命名した）を回収し、ついで同ベ
クターに含まれるバチラス セリウス染色体ＤＮＡ断片
の塩基配列を、市販のキットＥＺ：：ＴＮ（商品名）＜
ＫＡＮ−１＞Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、エ
ピセンターテクノロジーズ社（Epicentre Technologies
Corporation）製）を用い、ジデオキシ法で決定した。
組換えベクター（本発明者らは、当該組換えベクターを
ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１と命名した）を回収し、ついで同ベ
クターに含まれるバチラス セリウス染色体ＤＮＡ断片
の塩基配列を、市販のキットＥＺ：：ＴＮ（商品名）＜
ＫＡＮ−１＞Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、エ
ピセンターテクノロジーズ社（Epicentre Technologies
Corporation）製）を用い、ジデオキシ法で決定した。
【００３６】当該塩基配列から考えられる数個のＯＲＦ
それぞれについてのアミノ酸配列を、ＤＤＢＪ／ＥＭＢ
Ｌ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベースのアミノ
酸データベースにおいて既知のアミノ酸配列との相同性
を検索した。その結果、２４９残基からなるアミノ酸配
列が、セピアプテリン還元酵素に類似性を有するバチラ
ス ズブチルスのｙｕｅＤ遺伝子がコードするアミノ酸
配列、およびサッカロミセス セレビシエのＯＲＦ Ｙ
ＩＲ０３６Ｃがコードするアミノ酸配列に対して、それ
ぞれ４０％および３０％の類似性を有するという知見を
得た。一方、前記のキットＥＺ：：ＴＮ（商品名）＜Ｋ
ＡＮ−１＞Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いるトラン
スポゾンの挿入により、前記の２４９アミノ酸残基をコ
ードするＯＲＦ中にトランスポゾンが挿入された場合に
は、ハローが形成されなくなったことから、該ＯＲＦが
目的の酸化還元酵素をコードしていると考えられる。配
列番号９に示した塩基配列は、終止コドンを含めた当該
ＯＲＦの塩基配列を示したものである。
それぞれについてのアミノ酸配列を、ＤＤＢＪ／ＥＭＢ
Ｌ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベースのアミノ
酸データベースにおいて既知のアミノ酸配列との相同性
を検索した。その結果、２４９残基からなるアミノ酸配
列が、セピアプテリン還元酵素に類似性を有するバチラ
ス ズブチルスのｙｕｅＤ遺伝子がコードするアミノ酸
配列、およびサッカロミセス セレビシエのＯＲＦ Ｙ
ＩＲ０３６Ｃがコードするアミノ酸配列に対して、それ
ぞれ４０％および３０％の類似性を有するという知見を
得た。一方、前記のキットＥＺ：：ＴＮ（商品名）＜Ｋ
ＡＮ−１＞Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いるトラン
スポゾンの挿入により、前記の２４９アミノ酸残基をコ
ードするＯＲＦ中にトランスポゾンが挿入された場合に
は、ハローが形成されなくなったことから、該ＯＲＦが
目的の酸化還元酵素をコードしていると考えられる。配
列番号９に示した塩基配列は、終止コドンを含めた当該
ＯＲＦの塩基配列を示したものである。
【００３７】
【実施例】本発明を以下に実施例をあげて説明するが、
本発明は本実施例に限定されるものではない。
本発明は本実施例に限定されるものではない。
【００３８】実施例１
配列番号９の塩基配列における５´および３´末端側の
塩基配列に基づいて、２種のオリゴヌクレオチドを設計
し、亜リン酸−トリエステル法により合成した。合成し
たオリゴヌクレオチドの配列は、５´−ＧＧＣＧＡＡＧ
ＣＴＴＧＣＧＣＴＡＣＧＴＴＡＴＣＡＴＡＡＣＡＧ−３
´（配列番号２）および５´−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡ
ＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＣ−３´（配列番
号４）である。配列番号２に示した塩基配列におけるＡ
ＡＧＣＴＴ、および配列番号４に示した塩基配列におけ
るＧＧＡＴＣＣは、各々制限酵素の認識配列である。
塩基配列に基づいて、２種のオリゴヌクレオチドを設計
し、亜リン酸−トリエステル法により合成した。合成し
たオリゴヌクレオチドの配列は、５´−ＧＧＣＧＡＡＧ
ＣＴＴＧＣＧＣＴＡＣＧＴＴＡＴＣＡＴＡＡＣＡＧ−３
´（配列番号２）および５´−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡ
ＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＡＣ−３´（配列番
号４）である。配列番号２に示した塩基配列におけるＡ
ＡＧＣＴＴ、および配列番号４に示した塩基配列におけ
るＧＧＡＴＣＣは、各々制限酵素の認識配列である。
【００３９】実施例２
（１）酸化還元酵素遺伝子の組換えベクターの調製
ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１により形質転換された大腸菌ＤＨ５
α株を１．５ｍｌのＬＢ培地（培地の組成：トリプトン
１０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５
ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で２４時間振と
う培養した。培養後、菌液を遠心して集菌し、市販のプ
ラスミドＤＮＡ調製キットであるＦｌｅｘｉＰｒｅｐ
（商品名）Ｋｉｔ（商品名、アマシャムファルマシアバ
イオテク社製）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
すなわち、培養後に菌体を回収し、該菌体に溶液Ｉ（１
００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、４００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＩ）２００μｌを
添加し、ボルテックスにて懸濁する。ついで、溶液ＩＩ
（１Ｍ 水酸化ナトリウム、５．３％（重量／容量）Ｓ
ＤＳ）２００μｌを添加し穏かに混和した後、溶液ＩＩ
Ｉ（３Ｍカリウム、５Ｍ酢酸）２００μｌを添加し混和
した。遠心して得た上清に対しイソプロパノール沈澱を
行った後、遠心によりＤＮＡの沈澱を得た。Ｓｅｐｈａ
ｇｌａｓ（商品名）ＦＰ（７Ｍグアニジン−塩酸、５０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）１５０μｌを添加して懸濁し、該ＤＮＡを溶解させ
た。ついで遠心して上清を除き、洗浄緩衝液（２０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０
０ｍＭ塩化ナトリウム、６０％エタノール）２００μｌ
を添加して懸濁し、再び遠心により沈澱を得た。該沈殿
に７０％エタノール３００μｌを添加し、ボルテックス
にて軽く撹拌した。再び遠心して沈澱を得、ボルテック
スにて軽く撹拌し、沈澱を室内で１０分間乾燥させた。
ついで、ＴＥ緩衝液で溶出することによりＤＮＡを回収
し、さらにイソプロパノール沈澱法によりＤＮＡを濃縮
した。
α株を１．５ｍｌのＬＢ培地（培地の組成：トリプトン
１０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５
ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で２４時間振と
う培養した。培養後、菌液を遠心して集菌し、市販のプ
ラスミドＤＮＡ調製キットであるＦｌｅｘｉＰｒｅｐ
（商品名）Ｋｉｔ（商品名、アマシャムファルマシアバ
イオテク社製）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
すなわち、培養後に菌体を回収し、該菌体に溶液Ｉ（１
００ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、４００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＩ）２００μｌを
添加し、ボルテックスにて懸濁する。ついで、溶液ＩＩ
（１Ｍ 水酸化ナトリウム、５．３％（重量／容量）Ｓ
ＤＳ）２００μｌを添加し穏かに混和した後、溶液ＩＩ
Ｉ（３Ｍカリウム、５Ｍ酢酸）２００μｌを添加し混和
した。遠心して得た上清に対しイソプロパノール沈澱を
行った後、遠心によりＤＮＡの沈澱を得た。Ｓｅｐｈａ
ｇｌａｓ（商品名）ＦＰ（７Ｍグアニジン−塩酸、５０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）１５０μｌを添加して懸濁し、該ＤＮＡを溶解させ
た。ついで遠心して上清を除き、洗浄緩衝液（２０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０
０ｍＭ塩化ナトリウム、６０％エタノール）２００μｌ
を添加して懸濁し、再び遠心により沈澱を得た。該沈殿
に７０％エタノール３００μｌを添加し、ボルテックス
にて軽く撹拌した。再び遠心して沈澱を得、ボルテック
スにて軽く撹拌し、沈澱を室内で１０分間乾燥させた。
ついで、ＴＥ緩衝液で溶出することによりＤＮＡを回収
し、さらにイソプロパノール沈澱法によりＤＮＡを濃縮
した。
【００４０】（２）酸化還元酵素遺伝子の増幅および挿
入断片の調製 実施例１において作製した２種のオリゴヌクレオチドを
プライマーとして用い、酸化還元酵素遺伝子を増幅し
た。すなわち、（１）で調製した試料２０ｎｇ、２ｍＭ
のｄＮＴＰ５μｌ、５μＭのプライマー各４μｌ、ＫＯ
Ｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、東洋紡績
株式会社製）２ユニットおよび１０倍濃縮ＫＯＤ ＤＮ
Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ緩衝液５μｌに純水
を加えて全量５０μｌとし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ
は、９４℃で１分間インキュベーションしたのち、９８
℃で１５秒間、６５℃で２秒間および７４℃で３０秒間
を１サイクルとしてこれを５サイクル、さらに９８℃で
１５秒間、６０℃で２秒間および７４℃で３０秒間を１
サイクルとしてこれを１０サイクル、その上さらに９８
℃で１５秒間、５５℃で２秒間および７４℃で３０秒間
を１サイクルとしてこれを１０サイクル行い、最後に７
４℃で３０秒間インキュベーションして実施した。
入断片の調製 実施例１において作製した２種のオリゴヌクレオチドを
プライマーとして用い、酸化還元酵素遺伝子を増幅し
た。すなわち、（１）で調製した試料２０ｎｇ、２ｍＭ
のｄＮＴＰ５μｌ、５μＭのプライマー各４μｌ、ＫＯ
Ｄ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、東洋紡績
株式会社製）２ユニットおよび１０倍濃縮ＫＯＤ ＤＮ
Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＰＣＲ緩衝液５μｌに純水
を加えて全量５０μｌとし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ
は、９４℃で１分間インキュベーションしたのち、９８
℃で１５秒間、６５℃で２秒間および７４℃で３０秒間
を１サイクルとしてこれを５サイクル、さらに９８℃で
１５秒間、６０℃で２秒間および７４℃で３０秒間を１
サイクルとしてこれを１０サイクル、その上さらに９８
℃で１５秒間、５５℃で２秒間および７４℃で３０秒間
を１サイクルとしてこれを１０サイクル行い、最後に７
４℃で３０秒間インキュベーションして実施した。
【００４１】ＰＣＲ終了後、反応液を１．５％のアガロ
ースゲルを用いた電気泳動により展開し、酸化還元酵素
遺伝子のＰＣＲ産物含有画分をゲルから切り出して、Ｐ
ｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ（商品名、バイオラッド社製）によりＰＣＲ産物を
回収した。すなわち、ＤＮＡ断片を含むアガロースゲル
をＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ結合緩衝液１ｍｌに溶解し、
Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅのマトリックス２０μｌにＤＮ
Ａを吸着させた。ついで、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ洗浄
液６００μｌで２回洗浄した後、ＴＥ緩衝液３０μｌ中
で５０℃で５分間インキュベートし、ＤＮＡ断片を溶出
して回収した。
ースゲルを用いた電気泳動により展開し、酸化還元酵素
遺伝子のＰＣＲ産物含有画分をゲルから切り出して、Ｐ
ｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ（商品名、バイオラッド社製）によりＰＣＲ産物を
回収した。すなわち、ＤＮＡ断片を含むアガロースゲル
をＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ結合緩衝液１ｍｌに溶解し、
Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅのマトリックス２０μｌにＤＮ
Ａを吸着させた。ついで、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ洗浄
液６００μｌで２回洗浄した後、ＴＥ緩衝液３０μｌ中
で５０℃で５分間インキュベートし、ＤＮＡ断片を溶出
して回収した。
【００４２】ついで、該ＰＣＲ産物０．５μｇ、制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩを各２０ユニット、およ
び緩衝液（２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．５）、１
００ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ジチオトレイト
ール、６６０ｍＭ 酢酸カリウム）５μｌに純水を加え
て全量５０μｌとする。この反応溶液を３７℃で２時間
インキュベートすることにより、該ＰＣＲ産物を消化し
た。ついで、該ＰＣＲ産物をさらに１．５％のアガロー
スゲルを用いた電気泳動により展開し、目的のＤＮＡ断
片を含む画分をゲルから切りだして、前記Ｐｒｅｐ−Ａ
−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（商品
名、バイオラッド社製）を用いてＤＮＡを精製した。
素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩを各２０ユニット、およ
び緩衝液（２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．５）、１
００ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ジチオトレイト
ール、６６０ｍＭ 酢酸カリウム）５μｌに純水を加え
て全量５０μｌとする。この反応溶液を３７℃で２時間
インキュベートすることにより、該ＰＣＲ産物を消化し
た。ついで、該ＰＣＲ産物をさらに１．５％のアガロー
スゲルを用いた電気泳動により展開し、目的のＤＮＡ断
片を含む画分をゲルから切りだして、前記Ｐｒｅｐ−Ａ
−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（商品
名、バイオラッド社製）を用いてＤＮＡを精製した。
【００４３】（３）ベクターの調製
次に、２μｇのｐＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造株式会社
製）、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを各２
０ユニット、緩衝液（２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
８．５）、１００ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ジ
チオトレイトール、６６０ｍＭ 酢酸カリウム）５μｌ
および大腸菌由来のアルカリホスファターゼ（宝酒造株
式会社製）０．４ユニットに純水を加えて全量５０μｌ
とし、３７℃で２時間反応させることにより該ベクター
を消化した。ついでフェノール処理およびエタノール沈
澱を行い、該ベクターを調製した。
製）、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを各２
０ユニット、緩衝液（２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
８．５）、１００ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ジ
チオトレイトール、６６０ｍＭ 酢酸カリウム）５μｌ
および大腸菌由来のアルカリホスファターゼ（宝酒造株
式会社製）０．４ユニットに純水を加えて全量５０μｌ
とし、３７℃で２時間反応させることにより該ベクター
を消化した。ついでフェノール処理およびエタノール沈
澱を行い、該ベクターを調製した。
【００４４】（４）ＰＣＲ産物とｐＵＣ１９ベクターと
のライゲーション （２）で調製したＰＣＲ産物と（３）で調製したｐＵＣ
１９を２：１のモル比で混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（商品名、宝酒造株式会社
製）の緩衝液ＡをＤＮＡ溶液に対して４倍量添加し、さ
らに酵素液ＢをＤＮＡ溶液と等量添加する。１６℃で１
時間ライゲーションを行い、組換えベクターを得た。
のライゲーション （２）で調製したＰＣＲ産物と（３）で調製したｐＵＣ
１９を２：１のモル比で混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（商品名、宝酒造株式会社
製）の緩衝液ＡをＤＮＡ溶液に対して４倍量添加し、さ
らに酵素液ＢをＤＮＡ溶液と等量添加する。１６℃で１
時間ライゲーションを行い、組換えベクターを得た。
【００４５】（５）酸化還元酵素遺伝子含有形質体の製
法 （４）にて作製した組換えベクターで大腸菌ＤＨ５α株
（ギブコビーアールエルライフテクノロジーズ社（Gibc
oBRL Life Technologies）製）のコンピテント細胞を形
質転換させた（Methods Enzymol.、第２０４号、６３〜
１１３頁、１９９１年）。すなわち、組換えベクターを
含むライゲーション液１０μｌとＤＨ５α株のコンピテ
ント細胞２００μｌとを穏かに混和した後、氷中で３０
分間放置した。ついで、４２℃で６０秒間インキュベー
トし、氷中で１〜２分間冷却して形質転換体を得た。
法 （４）にて作製した組換えベクターで大腸菌ＤＨ５α株
（ギブコビーアールエルライフテクノロジーズ社（Gibc
oBRL Life Technologies）製）のコンピテント細胞を形
質転換させた（Methods Enzymol.、第２０４号、６３〜
１１３頁、１９９１年）。すなわち、組換えベクターを
含むライゲーション液１０μｌとＤＨ５α株のコンピテ
ント細胞２００μｌとを穏かに混和した後、氷中で３０
分間放置した。ついで、４２℃で６０秒間インキュベー
トし、氷中で１〜２分間冷却して形質転換体を得た。
【００４６】（６）酸化還元酵素の製造方法
（５）にて得た形質転換体にＳＯＣ培地（培地組成：ト
リプトン２０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、１０ｍＭ塩
化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化
マグネシウム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、２０ｍＭグ
ルコース）を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベー
トした。インキュベート後、該形質転換体の菌体溶液を
アンピシリン含有ＬＢ寒天培地（培地の組成：トリプト
ン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１
０ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）に蒔き、３７
℃で一晩培養し、酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体の
コロニーを得た。当該コロニーを、アンピシリン含有Ｌ
Ｂ液体培地にて３７℃で一晩振とう培養した。培養後、
遠心して集菌した菌体を超音波で破砕し、再び遠心し
た。上清を硫酸アンモニウムで分画し、タンパク質の含
まれている画分を透析することにより、当該酸化還元酵
素を得た。
リプトン２０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、１０ｍＭ塩
化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化
マグネシウム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、２０ｍＭグ
ルコース）を１ｍｌ加え、３７℃で１時間インキュベー
トした。インキュベート後、該形質転換体の菌体溶液を
アンピシリン含有ＬＢ寒天培地（培地の組成：トリプト
ン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム１
０ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）に蒔き、３７
℃で一晩培養し、酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体の
コロニーを得た。当該コロニーを、アンピシリン含有Ｌ
Ｂ液体培地にて３７℃で一晩振とう培養した。培養後、
遠心して集菌した菌体を超音波で破砕し、再び遠心し
た。上清を硫酸アンモニウムで分画し、タンパク質の含
まれている画分を透析することにより、当該酸化還元酵
素を得た。
【００４７】実施例３
（１）ＩＦＯ３００１菌株の染色体ＤＮＡの調製
バチラス セリウスＩＦＯ３００１菌株のシングルコロ
ニーを、１０ｍｌのＰＮＥ培地（培地の組成：ポリペプ
トン１０ｇ／ｌ、カツオ魚肉エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナ
トリウム２ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）に接種し、３７℃で２
４時間振とう培養した。培養終了後、当該菌体に酵母・
グラム陽性菌用Ｇｅｎとるくん（商品名、宝酒造株式会
社製）を用いて菌体の染色体ＤＮＡを回収した。すなわ
ち、培養終了後、遠心分離により上清を除いて菌体を
得、当該菌体にＧｅｎとるくん（商品名、宝酒造株式会
社製）のＧｅｎＴＬＥ溶液Ｉ１８０μｌを添加後、直ち
に２０秒間ボルテックスにて強く撹拌した。ついで、Ｇ
ｅｎＴＬＥ溶液ＩＩ２０μｌを添加して５秒間ボルテッ
クスにて撹拌し、７０℃で１０〜１５分間インキュベー
トして溶菌させた後、ＧｅｎＴＬＥ溶液ＩＩＩ１００μ
ｌを添加してよく混和した。氷中で５分間放置した後遠
心し、上清を別のチューブに移して等量のイソプロパノ
ールを加え、よく混和した。その後、さらに遠心して上
清を除き、沈殿を７０％エタノールで洗浄し、数秒間軽
く遠心して上清を除いた。沈殿をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
トリス塩酸、１ｍＭ エチレンジニトロロ四酢酸、ｐＨ
７．５）３００μｌに溶解し、７．５Ｍ酢酸アンモニウ
ム１５０μｌとエタノール４５０μｌを加えて混和し、
糸状のＤＮＡ沈殿をピペットチップの先で絡め取り、Ｔ
Ｅ緩衝液３００μｌに溶解した。
ニーを、１０ｍｌのＰＮＥ培地（培地の組成：ポリペプ
トン１０ｇ／ｌ、カツオ魚肉エキス１０ｇ／ｌ、塩化ナ
トリウム２ｇ／ｌ、ｐＨ７．４）に接種し、３７℃で２
４時間振とう培養した。培養終了後、当該菌体に酵母・
グラム陽性菌用Ｇｅｎとるくん（商品名、宝酒造株式会
社製）を用いて菌体の染色体ＤＮＡを回収した。すなわ
ち、培養終了後、遠心分離により上清を除いて菌体を
得、当該菌体にＧｅｎとるくん（商品名、宝酒造株式会
社製）のＧｅｎＴＬＥ溶液Ｉ１８０μｌを添加後、直ち
に２０秒間ボルテックスにて強く撹拌した。ついで、Ｇ
ｅｎＴＬＥ溶液ＩＩ２０μｌを添加して５秒間ボルテッ
クスにて撹拌し、７０℃で１０〜１５分間インキュベー
トして溶菌させた後、ＧｅｎＴＬＥ溶液ＩＩＩ１００μ
ｌを添加してよく混和した。氷中で５分間放置した後遠
心し、上清を別のチューブに移して等量のイソプロパノ
ールを加え、よく混和した。その後、さらに遠心して上
清を除き、沈殿を７０％エタノールで洗浄し、数秒間軽
く遠心して上清を除いた。沈殿をＴＥ緩衝液（１０ｍＭ
トリス塩酸、１ｍＭ エチレンジニトロロ四酢酸、ｐＨ
７．５）３００μｌに溶解し、７．５Ｍ酢酸アンモニウ
ム１５０μｌとエタノール４５０μｌを加えて混和し、
糸状のＤＮＡ沈殿をピペットチップの先で絡め取り、Ｔ
Ｅ緩衝液３００μｌに溶解した。
【００４８】（２）ＰＣＲによる遺伝子の増幅および挿
入断片の調製 実施例１で合成した２種のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用い、ＰＣＲを行った。すなわち、（１）で
調製した染色体ＤＮＡ１μｇ、２．５ｍＭのｄＮＴＰ４
μｌ、５μＭのプライマー各４μｌ、５Ｕ／μｌのＴａ
ＫａＲａ ＥｘＴａｑ（商品名、宝酒造株式会社製）
０．４μｌ、１０倍濃縮Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液１０μｌお
よび１ｍｇ／ｍｌのａｎｔｉ−Ｔａｑ ｈｉｇｈ（商品
名、東洋紡績株式会社製）０．４μｌに純水を加えて全
量１００μｌとし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃
で１分間インキュベーションしたのち、９４℃で１分
間、７２℃で３分間を１サイクルとしてこれを１０サイ
クル、さらに９４℃で１分間、６５℃で２分間および７
２℃で１分間を１サイクルとしてこれを１５サイクル、
その上さらに９４℃で１分間、６０℃で２分間および７
２℃で１分間を１サイクルとしてこれを１０サイクル行
い、最後に７２℃で１分間インキュベーションして実施
した。
入断片の調製 実施例１で合成した２種のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用い、ＰＣＲを行った。すなわち、（１）で
調製した染色体ＤＮＡ１μｇ、２．５ｍＭのｄＮＴＰ４
μｌ、５μＭのプライマー各４μｌ、５Ｕ／μｌのＴａ
ＫａＲａ ＥｘＴａｑ（商品名、宝酒造株式会社製）
０．４μｌ、１０倍濃縮Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液１０μｌお
よび１ｍｇ／ｍｌのａｎｔｉ−Ｔａｑ ｈｉｇｈ（商品
名、東洋紡績株式会社製）０．４μｌに純水を加えて全
量１００μｌとし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃
で１分間インキュベーションしたのち、９４℃で１分
間、７２℃で３分間を１サイクルとしてこれを１０サイ
クル、さらに９４℃で１分間、６５℃で２分間および７
２℃で１分間を１サイクルとしてこれを１５サイクル、
その上さらに９４℃で１分間、６０℃で２分間および７
２℃で１分間を１サイクルとしてこれを１０サイクル行
い、最後に７２℃で１分間インキュベーションして実施
した。
【００４９】（３）組換えべクターの作製
ｐＵＣ１９（宝酒造株式会社製）を実施例２（３）と同
様に処理し、ベクターを調製した。ついで、（２）にて
得られたＰＣＲ産物と該ｐＵＣ１９を２：１のモル比で
混合し、該ＤＮＡ溶液の半分量のＬｉｇｔｉｏｎ ｈｉ
ｇｈ（商品名、東洋紡績株式会社製）を加え、１６度に
てライゲーションすることにより、組換えベクターを得
た。
様に処理し、ベクターを調製した。ついで、（２）にて
得られたＰＣＲ産物と該ｐＵＣ１９を２：１のモル比で
混合し、該ＤＮＡ溶液の半分量のＬｉｇｔｉｏｎ ｈｉ
ｇｈ（商品名、東洋紡績株式会社製）を加え、１６度に
てライゲーションすることにより、組換えベクターを得
た。
【００５０】（４）形質転換体の作製およびＰＣＲ産物
の塩基配列決定 組換えベクターとして（３）にて作製した組換えベクタ
ーを用いたほかは実施例２（５）と同様にして、形質転
換体を得た。当該形質転換体にＳＯＣ培地を１ｍｌ加
え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベー
ト後、該形質転換体の菌体溶液をアンピシリン含有ＬＢ
寒天培地に蒔いて、３７℃で一晩培養し、酸化還元酵素
遺伝子含有形質転換体のコロニーを得た。ついで、当該
コロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃で
一晩振とう培養した。培養後、遠心操作により菌体を回
収した。ついで、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商品名）Ｋｉｔ
（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、菌
体として当該菌体を用いたほかは実施例２（１）と同様
にして、該菌体からプラスミドＤＮＡを調製した。
の塩基配列決定 組換えベクターとして（３）にて作製した組換えベクタ
ーを用いたほかは実施例２（５）と同様にして、形質転
換体を得た。当該形質転換体にＳＯＣ培地を１ｍｌ加
え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベー
ト後、該形質転換体の菌体溶液をアンピシリン含有ＬＢ
寒天培地に蒔いて、３７℃で一晩培養し、酸化還元酵素
遺伝子含有形質転換体のコロニーを得た。ついで、当該
コロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃で
一晩振とう培養した。培養後、遠心操作により菌体を回
収した。ついで、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商品名）Ｋｉｔ
（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用い、菌
体として当該菌体を用いたほかは実施例２（１）と同様
にして、該菌体からプラスミドＤＮＡを調製した。
【００５１】該遺伝子の塩基配列は、Ｍ１３ Ｐｒｉｍ
ｅｒ ＲＶ（商品名、宝酒造株式会社製）およびＡＢＩ
ＰＲＩＺＭ（商品名） ＢｉｇＤｙｅ（商品名） Ｔ
ｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、
ピーイーアプライドバイオシステムズ社製）を用いたジ
デオキシ法により、当該遺伝子の５´側から決定した。
また、Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（商品名、宝酒造株
式会社製）および該キットを用いたジデオキシ法によ
り、当該遺伝子の３´側からも塩基配列を決定した。そ
の結果、これら両側から決定した塩基配列は同じである
ことを確認した。
ｅｒ ＲＶ（商品名、宝酒造株式会社製）およびＡＢＩ
ＰＲＩＺＭ（商品名） ＢｉｇＤｙｅ（商品名） Ｔ
ｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名、
ピーイーアプライドバイオシステムズ社製）を用いたジ
デオキシ法により、当該遺伝子の５´側から決定した。
また、Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（商品名、宝酒造株
式会社製）および該キットを用いたジデオキシ法によ
り、当該遺伝子の３´側からも塩基配列を決定した。そ
の結果、これら両側から決定した塩基配列は同じである
ことを確認した。
【００５２】ＩＦＯ３００１株におけるＰＣＲ産物の塩
基配列は７５０ｂｐであった。ＩＦＯ３００１株由来の
塩基配列を配列番号５に、また推定アミノ酸配列を配列
番号６に示す。
基配列は７５０ｂｐであった。ＩＦＯ３００１株由来の
塩基配列を配列番号５に、また推定アミノ酸配列を配列
番号６に示す。
【００５３】実施例４
（１）ＩＦＯ１５３０５菌株の染色体ＤＮＡの調製
バチラス セリウスＩＦＯ１５３０５を菌株として用い
たほかは実施例３（１）と同様にして、菌体の染色体Ｄ
ＮＡを調製した。
たほかは実施例３（１）と同様にして、菌体の染色体Ｄ
ＮＡを調製した。
【００５４】（２）ＰＣＲによる遺伝子の増幅および挿
入断片の調製 （１）で調製した染色体ＤＮＡ１μｇを試料として用い
たほかは実施例２（２）と同様にして、制限酵素処理さ
れたＰＣＲ産物を得た。
入断片の調製 （１）で調製した染色体ＤＮＡ１μｇを試料として用い
たほかは実施例２（２）と同様にして、制限酵素処理さ
れたＰＣＲ産物を得た。
【００５５】（３）組換えべクターの作製
ｐＵＣ１９を実施例２（３）と同様に処理し、ベクター
を調製した。ついで、（２）にて得られたＰＣＲ産物を
ＰＣＲ産物として用いたほかは実施例２（４）と同様に
ライゲーションし、組換えベクターを得た。
を調製した。ついで、（２）にて得られたＰＣＲ産物を
ＰＣＲ産物として用いたほかは実施例２（４）と同様に
ライゲーションし、組換えベクターを得た。
【００５６】（４）形質転換体の作製およびＰＣＲ産物
の塩基配列決定 （３）にて得られた組換えベクターを組換えベクターと
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、形質転
換体を作製した。また、当該形質転換体を形質転換体と
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、ＰＣＲ
産物の塩基配列を決定した。
の塩基配列決定 （３）にて得られた組換えベクターを組換えベクターと
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、形質転
換体を作製した。また、当該形質転換体を形質転換体と
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、ＰＣＲ
産物の塩基配列を決定した。
【００５７】その結果、ＩＦＯ１５３０５株におけるＰ
ＣＲ産物の塩基配列は７５０ｂｐであることが判明し
た。ＩＦＯ１５３０５株由来の塩基配列を配列番号７
に、また推定アミノ酸配列を配列番号８に示す。
ＣＲ産物の塩基配列は７５０ｂｐであることが判明し
た。ＩＦＯ１５３０５株由来の塩基配列を配列番号７
に、また推定アミノ酸配列を配列番号８に示す。
【００５８】実施例５〜７
（１）菌株の染色体ＤＮＡの調製
バチラス セリウスＩＦＯ３００３、ＩＦＯ３５６３ま
たはＩＦＯ１３５９７を菌株として用いたほかは実施例
３（１）と同様にして、菌体の染色体ＤＮＡを調製し
た。
たはＩＦＯ１３５９７を菌株として用いたほかは実施例
３（１）と同様にして、菌体の染色体ＤＮＡを調製し
た。
【００５９】（２）ＰＣＲによる遺伝子の増幅および挿
入断片の調製 （１）で調製した染色体ＤＮＡ１μｇを試料として用い
たほかは実施例２（２）と同様の操作をそれぞれに対し
て行い、制限酵素処理されたＰＣＲ産物を得た。
入断片の調製 （１）で調製した染色体ＤＮＡ１μｇを試料として用い
たほかは実施例２（２）と同様の操作をそれぞれに対し
て行い、制限酵素処理されたＰＣＲ産物を得た。
【００６０】（３）組換えべクターの作製
ｐＵＣ１９を実施例２（３）と同様に処理し、ベクター
を調製した。ついで、（２）にて得られたＰＣＲ産物を
ＰＣＲ産物として用いたほかは実施例２（４）と同様に
ライゲーションし、それぞれの組換えベクターを得た。
を調製した。ついで、（２）にて得られたＰＣＲ産物を
ＰＣＲ産物として用いたほかは実施例２（４）と同様に
ライゲーションし、それぞれの組換えベクターを得た。
【００６１】（４）形質転換体の作製およびＰＣＲ産物
の塩基配列決定 （３）にて得られた組換えベクターを組換えベクターと
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、それぞ
れの形質転換体を作製した。また、当該形質転換体を形
質転換体として用いたほかは実施例３（４）と同様にし
て、それぞれのＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
の塩基配列決定 （３）にて得られた組換えベクターを組換えベクターと
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、それぞ
れの形質転換体を作製した。また、当該形質転換体を形
質転換体として用いたほかは実施例３（４）と同様にし
て、それぞれのＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
【００６２】ＩＦＯ３００３の塩基配列を配列番号１
０、ＩＦＯ３５６３の塩基配列を配列番号１２およびＩ
ＦＯ１３５９７の塩基配列を配列番号１４に示す。ま
た、ＩＦＯ３００３の推定アミノ酸配列を配列番号１
１、ＩＦＯ３５６３の推定アミノ酸配列を配列番号１３
およびＩＦＯ１３５９７の推定アミノ酸配列を配列番号
１５に示す。
０、ＩＦＯ３５６３の塩基配列を配列番号１２およびＩ
ＦＯ１３５９７の塩基配列を配列番号１４に示す。ま
た、ＩＦＯ３００３の推定アミノ酸配列を配列番号１
１、ＩＦＯ３５６３の推定アミノ酸配列を配列番号１３
およびＩＦＯ１３５９７の推定アミノ酸配列を配列番号
１５に示す。
【００６３】実施例８
（１）ＩＡＭ１０２９菌株の染色体ＤＮＡの調製
バチラス セリウスＩＡＭ１０２９を菌株として用いた
ほかは実施例３（１）と同様にして、菌体の染色体ＤＮ
Ａを調製した。
ほかは実施例３（１）と同様にして、菌体の染色体ＤＮ
Ａを調製した。
【００６４】（２）ＰＣＲによる遺伝子の増幅および挿
入断片の調製 実施例１において作製した２種のオリゴヌクレオチドを
用い、酸化還元酵素遺伝子を増幅した。すなわち、
（１）で調製した試料２μｇ、２ｍＭのｄＮＴＰ５μ
ｌ、５μＭのプライマー各５μｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、東洋紡績株式
会社製）１ユニット、２５ｍＭの硫酸マグネシウム２μ
ｌおよびＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅの１０倍濃縮緩衝液５μｌに純水を加えて全量５０
μｌとし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で２分間
インキュベーションしたのち、９４℃で１５秒間、６０
℃で３０秒間および６８℃で１分間を１サイクルとして
これを１０サイクル、さらに９４℃で１５秒間、５５℃
で２０秒間および６８℃で１分間を１サイクルとしてこ
れを１０サイクル、その上さらに９４℃で１５秒間、５
０℃で１０秒間および６８℃で１分間を１サイクルとし
てこれを１０サイクル行い、最後に６８℃で１分間イン
キュベーションして実施した。
入断片の調製 実施例１において作製した２種のオリゴヌクレオチドを
用い、酸化還元酵素遺伝子を増幅した。すなわち、
（１）で調製した試料２μｇ、２ｍＭのｄＮＴＰ５μ
ｌ、５μＭのプライマー各５μｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、東洋紡績株式
会社製）１ユニット、２５ｍＭの硫酸マグネシウム２μ
ｌおよびＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅの１０倍濃縮緩衝液５μｌに純水を加えて全量５０
μｌとし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で２分間
インキュベーションしたのち、９４℃で１５秒間、６０
℃で３０秒間および６８℃で１分間を１サイクルとして
これを１０サイクル、さらに９４℃で１５秒間、５５℃
で２０秒間および６８℃で１分間を１サイクルとしてこ
れを１０サイクル、その上さらに９４℃で１５秒間、５
０℃で１０秒間および６８℃で１分間を１サイクルとし
てこれを１０サイクル行い、最後に６８℃で１分間イン
キュベーションして実施した。
【００６５】（３）組換えべクターの作製
ｐＵＣ１９を実施例２（３）と同様に処理し、ベクター
を調製した。ついで、（２）にて得られたＰＣＲ産物を
ＰＣＲ産物として用いたほかは実施例２（４）と同様に
ライゲーションすることにより、組換えベクターを得
た。
を調製した。ついで、（２）にて得られたＰＣＲ産物を
ＰＣＲ産物として用いたほかは実施例２（４）と同様に
ライゲーションすることにより、組換えベクターを得
た。
【００６６】（４）形質転換体の作製およびＰＣＲ産物
の塩基配列決定 （３）にて得られた組換えベクターを組換えベクターと
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、形質転
換体を作製した。また、当該形質転換体を形質転換体と
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、ＰＣＲ
産物の塩基配列を決定した。
の塩基配列決定 （３）にて得られた組換えベクターを組換えベクターと
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、形質転
換体を作製した。また、当該形質転換体を形質転換体と
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、ＰＣＲ
産物の塩基配列を決定した。
【００６７】ＩＡＭ１０２９の塩基配列を配列番号１６
に、推定アミノ酸配列を配列番号１７に示す。
に、推定アミノ酸配列を配列番号１７に示す。
【００６８】実施例９
（１）菌株の染色体ＤＮＡの調製
バチラス セリウスＩＦＯ３１３２を菌株として用いた
ほかは実施例３（１）と同様にして、菌体の染色体ＤＮ
Ａを調製した。
ほかは実施例３（１）と同様にして、菌体の染色体ＤＮ
Ａを調製した。
【００６９】（２）ＰＣＲによる遺伝子の増幅および挿
入断片の調製 実施例１において作製した２種のオリゴヌクレオチドを
用い、酸化還元酵素遺伝子を増幅した。すなわち、
（１）で調製した試料１μｇ、２．５ｍＭのｄＮＴＰ４
μｌ、１０μＭのプライマー各５μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓ
ｔ（商品名）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、宝
酒造株式会社製）１．２５ユニットおよびＰｙｒｏｂｅ
ｓｔ（商品名）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの１０倍
緩衝液１０μｌに純水を加えて全量１００μｌとし、Ｐ
ＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間インキュベー
ションしたのち、９４℃で１分間および７２℃で３分間
を１サイクルとしてこれを１０サイクル、さらに９４℃
で１分間、６５℃で２分間および７２℃で１分間を１サ
イクルとしてこれを１５サイクル、その上さらに９４℃
で１分間、６０℃で２分間および７２℃で１分間を１サ
イクルとしてこれを１０サイクル行い、最後に７２℃で
１分間インキュベーションして実施した。
入断片の調製 実施例１において作製した２種のオリゴヌクレオチドを
用い、酸化還元酵素遺伝子を増幅した。すなわち、
（１）で調製した試料１μｇ、２．５ｍＭのｄＮＴＰ４
μｌ、１０μＭのプライマー各５μｌ、Ｐｙｒｏｂｅｓ
ｔ（商品名）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名、宝
酒造株式会社製）１．２５ユニットおよびＰｙｒｏｂｅ
ｓｔ（商品名）ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの１０倍
緩衝液１０μｌに純水を加えて全量１００μｌとし、Ｐ
ＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分間インキュベー
ションしたのち、９４℃で１分間および７２℃で３分間
を１サイクルとしてこれを１０サイクル、さらに９４℃
で１分間、６５℃で２分間および７２℃で１分間を１サ
イクルとしてこれを１５サイクル、その上さらに９４℃
で１分間、６０℃で２分間および７２℃で１分間を１サ
イクルとしてこれを１０サイクル行い、最後に７２℃で
１分間インキュベーションして実施した。
【００７０】（３）組換えべクターの作製
ｐＵＣ１９を実施例２（３）と同様に処理し、ベクター
を調製した。（２）記載のＰＣＲ産物をＰＣＲ産物とし
て用いたほかは実施例２（４）と同様にライゲーション
することにより、組換えベクターを得た。
を調製した。（２）記載のＰＣＲ産物をＰＣＲ産物とし
て用いたほかは実施例２（４）と同様にライゲーション
することにより、組換えベクターを得た。
【００７１】（４）形質転換体の作製およびＰＣＲ産物
の塩基配列決定 （３）にて得られた組換えベクターを組換えベクターと
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、形質転
換体を作製した。また、当該形質転換体を形質転換体と
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、ＰＣＲ
産物の塩基配列を決定した。
の塩基配列決定 （３）にて得られた組換えベクターを組換えベクターと
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、形質転
換体を作製した。また、当該形質転換体を形質転換体と
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、ＰＣＲ
産物の塩基配列を決定した。
【００７２】ＩＦＯ３１３２の塩基配列を配列番号１８
に、推定アミノ酸配列を配列番号１９に示す。
に、推定アミノ酸配列を配列番号１９に示す。
【００７３】実施例１０
（１）ＩＡＭ１１１０菌株の染色体ＤＮＡの調製
バチラス セリウスＩＡＭ１１１０を菌株として用いた
ほかは実施例３（１）と同様にして、菌体の染色体ＤＮ
Ａを調製した。
ほかは実施例３（１）と同様にして、菌体の染色体ＤＮ
Ａを調製した。
【００７４】（２）ＰＣＲによる遺伝子の増幅および挿
入断片の調製 （１）で調製した染色体ＤＮＡ１μｇを試料として用い
たほかは実施例１５（２）と同様の操作をそれぞれに対
して行い、制限酵素処理されたＰＣＲ産物を得た。
入断片の調製 （１）で調製した染色体ＤＮＡ１μｇを試料として用い
たほかは実施例１５（２）と同様の操作をそれぞれに対
して行い、制限酵素処理されたＰＣＲ産物を得た。
【００７５】（３）組換えべクターの作製
ｐＵＣ１９を実施例２（３）と同様に処理し、ベクター
を調製した。ついで、（２）にて得られたＰＣＲ産物を
ＰＣＲ産物として用いたほかは実施例２（４）と同様に
ライゲーションし、それぞれの組換えベクターを得た。
を調製した。ついで、（２）にて得られたＰＣＲ産物を
ＰＣＲ産物として用いたほかは実施例２（４）と同様に
ライゲーションし、それぞれの組換えベクターを得た。
【００７６】（４）形質転換体の作製およびＰＣＲ産物
の塩基配列決定 （３）にて得られた組換えベクターを組換えベクターと
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、それぞ
れの形質転換体を作製した。また、当該形質転換体を形
質転換体として用いたほかは実施例３（４）と同様にし
て、ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
の塩基配列決定 （３）にて得られた組換えベクターを組換えベクターと
して用いたほかは実施例３（４）と同様にして、それぞ
れの形質転換体を作製した。また、当該形質転換体を形
質転換体として用いたほかは実施例３（４）と同様にし
て、ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。
【００７７】ＩＡＭ１１１０の塩基配列を配列番号２０
に、推定アミノ酸配列を配列番号２１に示す。
に、推定アミノ酸配列を配列番号２１に示す。
【００７８】実施例１１
（１）オリゴヌクレオチドの合成
公知の亜リン酸−トリエステル法により、２種のオリゴ
ヌクレオチドを合成した。合成したオリゴヌクレオチド
の配列はＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡＣＡＴＧ
ＣＧＣＴＡＣＧＴＴＡＴＣＡＴＡＡＣ（配列番号２２）
およびＣＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴ
ＣＴＡＡＴＡＡＣ（配列番号２３）である。配列番号２
２におけるＧＣＴＣＴＴＣ、および配列番号２３におけ
るＣＴＧＣＡＧは、各々制限酵素の識別配列である。
ヌクレオチドを合成した。合成したオリゴヌクレオチド
の配列はＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡＣＡＴＧ
ＣＧＣＴＡＣＧＴＴＡＴＣＡＴＡＡＣ（配列番号２２）
およびＣＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴ
ＣＴＡＡＴＡＡＣ（配列番号２３）である。配列番号２
２におけるＧＣＴＣＴＴＣ、および配列番号２３におけ
るＣＴＧＣＡＧは、各々制限酵素の識別配列である。
【００７９】（２）酸化還元酵素遺伝子の増幅
（１）で作製した２種類のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いたほかは実施例２（２）と同様にして、
ＰＣＲを行った。ついで、当該ＰＣＲ産物をＰＣＲ産物
として用いたほかは実施例２（２）と同様にして、ＰＣ
Ｒ産物を回収した。当該ＰＣＲ産物０．５μｇ、Ｐｓｔ
Ｉ １０ユニットおよびＮＥＢｕｆｆｅｒ３（商品名、
ニューイングランドＢｉｏＬａｂｓ社製）（１Ｍ 塩化
ナトリウム、５００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．９）、
１００ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭ ジチオトレ
イトール）５μｌに純水を加えて全量５０μｌとした。
該反応溶液を３７℃で２時間インキュベートすることに
より、該ＰＣＲ産物を消化した。制限酵素処理後、該Ｐ
ＣＲ産物をフェノール抽出法およびエタノール沈澱法に
より精製して回収した。回収したＰＣＲ産物に、Ｓａｐ
Ｉ ９ユニットおよびＮＥＢｕｆｆｅｒ４（商品名、ニ
ューイングランドＢｉｏＬａｂｓ社製）（５００ｍＭ
酢酸カリウム、２００ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ７．
９）、１００ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭ ジチオ
トレイトール）５μｌを加え、さらに純水を加えて全量
５０μｌとした。該反応溶液を３７℃で２時間インキュ
ベートすることにより、該ＰＣＲ産物を消化した。Ｓａ
ｐＩによる制限酵素処理後、該反応液を１．５％のアガ
ロースゲルを用いた電気泳動により展開し、目的のＤＮ
Ａ断片を含む画分をゲルから切りだした。ついで、当該
画分を用いたほかは実施例２（２）と同様にして、Ｐｒ
ｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ（商品名、バイオラッド社製）により、ＤＮＡを精製
した。
マーとして用いたほかは実施例２（２）と同様にして、
ＰＣＲを行った。ついで、当該ＰＣＲ産物をＰＣＲ産物
として用いたほかは実施例２（２）と同様にして、ＰＣ
Ｒ産物を回収した。当該ＰＣＲ産物０．５μｇ、Ｐｓｔ
Ｉ １０ユニットおよびＮＥＢｕｆｆｅｒ３（商品名、
ニューイングランドＢｉｏＬａｂｓ社製）（１Ｍ 塩化
ナトリウム、５００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．９）、
１００ｍＭ 塩化マグネシウム、１０ｍＭ ジチオトレ
イトール）５μｌに純水を加えて全量５０μｌとした。
該反応溶液を３７℃で２時間インキュベートすることに
より、該ＰＣＲ産物を消化した。制限酵素処理後、該Ｐ
ＣＲ産物をフェノール抽出法およびエタノール沈澱法に
より精製して回収した。回収したＰＣＲ産物に、Ｓａｐ
Ｉ ９ユニットおよびＮＥＢｕｆｆｅｒ４（商品名、ニ
ューイングランドＢｉｏＬａｂｓ社製）（５００ｍＭ
酢酸カリウム、２００ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ７．
９）、１００ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭ ジチオ
トレイトール）５μｌを加え、さらに純水を加えて全量
５０μｌとした。該反応溶液を３７℃で２時間インキュ
ベートすることにより、該ＰＣＲ産物を消化した。Ｓａ
ｐＩによる制限酵素処理後、該反応液を１．５％のアガ
ロースゲルを用いた電気泳動により展開し、目的のＤＮ
Ａ断片を含む画分をゲルから切りだした。ついで、当該
画分を用いたほかは実施例２（２）と同様にして、Ｐｒ
ｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ（商品名、バイオラッド社製）により、ＤＮＡを精製
した。
【００８０】（３）ベクターの調製
（２）のＰＣＲ産物０．５μｇのかわりにＩＭＰＡＣＴ
（商品名）−ＣＮ（ニューイングランドＢｉｏＬａｂｓ
（登録商標）社製）キット中のｐＴＹＢ−１１ベクター
２μｇを用いたほかは(２）と同様にして、該ベクター
を消化した。当該反応液をアガロースゲルを用いた電気
泳動により展開し、目的のＤＮＡ断片を含む画分をゲル
から切りだした。ついで、当該画分を用いたほかは実施
例２（２）と同様にして、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ Ｄ
ＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（商品名、バイオラッ
ド社製）により、当該ベクターを調製した。
（商品名）−ＣＮ（ニューイングランドＢｉｏＬａｂｓ
（登録商標）社製）キット中のｐＴＹＢ−１１ベクター
２μｇを用いたほかは(２）と同様にして、該ベクター
を消化した。当該反応液をアガロースゲルを用いた電気
泳動により展開し、目的のＤＮＡ断片を含む画分をゲル
から切りだした。ついで、当該画分を用いたほかは実施
例２（２）と同様にして、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ Ｄ
ＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（商品名、バイオラッ
ド社製）により、当該ベクターを調製した。
【００８１】（４）形質転換体の作製
ＰＣＲ産物として（２）で調製したＰＣＲ産物を、また
ベクターとして（３）で調製したｐＴＹＢ−１１ベクタ
ーを用いたほかは実施例２（４）と同様にしてライゲー
ションを行い、組換えベクターを得た。つぎに、当該組
換えベクターを組換えベクターとして、またＩＭＰＡＣ
Ｔ（商品名）−ＣＮキット中の大腸菌ＥＲ２５６６株を
宿主として用いたほかは実施例２（５）と同様にして、
形質転換体を得た。該形質転換体にＳＯＣ培地を１ｍｌ
加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベ
ート後、該形質転換体の菌体溶液をアンピシリン含有Ｌ
Ｂ寒天培地に蒔き、３７℃で一晩培養し、酸化還元酵素
遺伝子含有形質転換体のコロニーを得た。ついで、６０
０ｎｍの吸光度が５になるまで、当該コロニーをアンピ
シリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃で振とう培養した。
培養後、集めた菌体を超音波で破砕し、再び遠心して上
清を得た。ついで、キチンアフィニティーカラム（ニュ
ーイングランドＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）社製）をカ
ラム緩衝液（２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、５
００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジニトロロ
四酢酸）で平衡化し、該上清をカラムにかけ、カラム内
でインテイン−キチン複合体を形成させた。ついでカラ
ム緩衝液により洗浄した後、インテインの自己スプラシ
ングを誘導するための３０ｍＭジチオトレイトールを含
む緩衝液（２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０
０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ エチレンジニトロロ
四酢酸、５０ｍＭ ジチオトレイトール）中で４℃で一
晩インキュベートすることにより、酸化還元酵素のタン
パク質をインテインから切り離した。翌日、酵素タンパ
ク質のみを溶出し、精製タンパク質を得た。
ベクターとして（３）で調製したｐＴＹＢ−１１ベクタ
ーを用いたほかは実施例２（４）と同様にしてライゲー
ションを行い、組換えベクターを得た。つぎに、当該組
換えベクターを組換えベクターとして、またＩＭＰＡＣ
Ｔ（商品名）−ＣＮキット中の大腸菌ＥＲ２５６６株を
宿主として用いたほかは実施例２（５）と同様にして、
形質転換体を得た。該形質転換体にＳＯＣ培地を１ｍｌ
加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベ
ート後、該形質転換体の菌体溶液をアンピシリン含有Ｌ
Ｂ寒天培地に蒔き、３７℃で一晩培養し、酸化還元酵素
遺伝子含有形質転換体のコロニーを得た。ついで、６０
０ｎｍの吸光度が５になるまで、当該コロニーをアンピ
シリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃で振とう培養した。
培養後、集めた菌体を超音波で破砕し、再び遠心して上
清を得た。ついで、キチンアフィニティーカラム（ニュ
ーイングランドＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）社製）をカ
ラム緩衝液（２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、５
００ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジニトロロ
四酢酸）で平衡化し、該上清をカラムにかけ、カラム内
でインテイン−キチン複合体を形成させた。ついでカラ
ム緩衝液により洗浄した後、インテインの自己スプラシ
ングを誘導するための３０ｍＭジチオトレイトールを含
む緩衝液（２０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０
０ｍＭ 塩化ナトリウム、１ｍＭ エチレンジニトロロ
四酢酸、５０ｍＭ ジチオトレイトール）中で４℃で一
晩インキュベートすることにより、酸化還元酵素のタン
パク質をインテインから切り離した。翌日、酵素タンパ
ク質のみを溶出し、精製タンパク質を得た。
【００８２】実施例１２
実施例２（５）にて得た形質転換体を、アンピシリン含
有ＬＢ液体培地２００ｍｌに接種し、６００ｎｍの吸光
度が５になるまで３７℃で培養した。ついで、イソプロ
ピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）および基質のベンジ
ルを、最終濃度が各々０．５ｍＭおよび１ｍＭとなるよ
うに添加した後、さらに３７℃で２４時間培養した。培
養終了後、培養液に酢酸エチル４０ｍｌを加えて撹拌
し、遠心により酢酸エチルの層を分離した。当該操作を
さらに２回繰り返し、得られた酢酸エチル層１２０ｍｌ
を濃縮した。得られた生成物を、ヘキサン：エーテル：
酢酸（容量比４５：５：１）を展開溶媒としたシリカゲ
ルのカラムにかけて、ベンゾインの画分を分取した。さ
らに、逆層高速液体クロマトグラフィーにかけ、ベンゾ
インを高度に精製した。収率は８０％、光学純度は８８
％ｅｅであった。
有ＬＢ液体培地２００ｍｌに接種し、６００ｎｍの吸光
度が５になるまで３７℃で培養した。ついで、イソプロ
ピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）および基質のベンジ
ルを、最終濃度が各々０．５ｍＭおよび１ｍＭとなるよ
うに添加した後、さらに３７℃で２４時間培養した。培
養終了後、培養液に酢酸エチル４０ｍｌを加えて撹拌
し、遠心により酢酸エチルの層を分離した。当該操作を
さらに２回繰り返し、得られた酢酸エチル層１２０ｍｌ
を濃縮した。得られた生成物を、ヘキサン：エーテル：
酢酸（容量比４５：５：１）を展開溶媒としたシリカゲ
ルのカラムにかけて、ベンゾインの画分を分取した。さ
らに、逆層高速液体クロマトグラフィーにかけ、ベンゾ
インを高度に精製した。収率は８０％、光学純度は８８
％ｅｅであった。
【００８３】参考例１
（１）菌体からの染色体ＤＮＡ回収方法
バチラス セリウスＦＥＲＭ Ｐ−１４２１０菌株のシ
ングルコロニーを１０ｍｌのＰＮＥ培地に接種し、３７
℃で２４時間振とう培養した。培養終了後、当該菌体に
Ｇｅｎとるくん（商品名、宝酒造株式会社製）を用いて
染色体ＤＮＡを回収した。回収した染色体ＤＮＡは、３
００μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。得られたＤＮＡ量
は、数回分を合わせて２２０μｇであった。
ングルコロニーを１０ｍｌのＰＮＥ培地に接種し、３７
℃で２４時間振とう培養した。培養終了後、当該菌体に
Ｇｅｎとるくん（商品名、宝酒造株式会社製）を用いて
染色体ＤＮＡを回収した。回収した染色体ＤＮＡは、３
００μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。得られたＤＮＡ量
は、数回分を合わせて２２０μｇであった。
【００８４】（２）染色体ＤＮＡ挿入断片の調製
（１）で調製した染色体ＤＮＡに、制限酵素Ｓａｕ３Ａ
Ｉ（宝酒造株式会社製）を作用させることにより、該染
色体ＤＮＡを部分消化した。ついで、部分消化した反応
液のフェノール抽出後、イソプロパノール沈澱を２回行
って、ＤＮＡ断片を純化した。
Ｉ（宝酒造株式会社製）を作用させることにより、該染
色体ＤＮＡを部分消化した。ついで、部分消化した反応
液のフェノール抽出後、イソプロパノール沈澱を２回行
って、ＤＮＡ断片を純化した。
【００８５】前記の方法で得たＤＮＡ断片に、クレノウ
フラグメント（宝酒造株式会社製）を作用させて、Ｓａ
ｕ３ＡＩによる消化で生じた５´突出末端の半分を埋め
た。したがって該染色体ＤＮＡ断片においては、ＧＡが
５´突出末端となる。ついで、該ＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動することにより、２〜４ｋｂのＤＮＡ断
片を含む画分をゲルから切り出して、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇ
ｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（商品名、
バイオラッド社製）によりＤＮＡ断片を回収した。
フラグメント（宝酒造株式会社製）を作用させて、Ｓａ
ｕ３ＡＩによる消化で生じた５´突出末端の半分を埋め
た。したがって該染色体ＤＮＡ断片においては、ＧＡが
５´突出末端となる。ついで、該ＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動することにより、２〜４ｋｂのＤＮＡ断
片を含む画分をゲルから切り出して、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇ
ｅｎｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（商品名、
バイオラッド社製）によりＤＮＡ断片を回収した。
【００８６】（３）ベクターの調製
次に、ｐＵＣ１９ＤＮＡ（宝酒造株式会社製）に、制限
酵素ＳａｌＩ（宝酒造株式会社製）作用させることによ
り該ベクターを消化した。ついで、該ベクターにクレノ
ウフラグメントを作用させ、ＳａｌＩによる消化で生じ
た５´突出末端の半分を埋めた。したがって該ｐＵＣ１
９における５´突出末端は、ＴＣである。
酵素ＳａｌＩ（宝酒造株式会社製）作用させることによ
り該ベクターを消化した。ついで、該ベクターにクレノ
ウフラグメントを作用させ、ＳａｌＩによる消化で生じ
た５´突出末端の半分を埋めた。したがって該ｐＵＣ１
９における５´突出末端は、ＴＣである。
【００８７】（４）挿入断片とベクターとのライゲーシ
ョン ＧＡが５´突出末端である該染色体ＤＮＡおよびＴＣが
５´突出末端である該ｐＵＣ１９ＤＮＡを２：１のモル
比で混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．１（商品名、宝酒造株式会社製）用いてライゲーシ
ョンを行った。これにより、バチラス セリウスの染色
体ＤＮＡライブラリーを完成させた。該ライブラリーを
２５ｎｇ用いて、常法にしたがい作製した大腸菌ＤＨ５
α株（ギブコBRLライフテクノロジーズ社（GibcoBRL Li
fe Technologies）製）のコンピテント細胞を形質転換
させた（Methods Enzymol.、第２０４号、６３〜１１３
頁、１９９１年）。
ョン ＧＡが５´突出末端である該染色体ＤＮＡおよびＴＣが
５´突出末端である該ｐＵＣ１９ＤＮＡを２：１のモル
比で混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．１（商品名、宝酒造株式会社製）用いてライゲーシ
ョンを行った。これにより、バチラス セリウスの染色
体ＤＮＡライブラリーを完成させた。該ライブラリーを
２５ｎｇ用いて、常法にしたがい作製した大腸菌ＤＨ５
α株（ギブコBRLライフテクノロジーズ社（GibcoBRL Li
fe Technologies）製）のコンピテント細胞を形質転換
させた（Methods Enzymol.、第２０４号、６３〜１１３
頁、１９９１年）。
【００８８】（５）酸化還元酵素遺伝子のスクリーニン
グ 形質転換した大腸菌を、ジメチルスルホキシドに溶解し
た０．１Ｍベンジル溶液をプレート１枚あたり４０μｌ
塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に蒔き、３７℃
で一晩培養したところ、２７１０個のコロニーが観察さ
れた。さらに室温に放置し、ハロー形成を待った。すな
わち、大腸菌のコロニーの周辺のベンジルが還元されて
ベンゾインが生成されると、溶解度が上がり、ハローが
形成される現象を利用して、ベンジル還元酵素を持つク
ローンのスクリーニングの指標とした。その結果、ハロ
ー形成したコロニーは７個あり、最も早いものでは、形
質転換した菌液を蒔いてから３０時間でハローを形成し
た。
グ 形質転換した大腸菌を、ジメチルスルホキシドに溶解し
た０．１Ｍベンジル溶液をプレート１枚あたり４０μｌ
塗布したアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に蒔き、３７℃
で一晩培養したところ、２７１０個のコロニーが観察さ
れた。さらに室温に放置し、ハロー形成を待った。すな
わち、大腸菌のコロニーの周辺のベンジルが還元されて
ベンゾインが生成されると、溶解度が上がり、ハローが
形成される現象を利用して、ベンジル還元酵素を持つク
ローンのスクリーニングの指標とした。その結果、ハロ
ー形成したコロニーは７個あり、最も早いものでは、形
質転換した菌液を蒔いてから３０時間でハローを形成し
た。
【００８９】得られた７個のコロニーを液体培養ＬＢ培
地２ｍｌに接種して、３７℃で１２時間振とう培養し
た。基質の０．１Ｍベンジルを２０μｌ（最終濃度１ｍ
Ｍ）添加した後、さらに２４時間培養した。酢酸エチル
で菌液から基質と生成物を抽出し、ヘキサン：エーテ
ル：酢酸（容量比４５：５：１）を溶媒とした薄層クロ
マトグラフィーで展開し、ベンジル還元活性を再確認し
た。その結果、活性を示したのは、最も早くハローを形
成した菌体のみであった。そこで本発明者らは、この菌
体が有する組換えベクターをｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１と命名
した。
地２ｍｌに接種して、３７℃で１２時間振とう培養し
た。基質の０．１Ｍベンジルを２０μｌ（最終濃度１ｍ
Ｍ）添加した後、さらに２４時間培養した。酢酸エチル
で菌液から基質と生成物を抽出し、ヘキサン：エーテ
ル：酢酸（容量比４５：５：１）を溶媒とした薄層クロ
マトグラフィーで展開し、ベンジル還元活性を再確認し
た。その結果、活性を示したのは、最も早くハローを形
成した菌体のみであった。そこで本発明者らは、この菌
体が有する組換えベクターをｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１と命名
した。
【００９０】（６）酸化還元酵素遺伝子の塩基配列決定
ｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１の挿入断片の塩基配列決定は、Ｅ
Ｚ：：ＴＮ（商品名）＜ＫＡＮ−１＞Ｉｎｓｅｒｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（商品名、エピセンターテクノロジーズ社
製）を用いて行った。この決定により、ｐＵＣ−ＢＣ−
Ｂ１の挿入断片は２４３８ｂｐであることが判明した。
つぎに、当該ＤＮＡ断片の塩基配列をＤＤＢＪ／ＥＭＢ
Ｌ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベースの塩基配
列データベースにおいて既知の塩基配列との相同性を検
索したが、当該塩基配列と高い相同性を有する塩基配列
は得られなかった。そこで、考えられるＯＲＦ毎に、そ
のＯＲＦがコードするアミノ酸配列をＤＤＢＪ／ＥＭＢ
Ｌ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベースのアミノ
酸配列データベースにて相同検索したところ、配列番号
２に示した２４９残基からなるアミノ配列が、バチラス
ズブチルスのｙｕｅＤ遺伝子でコードされるアミノ酸
配列（２４３アミノ酸残基）と４０％の相同性を有して
いた。該ＹｕｅＤタンパク質の機能は不明であるが、そ
のアミノ酸配列はセピアプテリン（sepiapterin）還元
酵素に高い相同性を有していた。
Ｚ：：ＴＮ（商品名）＜ＫＡＮ−１＞Ｉｎｓｅｒｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（商品名、エピセンターテクノロジーズ社
製）を用いて行った。この決定により、ｐＵＣ−ＢＣ−
Ｂ１の挿入断片は２４３８ｂｐであることが判明した。
つぎに、当該ＤＮＡ断片の塩基配列をＤＤＢＪ／ＥＭＢ
Ｌ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベースの塩基配
列データベースにおいて既知の塩基配列との相同性を検
索したが、当該塩基配列と高い相同性を有する塩基配列
は得られなかった。そこで、考えられるＯＲＦ毎に、そ
のＯＲＦがコードするアミノ酸配列をＤＤＢＪ／ＥＭＢ
Ｌ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベースのアミノ
酸配列データベースにて相同検索したところ、配列番号
２に示した２４９残基からなるアミノ配列が、バチラス
ズブチルスのｙｕｅＤ遺伝子でコードされるアミノ酸
配列（２４３アミノ酸残基）と４０％の相同性を有して
いた。該ＹｕｅＤタンパク質の機能は不明であるが、そ
のアミノ酸配列はセピアプテリン（sepiapterin）還元
酵素に高い相同性を有していた。
【００９１】また、サッカロミセス セレビシエのＯＲ
Ｆ ＹＩＲ０３６Ｃでコードされるアミノ酸配列とも３
０％の類似性を有するという知見も得た。このＹＩＲ０
３６Ｃタンパク質の機能は不明であるが、そのアミノ酸
配列は酸化還元酵素の１種である短鎖アルコール脱水素
酵素に類似性を有していることが知られている。
Ｆ ＹＩＲ０３６Ｃでコードされるアミノ酸配列とも３
０％の類似性を有するという知見も得た。このＹＩＲ０
３６Ｃタンパク質の機能は不明であるが、そのアミノ酸
配列は酸化還元酵素の１種である短鎖アルコール脱水素
酵素に類似性を有していることが知られている。
【００９２】ＹｕｅＤタンパク質から推定した当該ＯＲ
Ｆが酸化還元機能を有することを確かめるために、塩基
配列を決定する過程において該ＯＲＦ上にトランスポゾ
ンが挿入されたｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１を、ベンジルを塗っ
たアンピシリン含有寒天プレートにて２５℃で３６〜４
８時間培養した。培養後に観察したところ、ハローを形
成したコロニーはみられなかった。したがって、該ＯＲ
Ｆがベンジル還元酵素をコードしていると判断した。終
止コドンを含めた該ＯＲＦを、配列番号９に示す。
Ｆが酸化還元機能を有することを確かめるために、塩基
配列を決定する過程において該ＯＲＦ上にトランスポゾ
ンが挿入されたｐＵＣ−ＢＣ−Ｂ１を、ベンジルを塗っ
たアンピシリン含有寒天プレートにて２５℃で３６〜４
８時間培養した。培養後に観察したところ、ハローを形
成したコロニーはみられなかった。したがって、該ＯＲ
Ｆがベンジル還元酵素をコードしていると判断した。終
止コドンを含めた該ＯＲＦを、配列番号９に示す。
【００９３】
【発明の効果】本発明は、新規オリゴヌクレオチド、同
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる新規酸化
還元酵素遺伝子の増幅・クローニング法、同遺伝子を含
有する組換えベクター、同組換えベクターにより形質転
換された形質転換体、および同形質転換体による酸化還
元酵素の製造方法を提供した。本発明のプライマーを用
いれば、未知のバチラス セリウス種の酸化還元酵素遺
伝子を単離することができる。また、本発明の遺伝子を
用いれば、芳香族ジケトン化合物に対し不斉還元能を示
す新規酸化還元酵素を容易にクローニングすることがで
き、さらに種々の宿主細胞で発現させることができる。
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる新規酸化
還元酵素遺伝子の増幅・クローニング法、同遺伝子を含
有する組換えベクター、同組換えベクターにより形質転
換された形質転換体、および同形質転換体による酸化還
元酵素の製造方法を提供した。本発明のプライマーを用
いれば、未知のバチラス セリウス種の酸化還元酵素遺
伝子を単離することができる。また、本発明の遺伝子を
用いれば、芳香族ジケトン化合物に対し不斉還元能を示
す新規酸化還元酵素を容易にクローニングすることがで
き、さらに種々の宿主細胞で発現させることができる。
【００９４】
配列番号１：合成オリゴヌクレオチド。
配列番号２：合成オリゴヌクレオチド。
配列番号３：合成オリゴヌクレオチド。
配列番号４：合成オリゴヌクレオチド。
【００９５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Arakawakagakukougyoukabushikigaisha
<120> oxido-reductase genes, Cloning the genes and Preparing the enzymes
<130> JP-12297
<140>
<141>
<160> 23
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence：synthetic
oligonucleotide
<400> 1
tgcgctacgt tatcataaca g 21
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence：synthetic
oligonucleotide
<400> 2
ggcgaagctt gcgctacgtt atcataacag 30
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence：synthetic
oligonucleotide
<400> 3
tattcatcaa ttctaataac 20
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence：synthetic
oligonucleotide
<400> 4
cgcggatcct attcatcaat tctaataac 29
<210> 5
<211> 750
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 5
atgcgctacg ttatcataac aggaacttca caaggtttag gtgaggctat tgccacacaa 60
ttgttagaaa aaaatacaac tgtcatctct atttctagaa gagaaaataa agagcttacg 120
aaactcgcag aacaatataa tagcaattgt gttctccact ccttagatct tcaagatgta 180
cataatttag aaacgaactt taacaaaatc atttcatcta ttcaagaaga cagtgtatct 240
tctattcatt taattaataa tgcgggtacg gttgctccta tgaagccaat tgaaaaagca 300
gaaagtgaac aattcattac gaacgttcac attaatttac ttgcacctat gattctcacc 360
tccactttca tgaaacatac gaaagaatgg aaagtagata aacgtgttat aaacatttca 420
tctggtgcag gaaaaaatcc atacttcgga tggggcgctt attgtacaac gaaagctggc 480
gtaaatatgt ttacacagtg cgtagcaacc gaagaagcag caaaagaatt tccagtaaaa 540
atcgtcgctt ttgcacctgg cgttgttgat acaaatatgc aagcacaaat tcgggaaaca 600
aatagagaag acttcacaaa tttagatcga ttcatcgcat taaaagaaga aggaaggcta 660
ttatcacccg aatacgttgc gaaagctatt cgtaacttac tagaaactga agacttccct 720
caaggcgagg ttattagaat tgatgaatag 750
<210> 6
<211> 249
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 6
Met Arg Tyr Val Ile Ile Thr Gly Thr Ser Gln Gly Leu Gly Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Thr Gln Leu Leu Glu Lys Asn Thr Thr Val Ile Ser Ile Ser
20 25 30
Arg Arg Glu Asn Lys Glu Leu Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Asn Ser
35 40 45
Asn Cys Val Leu His Ser Leu Asp Leu Gln Asp Val His Asn Leu Glu
50 55 60
Thr Asn Phe Asn Lys Ile Ile Ser Ser Ile Gln Glu Asp Ser Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile His Leu Ile Asn Asn Ala Gly Thr Val Ala Pro Met Lys Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Ala Glu Ser Glu Gln Phe Ile Thr Asn Val His Ile Asn
100 105 110
Leu Leu Ala Pro Met Ile Leu Thr Ser Thr Phe Met Lys His Thr Lys
115 120 125
Glu Trp Lys Val Asp Lys Arg Val Ile Asn Ile Ser Ser Gly Ala Gly
130 135 140
Lys Asn Pro Tyr Phe Gly Trp Gly Ala Tyr Cys Thr Thr Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Asn Met Phe Thr Gln Cys Val Ala Thr Glu Glu Ala Ala Lys Glu
165 170 175
Phe Pro Val Lys Ile Val Ala Phe Ala Pro Gly Val Val Asp Thr Asn
180 185 190
Met Gln Ala Gln Ile Arg Glu Thr Asn Arg Glu Asp Phe Thr Asn Leu
195 200 205
Asp Arg Phe Ile Ala Leu Lys Glu Glu Gly Arg Leu Leu Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Val Ala Lys Ala Ile Arg Asn Leu Leu Glu Thr Glu Asp Phe Pro
225 230 235 240
Gln Gly Glu Val Ile Arg Ile Asp Glu
245
<210> 7
<211> 750
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 7
atgcgctacg ttatcataac aggaacttca caaggtttag gtgaggcaat cgctacgcaa 60
ttattagaaa aaaatacaac tgtcatctct atttctagaa gagaaaatca agagcttaca 120
aaacttgcag agcaatataa cagcaattgc atttttcatt ccctagatct tcaagatgta 180
cataacttag agactaactt taaagagatc atttcatcta ttaaaaaaga caatgtatcc 240
tctattcatt taattagtaa cgcgggtaca gttgcaccta tgaagccaat tgaaaaagct 300
gaaagtgaac aattcattac gaacgttcac attaatttac ttgcacctat gattcttaca 360
tctacattta tgaaacatac gaaagactgg aaagtaggtg aacgcgttat taacatttca 420
tctggtgcag gaaaaaaccc ttactttggc tggggcgctt attgtacaac gaaagctagt 480
gtaaatgtgt ttacacagtg cgtagcaact gaagaagtgg aaaaagaata tccagtaaaa 540
atcgtcgctt ttgcacctgg cgttgttgat acaaatatgc aatcacaaat tcgcgaaaca 600
aataaagaag atttcataaa tttggaccgc ttcattgcat taaaggaaga aggaaaacta 660
ttatcacctg aatatgttgc gaaagctatt cgtaacttac tagaaactga ggacttccct 720
caaggcgagg ttattagaat tgatgaatag 750
<210> 8
<211> 249
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 8
Met Arg Tyr Val Ile Ile Thr Gly Thr Ser Gln Gly Leu Gly Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Thr Gln Leu Leu Glu Lys Asn Thr Thr Val Ile Ser Ile Ser
20 25 30
Arg Arg Glu Asn Gln Glu Leu Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Asn Ser
35 40 45
Asn Cys Ile Phe His Ser Leu Asp Leu Gln Asp Val His Asn Leu Glu
50 55 60
Thr Asn Phe Lys Glu Ile Ile Ser Ser Ile Lys Lys Asp Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile His Leu Ile Ser Asn Ala Gly Thr Val Ala Pro Met Lys Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Ala Glu Ser Glu Gln Phe Ile Thr Asn Val His Ile Asn
100 105 110
Leu Leu Ala Pro Met Ile Leu Thr Ser Thr Phe Met Lys His Thr Lys
115 120 125
Asp Trp Lys Val Gly Glu Arg Val Ile Asn Ile Ser Ser Gly Ala Gly
130 135 140
Lys Asn Pro Tyr Phe Gly Trp Gly Ala Tyr Cys Thr Thr Lys Ala Ser
145 150 155 160
Val Asn Val Phe Thr Gln Cys Val Ala Thr Glu Glu Val Glu Lys Glu
165 170 175
Tyr Pro Val Lys Ile Val Ala Phe Ala Pro Gly Val Val Asp Thr Asn
180 185 190
Met Gln Ser Gln Ile Arg Glu Thr Asn Lys Glu Asp Phe Ile Asn Leu
195 200 205
Asp Arg Phe Ile Ala Leu Lys Glu Glu Gly Lys Leu Leu Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Val Ala Lys Ala Ile Arg Asn Leu Leu Glu Thr Glu Asp Phe Pro
225 230 235 240
Gln Gly Glu Val Ile Arg Ile Asp Glu
245
<210> 9
<211> 750
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 9
atgcgctacg ttatcataac aggaacttca caaggtttag gtgaggctat tgccactcaa 60
ttgttagaag aaagtacaac tgtcatctct atttctagaa gagaaaataa agaacttact 120
aaacttgcag agcaatataa cagcaattgc atttttcatt ccttagatct tcaagatgta 180
cataacttag aaactaactt taaagaaatc atttcatcca ttaaagaaga caatgtatcc 240
tctattcatt taattaataa tgcaggtaca gttgcaccta tgaagccgat tgaaaaagca 300
gaaagtgaac aattcattac gaacgttcac attaatttac ttgcacctat gattcttaca 360
tctacgttta tgaaacatac gaaagaatgg aaagtagata aacgcgttat aaatatttca 420
tctggtgcag gaaaaaatcc ttatttcgga tggggcgctt attgtacgac gaaagctggt 480
gtaaatatgt ttacacaatg cgtagcaact gaagaagtgg aaaaagaata tccagtaaaa 540
atcgtcgctt ttgcccccgg tgttgttgat acaaatatgc aagcacaaat tcgtgaaaca 600
gctaaagaag acttcacaaa tttagaccgc ttcattgcat taaaagaaga aggaaagcta 660
ttatcacctg aatatgttgc gaaagctatt cgtaacttac tagaaactga ggaattccct 720
caaggcgagg ttattagaat tgatgaataa 750
<210> 10
<211> 750
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 10
atgcgctacg ttatcataac aggaacttca caaggtttag gtgaggctat tgccacacaa 60
ttgttagaga aaaatacaac tgtcatctct atttctagaa gagaaaataa agagcttacg 120
aaactcgcag aacaatataa tagcaattgt gttctccact ccttagatct tcaagatgta 180
cataatttag aaacgaactt taacaaaatc atttcatcta ttcaagaaga cagtgtatct 240
tctattcatt taattaataa tgcgggtacg gttgctccta tgaagccaat tgaaaaagca 300
gaaagtgaac aattcattac gaacgttcac attaatttac ttgcacctat gattctcacc 360
tccactttca tgaaacatac gaaagaatgg aaagtagata aacgtgttat aaacatttca 420
tctggtgcag gaaaaaatcc atacttcgga tggggcgctt attgtacaac gaaagctggc 480
gtaaatatgt ttacacagtg cgtagcaacc gaagaagcag taaaagaatt tccagtaaaa 540
atcgtcgctt ttgcacctgg tgttgttgat acaaatatgc aagcacaaat tcgggaaaca 600
aatagagaag acttcgcaaa tttagatcga ttcatcgcat taaaagaaga aggaaagcta 660
ttatcacccg aatacgttgc gaaagctatt cgtaacttac tagaaactga agacttccct 720
caaggcgagg ttattagaat tgatgaataa 750
<210> 11
<211> 249
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 11
Met Arg Tyr Val Ile Ile Thr Gly Thr Ser Gln Gly Leu Gly Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Thr Gln Leu Leu Glu Lys Asn Thr Thr Val Ile Ser Ile Ser
20 25 30
Arg Arg Glu Asn Lys Glu Leu Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Asn Ser
35 40 45
Asn Cys Val Leu His Ser Leu Asp Leu Gln Asp Val His Asn Leu Glu
50 55 60
Thr Asn Phe Asn Lys Ile Ile Ser Ser Ile Gln Glu Asp Ser Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile His Leu Ile Asn Asn Ala Gly Thr Val Ala Pro Met Lys Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Ala Glu Ser Glu Gln Phe Ile Thr Asn Val His Ile Asn
100 105 110
Leu Leu Ala Pro Met Ile Leu Thr Ser Thr Phe Met Lys His Thr Lys
115 120 125
Glu Trp Lys Val Asp Lys Arg Val Ile Asn Ile Ser Ser Gly Ala Gly
130 135 140
Lys Asn Pro Tyr Phe Gly Trp Gly Ala Tyr Cys Thr Thr Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Asn Met Phe Thr Gln Cys Val Ala Thr Glu Glu Ala Val Lys Glu
165 170 175
Phe Pro Val Lys Ile Val Ala Phe Ala Pro Gly Val Val Asp Thr Asn
180 185 190
Met Gln Ala Gln Ile Arg Glu Thr Asn Arg Glu Asp Phe Ala Asn Leu
195 200 205
Asp Arg Phe Ile Ala Leu Lys Glu Glu Gly Lys Leu Leu Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Val Ala Lys Ala Ile Arg Asn Leu Leu Glu Thr Glu Asp Phe Pro
225 230 235 240
Gln Gly Glu Val Ile Arg Ile Asp Glu
245
<210> 12
<211> 750
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 12
atgcgctacg ttatcataac aggaacttca caaggtttag gtgaggctat tgccactcag 60
ttgttagaag aaagtacaac tgtcatctct atttctagaa gagaaaataa agaacttact 120
aaacttgcag agcaatataa cagcaattgc atttttcatt ccttagatct tcaagatgta 180
cataacttag aaactaactt taaagaaatc atttcatcca ttaaagaaga caatgtatcc 240
tctattcatt taattaataa tgcaggtaca gttgcaccta tgaagccgat tgaaaaagca 300
gaaagtgaac aattcattac gaacgttcac attaatttac ttgcacctat gattcttaca 360
tctacgttta tgaaacatac gaaagaatgg aaagtagata aacgcgttat aaatatttca 420
tctggtgcag gaaaaaatcc ttatttcgga tggggcgctt attgtacgac gaaagctggt 480
gtaaatatgt ttacacaatg cgtagcaact gaagaagtgg aaaaagaata tccagtaaaa 540
atcgtcgctt ttgcccccgg tgttgttgat acaaatatgc aagcacaaat tcgtgaaaca 600
gctaaagaag acttcacaaa tttagaccgc ttcattgcat taaaagaaga aggaaagcta 660
ttatcacctg aatatgttgc gaaagctatt cgtaacttac tagaaactga ggaattccct 720
caaggcgagg ttattagaat tgatgaataa 750
<210> 13
<211> 249
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 13
Met Arg Tyr Val Ile Ile Thr Gly Thr Ser Gln Gly Leu Gly Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Thr Gln Leu Leu Glu Glu Ser Thr Thr Val Ile Ser Ile Ser
20 25 30
Arg Arg Glu Asn Lys Glu Leu Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Asn Ser
35 40 45
Asn Cys Ile Phe His Ser Leu Asp Leu Gln Asp Val His Asn Leu Glu
50 55 60
Thr Asn Phe Lys Glu Ile Ile Ser Ser Ile Lys Glu Asp Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile His Leu Ile Asn Asn Ala Gly Thr Val Ala Pro Met Lys Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Ala Glu Ser Glu Gln Phe Ile Thr Asn Val His Ile Asn
100 105 110
Leu Leu Ala Pro Met Ile Leu Thr Ser Thr Phe Met Lys His Thr Lys
115 120 125
Glu Trp Lys Val Asp Lys Arg Val Ile Asn Ile Ser Ser Gly Ala Gly
130 135 140
Lys Asn Pro Tyr Phe Gly Trp Gly Ala Tyr Cys Thr Thr Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Asn Met Phe Thr Gln Cys Val Ala Thr Glu Glu Val Glu Lys Glu
165 170 175
Tyr Pro Val Lys Ile Val Ala Phe Ala Pro Gly Val Val Asp Thr Asn
180 185 190
Met Gln Ala Gln Ile Arg Glu Thr Ala Lys Glu Asp Phe Thr Asn Leu
195 200 205
Asp Arg Phe Ile Ala Leu Lys Glu Glu Gly Lys Leu Leu Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Val Ala Lys Ala Ile Arg Asn Leu Leu Glu Thr Glu Glu Phe Pro
225 230 235 240
Gln Gly Glu Val Ile Arg Ile Asp Glu
245
<210> 14
<211> 750
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 14
atgcgctacg ttatcataac aggaacttca caaggtttag gtgaggctat tgccactcaa 60
ttgttagaag aaagtacaac tgtcatctct atttctagaa gagaaaatag agaacttact 120
aaacttgcag agcaatataa cagcaattgc atttttcatt ccctagatct tcaagatgta 180
cataacttag aaactaactt taaagagatc atttcatcta ttaaaaaaga caatgtatcc 240
tctattcatt taattaataa tgcgggtaca gttgcaccta tgaagccaat cgaaaaagct 300
gaaagcgaac aattcattac gaacgttcac attaatttac ttgcacctat gattcttaca 360
tctacattta tgaaacatac gaaagaatgg aaagtagata aacgcgttat aaatatttca 420
tctggtgcag gaaaaaatcc ttatttcgga tggggcgctt attgtacgac gaaagctggt 480
gtaaatatgt ttacacaatg cgtagcaact gaagaagtgg aaaaagagtg tccagtaaaa 540
atcgtcgctt ttgcccccgg tgttgttgat acaaatatgc aagcacaaat tcgtgaaaca 600
aataaagaag acttcacaaa tttagaccgc ttcattgcat taaaagaaga aggaaagcta 660
ttatcacctg aatatgttgc gaaagctatt cgtaacttac tagaaactga ggaattccct 720
caaggcgagg ttattagaat tgatgaataa 750
<210> 15
<211> 249
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 15
Met Arg Tyr Val Ile Ile Thr Gly Thr Ser Gln Gly Leu Gly Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Thr Gln Leu Leu Glu Glu Ser Thr Thr Val Ile Ser Ile Ser
20 25 30
Arg Arg Glu Asn Arg Glu Leu Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Asn Ser
35 40 45
Asn Cys Ile Phe His Ser Leu Asp Leu Gln Asp Val His Asn Leu Glu
50 55 60
Thr Asn Phe Lys Glu Ile Ile Ser Ser Ile Lys Lys Asp Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile His Leu Ile Asn Asn Ala Gly Thr Val Ala Pro Met Lys Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Ala Glu Ser Glu Gln Phe Ile Thr Asn Val His Ile Asn
100 105 110
Leu Leu Ala Pro Met Ile Leu Thr Ser Thr Phe Met Lys His Thr Lys
115 120 125
Glu Trp Lys Val Asp Lys Arg Val Ile Asn Ile Ser Ser Gly Ala Gly
130 135 140
Lys Asn Pro Tyr Phe Gly Trp Gly Ala Tyr Cys Thr Thr Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Asn Met Phe Thr Gln Cys Val Ala Thr Glu Glu Val Glu Lys Glu
165 170 175
Cys Pro Val Lys Ile Val Ala Phe Ala Pro Gly Val Val Asp Thr Asn
180 185 190
Met Gln Ala Gln Ile Arg Glu Thr Asn Lys Glu Asp Phe Thr Asn Leu
195 200 205
Asp Arg Phe Ile Ala Leu Lys Glu Glu Gly Lys Leu Leu Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Val Ala Lys Ala Ile Arg Asn Leu Leu Glu Thr Glu Glu Phe Pro
225 230 235 240
Gln Gly Glu Val Ile Arg Ile Asp Glu
245
<210> 16
<211> 750
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 16
atgcgctacg ttatcataac aggaacttca caaggtttag gtgaggctat tgccactcaa 60
ttgttagaag aaagtacaac tgtcatctct atttctagaa gagaaaataa agaacttact 120
aaacttgcag agcaatataa cagcaattgc atttttcatt ccttagatct tcaagatgta 180
cataacttag aaactaactt taaagaaatc atttcatcca ttaaagaaga caatgtatcc 240
tctattcatt taattaataa tgcaggtaca gttgcaccta tgaagccgat tgaaaaagca 300
gaaagtgaac aattcattac gaacgttcac attaatttac ttgcacctat gattcttaca 360
tctacgttta tgaaacatac gaaagaatgg aaagtagata aacgcgttat aaatatttca 420
tctggtgcag gaaaaaatcc ttatttcgga tggggcgctt attgtacgac gaaagctggt 480
gtaaatatgt ttacacaatg cgtagcaact gaagaagtgg aaaaaggata tccagtaaaa 540
atcgtcgctt ttgcccccgg tgttgttgat acaaatatgc aagcacaaat tcgtgaaaca 600
gctaaagaag acttcacaaa tttagaccgc ttcattgcat taaaagaaga aggaaagcta 660
ttatcacctg aatatgttgc gaaagctatt cgtaacttac tagaaactga ggaattccct 720
caaggcgagg ttattagaat tgatgaataa 750
<210> 17
<211> 249
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 17
Met Arg Tyr Val Ile Ile Thr Gly Thr Ser Gln Gly Leu Gly Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Thr Gln Leu Leu Glu Glu Ser Thr Thr Val Ile Ser Ile Ser
20 25 30
Arg Arg Glu Asn Lys Glu Leu Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Asn Ser
35 40 45
Asn Cys Ile Phe His Ser Leu Asp Leu Gln Asp Val His Asn Leu Glu
50 55 60
Thr Asn Phe Lys Glu Ile Ile Ser Ser Ile Lys Glu Asp Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile His Leu Ile Asn Asn Ala Gly Thr Val Ala Pro Met Lys Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Ala Glu Ser Glu Gln Phe Ile Thr Asn Val His Ile Asn
100 105 110
Leu Leu Ala Pro Met Ile Leu Thr Ser Thr Phe Met Lys His Thr Lys
115 120 125
Glu Trp Lys Val Asp Lys Arg Val Ile Asn Ile Ser Ser Gly Ala Gly
130 135 140
Lys Asn Pro Tyr Phe Gly Trp Gly Ala Tyr Cys Thr Thr Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Asn Met Phe Thr Gln Cys Val Ala Thr Glu Glu Val Glu Lys Gly
165 170 175
Tyr Pro Val Lys Ile Val Ala Phe Ala Pro Gly Val Val Asp Thr Asn
180 185 190
Met Gln Ala Gln Ile Arg Glu Thr Ala Lys Glu Asp Phe Thr Asn Leu
195 200 205
Asp Arg Phe Ile Ala Leu Lys Glu Glu Gly Lys Leu Leu Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Val Ala Lys Ala Ile Arg Asn Leu Leu Glu Thr Glu Glu Phe Pro
225 230 235 240
Gln Gly Glu Val Ile Arg Ile Asp Glu
245
<210> 18
<211> 750
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 18
atgcgctacg ttatcataac aggaacttca caaggtttag gtgaggcaat cgctacgcaa 60
ttattagaaa aaaatacaac tgtcatctct atttctagaa gagaaaatca agagcttaca 120
aaacttgcag agcaatataa cagcaattgc atttttcatt ccctagatct tcaagatgta 180
cataacttag aaactaactt taaagagatc atttcatcta ttaaaaaaga caatgtatcc 240
tctattcatt taattaataa tgcgggtaca gttgcaccta tgaagccaat tgaaaaagct 300
gaaagtgaac aattcattac gaacgttcac attaatttac ttgcacctat gattcttaca 360
tctacattta tgaaacatac gaaagactgg aaagtagata aacgcgttat taacatttca 420
tctggtgcag gaaaaaaccc ttactttggc tggggcgctt attgtacaac gaaagctggt 480
gtaaatatgt ttacacagtg cgtagcaact gaagaagtgg aaaaagaata tccagtaaaa 540
atcgtcgctt ttgcacctgg cgttgttgat acaaatatgc aatcacaaat tcgcgaaaca 600
aataaagaag atttcataaa tttggaccgc ttcattgcat taaaagaaga aggaaaacta 660
ttatcacctg aatatgttgc gaaagctatt cgtaacttac tagaaactga ggacttccct 720
caaggcgagg ttattagaat tgatgaataa 750
<210> 19
<211> 249
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 19
Met Arg Tyr Val Ile Ile Thr Gly Thr Ser Gln Gly Leu Gly Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Thr Gln Leu Leu Glu Lys Asn Thr Thr Val Ile Ser Ile Ser
20 25 30
Arg Arg Glu Asn Gln Glu Leu Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Asn Ser
35 40 45
Asn Cys Ile Phe His Ser Leu Asp Leu Gln Asp Val His Asn Leu Glu
50 55 60
Thr Asn Phe Lys Glu Ile Ile Ser Ser Ile Lys Lys Asp Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile His Leu Ile Asn Asn Ala Gly Thr Val Ala Pro Met Lys Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Ala Glu Ser Glu Gln Phe Ile Thr Asn Val His Ile Asn
100 105 110
Leu Leu Ala Pro Met Ile Leu Thr Ser Thr Phe Met Lys His Thr Lys
115 120 125
Asp Trp Lys Val Asp Lys Arg Val Ile Asn Ile Ser Ser Gly Ala Gly
130 135 140
Lys Asn Pro Tyr Phe Gly Trp Gly Ala Tyr Cys Thr Thr Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Asn Met Phe Thr Gln Cys Val Ala Thr Glu Glu Val Glu Lys Glu
165 170 175
Tyr Pro Val Lys Ile Val Ala Phe Ala Pro Gly Val Val Asp Thr Asn
180 185 190
Met Gln Ser Gln Ile Arg Glu Thr Asn Lys Glu Asp Phe Ile Asn Leu
195 200 205
Asp Arg Phe Ile Ala Leu Lys Glu Glu Gly Lys Leu Leu Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Val Ala Lys Ala Ile Arg Asn Leu Leu Glu Thr Glu Asp Phe Pro
225 230 235 240
Gln Gly Glu Val Ile Arg Ile Asp Glu
245
<210> 20
<211> 750
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 20
atgcgctacg ttatcataac aggaacttca caaggtttag gtgaggctat tgccacacaa 60
ttgttagaaa aaaatacaac tgtcatctct atttctagaa gagaaaataa agagcttacg 120
aaactcgcag aacaatataa tagcaattgt gttctccact ccttagatct tcaagatgta 180
cataatttag aaacgaactt taacaaaatc atttcatcta ttcaagaaga cagtgtatct 240
tctattcatt taattaataa tgcgggtacg gttgctccta tgaagccaat tgaaaaagca 300
gaaagtgaac aattcattac gaacgttcac attaatttac ttgcacctat gattctcacc 360
tccactttca tgaaacatac gaaagaatgg aaagtagata aacgtgttat aaacatttca 420
tctggtgcag gaaaaaatcc atacttcgga tggggcgctt attgtacaac gaaagctggc 480
gtaaatatgt ttacacagtg cgtagcaacc gaagaagcag caaaagaatt tccagtaaaa 540
atcgtcgctt ttgcacctgg tgttgttgat acaaatatgc aagcacaaat tcgggaaaca 600
aatagagaag acttcacaaa tttagatcga ttcatcgcat taaaagaaga aggaaagcta 660
ttatcacccg aatacgttgc gaaagctatt cgtaacttac tagaaactga agacttccct 720
caaggcgagg ttattagaat tgatgaataa 750
<210> 21
<211> 249
<212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 21
Met Arg Tyr Val Ile Ile Thr Gly Thr Ser Gln Gly Leu Gly Glu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Thr Gln Leu Leu Glu Lys Asn Thr Thr Val Ile Ser Ile Ser
20 25 30
Arg Arg Glu Asn Lys Glu Leu Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Asn Ser
35 40 45
Asn Cys Val Leu His Ser Leu Asp Leu Gln Asp Val His Asn Leu Glu
50 55 60
Thr Asn Phe Asn Lys Ile Ile Ser Ser Ile Gln Glu Asp Ser Val Ser
65 70 75 80
Ser Ile His Leu Ile Asn Asn Ala Gly Thr Val Ala Pro Met Lys Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Ala Glu Ser Glu Gln Phe Ile Thr Asn Val His Ile Asn
100 105 110
Leu Leu Ala Pro Met Ile Leu Thr Ser Thr Phe Met Lys His Thr Lys
115 120 125
Glu Trp Lys Val Asp Lys Arg Val Ile Asn Ile Ser Ser Gly Ala Gly
130 135 140
Lys Asn Pro Tyr Phe Gly Trp Gly Ala Tyr Cys Thr Thr Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Asn Met Phe Thr Gln Cys Val Ala Thr Glu Glu Ala Ala Lys Glu
165 170 175
Phe Pro Val Lys Ile Val Ala Phe Ala Pro Gly Val Val Asp Thr Asn
180 185 190
Met Gln Ala Gln Ile Arg Glu Thr Asn Arg Glu Asp Phe Thr Asn Leu
195 200 205
Asp Arg Phe Ile Ala Leu Lys Glu Glu Gly Lys Leu Leu Ser Pro Glu
210 215 220
Tyr Val Ala Lys Ala Ile Arg Asn Leu Leu Glu Thr Glu Asp Phe Pro
225 230 235 240
Gln Gly Glu Val Ile Arg Ile Asp Glu
245
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence：synthetic
oligonucleotide
<400> 22
ggtggttgct cttccaacat gcgctacgtt atcataac 38
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence：synthetic
oligonucleotide
<400> 23
cggctgcagt tattcatcaa ttctaataac 30
フロントページの続き
(72)発明者 丸山 励治
富山市寺町けや木台52 つかさハイツ寺
町203号
(72)発明者 糸井 泰
大阪府大東市南新田１丁目21−502
(56)参考文献 特開2002−65267（ＪＰ，Ａ)
Ｇｅｎｅ， 1997， Ｖｏｌ．189,
ｐ．213−219
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， 1991,
Ｖｏｌ．173， Ｎｏ．17， ｐ.
5385−5395
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ， 1988， Ｖｏｌ．７， ｐ．1191
−1192
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ， 1985， Ｖｏｌ．８， ｐ．1111
−1112
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12N 9/02
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (16)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１、２、３または４に
示した塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 （ａ）請求項１記載のオリゴヌクレオチ
ドから選ばれた少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを
プライマーとして、試料に含まれる標的酸化還元酵素遺
伝子を増幅し、 （ｂ）増幅された当該遺伝子をベクターに挿入して組換
えベクターを調製した後、 （ｃ）当該ベクターにより形質転換された形質転換体を
得ることを特徴とする酸化還元酵素遺伝子含有形質転換
体の製法。 - 【請求項３】 酸化還元遺伝子を含有する試料が、バチ
ラス属に属する菌株から得られた染色体ＤＮＡ、当該染
色体のＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーまた
は当該遺伝子を含む組換えベクターであることを特徴と
する請求項２記載の酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体
の製法。 - 【請求項４】 酸化還元遺伝子を含有する試料が、バチ
ラス セリウスから得られた染色体ＤＮＡ、当該染色体
のＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーまたは当
該遺伝子を含む組換えベクターであることを特徴とする
請求項２記載の酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体の製
法。 - 【請求項５】 配列表の配列番号２および４記載の２種
のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いることを
特徴とする請求項２、３または４記載の酸化還元酵素遺
伝子含有形質転換体の製法。 - 【請求項６】 形質転換する宿主細胞が微生物であるこ
とを特徴とする請求項２、３、４または５記載の酸化還
元酵素遺伝子含有形質転換体の製法。 - 【請求項７】 ベクターがｐＵＣ１９であり、形質転換
する宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項
２、３、４または５記載の酸化還元酵素遺伝子含有形質
転換体の製法。 - 【請求項８】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドから
選ばれた少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応により得られ、
配列表の配列番号５、７、１０、１２、１４、１６、１
８または２０に示した塩基配列からなる酸化還元酵素遺
伝子。 - 【請求項９】 請求項１記載のオリゴヌクレオチドから
選ばれた少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応により得られ、
配列表の配列番号６、８、１１、１３、１５、１７、１
９または２１に示したアミノ酸配列をコードする酸化還
元酵素遺伝子。 - 【請求項１０】 請求項８または９記載の遺伝子にコー
ドされた酸化還元酵素。 - 【請求項１１】 請求項８または９記載の遺伝子を含有
する組換えベクター。 - 【請求項１２】 ベクターがｐＵＣ１９である請求項１
１記載の組換えベクター。 - 【請求項１３】 請求項１１または１２記載の組換えベ
クターにより形質転換された形質転換体。 - 【請求項１４】 宿主細胞が微生物である請求項１３記
載の形質転換体。 - 【請求項１５】 微生物が大腸菌である請求項１３記載
の形質転換体。 - 【請求項１６】 請求項２、３、４、５、６または７記
載の方法で得られる酸化還元酵素遺伝子含有形質転換体
を培養し、培養物から酸化還元酵素を採取することを特
徴とする酸化還元酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000306503A JP3518501B2 (ja) | 2000-10-05 | 2000-10-05 | 酸化還元酵素遺伝子、同遺伝子のクローニングおよび同酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000306503A JP3518501B2 (ja) | 2000-10-05 | 2000-10-05 | 酸化還元酵素遺伝子、同遺伝子のクローニングおよび同酵素の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002112783A JP2002112783A (ja) | 2002-04-16 |
| JP3518501B2 true JP3518501B2 (ja) | 2004-04-12 |
Family
ID=18787186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000306503A Expired - Fee Related JP3518501B2 (ja) | 2000-10-05 | 2000-10-05 | 酸化還元酵素遺伝子、同遺伝子のクローニングおよび同酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3518501B2 (ja) |
-
2000
- 2000-10-05 JP JP2000306503A patent/JP3518501B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８５， Ｖｏｌ．８， ｐ．１１１１−１１１２ |
| Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８８， Ｖｏｌ．７， ｐ．１１９１−１１９２ |
| Ｇｅｎｅ， １９９７， Ｖｏｌ．１８９， ｐ．２１３−２１９ |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １９９１， Ｖｏｌ．１７３， Ｎｏ．１７， ｐ．５３８５−５３９５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002112783A (ja) | 2002-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH11514530A (ja) | （２．５―ｄｋｇ）リダクターゼの各種改良型変異体 | |
| US6242234B1 (en) | Mutants of formate dehydrogenase from Candida boidinii, new gene sequences encoding these and use of the new formate dehydrogenases | |
| EP1174499B1 (en) | Novel amidase gene | |
| JP3518501B2 (ja) | 酸化還元酵素遺伝子、同遺伝子のクローニングおよび同酵素の製造方法 | |
| JP4880859B2 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 | |
| JPH0587234B2 (ja) | ||
| JP2003502021A (ja) | アスペルギルス起源のエポキシドヒドロラーゼ | |
| IE912083A1 (en) | An oxido reductase enzyme system obtainable from p.¹chrysogenum, the set of genes encoding the same and the use¹of oxido reductase enzyme systems or genes encoding the same¹for increasing antibiotic production | |
| EP1231266B1 (en) | Arabidopsis-origin gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reductase gene | |
| JPH07108225B2 (ja) | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 | |
| JP2003514582A (ja) | テトラヒドロピリミジンジオキシゲナーゼ遺伝子、該遺伝子によってコードされるポリペプチド、およびその生成法 | |
| JP3496640B2 (ja) | 酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子、同酵素遺伝子含有形質転換体および同酵素の製造方法 | |
| JP3549551B2 (ja) | Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコードするｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクター | |
| JP2002345469A (ja) | コエンザイムｑ１０の製造法 | |
| JP3468216B2 (ja) | 酸化還元酵素、同酵素をコードする遺伝子および同遺伝子のクローニング | |
| US6214590B1 (en) | 2-aminothiazoline-4-carboxylate racemase and gene encoding therefor | |
| JP4069129B2 (ja) | 新規なアミダーゼ遺伝子 | |
| JP2999954B2 (ja) | ４−カルバモイル−１−β−Ｄ−リボフラノシル−イミダゾリウム−５−オレイトの酵素的製造法 | |
| JP2023527107A (ja) | シスチンを生体触媒還元するための酵素的触媒酸化還元系のコア構成成分としての生体触媒 | |
| JPH02501260A (ja) | 合成遺伝子を使用した酵母細胞でのブタ成長ホルモンの生産方法 | |
| JP3473985B2 (ja) | Ｄ−プロリンの製造法 | |
| JP4485081B2 (ja) | プラバスタチンの生産に関与するｄｎａおよびその使用 | |
| JPH06253854A (ja) | 組換えｄｎａ手法によるヌクレオシド・ホスホリラーゼの製造法 | |
| JPS63269986A (ja) | 遺伝子調節単位および、クローニング・発現系 | |
| JPH08103269A (ja) | カルボニルレダクターゼ遺伝子の塩基配列及びその利用法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040106 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040119 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |