JPH02500133A - ハプテンについての改良濁り測定抑制検定法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ハプテンについての改良濁り測定抑制検定法日　の　ブ ト発１と別」 本発明は方法に指向する。特に、本発明はハプテン変調拮抗結合免疫検定法（ｈ ａｐｔｅｎ　ｍｏｄｕｌａｔｅｄ　ｃｏｍｐｅｌｉｔｉｖｅｂｒｉｎｄｉｎｇ　 ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）に指向するもので、この場合ハブタンの相対濃度は、 抗体とこの抗体に関するハプテンの免疫化学応答を模擬する多抗原分子（以後「 抱合体（ｃｏｎｊｕ−ｇａｔｅ）　Ｊと称する）との間の免疫複合体の形成によ り生ずる吸光度の強さを測定することによって定められる。この検定の動的分析 範囲およびＳＮ比はハプテンの濁り測定分析に対して独特のものである。また、 本発明はこの方法に用いる試薬の特定化に独特のものである。

２・蓑米Ω肢玉 抗原材料と抗体との間の免疫化学相互作用によるとの明示は多くの変数によって 認知することができ、または認知することができない。この変数としては上記相 互作用を生ずる環境；生成複合体の相対的な大きさ；反応媒質における生成複合 体の相対溶解度；複合体の固を螢光；および／または標識、指示薬またはタグ（ ｔａｇ）を生成複合体に導入でき、これにより計装化の助けによりまたは助けに よらずに検出できるようにする若干の他の作用囚の存在を包含している。

免疫検定に対する種々の提案のすべては多少なりとも効果的ではあるが、いずれ も速度、感度９便利さおよび／または安全性に対する若干のトレードオフにおい て必然的に生ずる固有の制限を有している。特に、同質免疫検定技術はモニター された現象に貢献するかまたはマスクする他の試料成分の存在に興味を有する検 体を指示する検出しうる種の明示を包含している。ある場合には、検出しうる種 または標識は発螢光団の場合には直接にモニターすることができ；また基質のよ うな付加試薬を他の可視標識（すなわち、酵素）の存在を明示するのに必要とさ れている。異質免疫検定技術においては、試料を１または２種以上の試料成分と 相互作用する特異な吸着試薬を有する固相と接触する。固相と結合した試薬が１ または２種以上の試料成分と相互に作用した後、試料の液相（および液体に溶解 および懸濁して残存する試料成分）を固相（固相において試薬に結合する試料成 分）から分離する。更に、固相は洗浄して任意の非結合材料を除去する。この洗 浄液体は回収するか、試料の液体フラクションと合せるか、または単に廃棄する ことができる。この手段において、溶解検体（液相）または不溶解検体（固相） を含む２種の互いに排他的なフラクションを生ずる。しかる後に、一方または双 方のこれらのフラクションを興味ある検体の存在について分析することができる 。興味ある検体を指示する検出しうる種（標識）が発螢光団である場合には、液 相または固相をモニターされた励起エネルギーおよびその螢光発光で照射する。

標識が酵素である場合には、先ず基質を液相または固相、および検出しうる種の 生成についてモニターされた反応雰囲気と接触する必要がある。

他のタイプの異質免疫検定は標識として放射性同位元素の使用、および液相／固 相を２つの互いに排他的なフラクションに分割する次の分割手段を含んでいる。

特に、興味ある検体および識別に用いる放射性同位元素を初めに接触させ、およ び固相において不溶化された免疫試薬と互いに作用させるか；または識別に用い る放射性同位元素を含有する免疫複合体を沈澱するのに用いる第２抗体と互いに 作用させる。固相に存在する識別に用いる放射性同位元素の量は、シンチレーシ ョン計数器にモニターし、カウント数を試料中に検体の濃度と相関関係にする。

免疫検定についての上述するすべての提案は妥協させるかおよび／または固有の 欠点を有している。多くの場合（ＲＩＡを除いて）、これらの欠点は検定におけ る怒度の損失に置き替えられる。特に、実際上、すべての免疫検定は、特にＲＩ Ａを除いて、上述するように構成されており、通常、ＳＮ比が検出しうる種をモ ニターする雰囲気により悪影響を受ける０例えば、同質免疫検定においては、検 出しうる種のモニターリング（ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）試料に内生ずる他の成分 から干渉される。異質免疫検定においては、液相をモニターする類似する束縛を 受ける。固相と結合した検出しうる種のモニターリングはこの問題が全く解決さ れておらず、特に指示薬が螢光性化合物でありおよび固相がそれ自体である場合 には、検出しうる種の励起または発光スペクトル内で螢光を発する。

上述するように、識別に用いる放射性同位元素の検出に基づく免疫検定では、モ ニター検定間隔の普通の時間経過において類似ＳＮ比損失を受けない。しかしな がら、この検定は検出しうる種を測定する高価な器械を必要とすると共に、厳格 な規制が検定の実施に要求される同位元素材料の処理と関連するために一般に望 ましくない。

上述する免疫検定システムは定性的および定量的結果を得る能力を有している。

また、これらの検定は終点反応として、または動的反応（反応速度）として行う ことができる。勿論、動的検定は速度（勾配）測定のための器械を用いる必要が あり、かつ検体の低いレベルをマスクする干渉を控除するようにする。動的器械 の使用は、バックグラウンドによる信号の貢献がモニター器械の動的分析範囲を 越えないようにするとの条件で、高いバックグラウンドを有するシステムに好ま しい。

これらの分析において、定性的結果を必要とする場合（血液型についての細胞表 面標識の同定）には、簡単な凝結検定（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ ）が適切である。凝結／凝集タイプの検定は可溶性検体、粒状検体、およびラテ ックスビーズを含有する安定エマルジョンに対して開発されている。この検定に 用いるラテックス　ビーズを含む試薬は液体環境内に安定懸濁物として存在して いる。ラテックス試薬を用いる代表的な分析環境において、興味ある検体とのそ の後の相互作用および／またはその環境における変化は興味ある検体の存在に帰 することのできる分散安定性（凝集）に変化を与える。ラテックス　ビーズ試薬 を用いる凝集検定は多くの血清学的決定基に対して開発されている。多くの場合 、これらの検定は定性的である。

粒子分散物の定量分析を必要とする場合には、一般に比濁分析または濁り測定に 制限される。比濁法および濁り測定は同じ粒子分散物のホトオプティカル（ｐｈ ｏｔｏｏｐｔｉｃａｌ）特性の技術に簡単に代替できない。各分析法は免疫化学 的相互作用に基づく沈降反応を測定するのに用いることができるが、しかしなが らこれらの相対感度は使用する特異免疫試薬、その相対反応性（結合活性）、お よびかがる分析を行う液体環境におけるその相対濃度に極めて影響される。

一般に、比濁法は希釈分散物のコヒーレント光源（すなわち、レーザ）による照 射、および入射放射に対して９０°での反射光の強さの測定を含んでいる。免疫 検定に通用する場合、この分析技術は抗体濃度および抗体価に対して敏感性が乏 しい。これに対して、濁り測定は普通のスペクトル分析（分散物の光学密度／吸 光度の測定）を利用できるが、しかしながら試薬の規格および性能の要求が極め て過酷になり、広範囲にわたる動的分析範囲についての可能性が提議されること になる。濁り測定モニターリング技術を免疫検定に適用する可能性については、 以前において試みられている（例えば、米国特許明細書第４，６０４，３６５号 ）。更に、正確な濁り測定モニター免疫検定の性能がラテックス試薬システムに よって高められている（例えば米国特許明細書第４．５８１，３３７　；４．５ ２４．０２５；　４．５２１，５１０；４，４７？、３４６　ｉ４．４６０，６ ９５　、および４，４０１，７６５号）。これらの米国特許には、ある種の単ク ローン抗体（米国特許明細書第４　、５２４　、０２５号）、および重合体粒子 による性能の増強（米国特許明細書第４．４０１．７６５号）について記載され ている。

免疫化学相互作用に基づく沈降反応の光散乱および吸光度測定に含まれている原 理、ファクターおよび制約は以前から知られている。パラリング（Ｐａｕｌｉｎ ｇ）、プレスマン（Ｐｒｅｓｓｍａｎ）氏そのほかの共同執筆による一連の論文 には、抗血清／小さい分子複合体の沈澱におけるハプテンの抑制効果について１ ９４０年初期に報告されていることが記載している。この研究論文では、かかる 抑制に必要とされる遊離ハプテンの量を正確に定めて沈降反応における遊離ハプ テンの効果を正確に予報している（パラリングＬ０氏ほかｒＪ、　Ａｍ、　Ｃｈ ｅＩＩｌ、　Ｓｏｃ、　Ｊ　６４　：　２９９４〜３００２　（１９４２）　、 　１９４０年後期では、バラリング氏らによる研究が進み、抗体／抗原沈降反応 の原理が解明されている。この時期における彼らの研究は、沈降免疫複合体を可 溶化するおよび／または反応環境に加えられる成分による沈澱物の量を変える遊 離ハプテンの能力に集中している（バブリング上０氏ほかｒＪ。

八ｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　Ｊ　６４　：　３０１０〜３０１４　（１９４ ２）およびパウリングＬ０氏ほかｒＪ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　Ｊ　 ６４　：　３０１５〜３０２０（１９４２）　。

１９５０年初期では、免疫化学相互作用に基づく沈降反応の測定についての光散 乱技術が器機の製作に向けられるようになってきた。抗血清／抗体相互作用の光 散乱特性は、最初に、入射放射に対して９０°で観測すること（ゴールドヘルグ Ｒ，Ｊ、氏ほかｒＪ、ｏｆ　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　Ｊ　６６　：　７９〜８６（１ ９５１）が報告され、しかる後に光散乱を低い角度で観測すること（トッテイー Ｐ、氏ほかｒＡｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」 ６：３５〜１２１　（１９５２）が報告されている。トッテイー氏らによる低角 度光散乱測定は入射放射に対して９０°での測定（少なくとも研究されたシステ ム）より一層敏惑であると報告されている。１９７０年初期においては、比濁法 による免疫沈降反応の自動化モニター測定を試みる器機に進められている（デー ヴイスＧ、Ｅ、氏ｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」２０　（１９７０）７７９）。

以前においては、器機による沈降反応は検出に困難であるとされている。更に、 この反応は極めて遅く、かつ検出に数分から数時間を必要としている。この沈降 反応において生成する粒子の速さおよび大きさを高めるために、ある種の重合体 を反応媒質に添加することによって粒子の生長が促進されることを確めている（ ハリングトンＪ、Ｃ，氏ほか’Ｉｗ＋ＩＩＩｕｎｏｃｈｅ＠１ｓｔｒｙ　Ｊ　８ 　（１９７１）　４１３〜４２１　）　＊器機において促進することにより、明 らかに好ましい免疫沈降反応での関心事は１０個からなる１組のバランスに連続 的に通すことである。コーヘン氏は、１９７４年に、単光散乱分光学および濁り 測定による凝集反応の初期段階をモニターすることを報告している（コーヘンＲ ，Ｊ、氏ほかｒ　Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ　Ｊ１２　（１９７４ ）　３４９　）　、コーヘン氏の研究に用いられたモデルシステムは、個々の重 合体粒子をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および凝集剤、ＢＳＡに対する抗血清 で被覆したポリスチレン　ラテックスとしたことである。

１９７９年に、テオフィリンについての競争的濁り測定免疫検定が、初めて技術 文献にシカワＴ８氏はか「Ｃｌ１ｎ。

ＣｈｅＩＩｌ、　Ａｃｔａ、　Ｊ　９１　（１９７９）　５９〜６５）に発表さ れている。同じ頃、ベックマン　インストルメンツ　インコーポレーション（Ｂ ｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、　）　、カリフォルニア州 。

フラートンは生物学的液体試料についての診断試験を行う比濁分析器機および試 薬システムを紹介している。このシステムに用いるのに有用なベックマン　イン ストルメンツインコーポレーションからの試薬システム（商品名「ＩＣ３Ｔｌ″ リアージエンツ（ＩＣ５”　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　）　」は治療薬（すなわち、テ オフィリン）の血清レベルを調べるテストキットを含んでいる。テオフィリン　 テスト　キットはテオフィリンに対する抗血清を含み、およびテオフィリン抱合 体はウマ　アポフェリチン担体蛋白質に共有結合したテオフィリン誘導体を含ん でいる。テオフィリン対担体蛋白質の比は明らかにされておらず、またテオフィ リンの誘導化を部分についても明らかにされていない、検定を実施する分析実験 計画案（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　）は上記文献ｒｃ１ｉｎ、 　Ｃｈｅｍ、　Ａｃｔａ、　」９１　（１９７９）　５９〜６５に記載されてい るニジカワ報告と実質的に同じであった。テオフィリンについてのベックマン試 薬に対するパッケージ挿入物に記載されている検定実験計画案の詳細は実際に許 容されるものである。この挿入物には、分析を行う試料を初めに稀釈（’１：６ ）Ｌ、次いで他の稀釈段階で稀釈（１：６）する必要があるとしている。この稀 釈は３つの目的、すなわち、（ａ）試料に対して内生ずる材料の干渉（ＳＮ比） を減少すること；（ｂ）１または２種以上の試薬と１または２種以上の成分（検 体以外の）との交差反応性から生ずる干渉（ＳＮ比）を減少すること；および（ ｃ）モニターされた反応を与えられた器機についての反応の動的分析範囲内にな るようにすることがある。

また、免疫沈降反応についての異なる自動化モニターリング技術の適用について 記載されている文献がある（デベリル■０氏’Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔ ｈ、Ｊ　３８　（１９８０）　１９１〜２０４）　−この文献には検出／モニタ ーリング免疫沈降反応に歴史的に用いられている種々の方法学が記載されており 、また高品位の紫外線吸光光度計を用いる濁り度の直接測定が液相免疫沈降のこ の特性化（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）について最っとも敏感な光学方 法を提供することが論議されている。

不幸にして、分析試験に用いる免疫沈降反応についての試薬の開発は器機の開発 より遅れている。高いスルーブツト器機環境についての免疫沈降試薬システムを 確立するために、免疫沈降反応を現存する臨床分析器（ｃｌｉｎｉｃａｌａｎａ ｌｙｚｅｒ）の経過時間内に生じさせるようにし、また器機をこれらの免疫沈降 試薬に適応するように、特に設計するようにする。あるいは、また後者は魅力的 でないから、試薬システムを現存する器機の操作パラメータ内で作業できるよう に行うこともできる。それ故、この試薬システムの開発者は市場での経済性を高 めるようにでき、この試薬システムを濁り測定モニターリング環境に用いるよう に設計されている。

この分野に最近、登場した１つのシステムはデュポンａｃａ　臨床分析器の操作 について開発された試薬システムであり、このシステムは米国特許明細書第４， ４０１．７６５および４．５２４．０２５号に記載されている。デエポンの試薬 システムは単クローン抗体およびハプテン／ラテックス粒子抱合体を含んでいる 。このタイプの試薬システムの性能特性はそれを使用しようとする器機環境に必 然的に適合させる必要がある。しかしながら、一度、作業溶液として作られた（ 稀釈された）ハプテン／ラテックス粒子試薬は貯蔵寿命が短い（一般に８時間以 下）、従って、この試薬は一日投与基準で、そのために制限された量だけを調製 する必要がある。

また、上記試薬システムはハプテン／担体蛋白質を用いて調製する場合と同様の 制約がある。米国特許明細書第４．６０４．３６５号に記載されている試薬シス テムは従来の上記システムを代表するものである。この米国特許明細書に記載さ れているハブテン／担体蛋白質は本質的に一層安定に、かつ可溶性にすることが できるが、器機環境におけるその使用は必然的に重合沈降反応「エンハンサ−」 の添加が予想される。また、これらのエンハンサ−は、沈降免疫複合体の形成を 促進しようとするけれども、ハプテン／担体蛋白質の自発的（自動的）凝集およ び／またはハプテン／担体蛋白質の減成を生じさせる。

試薬安定性のほかに、上記米国特許明細書第４．６０４．３６５号では沈降反応 の分光光度モニターリングを含む分析実験計画案についての試薬の合成において 考慮する必要のある若干のファクターに集中させている。これらのファクターは 、必然的に、試薬システムの安定性に伴ない、その敏感性を実質的に有している 。作動／機能試薬パラメータの規定については、一般に知られている。４つのこ のシステムについては、特に確定されており、米国特許明細書第４，６０４．３ ６５号には若干のハブテン／Ｈ５Ａ担体蛋白質システムについて正確に記載され ている。試薬システム動力学が特定の検定フォーマット（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａ ｓｓａｙ　ｆｏｒｍａｔ）　、検体のタイプおよびモニターリング　システムの 要求／要件によりどのように変わるかは上記米国特許明細書および他の文献から 明らかである。免疫沈降反応についての試薬パラメータ（濁り測定によりモニタ ーする）の規定において、試薬の相対結合親和力（抗体および検体模擬またはハ プテンアナログ）は検体模擬の組成であるように、一般に臨界的である。検体が 「小さい分子」である場合には、感作宿主内に免疫応答を引起す能力は一般的に 起りえない、従って、小さい分子に対する宿主の感作は小さい分子を大きい物質 （一般に「担体蛋白質」と称される）にカップリングすることによって、および このハプテン／蛋白質化合物を免疫原として利用することによって達成する。上 述するように、この免疫原に対する応答は免疫原の小さい分子成分に対するばか りか、蛋白質分子の部分に対する抗体を引起す。従って、この免疫原に用いる蛋 白質を選定してこの複合体の蛋白質成分（たとえあるとして）に形成する抗体は 、免疫検定を最終的に施す試料に存在する任意の蛋白質と交差反応しない、生物 工学工業における経験は、好ましい遊離薬剤阻害抗体（ｆｒｅｅ　ｄｒｎｇ　１ ｎｈｉｂｉｔｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に 抱合されたハプテンを含む免疫原に応答して生ずることを暗示している。

また、小さい分子が蛋白質に結合する手段は、宿主試料に引起きる抗体の性質に 影響する０例えば、ある環境において、小さい分子と蛋白質との間の架橋分子を 有利に用いることができる。架橋分子は小さい分子を蛋白質から離し、それ飲手 さい分子に対する大きい特異性を有する抗体の形成を誘導する。また、引起きる 抗体が架橋単位であることを確認することは潜在的に可能である。

免疫検定が競争的結合／阻害原理に基づく場合には、検体と抗体（検体に対して 特異な）免疫化学相互作用を模擬する第２試薬（一般に抱合体と称する）を作る 。一般に、この検体模擬はハプテン、またはハプテンの部分と免疫化学的に同一 である化学的に特有な基、および蛋白質を含んでいる。この抱合体の蛋白質部分 は活性に（例えば酵素）または不活性にできる。蛋白質が不活性である場合には 、蛋白質は第２抗体に対する結合部位として、または沈降免疫複合体を形成する 核形成部位として作用する。抱合体、および興味あるハプテンに対して特異な抗 体の相互作用が、沈降免疫複合体を形成する場合には、この免疫複合体の相対濃 度を標準の光散乱および分光光度技術によって測定することができる。一般に、 この沈降免疫複合体の相対濃度は分析される試料に存在する拮抗する検体の相対 濃度に逆比例する。

沈降反応に基づく免疫検定方法学を広範囲にわたって通用する場合の１つの重大 な阻害は、作業試薬溶液（特に抱合体溶液）の制限された安定性である。作業試 薬溶液における安定性の問題を克服する多くの試みは成功しておらず、それ故こ の方法学を免疫化学分析に一般的に適応することは、十分な競争方法の不利用可 能性によりおよび／または特定器機についての試験プログラムを高める必要性に より推進されている。現在に至るまで、たえず進歩しているけれども、入手しう る試薬システム（すなわち、上述するラテックスを主体とする試薬システム）は 免疫検定に用いられている多くの普通の試薬より僅かしか安定にされておらず、 短い貯蔵寿命および作業溶液安定性に関連する問題に常に遭遇している。

又ユ皇互翌 本発明の改良されたハプテン変性免疫沈降反応は、濁り測定モニターリング技術 を用いる沈降反応の測定によるハプテン濃度の測定についてのシステムにおける 多くの欠点を克服する唯一の解決手段である。本発明により適応される解決手段 は正確さ、速やかさまたは試薬安定性を犠牲にすることなく、このタイプの測定 に用いる試薬システムに定められる多くの制約に適応させることである。これら の特徴は、従来の濁り測定分析技術の向上において区別できるばかりか、・動的 分析範囲およびＳＮ比において有意な向上を達成することである。

特に、本発明の濁り測定モニター検定は、（ａ）予期しない試薬安定性および沈 降免疫複合体の制御形成および（ｂ）拡大した動的分析範囲に翻訳して、臨床医 に治療薬の有効性および毒性レベルに関する情報判断（ｉｎｆｏｒｕ＋ｅｄ　ｊ ｕｄｇｍｅｎｔｓ）を作成する必要な情報を与える、独特の試料システム　パラ メータのセットによるものである。特に、この検定は、正確さ、速やかさおよび 多くの伝統的な臨床化学および免疫化学方法に少なくとも匹敵する動的分析範囲 にわたって；および濁り測定速度抑制波ｉネテにより従来では達成されない正確 さ、速やかさおよび制御により、患者の治療薬レベルをモニターリングするよう に連合する。これらの改良は抗体の適当な選択、抗体に対する相手試薬（ｃｏｍ ｐａｎｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ）（抱合体）の正確な処理、および下限および上 限の感受性を与える動的分析範囲を得る沈降反応の速度を制御／調和する反応環 境の塩濃度の調整に特徴がある。本発明の試薬システムはハプテン変調濁り測定 速度抑制検定はシステムまたは装置の変更なく自動分光光度計を含む器機に適応 する。

胚ｌ４ｊ１１慢区肌 第１図はフエノバルビクール（ハプテン）変調免疫沈降反応（濁り測定によりモ ニターする）に基づく免疫検定の動的分析範囲と反応環境におけるりん酸緩衝剤 の濃度との関係を示す棒グラフである。

第２図はフエノバルビクール変調免疫沈降反応（濁り測定によりモニターする） に基づく免疫検定の動的分析範囲とエンハンサ−（ポリエチレン　グリコール） の濃度との関係を示す棒グラフである。

第３図は２種の異なる単クローン抗体Ａ、Ｄ、−２５１２およびａ、ｏ、−２１ を用いるフェノバルビッール／アポフェリチン抱合体の感受性における架橋長さ の効果を示すグラフである。

第４図は２種の異なる単クローン抗体Ａ、Ｄ、−２５１２およびＡＪｓ−２１を 用いる検定感度におけるフエノバルビタール：アポフェリン　モル比の効果を示 すグラフである。

第５図は濁り測定により経過時間にわたってモニターするフエノバルビクール変 調免疫沈降反応に基づく免疫検定の動的分析範囲を示すグラフである。

第６図は線状（回帰線の相関係数＝、９９４”）投与量応答曲線を有するフエノ バルビタール変調免疫沈降反応に基づく動的分析範囲を示すグラフである。

゛な貝　Ａ−Ｈのｉ′日 本発明の詳細な説明するために、あらかじめ、次の用語および熟語を定義する。

用語の「濁り測定速度抑制検定（ｔｕｒｂｉｄｉ＋ｎｅｔｒｉｃ　ｒａｔｅｔｎ ｈｉｂｉｔｔｏｎ　ａｓｓａｙ）　Ｊ、「濁り測定速度抑制免疫検定（ｔｕｒｂ ｉｄｉｍｅｔｒｉｃ　ｒａｔｅ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ ｙ）　Ｊ　、および「ハプテン変調免疫沈降反応（ｈａｐｔｅｎ　ｍｏｄｕｌａ ｔｅｄ　１ｍ１ｕｎｏ−ｐｒｅｃｔｐｉｔｉｖｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）　」およ びアクロニマ（ａｃｒｏｎｙｍ）ｒＴＲＩＡＪは、試料においても未知濃度で遊 離検体を用いて免疫沈降反応の速度を変調する分析実験計画案について説明しよ うとするものである。遊離検体は免疫試薬（すなわち、抗体）に結合する検体模 擬と拮抗し、これにより抗体と検体模擬との間に沈降免疫複合体が形成するのを 防止する。検体と抗体との間に形成した複合体は可溶性であり、このために試料 中の検体の濃度が高いほど、形成する沈降複合体の量が減少する。

用語の「比濁（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ）　Ｊおよび「比濁分析（ｎｅｐｈ ｅｌｏｍｅｔｒｙ）　Ｊは、最初に粒子分散物を干渉性の光ビームで照射し、反 射ビームの強さを入射放射から９０°の角度でモニターリングすることによって 粒子分散物をモニターリングする技術を説明しようとするものである。

用語の「分光光度（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ）　Ｊ、「分光測光 （ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）　Ｊ、「濁り（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔ ｒｉｃ）　Ｊおよび「濁り測定（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ））Ｊはすべて、普 通の測光（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ）技術および装置を用いて粒子分散物の光学 密度をモニターリングする技術について説明しようとするもので、互いに交換し て用いることができる。特に、これらの用語は反応キュベツトを通して透過する 光の量を測定するモニターリング　システムを説明するものである。伝達する光 の透過率の値は光源からの入射光の値に基づくもので、その光の量より少ないこ とは反応キュベツトの内容物による吸収および反射率による。この技術（本発明 の方法に関連する）により分散物に存在させて測定する粒状物質の含有量または 濃度は、分析する検体に初めから含有している遊離検体の濃度に逆比例するのが 好ましい。

用語の「粒子分散物（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ　ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）　Ｊお よび用語の「分散物」は多価抗体および多価ハプテン化合物の沈降反応の生成物 を説明しようとするものである。この反応生成物は、網目の大きさく分子量）が 検定を行う液体媒質内のこの種についての生成物溶解度係数を越えるまでに、多 数の免疫複合体間に形成した網目または格子を含んでいる。

用語の「動的分析範囲（ｄｙｎａｍｉｃ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｒａｎｇｅ） 　Ｊは検体の最少有効量から関与または治療作用を適切にできる上限レベルにわ たる値の範囲を包含する、試料中の検体（ハプテン）の濃度範囲を説明しようと するものである。

治療薬剤モニターリングに関連して、動的分析範囲は、勿論、薬剤を標準的に処 方する範囲、および臨床医に可能性のある毒性作用を警告する好ましい最大治療 レベルの少なくとも２倍に理想的に増量できる値の範囲を包含する。

用語の「反応混合物」および「反応環境」は、ハプテン変調濁り測定速度抑制免 疫検定を実施するのに必要とする適当な反応容器（すなわち、キュベツト）内に おける試薬および試料の最終混合物を説明しようとするものである。

試料はあらかじめ稀釈しないこれらの試薬と混合し、反応混合物における試料／ 全容量比は一般に約１：２５〜１：１０１の範囲にする。

用語の「結合活性（ａｖｉｄｉ　ｔｙ）　Ｊは、抗体を特定するハプテンおよび 多価ハプテン化合物に対する抗体の相対結合親和性を説明しようとするものであ る。

本発明の方法において、免疫検定を実施する基準は広範囲にわたって変更するこ とができる。検定フォーマットおよび試料組成によって、得られる値を、一般に データを集めるのに用いる分析技術に関連させる。本発明の方法に関連して、免 疫試薬特性、他方とのおよび検体との関係、および反応環境の相対的塩濃度は下 限および上限の感度を含む動的分析範囲を有するハプテン（検体）変調濁り測定 速度抑制検定のモデリングに臨界的にする。更に、これらの免疫試薬は、試料中 の検体の同定／定量化の基準として、免疫化学相互作用を利用する他の分析実験 計画案に別々におよび合わせて用いることができる。

本発明の方法は、興味ある粒状検体について特異な免疫試薬の調製（および選択 ）およびこの免疫試薬の沈降反応においての使用を含んでおり；この反応速度は 、試料中に初めに存在する遊離検体の量によって変調する。しかしながら、上記 免疫試薬の調製を管理する多くの一般的な目的／パラメータは、かかる材料を特 定環境において、かつ実際の検定条件下で実際に調製しおよび評価するまで知ら れているが、他方との相容性および検定環境については知られていない。最低に おいて、一般に最適化が要求される。

例えば、抗体のライジング（ｒａｉｓｉｎｇ）において、使用する免疫原は架橋 部分を介して担体蛋白質に抱合した検体模擬からなる。架橋部分の相対長さおよ び担体蛋白質の動物源は意識的に選定し、抗体に対する相手試薬（抱合体）の組 成と実質的に異にする。この相違の理由は興味ある検体を表示するエピトープに ついての抗体の特異性が高められるためである。架橋部分のハプテン化合物への 付着部分は、勿論、普通のエピトープが抗体に対して示す免疫原および抱合体の 両者に対して同じである。しかしながら、この架橋部分の長さの程度は（下限に おいて）エピトープ同一性を保持する必要性により（担体蛋白質は別として）、 および（上限において）抗体により確認しやすいようにエピトープの配向に関し て立体考察することにより束縛されることは明らかでない、これにもかかわらず 、各試薬システムにおいて、これらの同じ一般的な考察は、特定の免疫試薬の技 術を１つの検体を他の検体に対して相違させ、および同じ検体の異なる部分の異 性体に対して相違させるように制御する０表１は本発明の濁り測定モニター免疫 検定の要求／基準によって、特に処理された一連の試料システムを示している。

各医薬についての試薬システムの動的分析範囲は治療範囲の上限を実質的に越え ない治療範囲までの通常の治療範囲を包含している。試薬システムとしては、特 にテオフィリン（ＴＨＥＯ）　；フエノバルビタール（ＰＨＥＮＯ）　；フェニ トイン（ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）　（ＰＨＥＮＹ）　；ゲンタマイシン（ＧＥＮＴ Ａ）　；およびトブラマイシン（ＴＯＢＲＡ）を例示する。

表−１ パラメータ　Ｔ）ＩＥＯＰＨＥＮＯＰＨＥＮＹ　ＧＥＮＴＡ　ＴＯＢＲＡ扶−Ｕ −敢 試】しと入車ノ４助叉 惣−」Ｌ−生 重　合　＜１０χ　＜１０χ　＜１０χ　＜１０χ　＜１０χ濃度（ｍｇ／＋Ｉ ｌｊり、１９−．３９４　．１９−．３９４　．０１−．３９４　．００２−． １９０．００２−．０１蛋白質”　Ａｐｏ　Ａｐｏ　Ａｐｏ　Ａｐｏ　Ａｐ。

モル比　１７−２１　９−１０　２３−３０　２０−２３　６−８付着部位　Ｎ −Ｉ　Ｎ−Ｉ　Ｎ−３ランダム　ランダム五−生 抗体　Ｙｅｓ　Ｙｅｓ　Ｙｅｓ　Ｙｅｓ　Ｙｅｓ力価（ｍｇ／＋ＩＩＬ）　＞０ ．０２　＞０．０２　＞０．０２　＞０．０２　＞０．０２親和力　１０Ｉ０１ ０”　１０１０１０”　１０″結合活性−検定特徴により上述するように規定互 １皿 塩濃度　１００−５００　１００−５００　１００−５００　１００−５００　 １００−５００孝ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　４０００−２０．０００ 、またはデキストラン＠１００．０００−２００．０００゜本本アポフェリチン （Ａｐｏ） 抗体／抱合体対の賢明な選択および処理により、通常の分光光度技術による懸濁 物の光学密度の測定によって最終試料の遊離ハプテン濃度を効果的に測定するこ とができる。

についての普゛日 ｆＬｆｉ生豆性　上記表に示されている各試薬システムは単クローン抗体、およ びハプテン蛋白質抱合体を含む相手試薬からなり、かかるハプテン蛋白質抱合体 は蛋白質は付加した正確な割合（割合の範囲）のハプテン官能基を有している。

この抱合体の蛋白質成分としては、有機または無機補欠分子族を有する他の球状 蛋白質が適当であるが、アポフェリンが好ましい、運搬体／担体蛋白質として生 物学的システムに一般に作用するこれらの球状蛋白質は緻密な三次元構造、およ び少なくとも１００，０００の分子量を有する高次巨大分子を生ずる十分な数の 三次単位からなる四次構造を有している。勿論、ハプテンにより水溶性抱合体を 形成できるこれらの球状蛋白質（適当なハプテン：蛋白質比で）は本発明の方法 において免疫試薬として適当である。

更に、上記表から明らかなように、またハプテン対アポフエリン蛋白質の正確な 比の測定は各抱合体について独特のものであり、かつ本発明のＴＲＩＡ法におけ る性能に臨界的である。ハプテン対アポフェリン蛋白質の比は好ましい値より低 く、抗体との相互作用の相対割合はあまりに低く、沈澱物を形成するのに十分な 大きさの複合体が生長しなくなる。逆に、ハプテン対アポフェリン蛋白質の割合 が好ましい割合より大きい場合には、免疫複合体形成速度は試料中の遊離ハプテ ンの量に逆比例するよりむしろ、直接に比例する。更に、ハプテン対アポフェリ ン蛋白質の正確な比を用いる場合には、抗体／抱合体のハプテン阻止が濁り測定 速度分析の好ましい目的と矛盾しなくなる。特に、抱合体におけるハプテン対ア ポフェリチン蛋白質の比を、検体の予想濃度、および検体の濃度が予想範囲から それる潜在的範囲に関して選択する。例えば、テオフィリンの測定のために処理 する免疫試料は、この薬剤を治療範囲内でおよび望ましい治療範囲の上限の２倍 のレベルまでに検出するのに敏怒である。

択生豊ユ　このタイプの検定についての単クローン抗体の選択における１つの原 則的な基準は、抱合体への結合に対する検体への結合についての僅かなバイアス である。上述するように、抗体は反応環境において抱合体中の有効なエビトップ 部位に対して僅かに多く存在するのが好ましい。

抗体能力および有効性に関するこれら２つのファクターの組合せは濁り速度抑制 検定の動的分析範囲に対して臨界的に必要である。抗体能力の一方または双方を 満足できない場合には、本発明の動的分析範囲が実質的に減少し、それ故制限さ れた値になり、動的分析範囲に関する交替しうる技術と競争できない。

Ｕ度　反応環境の比較的に高い塩濃度が検体についての単クローン抗体の親和力 を高めることを確かめたことは予期しえないことである。塩の供給源は十分に稀 釈した抱合体試薬溶液である０本発明の好ましい例は、沈降反応におけるエンハ ンサ−および抱合体を十分に稀釈した一種の試薬において混合する。この試薬を 安定化させ、かつエンハンサ−の存在においての自発的な凝集を妨げるために、 少なくとも約１５０＋ａＭの塩化ナトリウムおよび少なくとも約１００ｍＭの緩 衝剤（りん酸緩衝剤）をこの抱合体／エン／％ンサー溶液に添加する。抱合体／ エンハンサ−溶液における抱合体に対する塩濃度は抱合体の電荷を効果的にかつ 実質的に中和するように選定し、これによってこの試薬の安定性を自発的な凝集 に対して高める。また、高い塩濃度は免疫複合体におけるエンハンサ−の作用を 阻止することによって沈降反応を変調し、これによって沈降免疫複合体の形成速 度を制御し、検定の動的分析範囲を拡大する。

また、エンハンサ−の存在における抱合体の安定性はアポフェリン蛋白質の性質 に、幾分、属するものと思われる。

抱合体のこの蛋白質成分はエンハンサ−による減成に抵抗し、抗体と反応する場 合に比較的に速やかに応答し、沈降形成を制御する。

ｆｆｉ　上述するように、本発明の方法に用いるのに選択される単クローン抗体 は、遊離ハプテン（検体）に対するその高い滴定濃度およびその選択的親和性に ついて選定する。特に、遊離ハプテンを試料から抗体が抱合体にカップリングす るのを効果的に阻止するようにするために、抗体を遊離ハプテンに対して僅かに バイアスするように選定する。それ故、一度、試料、抱合体試薬および単クロー ン抗体を適当な反応環境に組合せると、沈降反応は制御速度で進行する。試料か らの遊離ハプテンは抗体についての抱合体と拮抗し、抗体における有効な部位か らの若干の抱合体が置換する。抱合体の遊離ハプテンによるこの置換は分散物に おける沈降物の量を減少すると共に、これに相当して光学密度を低下する。この 置換の速度は生成する分散物中の遊離ハプテンの相対濃度と互いに関係させるこ とができる。本発明における好ましい分析条件下における遊離ハプテンの濃度は 分散物の光学密度に逆比例する。

上述するところから明らかなように、免疫試薬の適当な試薬の選択および処理は 本発明の方法の感度および動的分析範囲を決定する。表１に示す試薬システム　 パラメータはこれらの試薬システムのそれぞれの個々の成分についてのパラメー タの組合せの最適化を示し；およびハプテン変調免疫沈降反応の濁り測定モニタ ーリングに基づく免疫検定における他方に対する相対濃度を示している。　ＴＲ ＩＡのファクター／要件の相関マトリックスは複合体で、予期できない、不幸に して、この複合体システムにおいて、試薬システムの成分の１つのパラメータに おける変化は多数の他の変数（試薬およびプロセス）に影響を及ぼす、生ずる個 々の成分のパラメータのこの改善により、試薬および反応混合物の塩濃度が試薬 安定度に対して、および沈降反応の動力学における制御について臨界的になる驚 くべきことを確かめた。特に、薬剤−アポフェリチン試薬溶液における比較的に 高い全体の塩濃度は、沈降反応エンハンサ−化合物によって、この抱合体を凝集 ／減成に対して安定化することを確め、このために試薬システムのこれらの成分 の双方を含有する１種の十分に稀釈された試薬溶液を生成する能力を与える。ま た、この比較的に高い全体の塩濃度は、反応混合物において、遊離薬剤の存在に おける抱合体と抗血清と間の免疫複合体の形成を制御／モジュレーテングする予 期しえない付加能力を与える。この結果は、反応媒質の光学密度と沈降免疫複合 体の形成速度との間の線状関係で示される。

添付図面は抱合体試薬溶液にお４Ｊるりん酸緩衝剤の濃度範囲（第１図）；およ び抱合体試薬溶液におけるポリエチレングリコール（６０００ＭＷ）エンハンサ −の濃度範囲（第２図）を示している。これらの図面に示している値は抱合体試 薬における相対濃度を示しており、表１に示している値と相違する０表１に示し ているこれらの成分のそれぞれの値の範囲は反応混合物におけるその濃度である 。薬剤をアポフェリチンに連結するメチレン架橋の長さの最適化は最適な感度（ 動的分析範囲の下限および上限において）を達成するように変えている。第３図 は最適条件として異なるハプテン／アポフェリチン蛋白質比を有する２つのフエ ノバルビタール／単クローン抗体についての架橋長さの最適化について示してい る。第３および４図はこの比と検定悪魔との関係を示している。また、第４図は 、薬剤；アポフェリチンの比を同じにして、架橋長さの変化が検定における抗体 ／抱合体対の能力を決定することを示している。得られる濁り測定免疫検定の動 的分析範囲は、生物学的試料における薬剤の双方の規定された治療レベル並びに 臨床関与（ｃｌｉｎｉｃａｌ　１ｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）を要する高いレベル を包囲するように拡大する。第５図は８〜１６０秒にわたる既知の濃度のフエノ バルビクールを含む分散物の吸光度の変化を示している。反応媒質における薬剤 の濃度を高めるにつれて、吸光度のプロットはだんだんと直線状になる。検定の この特徴はフエノバルビクールについての全動的範囲にわたる検量器値（ｃａｌ ｉｂｒａｔｏｒ　ｖａｌｕｅｓ）を用いる線状回帰方程式の関係係数を計算する ことによって他の手段において証明することができる。これらの値をプロットす る場合（第６図）、関係係数は（１，０）において完成、すなわち、直線に達し １．９９４におけるフエノバルビクール値は検定の許容された実験的正確さ内で 直線であることを示している。

本発明のある独特な特性を評価するために、本発明を実施例に基づいて説明する 。この例に示す部および百分率は、特に示さないかぎり重量で示している。本発 明の方法における試薬の調製およびその評価に用いる装置および技術は上述する ように標準のものである。

実１１１Ｌ 試薬システムを、生物学的試料におけるフエノバルビクール　レベルを決定する ために、濁り測定によりモニターする薬剤変調免疫沈降反応によって調製した。

個々の試薬についての明細は表１に示している。試薬システムの個々の成分は、 初めに、２種の別々の溶液：すなわち、（ａ）３個の炭素原子を有するメチレン 架橋を介して１一部分でキーホール　リンベト　ヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ 　ｌｉｍｐｅｔｈｅ＋ｎｏｃｙａｎｉｎ）　（ＫＬＨ）に結合するフエノバルビ タール抱合体からなる免疫原に感作されたクローンにより作られた抗血清；およ び（ｂ）フェノバルビッール／アポフェリチン抱合体溶液として調製した。また 、これらの各試薬溶液にはそれぞれ約０．１％のアジ化ナトリウムおよび約１０ ０〜１５０　ミリモル／Ｌのりん酸緩衝剤を含有させた。沈降反応のためのエン ハンサ−１すなわち、６．２％のポリエチレングリコール（６０００ｈｗ）をフ ェノ式ルビタール／アポフェリチン抱合体に含有させた。フェノバルビッール／ アポフェリチン抱合体溶液を十分に稀釈し、試薬容器を開封した後でも、この溶 液は長期間（８ケ月まで）にわたった安定である驚くべき事実を確めた。

上述する試薬システムを用いて、既知濃度のフエノバルビクールを含有する血清 試料についての濁り測定速度抑制免疫検定を自動臨床化学分析器（ＤＡＣＯ５化 学分析器−クールター　エレクトロエックス　インコーポレーション、フロリダ 州　バイアレア）について行った。試料中のフエノバルビクールの相対濃度を動 的にモニターし、勾配データを分析器のマイクロプロセッサ−に蓄積された標準 曲線と関係させた。値は分析器により試料に存在する既知のフエノバルビクール のレベルに従うように記録した。

上述する説明、実施例および添付図面は方法の多くの好ましい例を説明するもの である。本発明の境界および範囲を次の請求の範囲に示す。

Ｏ ｅ矛ｒＦ５Ｆ４＋＝あ＋＋（３４Ｄｎｍ（×１０一つｍＡＢｓ＋＝Ｆ；ｈ６ｔイ ヒ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．検体をハプテンとし、反応環境を濁り測定的にモニターし、ハプテンおよび ハプテン模擬を沈降反応エンハンサーの存在で抗体との拮抗免疫化学相互作用を 含むハプテン変調沈降反応により行う液体試料の免疫検定法において、沈降反応 の速度を前記液体試料に、エンハンサー変調有効量の主として生理学的緩衝塩を 含む混合物を添加して制御し、液体試料の光学密度における線状変化をハプテン の動的分析範囲にわたって生ずるようにエンハンサーに対する塩の相対濃度が沈 降反応の動力学を効果的に最適化することを特徴とする液体試料の免疫検定法。
2. ２．エンハンサーをポリエチレングリコールおよびデキストランからなる群から 選択する請求の範囲１記載の免疫検定法。
3. ３．生理学的緩衝塩の混合物が主として約１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび少 なくとも約１００ｍＭの緩衝塩を含む請求の範囲１記載の免疫検定法。
4. ４．沈降反応の速度の変調をゼロ度カイネテックス（ｚｅｒｏｏｒｄｅｒ　ｌｅ ｉｎｅｔｉｃｓ）に近づける請求の範囲１記載の免疫検定法。
5. ５．ハプテンを治療剤とし、および検定の動的分析範囲は範囲の下限における前 記治療剤についての最小治療レベルおよび範囲の上限における前記治療剤につい ての毒性レベルを含む請求の範囲１記載の免疫検定法。
6. ６．抗体を単クローン抗体とし、およびハプテン模擬が主として粒状担体蛋白質 上の多数の官能性エピトープ部位を有するポリハプテン分子からなり、官能性エ ピトープ部位対担体蛋白質の比を、ハプテンについての動的分析範囲にわたり抗 体と相手試薬との間の沈降反応を遊離ハプテン変調しうる範囲内にする請求の範 囲１記載の免疫検定法。