JPH02501028A - トロンビンから誘導されたポリペプチド、組成物およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トロンビンから誘導されたポリペプチド、組成物およびその使用方法 本発明はトロンビンーリセブタ−（受容体）を介する細胞刺激の制御に有用な化 合物および制御法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、プロトロン ビンから導かれたペプチド、および該ペプチドを傷の治癒の促進、並びに搬痕形 成、組織癒着、血液凝固、腫瘍血管形成、腫瘍転移および肺浮腫の阻止に用いる 方法に関するものである。

ヒト−アルファートロンビンは様々な組織の細胞に対する増殖促進作用を有する ようである。例えばアルファートロンビンは、血清や他の精製増殖因子を加えな くとも培養中の線維芽細胞の増殖を開始させる、ある種のハムスターの線維芽細 胞およびヒト内皮細胞において上皮増殖因子に相乗作用を及ぼす、あるいは哺乳 類の水晶体上皮細胞および肺細胞の細胞分割またはＤＮＡ合成を開始させること が示された。しかし、トロンビンを増殖因子として用いること、および傷の治癒 において潜在的に重要物質であることに関しては未だ広く認められていない。こ れは、一部、トロンビンと凝固、血小板の活性化、および細胞増殖の開始との関 係の複雑さ、並びに血清プロテアーゼ阻害物質および細胞放出プロテアーゼ、ネ キシン類によるトロンビンおよびトロンビン様物質制御の複雑さに起因している 。しかしながら、この、生理学的制御の複雑性および高度性が傷治癒の開始経路 の潜在的重要性を支持するものといえる。

トロンビンはまた、腫瘍の転移および腫瘍血管形成にも一役を担っている可能性 がある。一般に、腫瘍が直径数ｍｍ以上になるには、腫瘍塊内部の細胞に循環と 栄養を与えるために血管内皮が増殖して血管壁を形成する必要がある。トロンビ ンは内皮細胞増殖促進能により、この工程を推進するらしい。しかも、トロンビ ンは、細胞および血漿因子が微小脈管系から出る、あるいは入るのを防止する上 で重要な上皮細胞の正常な細胞間接触を破壊することも示された。トロンビンが これらの接触を破壊することによって転移を増大させ得るというこの仮説は、抗 トロンビン■（血漿からトロンビンおよび他のプロテアーゼを取り出す）濃度の 減少と腫瘍転移の増大との相関性を証明する研究によって裏付けられた。

本発明者らは、様々な研究の結果、高度の親和性を有する細胞表面のトロンピン ーリセブタ−［カーネイ（Ｃａｒｎｅｙ）およびカンニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇ ｈａｍ）ら、セル（ＣｅｌｌＮ５　：　１３４１，１９７８年参照コが腫瘍の転 移および血管形成に関与しているという結論に達した。

例えば、ある研究の結果は、トロンビンーリセプターが組織プラスミノーゲン活 性化因子、転移腫瘍細胞から分泌される分子のりセブターとなり得ることを示唆 していた。また、他の研究では、組織プラスミノーゲン活性化因子が転移および 血管形成に関与していることが証明された。このように、プラスミノーゲン活性 化因子の作用の多くは、それと細胞表面のトロンビンーリセプターとの相互作用 を介するものである。従って、トロンビンーリセブターを刺激すると腫瘍の転移 が促され、リセブターを阻害すると転移活性が低下されるといえる。

また、トロンビンは、内皮血管形成を行う細胞の構造および機能に変化をもたら すことｔ・示された。これらの研究は、トロンビンが他の浮腫と同様、肺浮腫の 進行に中心的な役割を担っているかもしれないことを示唆している。例えば、ト ロンビンは、内皮細胞の単層の透過性の増大、動脈圧および肺血管の抵抗の増加 、平滑筋の収縮誘発、および毛細血管の液体ろ過の増加を引き起こすことが示さ れた。これらの作用はすべて、トロンビンと細胞表面トロンビンーリセプターと の相互反応を介するものであろう。

最近、トロンビンを介する細胞刺激機構の解明を試みた研究が多数なされている 。本発明者らは、これらの研究から、トロンビンによる細胞増殖の刺激には２つ のシグナルが必要であるという示唆を得た。第１のシグナルは、トロンビン分子 と高親和性の細胞表面リセフターとの結合に依存しており、第２のシグナルはト ロンビン分子の酵素活性に起因しているようである。即ち、アルファートロンビ ンとは異なり、ＤＩＰ−アルファートロンビン（リセブター結合活性は保持して いるがタンパク分解的には不活性なトロンビン誘導体）およびガンマ−トロンビ ン（エステル分解的には活性であるが非結合性のトロンビン誘導体）のいずれも Ｄ　Ｎ　Ａ合成または細胞分割を開始することができない。しかしながら、これ らの２種の非−マイトジェン（非−有糸***促進物質）性トロンビン誘導体を同 時に添加するとアルファートロンビンによる場合に匹敵するレベルでＤＮＡ合成 および細胞分割が開始される。

これらと同じトロンビン誘導体を用いて、高親和性トロンビンーリセブター〇占 有によって刺激される細胞間事象と、タンパク分解的な開裂に起因する事象とを 識別した。アルファートロンビンおよびガンマ−トロンビンは、いずれもＮａ” ／に″Ａ’ＴＰａｓｅ活性、ホスホイノシトール回転およびＣａ”代謝を刺激す るが、Ｄ　Ｉ　Ｐ−）ロンビンは刺激しない。したがって、これらの事象は、ト ロンビンのりセブター占有ではなく酵素活性に帰属することができる。さらに、 これらのシグナル（ジアシルグリセロールおよびイノシトールトリホスフェート の放出によるＣａ”移動の誘発）は次いで、タンパク質キナーゼＣを活性化する 。したがって、プロティンキナーゼＣを活性化するホルボール・−ミリステート ・アセテ−）（ＰＭＡ）でガンマ−トロンビンを置換することができ、リセブタ ーを飽和する濃度のＤＩＰ−アルファートロンビンまたはりセブターのモノクロ ーナル抗体の存在下で細胞分割を開始し得ることが分かった。このように、酵素 活性なトロンビンの必要性は、そのプロティンキナーゼＣの活性化作用と間接的 に係っているらしい。

トロンビンとそのリセブターとの高親和性の相互作用によって生成されるシグナ ルを正確に定義すること（明確にすること）はさらに困難であった。しかしなが ら、近年、ＤＩＰ−アルファートロンビンが細胞間ｃＡＭＰの一過性の増加を刺 激することが示された。イオン流出およびホスホイノシチド回転と対照的に、Ｄ ＩＰ−アルファートロンビンによってｃＡＭＰレベルは最大刺激を受けるが、ガ ンマ−トロンビンによっては刺激されない。しかしながら、ＤＩＰ−アルファー トロンビンをｃＡＭＰ同族体で置換する試みは成功しなかった。したがって、ト ロンビンーリセプター〇占有によってｃＡＭＰレベルが変化すると共に、多（の シグナルが生成する可能性がある。

そのようなトロンビンの利点を達成するための臨床応用に際して伴う１つの問題 は、それが血清の抗−トロンビンによるプロテアーゼ阻害物質（インヒビター） の影響を受け易いという点である。これまでトロンビンの臨床使用を妨げてきた この問題により、本発明者らは、トロンビン阻害物質の阻害作用に感受性を持た ない、小さいトロンビン活性な、トロンビン拮抗性ポリペプチドを同定した。

本発明は、トロンビンーリセブターと相互作用し、トロンビンーリセブター占有 に関連したシグナルを選択的に刺激または阻害するように仕立て（ｔａｉｌｏｒ ）られた数多くの小さいポリペプチドを提供するものである。回復の成功がトロ ンビンーリセブターに仲介される事象で影響され得る、種々広範な臨床状況にお けるこれらのポリペプチドの有用性が明らかになると確信する。

本発明は、細胞増殖を刺激し、傷の治癒を促進するのに有用な多くのトロンビン 誘導体および方法、並びに傷の治癒、組織の癲痕形な方法を提供するものである 。本発明はトロンビンとその高親和性のりセブターとの相互作用を選択的に阻止 する、またはトロンビンの刺激作用を模倣する、ポリペプチドトロンビン誘導体 またはその生理学的機能の同族体を製剤化し得るという発見に基づいている。

したがって、本発明は、最も一般的かつ総合的な範囲として、トロンピンーリセ ブター仲介事象に対する、合成または天然のポリペプチドアゴニスト（作用物質 ）およびアンタゴニスト（拮抗物質）に関するものである。これらの両群の物質 は選択的に高親和性トロンビンーリセプターと結合し得るポリペプチドセグメン トを含んだトロンビンーリセプター結合ドメインを含有している。このポリペプ チドセグメントはフィブロネクチンのトリペプチド細胞結合ドメインとホモロー ガスなアミノ酸配列を含有している。

トロンビンーリセブター結合ドメインに加えて、刺激性（作用性）ポリペプチド は、以前にセリンプロテアーゼ間で高度の保存性を有するこ七が示されたドデカ ペプチドのＮ−末端アミノ酸から導かれる配列のアミノ酸配列を含有している。

しかしながら、阻害性ポリペプチドはこれらのセリンエステラーゼ−保存配列を 含有していない。

非−マイトジェン（非刺激性）濃度のアルファルトロンビン、ガンマ−トロンビ ンまたはＰＭＡの存在下、刺激性ポリペプチドと細胞表面のトロンビンーリセブ ターの相互作用によって細胞が増殖性シグナルを得るということを示すことによ り、本発明を開示する。しかしながら、細胞表面トロンビンーリセブターが阻害 性ポリペプチドと相互作用する場合には増殖性シグナルは生じない。むしろ、次 の刺激性ポリペプチドによる処理に対する、細胞の抵抗が一層大きくなる。それ 自身は増殖活性シグナルを産生じ得ない阻害性ポリペプチドが刺激性ポリペプチ ドの結合を阻害するためにこのような結果を生じると考えられる。

上記のように、本発明の細胞刺激法の実施には、細胞に低親和性のタンパク分解 的開裂シグナルを供給するために、例えば非−マイトジェン濃度のアルファート ロンビン、ガンマ−トロンビン、またはＰＭＡの形の第２シグナルが必要である 。したがって、本発明は、これらの化合物が添加されている、医薬組成物および その方法を提供するものである。しかしながら、当業者ならば、本発明をインビ ボで行う場合には、一般に、宿主に固有の内因性アルファートロンビンによって 十分、この第２のシグナルが提供されることを認めるであろう。

トロンビンは多くの生物制御作用に関与しているので、これらの作用を選択的に 促進および阻害する方法を提供する本発明の臨床面での応用範囲は広い。例えば 、本発明は傷の治癒を促進するのに有用な多くのポリペプチドを提供する。その ような適用のために、本発明は、トロンビンーリセプター結合ドメインおよび少 なくとも１２アミノ酸からなるセリンエステラーゼ保存配列を有するドメインを 含有するトロンビン誘導体（またはそのような誘導体の機能的な等個物）を提供 する。本発明はまた、トロンビンーリセプター結合ドメインおよびセリンエステ ラーゼ保存アミノ酸配列を有するドメインを含有する少なくとも１２Ｌアミノ酸 のポリペプチド化合物を提供するものである。

１つの実施態様として、本発明はトロンビンーリセブター結合ドメインが、セリ ンエステラーゼ保存アミノ酸配列：　Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ　−Ｇ　ｌｕ　− Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｓｐ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｐ　ｒｏ　− Ｐ　ｈｅ　−Ｖ　ａｌと一緒にＬアミノ酸配列＋　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａ ｌａを含有するポリペプチド化合物のような、特異的なアミノ酸配列を含有する 幾つかのポリペプチドを提供するものである。好ましい態様では、ポリペプチド 化合物は、式：　Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ− Ｇｌｙ　−Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｌａ　−Ｃ ｙｓ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　ｓｐ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ｌ ｙ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｖ　ａｌで示されるしアミノ酸配列を含有する 。

本発明はまた、傷の治癒を促進する医薬組成物であって、治療有効濃度の上記化 合物のいずれかと薬学上許容し得る賦形剤とを含有する医薬組成物を提供するも のである。例えば、そのような組成物は、本明細書に記載したように、トロンビ ンーリセプターに刺激作用を及ぼすのに、十分な濃度のポリペプチドを含有して いる。即ち、そのような組成物は、一般に、インビトロでリセプターを刺激する ことが示されたレベルのポリペプチドが傷部位に供給されるのに十分な濃度のポ リペプチドを含有する。第２シグナルの内因性レベルが不適当であると考えられ る場合には、治療有効濃度のアルファートロンビンまたはガンマ−トロンビンを も加えた組成物を用いるとよい。

本明細書中、治療有効濃度とは、傷治癒速度を充分に増大し得る特定の物質の濃 度と定義する。また、そのような濃度は、インビトロでトロンビンーリセブター の刺激を引き起こすのに十分な濃度に相当すると考えられる。しかしながら、刺 激性（作用性）ポリペプチドがＱ、ｌｕＭからｌＱｕＭの濃度で存在するとき、 組成物は最も有効であると思われる。

さらに、アルファートロンビンやガンマ−トロンビンをも用いることができ、そ の場合、Ｑ、ｌｕＭから１０ｕＭの濃度が有効と考えられる。しかしながら、当 業者既知の経験的な方法を用い、特定の方法で投与される特定の組成物について 適切な治療量をより正確に決定することができる。

また、傷の治癒を促進するためにトロンビンアゴニストを用いる方法をも提供す るものである。そのような１方法は、トロンピンーリセブター結合ドメインおよ びセリンエステラーゼ保存アミノ酸配列を有するドメインの両者を含有する、治 療有効量のトロンビンのポリペプチド誘導体またはその生理学的かつ機能的等価 物を傷に適用することを含む。通常、線維芽細胞を刺激し、それによって組織の 再生を刺激するのに充分な量のトロンビンを適用する。そのような方法は、一般 に、傷部位への局所適用に関連しているので、全身性の毒作用の可能性は問題と されないと考えられる。したがって、実際には、どのような濃度を用いてもよい 。しかしながら傷の治療には傷表面に約１　ｎｇ／ｃｍ”　−１０ｕｇ／ａｍ″ の範囲に達するよう、傷を処置することが好ましい。

また、本発明は、傷の治癒を促進する方法であって、治療有効量のアルファート ロンビン（傷表面あたり１　ｎｇ／　ｃｍ”　１０　ｕｇ／　ａｍ”）、ガンマ −トロンビン（傷表面あたり１　ｎｇ／　ａｍ’　−１０ｕｇ／　ｃｍりを、上 記トロンビン誘導体と一緒に傷に適用することからなる方法を提供するものであ る。もちろん、本発明によって提供される特定のポリペプチドおよび医薬組成物 を傷の治癒促進に用いてもよい。これらの方法は、重大な事故に遭遇した患者（ とりわけ火傷患者）、外科手術を受けた患者、および傷治癒反応が低い患者（高 齢者や糖尿病患者）にとって特に有用である。

さらに、本発明は、トロンビンーリセプター阻害性ポリペプチドを用いる方法を 提供するものである。例えば、本発明は、トロンビンーリセプター結合ドメイン を含有するがセリンエステラーゼ保存配列を含有しない、治療有効量のトロンビ ンのポリペプチド誘導体またはその生理学的機能の等価物を傷または搬痕組織に 適用し、搬痕組織の形成を阻止する方法を提供するものである。通常、トロンビ ンーリセプターを仲介する事象を阻止するのに充分な濃度であることが適当であ る。好ましい態様では、傷表面に約１　ｎｇ／ｃｏｄ”　−１０ｕｇ／　ｃａｂ ”の範囲であることが適当と考えられる。

トロンビンのポリペプチド誘導体は、Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｓｐ　−Ａ 　ｌａで示されるしアミノ酸配列を有することが好ましい。

一般に、これらの方法は、火傷患者や眼科の外科手術を受けた患者など、癲痕の 形成が望ましくないあらゆる状況に用い得る。また、本発明方法は、ケロイドの 形成防止にも有用である。傷にエアゾールスプレーを吹き付ける方法が、火傷患 者の傷部分にポリペプチド化合物を適用する上で、特に滅菌された好都合な方法 と考えられる。

阻害性ポリペプチドは線維組織の形成による体器官間の異常な結合、と定義され る組織の癒着の阻止にも有用であることが分かるであろう。そのような癒着には 、線維芽細胞の増殖が必要である。アルファートロンビンは線維芽細胞の増殖を 誘発することが知られているので、本発明のペプチドによる、トロンビンを介す る有糸***の阻止によって癒着の形成が減少される。そのような阻害性ポリペプ チドを関係する器官の表面に適用することは、しばしば腸管の癒着が術後の合併 症として起こる胸部外科手術など、ある種の外科手術の後において殊に有用と思 われる。

阻害性ペプチドはまた、腫瘍を有する哺乳類において腫瘍の転移や血管形成を阻 止するための治療に有用ということが分かるであろう。この見解はアルファート ロンビンが、転移防止に重要な、内部−内皮細胞の正常な接触を破壊し得るとの 研究および、アルファートロンビンが血管形成に必要な内皮細胞の増殖を誘導し 得るという研究によって支持されている。したがって、本発明は、そのような腫 瘍を有する哺乳類動物に、トロンビンーリセプター結合ドメインを含有するがセ リンエステラーゼ保存アミノ酸配列を含有しない、治療有効量のトロンビンのポ リペプチド誘導体またはその生理学的等価物を投与する方法を提供するものであ る。正確な量は当業者既知の経験的な方法によって決定されるべきであるが、治 療すべき部位での濃度が０．ＩｕＭからｌＱｕＭの範囲に到達するのに充分な量 が必要と算定される。トロンビン結合ドメインがＡ　ｒｇ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　 ５ｐ−Ａｌａで示されるしアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いることが特 に提案される。このことに関しては、ポリペプチドを静脈投与することが最も有 効と考えられる。しかしながら他の投与方法でも同様に有効であることが明らか になるであろう。

本発明の最も一般的な実施態様は、細胞増殖を阻止するために阻害性ポリペプチ ドを用いることである。この方法には、インビトロでの細胞増殖阻止が望まれる 場合が包含されるがそれに限定されない。もちろん、細胞増殖の総合的な阻害物 質として、Ａｒｇ−Ｇｌｙ　−Ａｓｐ−Ａｌａで示される特殊な配列を有するト ロンビン結合ドメインを有する阻害性ポリペプチドを用いることもできる。

また他の一般的な実施態様として、本発明は細胞増殖を強化するために刺激性ポ リペプチドを用いる方法をも含む。式：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒ ｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙ ｓ−Ｃ；Ｉｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖ ａｌで示される配列を有するポリペプチドが特に提供される。この方法には、イ ンビトロでの細胞増殖の強化が望まれる場合が包含されるがそれに限定されない 。そのような細胞刺激の使用は、さらに、有効量のアルファートロンビン（０， ｌｏｇ／ｍ１２−１０ｕｇ／ｍｆり、ガンマ−トロンビン（０，Ｉｕｇ／ｍ１２ 　１０ｕｇ／ｍｌり、またはホルボール・ミリステート・アセテート（１０ｎｇ ／ｍｌ！　−１００ｎｇ／ｍｆ）を刺激性ポリペプチドと一緒に供給することで 増強される。

本発明の目的から、トロンビン誘導体とは、インビボまたはインビトロのいずれ で合成されたものであろうと、少な（ともトロンビンの一部から誘導されたアミ ノ酸配列を有する分子と定義する。従って、本明細書中、トロンビン誘導体とは 、アミノ酸数がトロンビンより少ないポリペプチド分子を指す。

トロンビンの生理学的に機能的な等価物とは、トロンビン誘導体とは異なる分子 であって、特にトロンビンーリセブターの結合ドメインまたはセリンエステラー ゼ保存アミノ酸配列の機能に影響を及ぼさない分子を含む。具体的には、保存的 なアミノ酸置換および修飾、例えばカルボキシ末端のアミド化、アミノ末端のア シル化、ポリペプチドと生理学的に不活性な担体分子との抱合体、またはセリン エステラーゼ保存配列に一致する配列の変化などが含まれるがこれらに限定され ない。

トロンビンーリ、セブター結合ドメインとはトロンビンーリセプターと直接結合 し、かつ／または高親和性のトロンビンーリセプターとアルファートロンビンと の結合を競合的に阻害するポリペプチド配列と定義する。

セリンエステラーゼ保存配列を有するドメインとは、既にセＩＪ　７プロテアー ゼの間で高度に保存性を有することが示されたドデカペプチドの、式：　Ａｓｐ −Ｘ、−Ｃｙｓ−Ｘｔ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　−５ｅｒ−Ｇｌｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｐ 　ｒｏ　−Ｘ　３−　Ｖ　ａｌ（式中、ＸｌはＡｌａまたはＳｅｒ、ＸｔはＧｌ ｕまたはＧｉｎ、Ｘ、はＰｈｅ、　Ｍｅｔ、　Ｌｅｕ、　ＨｉｓまたはＶａｌを 表す）で示されるＮ末端アミノ酸配列の少なくとも４−１２個を含有するポリペ プチド配列と定義される。

刺激性ポリペプチドとは、トロンビンーリセプターと結合し、刺激する能力を共 に有するトロンビンのポリペプチド誘導体、またはその生理学的に機能的な等価 物であると定義する。従って、刺激性ペプチドはトロンピンーリセプター結合ド メインと、セリンエステラーゼ保存アミノ酸配列を有するドメインの両方を包含 するであろう。

阻害性ポリペプチドとは、トロンビンーリセブター結合ドメインを有するが、セ リンエステラーゼ保存アミノ酸配列を有さない、トロンビンのポリペプチド誘導 体またはその生理学的に機能的な等傷物と定義される。

第１図：ヒトプロトロンビンの残基４８９−５４８のヒトロバシー、溶解性、お よび推定の２次構造に関するコンピューター分析の結果を示す図である。第１Ａ 図は、ヒトロバシー像、第２Ｂ図は溶解像、第１Ｃ図は推定の可動回転傾向、第 １Ｄ図は推定のアルファへりックスおよびベータシート構造を示す。

第２図：以下のＰＵＲＯＴＥＵＳコンピューターを用いるトロンビン特異的残基 の置換を有するトリプシンのＸ−線結晶学的データを３次元的に表現した図であ る：　Ｇ　ｌ）’＋５７Ｌｙｓ　；　ＬＹＳ＋ａａ　Ａｒｇ　；　Ｓｅｒ＋ｓｏ 　Ａ　ｌａ　；　Ｇ　１ｎ＋ｅｔ　Ｃｙ　ｌｕ　；およびＶａＬｓｓ　Ｐｈｅは 第２Ａ図および第２Ｄ図に示されている。第２Ｂ図および第２Ｃ図は３つの活性 残基（ＨｉＳｓ９、Ａｓｐ、０．、Ｓｅｒ＋ｓｓ）部位と、トロンビンの残基５ １〇−５３０とホモローガスな領域に位置するトリプシンの残基１８３−２００ のみを示す。これらのペプチドは第２Ａ図および第２Ｄ図の回転モデルにおける と同じ位置に配向されている。

第３図二合成ペプチドｐ５０８−５３０の、マウス胚（ＭＥ）細胞に対する［” ！］−アルファートロンビンの結合阻害作用を示す図である。記載の濃度のペプ チドの存在下でのＭＥ細胞への０．３ｎＭ［＋−ｓ■］−アルファートロンビン の特異的結合を好ましい実施態様の箇所で述べた方法で測定した。

第４図：ｐ５０８−５３０単独または低濃度のアルファートロンビンの共存下で の［３Ｈ］−チミジン取り込みへの影響を示す図である。ＭＥ（第４Ａ図）また はＮＩＬ（ハムスターの線維芽細胞系統、第４Ｂ図）の血清不含静止培養物を記 載の濃度のｐ５０８−５３０単独（○）、または最大応答の約１／３を与える濃 度のアルファートロンビンとの混合物で処理した。ＭＥ細胞については２ｎＭ（ 第４Ａ図）、ＮＩＬ細胞については４ｎＭ（第４Ｂ図）。［’Ｈ］チミジンの取 り込みを好ましい実施態様に述べたように、２４時間後に測定した。

第５図：　ＰＭＡの共存下、ｐ５０８−５３０（７）［”Ｈコチミジン取り込み に対する影響を表す図である。ＮＩＬ細胞の静止培養物をｐ５０８−５３０単独 （○）、または２５ｒ＋９／ｄＰＭＡの共存下でインキュベートした。［’Ｈ］ チミジンの取り込みを好ましい実施態様に述べたようにしてめた。

第６図ニトロンビン刺激チミジン取り込みに対するペプチドの影響を示す比較図 である。ＮＩＬ細胞の静止培養物をｌｎＭのアルファートロンビン（マイトジェ ン濃度の限界値）の存在下、漸増濃度のｐ５０８−５３０、ｐ５１９−５３０、 またはｐ５１７−５２０と一緒にインキュベートした。データをアルファートロ ンビン単独使用の効果に対する割合（％）として各濃度ごとに表した。

第７図：［３Ｈ］チミジン取り込みへのトロンビン刺激に対スルｐ５１７−５２ ０の影響を示す図である。ＭＥ細胞の静止培養物を漸増濃度のアルファートロン ビン単独、または６２５ｎＭのｐ５１７−５２０と一緒にインキュベートした。

［３Ｈ］チミジン取り込みは好ましい実施態様に記載の方法でめた。

かつては血液の凝固との関係においてのみ重要と考えられていた分子であるトロ ンビンは、今や、凝固と直接関係の無い多くの重要な生物学的作用を仲介するこ とが分かっている。これらの作用の多くは、少なくとも部分的に、トロンビンま たはトロンビン様分子と多数の細胞の表面に存在している高新和性トロンピンー リセブターとの相互作用によって産生されるシグナルに依っている。

本発明との関係において行った研究は、トロンビンで仲介される事象が、そのよ うな事象を模倣する、または阻害するよう特別に設計されたポリペプチドの形成 および合成によって選択的に制御されることを示唆していた。これらの作用を果 し得る、プロテアーゼ阻害物質に抵抗性の小さいポリペプチドの開発は、トロン ビンが、タンパク分解酵素阻害物質、例えば抗トロンビンの作用を受け易いとい う点から、望ましいことである。

ヒトプロトロンビンの配列に基づいて多くのペプチドを合成し、リセプターとの 結合能力および増殖性シグナルの産生能力を試験した。ペプチドの選択は、トロ ンビンの活性部位セリンの近傍領域のアミノ酸配列を中心として行われた。この 領域には、フィブロネクチンのトリペプチド細胞結合ドメイン［Ａ　ｒｇ　−Ｇ 　ｌｙ　−Ａ　ｓｐ］とホモロ−ガスな配列を有するドメイン［ヒトプロトロン ビンの残基５１７−５２０で表される］が含有されている。このトリペプチド配 列は細胞と相互反応し得る多くのタンパク質に共通している［ルスラーチ（Ｒｏ ｕｓ　１ａｈｔ　ｉ）およびペアシュバラシャ−（Ｐ　ｅｉｒｓｃｈｂａｃｈｅ ｒ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、４４：５１７−５１８．１９８５年参照］。さらに 、ヒトプロトロンビンの５１７−５２０で示されるペプチド（ｐ５１７−５２０ ）およびヒトプロトロンビンの５１６−５２２、およヒ５１０−５２６（それぞ れ、ｐ５１６−５２２およびｐ５１０−５２６）はフィブロネクチン特異的ペプ チドによる誘導と匹敵する線維芽細胞の付着（アタッチメント）を促進し得る。

選択された領域はまた、多くのセリンプロテアーゼと類似性の高いドメイン（ヒ トプロトロンビンの残基５１９−５３０で示される）を有する。

本発明者らはフィブロネクチンおよびセリンプロテアーゼとホモローガスなドメ イン（ヒトプロトロンビンの残基５０８−５３０）がトロンビンーリセブターと 高度の親和性をもって結合し、リセブター占有に関連するマイトジェン性シグナ ルの開始物質としてＤＩＰ−アルファートロンビンと代わり得ることを見いだし た。これと対照的に、フィブロネクチンとホモローガスなドメインのみを有する 合成ペプチド（ｐ５１７−５２０）はトロンビンーリセブタート結合しても*** （マイトジェネシス）を誘発しない。中間体ペプチド（ｐ５１９−５３０）は分 裂促進を仲介し得る能力を保持しているが、ｐ５０８−５３０よりもはるかに低 い。

実施例１ニトロンビンとその高度に親和性のりセプターとの結合に関連するヒト アルファートロンビンのドメインの選択リセプターとの結合に関与し得るペプチ ド配列の選択の助けとして、コンピューター分析を用い、ヒトプロトロンビンの 配列［デゲン（Ｄ　ｅｇｅｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｔ）、２ ２　：　２０８７−２０９７．１９８３年］に基いてアルファートロンビンの活 性部。

位セリン周辺の６０アミノ酸残基について、全ヒトロバシー、溶解性、および二 次構造像を予測した。第１Ａ図および第１Ｂ図に示すように、この領域、特に、 フィブロネクチンの細胞付着ドメインとホモローガスな領域の近くである残基５ １７−５２０は高度に親水性かつ溶解性と思われる。二次構造像の分析から、ト ロンビンの残基５１１−５２６の領域は可動回転領域としての傾向が強く、アル ファへりックスまたはベーターシート構造をとる傾向は殆んどないことが分かる （第１Ｃ図および第１Ｄ図）。コンピューターを用いた種々の分析を総合すると 、トロンビンのこの領域は外部から近付きやすく、従って細胞表面のトロンビン ーリセブターと相互反応しやすいことが強く示唆された。しかも、フィブロネク チンの細胞付着ドメインとホモローガスなトロンビンの領域はこのトロンビンの 親水性可動回転の中心またはその極く近くに位置している。

トリプシンに関する三次元Ｘ−線結晶学的データ［マーカート（Ｍａｒｑｕａｒ ｔ）ら、アクタ・クリスタルオグラフィ力（Ａ　ｅｔａ、　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏ ｇｒ、）、３９：４８０．１９８３年］を用い、トリプシンの活性部位セリン部 分周辺がトロンビン配列を反映するよう適当なアミノ酸置換を行うと、コンピュ ーターグラフィックアナリシスは、トロンビンの残基５１０から５３０が活性部 位の割れ目（クレット）に至るポケットの端にそって位置していることが予測さ れる（第２図）。上記の二次構造の予測と一致して、トロンビンのアミノ酸残基 ５１７−５２０は、提案されたトリプシン／トロンビン構造のこの領域の最も外 側の角に位置している。即ち、トロンビンのこの領域が、リセブターとの結合に 関連しているということは、理にかなっているようである。

実施例２：ペプチドの合成 自動化装置［Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙ ｎｔｈｅｓｙｚｅｒ　Ｍｏｄｅ１４３０Ａ］を用い、固相法でペプチドを合成し ［エリックソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）およびメリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉ ｅｌｄ）ら、ザ・プロテインズ（Ｔ　ｈｅ　Ｐ　ｒｏｔｅｉｎｓ）、２　：　２ ５５−２５７．１９７６年］、Ｃ−１８カラムと０．５％（ｖ／ｖ）　Ｔ　Ｆ　 Ａ　（トリフルオロ酢酸）を含有するアセトニトリル線状グラジェントを用いて ＨＰＬＣで精製した。

実施例３ニトロンビン誘導体が選択的に高親和性トロンビンーリセプターと結合 するということの証明 この実施例では、本発明のペプチドが多（の細胞型の表面に存在する高親和性ト ロンピンーリセプターと選択的に結合し得るということを証明する。この実施態 様では、この活性を、［”５１］−アルファートロンビンと培養された２株の線 維芽細胞のトロンビンーリセブターとの結合に対する本発明のペプチドの競合的 な阻害によって証明した。従って、以下に示す特殊な方法は、今日では発明者が 認識しているこの活性を証明するため最適方法である。

ａ、高親和性トロンビンーリセプターを有する線維芽細胞の培養物 上記のごとく、２つの供給源から導かれた線維芽細胞を用いて本発明のペプチド と高親和性トロンビンーリセブターとの結合を証明した。これらの細胞の調製を 以下に示す。

［カーネイ（Ｃａｒｎｅｙ）およびカンニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）、セ ル（Ｃｅｌｌ）、１５：　１３４１−１３４９．１９７８年コの記載のごとく、 ＮＩＨ−スイス遠縁交配マウスの９−１３日令の胚から、線維芽細胞の１次培養 物を調製した。ハムスター線維芽細胞の樹立菌株であるＮＩＬ細胞を保存培養物 として維持し、４日毎に継代培養した。

ずべての細胞を、１０％（Ｖ／Ｖ）のウシ血清＜ＣＳ）を補充したダルベツコ− ポット（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ−Ｖｏｇｔ）の改良イーグル培地（ＤＶ）で、Ｃ０， ５％を含む湿った空気中、３７°Ｃで培養した。

１００ｍｍの皿から得た保存細胞を０．０５％ｈ／　Ｖ）　トリプシンおよび０ ．２％Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（Ｗ／　Ｖ）を含むりん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で 継代培養し、それを、２４ウエルの培養プレートを用い、１０％（ｖ／ｖ）Ｃ３ を補充したＤ培地中で６Ｘ１０’細胞／ｃ１１′の密度で培養することにより、 静止培養を調製した。−夜、細胞を付着させ、培地を除去し、細胞を血清不含の ＤＶ培地で洗浄した。実験の前に、得られた細胞をこの血清不含培地中で４８時 間培養した。この工程で、Ｇ、／Ｃ；０細胞周期境界面で９０−９５％が捕獲さ れる、マウスおよびＮｌＬｉ、［［ｌ胞の非増殖性集団が得られることが分かっ た。

ｂ、）ロンビンとトロンビン誘導体の細胞表面トロンビンーリセブターへの特異 結合を測定するためのアッセイ上記のごとく、本実施態様では、トロンビン誘導 体のトロンビンーリセブターとの特異結合能力を、固有の［＋１１１１］　）ロ ンビンとトロンビンーリセブターとの結合を競合的に阻害する能力の関数として 測定した。競合的な結合を研究するために用いた具体的な方法を以下に示す。

ヒトアルファートロンビンをベンズアミジン（活性部位の競合的な阻害物質）、 ラクトペルオキシダーゼ、およびＮａ［”！］の存在下、沃素化した。ゲルろ過 および透析の後、［”’Ｉ］−アルファートロンビンは、比活性１〜３　Ｘ　１ ０−’ＣＰＭ／ｕｇを有し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルア ミドゲル上、標識されていないアルファートロンビンと一緒にシングルバンドと して泳動した。

これらの沃素化された製品はそのフィブリノーゲン凝固活性の約８０％を保持し ていた。

合成ペプチドの［’″５Ｉ］５Ｉ］−アルフアートロンビン芽細胞への特異的結 合に対する競合能力を、２４ウエルプレー）　（Ｆ　ａｌｃｏｎ）中、非増殖性 の、マイトジェンに反応性の培養物を用い、既述の方法しカーネイ（Ｃａｒｎｅ ｙ）およびカンニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）、セル（Ｃｅｌｌ）、１５： 　１３４１−１３４９（１９７８）コに従い、細胞密度約５Ｘ１０’細胞／ｃｍ ’で、測定した。細胞上の培地を結合培地［１５ｍＭ　ＨＥＰＥＳでｐＨ７，０ に調節した０、５％（Ｖ／Ｖ）ウシ血清アルブミン含有ＤＶ培地］に変えた。２ ３°Ｃで３０分間細胞を平衡化し、培地を指示した濃度のペプチドを含有する［ ＋−ｓｌ］−アルファートロンビン（１０ｎｇ／１ｆｆ）含有結合培地に変えた 。２３°Ｃで２時間経過後、細胞を素早く、水冷ＰＢＳで４回洗浄することによ りアッセイを終了した。細胞を０．５Ｎ　ＮａＯＨ１ｉ１２に溶かし、Ｂ　ｅｃ ｋｍａｎガンマカウンターで総放射活性を測定した。１００倍過剰量の非標識ア ルファートロンビンを含有する結合培地中でインキュベートした後、培養物と結 合した放射活性を測定し、非特異的結合をめた。特異的結合は培養物と結合した 総放射活性から非特異的結合を差し引いてめた。

Ｃ１選択したトロンビン誘導体のトロンビン結合活性本発明のポリペプチドのト ロンビンーリセブター結合活性を証明ために実施例１記載のごとくにして合成し たペプチドのトロンビンーリセフター結合活性を直前の節で述べたアッセイシス テムによって試験した。

具体的には、トロンビンーリセブターと結合したｐ５０８−５３０を証明するた めに、ＭＥ細胞の全面生長培養物を０．３ｎＭ［”ｓＢ−アルファートロンビン および濃度８〜４０００ｎＭのｐ５０８−５３０と一緒に２３°Ｃで９０分間イ ンキュベートした。第３図に示すように、ｐ５０８−５３０は、［ｌ傘ｓ■］− アルファートロンビンのＭＥ細胞への特異的結合を３０〜７０％競合した。［＋ １５１］標識ｐ５０８−５３０の直接結合のスキャッチャード（Ｓ　ｃａｔｃｈ ａｒｄ）分析から、ＫＤは約６Ｘ１０−”Ｍと示唆された（データは記載されて いない）。

加えて、［”’　Ｉ　］−ｐ５０８−５３０のＭＥ細胞との特異的結合は、過剰 量のｐ５０８−５３０または過剰量のヒトアルファートロンビンのいずれによっ ても置換された。即ち、［Ｉ＝Ｓｒｌ−アルファートロンビン結合に対するｐ５ ０８−５３０の競合から、ｐ５０８−５３０の結合部位はアルファートロンビン と同一であるが、親和性は約１けた低いと思われる。

さらに、ｐ５０８−５３０の結合およびマイトジェン活性が特異的であることを 示すために、ｐ５０８−５３０と物理的特性は同一であるが、ヒトアルファート ロンビンと配列のホモロジーを持たない２個の合成ペプチドの結合特徴を試験し た。これらの両ペプチドは［一方は１２アミノ酸（疎水性残基が３３％であって ｎｅｔ電荷−３）からなり、他方は１８アミノ酸（疎水性残基が３９％であって 、ｎｅｔＮ荷０　）］は、最高濃度５μＭで［１１５１］−アルファートロンビ ンの結合阻害は５％以下であった。

さらに、高親和性結合とマイトジェン性シグナルの生成に関与するトロンビンの 領域を同定するために、ｐ５０８　５３０　ｆ）特Ｘ的領域を表す２つのペプチ ドを試験した。第１のペプチドはセリンプロテアーゼ間で高度に保存されるトロ ンビンの領域である、ヒトプロトロンビンのＢ−鎖領域の残基５１９−５３０を 表す。第２のペプチドはフィブロネクチンの細胞結合領域とホモローガスなトロ ンビンの領域である、プロトロンビンの残基５１７−５２０を表す。

これらのペプチドはいずれも［”！］−アルファートロンビンのＭＥ細胞への結 合に３０％〜５０％の割合で競合するが、両方とも、最初のペプチドｐ５０８− ５３０の場合より高濃度であることを要した（表１）。例えば、［１！５■コー アルファ−トロンビン結合を３０％阻害するにはｐ５０８−５３０よりも、ｐ５ １９−５３０およびｐ５１７−５２０は、３３倍から５０倍高濃度であることが 必要である。このように、これらのペプチドはいずれもトロンピンーリセブター と相互反応するが、ｐ５０８−５３０よりも親和性が低いと思われる。ｐ５１７ −５２０はフィブロネクチンの細胞結合ドメインとホモローガスであるので、配 列、Ａ　ｒｇ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｓ　ｅｒ（フィブロネクチン特異的 ペプチドの配列）を有するペプチドについても、［”５１］−アルファートロン ビン結合に対する競合能力を試験した。

このペプチドは濃度１　、３　ｕＭでは［”５１１−アルファートロンビンと結 合に関して競合しなかった。このように、アルファートロンビンのりセブターは 、フィブロネクチンと特異的に相互反応して、フィブロネクチンの見掛は上の増 殖促進作用を引き起こす膜タンパク質と同一ではない。さらに、アラニンをセリ ンで置換すると、合成ペプチドのアルファートロ／ビンの結合に対する競合能力 が消滅することが示され、これらの結果から、トロンビンのりセプター結合ドメ インにはアラニン残基が必要であることが分かった。

（以下余白） 表１゜ＭＥ細胞への［”’Ｉ］−アルファートロンビンの結合に対するペプチド の競合の比較 ペプチド　アミノ酸配列　３０％阻害に　最大阻害％ｐ５０８−５３０　ＡＧＹ ＫＰＤＥＣ−６ｎＭ　７８％−ＫＲＧＤＡＣＥ−（４０ｘＭ） −ＧＤＳＧＧＰＦＶ ｐ５１９　５３０　ＤＡＣＥＧＤ−２００ｎＭ　５１％−３ＧＧＰＦＶ　（８０ ０ｎＭ） ｐ５１７−５２０　ＲＧＤＡ　３００ｎＭ　５０％（２，７ｕＭ） 様々す濃度のペプチドと［”５Ｉ］−アルファートロンビン（１１１Ｍ）とを静 止ＭＥ細胞と一緒に２３°Ｃで９０分間インキュベートした。

［Ｉ！５１］−アルファートロンビンの特異結合は実施例３記載の定義この実施 例では、刺激性（作用性）ポリペプチドがトロンビンーリセプターと結合するこ とによって、ＤＮＡ合成と細胞分割を誘導するりセブター占有シグナルが生成さ れるということを証明する。本実施例の態様では、ＤＮＡ合成および細胞増殖を 、非マイトジェンＪＲのアルファートロンビンまたはＰＭＡの存在下、選択した ポリペプチドに暴露した培養線維芽細胞の［３Ｈ］チミジン取り込みの関数とし て算出した。下記のインビトロの方法は選択したポリペプチドの刺激性作用を証 明するのに最も適した方法であるが、当業者ならば直下に示したインビトロ系の 原理をインビボにも適用し得ることを理解するであろう。

ａ、ＤＮＡ合成の測定方法 ＤＮＡ合成に対する合成ペプチドの影響は、通常、ペプチドおよび／またはトロ ンビン添加の２２時間後、２時間のインキュベーションの間のメチル−［３Ｈ］ −チミジン（ＴｄＲ，ＩＣＮＣデフマシューティカルス、アーウ゛イン、Ｃａ） の取り込みを測定することでめられる［スティーンバーグ（Ｓ　ｔ　ｉｅｒｎｂ ｅｒｇ）ら、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジ−（Ｊ　、　Ｃｅｌｌ 　Ｐ　ｈｙｓｉｏｌ、　）、１２０：２０９−２８５（１９８４）］。インキュ ベイーョンの後、細胞を抽出し、水冷１０％（９１／Ｖ））リクロロ酢酸（ＴＣ Ａ）で洗浄した。酸で析出可能な物質を０．５Ｎ　ＫＯＨ（０，５！ｆ２）！＝ ２３°Ｃで一夜溶かした。ＨＣｌ２（１Ｎ）（０，２５ｘのを加え、得られた溶 液をＲｅｄｉ　Ｓ　ｏｌｖ　−ＨＰ　ｂ（ベックマン・インスツルメント、ヒユ ーストン、ＴＸ）のシンチレーション液１０Ｍρ中で計数した。

ｂ０選択したトロンビン誘導体のマイトジェン活性合成した各トロンビン誘導体 について、実施例３（ｃ）に記載の２つの非トロンビンペプチドと同様にマイト ジェン活性を試験した。

これらの実験の結果を以下に示す。

本発明者らは、まず最初にＭＥまたはＮＩＬ細胞の非増殖性培養物におけるｐ５ ０８−５３０のＤＮＡ合成刺激能力を試験した。第４図に示すように、ｐ５０８ −５３０はそれのみでは［３Ｈ］−チミジンのＤＮＡへの導入を刺激するのに十 分でなかった。しかしながら、２ｎＭのアルファートロンビンと併用すると、Ｑ 、ｌｕＭのｐ５０８−５３０は、未処理、またはアルファートロンビンのみで処 理して並行培養した結果と比較して、ＭＥ細胞のＤＮＡへの［３Ｈ］チミジンの 導入を６または２倍以上刺激した。同様のマイトジェン性刺激がＮＩＬハムスタ ー細胞の場合にも認められたが、この場合にはトロンビンおよびペプチドがやや 高濃度であることを要した（第４Ｂ図）。

両細胞型の応答は最大有効濃度のアルファートロンビン（１０ｘＭ）による刺激 に対するマイトジェン性応答と同等である。ＭＥ細胞について、ｐ５０８−５３ ０による刺激は、ＭＥ細胞への［＋＝Ｓｌ］−アルファートロンビンの結合を阻 害するのに要する濃度（第３図）である、１２．５ｎＭ−１００ｎＭ（第４Ａ図 ）の間に観察されるということは注目される。ＮＩＬ細胞についても、ｐ５０８ −５３０のマイトジェン性濃度とトロンビン結合の阻害濃度との間に同様の関係 が認められるが、ＭＥ細胞の場合に要した濃度よりも高レベルであることが必要 である。

これらの結果は、ｐ５０８−５３０が高親和性トロンビンーリセプターとの相互 反応によってマイトジェン性シグナルを生成することを示唆するものであるが、 ペプチドは単にアルファートロンビンの有効濃度を増大したにすぎないという可 能性もある。最近、ホルボール・ミリステート・アセテート（ＰＭＡ）が、ガン マートロンビンノ作用ヲ模倣し、ＤＴＰ−アルファートロンビンまたはトロンビ ンーリセプターのモノクローナル抗体と一緒にＤ　Ｎ　Ａ合成および細胞増殖を 刺激することが分かった。したがって、ｐ５０８−５３０がリセブター占有に関 連したシグナルを生成しているのならば、ＰＭＡと一緒に細胞に与えれば***を 刺激するはずであるということが予測された。第５図に示すように、２５ｎｇ／ Ｈ２ＰＭＡ（非マイトジェン濃度）の存在下、ｐ５０８−５３０は対照の３．５ 倍のＤＮＡ合成を刺激した。この刺激は低濃度のアルファートロンビンの存在下 でのＤＮＡ合成刺激に必要なペプチド濃度とほぼ同じペプチド濃度で起きた。こ れらの実験には活性トロンビンが存在しないので、ｐ５０８−５３０自身が高親 和性トロンビンーリセプターとのＤＩＰ−またはアルファートロンビンの結合の 効果に模して、マイトジェン性シグナルを生成したと思われる。

ｐ５０８−５３０によるＤＮＡ合成の刺激がその高親和性トロンビンーリセブタ ーとの相互反応によるということを確認するために、実施例３（ｃ）記載の、合 成した、非トロンビンかつ非すセブター結合ポリペプチドのマイトジェン活性を 試験した。これらのペプチドのいずれもｌｎＭアルファートロンビンの存在下、 マイトジェン応答を生じなかった。即ち、ｐ！ｂ０８−５３０の結合活性および マイトジェン活性はいずれも、ポリペプチドと細胞との非特異的相互反応による ものではない。

本発明者らは次に、より小さいトロンビン誘Ｉ体、ｐ５１９−５３０およびｐ５ １７−５２０のマイトジェン活性を試験した。上記実施例３（ｃ）で示唆された ように、これらのペプチドは共に、高親和性トロンピンーリセブターと結合する 。これらの実験では、漸増濃度のｐ５１９−５３０およびｐ５１７−５２０を２ および４ｎＭのアルファートロンビンの存在下、ＮＩＬ細胞の静止培養に加えた 。

第６図に示すように、ｐ５１９は濃度全体を通してＤＮＡ合成を促進したが、ｐ ５１７−５２０は促進しなかった。実際には、ｐ５１７−５２０はＤＮＡ合成を 阻害した。

実施例５　：ｐ５１７−５２０による、トロンビンーリセプターを介する***の 阻害 ｐ５１７−５２０がアルファートロンビン刺激***を阻害するという観察は、ト ロンビンのマイトジェン性および膜透過のシグナル効果は、活性なアルファート ロンビン結合に競合するトロンビン誘導体であるＤＩＰ−アルファートロンビン によって阻害されない、ということを示すこれまでの研究に照らして幾分驚くべ きことである。即ち、本発明者らは、高親和性の細胞表面トロンビンーリセブタ ーへの結合において固有のアルファートロンビンと競合し得るがマイトジェン性 のりセプター占有シグナルは生成し得ないことから、ｐ５１７−５２０はこれま で当業者に知られていない特性を存するということを認識した。

ｐ５１７−５２０がトロンビンを介する***を阻害する機構を解説するために、 本発明者らは一定濃度（６２５ｎＭ）のｐ５１７−５２０を加えた培養中のＤＮ Ａ合成に対する漸増濃度のアルファートロンビンの刺激作用を測定した（第７図 ）。これらの実験からｐ５１７−５２０が細胞のアルファートロンビンに対する 用量一応答曲線を有意にシフトさせることが分かった。例えば、アルファートロ ンビンの２濃度、０．８ｎＭおよび１３．０ｎＭでは、ＤＮＡ合成はそれぞれ約 ７５％および３５％阻害された。即ち、ｐ５１７−５２０によるアルファートロ ンビン刺激の阻害には、ペプチドが５００−１０００倍モル多く必要であると思 われる。この発見はｐ５１７−５２０のＭＥ細胞上のトロンビンーリセブターに 対する競合的結合親和性がｐ５０８−’５３０よりも低いということと一致する 。

ｐ５１７−５２０がトロンビンの高親和性結合ドメインであるとの同定にはトロ ンビンのマイトジェン応答に関する暗示が幾つカ含まれている。これまでの研究 によってトロンビンで処理されたニワトリの胚細胞の表面において、分子がタン パク分解的に開裂され、消滅したことが示された。活性な、および不活性なトロ ンビンを用いる交差結合研究によって２つの異なるサイズのりセブター分子また は基質が同定された。この結果は、トロンビンの高親和性結合ドメインが活性部 位クレットと極めて接近しており、従って、トロンビンがリセプターを開裂する ことができることを示すものである。

トロンビンーリセブターのアフィニティー精製のデータはりセブターそのものが 活性なトロンビンによってタンパク分解的に開裂されるということを支持してい る。トロンピンーリセプター占有は開裂事象に必須の、リセプターの配置（コン ホメーション）の変化をもたらすよう刺激する可能性がある。本研究結果はペプ チドｐ５０８−５３０、ｐ５１９−５３０またはアルファートロンビンそのもの はそのような配置の変化をもたらし得るような方法でトロンピンーリセプターと 結合し得ることを示唆している。これと対照的に、ｐ５１７−５２０はりセプタ ーとのみ結合し得るようである。即ち、ｐ５１７−５２０は細胞に無意味なシグ ナルを提供するようなやり方で、トロンビンーリセブターと選択的に相互反応す る能力によって、トロンビンーリセプターによって仲介される事象を選択的に阻 害する。

実施例６：インビトロでの細胞増殖を増強する刺激性ペプチドの使用 多（の実験方法および診断法にはインビトロで増殖させた細胞が必要である。刺 激性ペプチドは高親和性トロンビンーリセブターを有する線維芽細胞の増殖を促 進するので、培養培地へのそのような刺激性分子の導入は効果的な細胞増殖の増 強法である。しかも、トロンビンは内皮細胞などの他の細胞の増殖をも増強する ので、これらのペプチドは多くの細胞型の増殖を有効に促進し得る。増殖補充物 として合成ポリペプチドを使用することには多くの利点がある。

天然に存在するトロンビンを精製するよりもポリペプチドを合成するほうがはる かに経済的である。さらに、天然に存在するトロンビンと異なり、ポリペプチド は血清中のプロテアーゼ阻害物質対して比較的抵抗性を有する。

当業者は培養のための細胞の調製法を多数知っている。カーネイ（Ｃａｒｎｅｙ ）ら［ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー（Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｐ　ｈ ｙｓｉｏｌ、　）、９５：１３−２２．１９７８年コによって記載された１つの 方法は本発明のこの側面を実施する上で特に適当と考えられる。

当業者には理解されるであろうが、本発明の刺激性ポリペプチドは、その細胞刺 激作用の利用を達成するために適当な細胞培養培地と一緒に用いることができる 。本発明者らは、例えば、Ｄ　ｕｌｂｅｃｃ。

−Ｖｏｇｔの改良イーグル培地やハムのＦ１２培地が特に適当な基礎培地である ことを見出だした。本発明を実行するためには、式：％式％ で示される刺激性ペプチドを培養培地に加える。次いで、細胞を適当な加湿雰囲 気下、例えば、５％ＣＯ２含有雰囲気下、３７°Ｃでインキュベートする。一定 間隔（３〜４日間）をおいて細胞培養から消耗された培地を除き、上記のごとく 調製された新しい培地で交換する。

実施例７：治療のプロトコール 新規な医薬品の開発に必然的に伴う慎重さの故に本発明のポリペプチドはヒトを 対照とする臨床試験には未だ付されていない。しかしながら、これらのポリペプ チドがインビトロにおいて、トロンビンによって仲介される***を選択的に増進 または阻害するということは、本発明がこの点に関して利用可能であることを示 すものと考えられる。以下に示す予想の方法は本発明者らが、本発明を様々な臨 床情況で実施する上で最良と考える実施態様である。

ａ、傷の治癒 刺激性ポリペプチドは傷の治癒の増強が望まれる様々な臨床情況において有用で あることが示されると考えられる。これらには、特に、火傷患者、大事故にあっ た人、種々の外科手術を受けた人、および高齢者や糖尿病患者など、傷の治癒反 応が低下している人等、などの治療が含まれる。最適なポリペプチド投与法は臨 床情況に応じて様々であるが、エアゾールスプレーの形で投与することが、その ような多くの情況に特に好都合と考えられる。治療物質をエアゾールスプレーに 含有させる方法は当該技術分野で周知である。故に、本発明の開示に照らして、 これらの刺激性ポリペプチドをそのようなエアゾールスプレーとして製剤化し、 用いることは当該技術分野では当然のことと考えられる。

刺激性ポリペプチドは、軟膏やローションの剤形で適用することもできる。ある いは、傷の被覆材料に含有させることもできる。治療用物質の組成物を軟膏、ロ ーションおよび包帯に含有せしめる方法もまた、本明細書によれば、当該技術分 野および当業者にとって周知のことである。

ポリペプチドの有効な用量は約０．５　ｕＭ　−５０ｕＭである。しかしながら 、正確な用量はまた、当然ながら、薬業にかかる当業者にとって周知の経験的な 方法で決定されるものである。

ｂ、阻害性ポリペプチドの使用 １、搬痕形成および組織癒着の阻止 阻害性ポリペプチドは多くの情況、例えば、線維芽細胞の増殖の阻止が望まれる 多くの場合に有用であると考えられる。これらには搬痕の形成および組織の癒着 の防止が含まれる。

本発明を実施する１つの方法は、阻害性ポリペプチド：Ａｒｇ−Ｇｌｙ　−Ａ　 ｓｐ　−Ａ　ｌａを傷、外科的な切開部位、または体器官の表面に適用するのに 適したビヒクルに含有させることにより行なわれる。これらのビヒクルには、組 織に直接適用するためのエアゾールスプレー、軟膏およびローション、並びに静 脈注射や皮下注射のための溶液が含まれる。上記のごとき医薬ビヒクルに治療物 質を含有させる方法は得られた組成物の適用方法と同様、当該技術分野の技術者 にとって良く知られていると考えられる。

ポリペプチドの有効用量としては、化合物を局所適用する場合、ｌ　ｕｇ／ｃｍ ’　−１０ｕｇ／ｃｍ”を提案する。注射の場合、有効用量は、必要とされる部 位でのポリペプチド濃度が０．１ｕＭ−１０ｕＭとなるのに十分な用量である。

しかしながら、正確な用量は、薬業界において当業者既知の認められた薬学的手 法で決定されるべきである。

２、腫瘍の治療 阻害性ポリペプチドはまた、様々な腫瘍の治療、とりわけ転位および血管形成の 阻止における有用性が明らかになると考えられる。

阻害性ポリペプチドを静脈内投与によって投与することが最適と予測される。

阻害性ポリペプチドを、毎日、連続注入するか、隔日に、さらに伝統的な化学療 法を数日おきに併用することができる。阻害性ポリペプチドの正確な投与Ｉは当 業者既知の方法で経験的に決定されるべきであるが、有効用量は、必要とされる 部位での濃度がＱ、ｌｕＭｌｏｕＭになるのに十分な量と見積もることができる 。どのようなタイプであれ、新規な医薬品として、許容し得ない毒作用が発現す る濃度を確認するための臨床試行が当然、必要である。

本発明は、本発明者らが、本発明の実施に最適方法であると考える具体的な実施 態様を挙げて開示された。しかしながら、本明細書の開示に鑑みて、様々な分野 の当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の改良を施し得るという ことを認めるであろう。

例えば、これらのペプチドの任意のものを当業者既知の様々な方法で投与するこ とができる。また、将来の研究によって刺激活性および阻害活性の増大されたト ロンビン誘導体が生産されることが期待される。特許請求の範囲は、これらの、 またはその他の改良および態様も包含するよう意図されている。

杉がｍ：に絣・ぼ−７Ｆ−簿 プレークー−２−ンー／−ｌ− トロンビン々デナＦ゛（％ＭＩ Ｏトロンビン孝鳩 ・トロンビン十　ｐ５１７−５２０ 国際調査報告

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．トロンビン−リセブター結合ドメインおよび少なくとも１２Ｌ−アミノ酸か らなるセリンエステラーゼ保存アミノ酸配列を有するドメインを有する、トロン ビンのポリペプチド誘導体、またはその生理学的に機能的な等価物を含有するポ リペプチド化合物。
2. ２．トロンピン−リセプター結合ドメインおよびセリンエステラーゼ保存アミノ 酸配列を有するドメインを有する、２３−Ｌアミノ酸を含有するポリペプチド化 合物。
3. ３．トロンピン−リセプター結合ドメインがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａを 含有し、セリンエステラーゼ保存アミノ酸配列が【配列があります】を 含有するものである請求項１または２記載のポリペプチド化合物。
4. ４．式： 【配列があります】 で示されるＬ−アミノ酸配列を含有するトロンビンのポリペプチド誘導体または その生理学的に機能的な等価物を含有するポリペプチド化合物。
5. ５．式： 【配列があります】 で示されるＬ−アミノ酸配列を含有するポリペプチド化合物。
6. ６．治療有効量の請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載の化合物を傷 に適用することからなる傷の治癒を促進する方法。
7. ７．アルファートロンビンまたはガンマートロンビンからなる群から選択される 化合物の治療有効量をも傷に適用することを含む請求項６記載の方法。
8. ８．治療有効濃度の請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載の化合物と 薬学上許容し得る賦形剤とを含有する医薬組成物。
9. ９．アルファートロンビンまたはガンマートロンビンからなる群から選択される 化合物をも治療有効濃度含有する請求項８記載の組成物。
10. １０．請求項８または９記載の医薬組成物を傷に適用することからなる傷の治癒 の促進方法。
11. １１．トロンビン−リセプター結合ドメインおよびセリンエステラーゼ保存配列 を有するドメインを含有するトロンビンのポリペプチド誘導体またはその生理学 的に機能的な等価物を治療有効量、傷に適用することからなる傷の治癒を促進す る方法。
12. １２．アルファートロンビンまたはガンマートロンビンからなる群から選択され る化合物をも治療有効量適用することからなる請求項１１記載の方法。
13. １３．トロンビン−リセプター結合ドメインを有するがセリンエステラーゼ保存 配列を有しないトロンビンのポリペプチド誘導体またはその生理学的に機能的な 等価物を治療有効量、傷に適用することからなる瘢痕組織の形成を阻止する方法 。
14. １４．トロンビン−リセプター結合ドメインがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ で示される配列を有するＬ−アミノ酸を含有するものである請求項１３記載の方 法。
15. １５．Ｌ−アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａを有するポリペプチド の治療有効量を傷に投与することからなる瘢痕組織の形成を阻止する方法。
16. １６．トロンビン−リセプター結合ドメインを有するがセリンエステラーゼ保存 配列を有しないトロンビンのポリペプチド誘導体またはその生理学的に機能的な 等価物を治療有効量、体器官の表面に適用することからなる組織の癒着形成を阻 止する方法。
17. １７．トロンビン−リセプター結合ドメインが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌ ａで示される配列を有するＬ−アミノ酸を含有するものである請求項１６記載の 方法。
18. １８．治療有効量のＬ−アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａを有する ポリペプチドを体器官の表面に適用することからなる組織の癒着形成の阻止法。
19. １９．トロンビン−リセプター結合ドメインを有するがセリンエステラーゼ保存 配列を有しないトロンビンのポリペプチド誘導体またはその生理学的に機能的な 等価物を治療有効量、腫瘍を有する哺乳類に適用することからなる、腫瘍の転移 および血管形成を阻止するために腫瘍を有する哺乳類を治療する方法。
20. ２０．トロンビン−リセプター結合ドメインがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ で示される配列を有するＬ−アミノ酸を含有するものである請求項１９記載の方 法。
21. ２１．治療有効量のＬ−アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａを有する ポリペプチドを腫瘍を有する哺乳類に投与することからなる腫瘍の転移または血 管形成を阻止するために腫瘍を有する哺乳類を治療する方法。
22. ２２．トロンビン−リセプター結合ドメインを有するがセリンエステラーゼ保存 配列を有しないトロンビンのポリペプチド誘導体またはその生理学的に機能的な 等価物の有効量に、細胞をさらすことからなる細胞増殖を阻止する方法。
23. ２３．トロンビン−リセプター結合ドメインがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ で示される配列を有するＬ−アミノ酸を含有するものである請求項２２記載の方 法。
24. ２４．有効量のＬ−アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａを有するポリ ペプチドに細胞をさらすことからなる細胞増殖を阻止する方法。
25. ２５．トロンビン−リセプター結合ドメインおよびセリンエステラーゼ保存配列 を有するドメインを含有するトロンビンのポリペプチド誘導体またはその生理学 的に機能的な等価物の有効量に、細胞をさらすことからなる細胞増殖を促進する 方法。
26. ２６．ポリペプチドトロンビン誘導体が、式：【配列があります】 で示されるＬ−アミノ酸配列を有するものである請求項２５記載の方法。
27. ２７．有効量の式： 【配列があります】 で示されるＬ−アミノ酸配列を有するポリペプチドに細胞をさらすことからなる 細胞増殖を促進する方法。
28. ２８．さらに、細胞を有効濃度の、アルファートロンビン、ガンマートロンビン またはホルボール・ミリステート・アセテートからなる群から選択される化合物 にさらすことを含む請求項２５、２６または２７のいずれかに記載の方法。
29. ２９．トロンビン−リセプター結合ドメインおよびセリンエステラーゼ保存配列 を有するドメインを含有するトロンビンのポリペプチド誘導体またはその生理学 的に機能的な等価物の有効量に細胞をさらすことからなる、細胞に対するトロン ビンの作用を模倣する方法。
30. ３０．トロンビン−リセプター結合ドメインを有するがセリンエステラーゼ保存 配列を有しないトロンビンのポリペプチド誘導体またはその生理学的に機能的な 等価物の有効量に細胞をさらすことからなる、トロンビンの細胞に対する作用を 阻止する方法。