JPH049262B2 - - Google Patents
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- JPH049262B2 JPH049262B2 JP9403882A JP9403882A JPH049262B2 JP H049262 B2 JPH049262 B2 JP H049262B2 JP 9403882 A JP9403882 A JP 9403882A JP 9403882 A JP9403882 A JP 9403882A JP H049262 B2 JPH049262 B2 JP H049262B2
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-
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Description
本発明は血清CRPの簡易迅速定量法に係り、
殊に免疫比濁法を利用する定量法に係る。 周知のように、CRPは急性相反応性血漿蛋白
成分の一種であり、種々の炎症性及び組織崩壊性
疾患に際して出現する非特異的蛋白成分であつ
て、生体に上記疾患が生じた場合に6〜24時間以
内の短時間で増量しその回復に伴ない減量消失す
ると謂う特徴を有しており、従つてその検査は臨
床上不可欠とされている。 従来におけるCRP検査法としてはルーチン検
査法例えば毛細管法、ラテツクス凝集法、一元免
疫拡散法等が使用されて来たが、これら測定法で
はCRP値の変動を時間の経過と共に定量的に把
握することが不可能であつたり、測定感度、精度
や操作時間等の問題により特に低値域における
CRP値の変動の把握に難点がある等の欠陥があ
つた。 しかしながら最近では、検出方法の進歩により
血漿中の種々の微量蛋白が定量的に測定し得るよ
うになりつつある。この検出方法の代表例が比濁
法であり、既述のルーチン検査法に代つて普及し
つつある。 但し近年普及して来たこの比濁法はレーザー比
濁計等を用いているので高感度ではあるが、その
有用性については絶対的なものとは云えないのが
実情である。蓋し、機器が極めて高価であるのみ
ならず、測定精度や測定範囲に問題があり、又高
感度故に試薬や検体血清の澄明度に特別の注意を
払う必要があるのでその前処理が煩雑となる等の
欠点が存在するからであり、更にはレーザー比濁
法は脂濁血清、黄疸血清又は溶血血清を検体とす
る場合に不適当であり、又不活化しない血清では
可成りのバラツキの出ることが報告されているか
らである。 斯くて、本発明の目的は、免疫比濁法を利用す
るものではあるが、特殊にして高価な機器を必要
とせずに、安定且つ良好な精度にて実施し得る血
清CRPの比較的迅速な定量法を提供することで
ある。 本発明によれば、この目的は検体血清と抗血清
使用液との混合液である被験液Tと、検体血清と
検体ブランク緩衝液との混合液である検体ブラン
ク液SBと、生理食塩液と抗血清使用液との混合
液である試薬ブランク液RBと、生理食塩液と検
体ブランク緩衝液との混合液である緩衝液ブラン
ク液BBとを調製し、これらをそれぞれインキユ
ベートしてプラトーに達せしめた後に、それぞれ
の液の吸光度(A、TASB、ARB及びABB)を測定
し、CRPによる検体血清の吸光度(ACRP)を式 ACRP=AT−ASB−(ARB−ABB)として算定し、
一方上記と同様に、但し検体血清の代わりに各種
濃度のCRP標準液を用いて吸光度―CRP値の関
係を示す検量線を予め作成しておき、上記の算定
吸光度値に該当するCRP値を上記の検量線から
求めることにより達成される。 抗原―抗体複合体は光を消散し或は吸収する
が、同じ濁度(吸光度)は抗原過剰状態でも或い
は抗体過剰状態でも得られる可能性がある。免疫
比濁法による血清CRPの定量に際しては吸光度
測定を抗体過剰状態で行ない抗原過剰状態のもの
とは之を区別せねばならない。従つて、このため
には特異性が高く且つ高力価の抗血清が必要とさ
れる。 本発明方法に使用されるこの種の抗血清として
は例えば抗ヒトCRPヤギ血清から得られたγ―
グロプリン分画がある。 次に、試薬、標準液測定方法、結果等に関連し
て本発明方法を更に詳細に説明する。 a) 試薬及び標準液 1) 緩衝液 ) 抗血清希釈緩衝液 HEPES bufferPH7.1 0.01M HEPES 0.1M NaCl,0.1% NaN3 ) 検体緩衝液 PEG6000 3% Tween20 0.2% ) 検体ブランク緩衝液 (抗血清希釈緩衝液を検体緩衝液で11倍に希釈
したもの) 2) 希釈液 CRP標準液及び検体の希釈用であつて、
生理食塩水をベースとする3%ウシアルブミ
ン液とヒトプール血清(CRP除去)との7
対3混液 3) 生理食塩液 4) CRP1次標準液 ガン患者のプール腹水からイオン交換クロマ
ト、ゲル過でCRPを純化したもの。その
純度はアクリルアミド電気泳動法、オクタロ
ニー法、免疫泳動法で確認され、このCRP
標準液の濃度は蛋白定量、アフイニテイーク
ロマトグラフイー及びSRID法により決定さ
れた。 5) CRP2次標準液 プール腹水から硫酸アンモニウム分画により
得た粗CRPを希釈液で一定の濃度に希釈し
たものであつて、その濃度は1次標準液を用
いSRID法により決定された。この2次標準
液は4℃に維持する場合には少なくとも6ケ
月間に亘り安定である。 6) 抗CRP血清 抗ヒトCRPヤギ血清から得たγ―グロブリ
ン分画を抗血清希釈緩衝液に溶解したもので
あつて、その特異性はオクタロニー法及び免
疫電気泳動法により確認された。 7) 抗血清原液 抗血清希釈緩衝液により2倍に希釈された抗
CRP血清。この原液は4℃に維持する場合
には少なくとも12ケ月間安定である。 8) 抗血清使用液 検体緩衝液により抗血清原液を11倍に希釈
し、ミリポアフイルタ(ボアサイズ0.45μm)
で過したもの。 b) 測定法 下記表
殊に免疫比濁法を利用する定量法に係る。 周知のように、CRPは急性相反応性血漿蛋白
成分の一種であり、種々の炎症性及び組織崩壊性
疾患に際して出現する非特異的蛋白成分であつ
て、生体に上記疾患が生じた場合に6〜24時間以
内の短時間で増量しその回復に伴ない減量消失す
ると謂う特徴を有しており、従つてその検査は臨
床上不可欠とされている。 従来におけるCRP検査法としてはルーチン検
査法例えば毛細管法、ラテツクス凝集法、一元免
疫拡散法等が使用されて来たが、これら測定法で
はCRP値の変動を時間の経過と共に定量的に把
握することが不可能であつたり、測定感度、精度
や操作時間等の問題により特に低値域における
CRP値の変動の把握に難点がある等の欠陥があ
つた。 しかしながら最近では、検出方法の進歩により
血漿中の種々の微量蛋白が定量的に測定し得るよ
うになりつつある。この検出方法の代表例が比濁
法であり、既述のルーチン検査法に代つて普及し
つつある。 但し近年普及して来たこの比濁法はレーザー比
濁計等を用いているので高感度ではあるが、その
有用性については絶対的なものとは云えないのが
実情である。蓋し、機器が極めて高価であるのみ
ならず、測定精度や測定範囲に問題があり、又高
感度故に試薬や検体血清の澄明度に特別の注意を
払う必要があるのでその前処理が煩雑となる等の
欠点が存在するからであり、更にはレーザー比濁
法は脂濁血清、黄疸血清又は溶血血清を検体とす
る場合に不適当であり、又不活化しない血清では
可成りのバラツキの出ることが報告されているか
らである。 斯くて、本発明の目的は、免疫比濁法を利用す
るものではあるが、特殊にして高価な機器を必要
とせずに、安定且つ良好な精度にて実施し得る血
清CRPの比較的迅速な定量法を提供することで
ある。 本発明によれば、この目的は検体血清と抗血清
使用液との混合液である被験液Tと、検体血清と
検体ブランク緩衝液との混合液である検体ブラン
ク液SBと、生理食塩液と抗血清使用液との混合
液である試薬ブランク液RBと、生理食塩液と検
体ブランク緩衝液との混合液である緩衝液ブラン
ク液BBとを調製し、これらをそれぞれインキユ
ベートしてプラトーに達せしめた後に、それぞれ
の液の吸光度(A、TASB、ARB及びABB)を測定
し、CRPによる検体血清の吸光度(ACRP)を式 ACRP=AT−ASB−(ARB−ABB)として算定し、
一方上記と同様に、但し検体血清の代わりに各種
濃度のCRP標準液を用いて吸光度―CRP値の関
係を示す検量線を予め作成しておき、上記の算定
吸光度値に該当するCRP値を上記の検量線から
求めることにより達成される。 抗原―抗体複合体は光を消散し或は吸収する
が、同じ濁度(吸光度)は抗原過剰状態でも或い
は抗体過剰状態でも得られる可能性がある。免疫
比濁法による血清CRPの定量に際しては吸光度
測定を抗体過剰状態で行ない抗原過剰状態のもの
とは之を区別せねばならない。従つて、このため
には特異性が高く且つ高力価の抗血清が必要とさ
れる。 本発明方法に使用されるこの種の抗血清として
は例えば抗ヒトCRPヤギ血清から得られたγ―
グロプリン分画がある。 次に、試薬、標準液測定方法、結果等に関連し
て本発明方法を更に詳細に説明する。 a) 試薬及び標準液 1) 緩衝液 ) 抗血清希釈緩衝液 HEPES bufferPH7.1 0.01M HEPES 0.1M NaCl,0.1% NaN3 ) 検体緩衝液 PEG6000 3% Tween20 0.2% ) 検体ブランク緩衝液 (抗血清希釈緩衝液を検体緩衝液で11倍に希釈
したもの) 2) 希釈液 CRP標準液及び検体の希釈用であつて、
生理食塩水をベースとする3%ウシアルブミ
ン液とヒトプール血清(CRP除去)との7
対3混液 3) 生理食塩液 4) CRP1次標準液 ガン患者のプール腹水からイオン交換クロマ
ト、ゲル過でCRPを純化したもの。その
純度はアクリルアミド電気泳動法、オクタロ
ニー法、免疫泳動法で確認され、このCRP
標準液の濃度は蛋白定量、アフイニテイーク
ロマトグラフイー及びSRID法により決定さ
れた。 5) CRP2次標準液 プール腹水から硫酸アンモニウム分画により
得た粗CRPを希釈液で一定の濃度に希釈し
たものであつて、その濃度は1次標準液を用
いSRID法により決定された。この2次標準
液は4℃に維持する場合には少なくとも6ケ
月間に亘り安定である。 6) 抗CRP血清 抗ヒトCRPヤギ血清から得たγ―グロブリ
ン分画を抗血清希釈緩衝液に溶解したもので
あつて、その特異性はオクタロニー法及び免
疫電気泳動法により確認された。 7) 抗血清原液 抗血清希釈緩衝液により2倍に希釈された抗
CRP血清。この原液は4℃に維持する場合
には少なくとも12ケ月間安定である。 8) 抗血清使用液 検体緩衝液により抗血清原液を11倍に希釈
し、ミリポアフイルタ(ボアサイズ0.45μm)
で過したもの。 b) 測定法 下記表
【表】
液
【表】
ク緩衝液
生理食塩液 − − 50μ 50μ
に見られる4種の液を調製し、各液を37℃でイ
ンキユベートした後に波長340nmでの吸光度を
測定し、検体血清の吸光度を式 ACRP=AT−ASB−(ARB−ABB) により算定し、一方上記と同様にして但し血清
の代りにCRP2次標準液を用いて操作して吸光
度−CRP濃度に関する検量線を作成し、上記
算定吸光度値に該当するCRP値を上記検量線
を利用して求めることにより測定する。 e) 結果 ) 経時変化 CRP2次標準液を用いそのCRP濃度が164
mg/(a)、63mg/(b)、15mg/(c)及び4
mg/(d)の場合の吸光度変化(AT−ASB)に
ついて、又ARB−ABB(e)について120分間に亘
り追究した処、反応は略々15分間で一定とな
り、その後は吸光度が変化しないことが判明
した(第1図参照)。これはインキユベート
時間が15分程度で充分なことを示している。 ) 沈降素曲線 抗血清使用液f及び希釈抗血清使用液g
(検体ブランク緩衝液にて抗血清使用液を
1/2に希釈したもの)を用いて沈降素曲線
を追究した処、第2図に見られる通りであ
り、曲線は比較的緩やかであり、従つてこの
抗血清は免疫比濁法に使用するに当つて充分
な高力価を有し且つ測定範囲の汎いものであ
ることが判る。 ) 検 線 CRP2次標準液を用いてそのCRP濃度が
8.0,29.5,65.0,114.5,164.0及び220.0mg/
のものを調製し、1日1回とし5日間に亘
り吸光度を測定し、その平均値をCRP値に
関してプロツトした処、第3図に示される通
りであり極めて安定した直線性が得られた。 尚CRP値が220mg/以上となると次第にスロ
ープを呈する。 ) 測定値と算定値との相関性 CRP2次標準液を希釈してCRP値が7段階
の検体(即ちCRP値が220,163,122,62,
36,17及び9mg/のもの)を調製し、測定
値と算定値との関係につき5回の平均値をプ
ロツトした処、第4図に見られる通り安定し
た直線が得られた。 このことは、本方法がCRP値が220mg/
又はそれ以下の検体を良好な精度で測定し得
ることを示している。 ) 干渉物質の影響 ビリルビン及びヘモグロビンを血清に添加
して測定したが、これら添加物質がCRP値
に及ぼす影響は第5図a及びbに示されるよ
うに殆んど見られなかつた。 尚、脂濁血清、黄疸血清及び溶血血清に関
する本方法による測定値は次の各表に示され
る通りSRID法による測定値と類似した値を
示した(レーザー比濁法による測定値とも相
関関係の存在を示している。但し脂濁血清に
関してはレーザー比濁法では測定不能であつ
た)。 これらの事実は、レーザー比濁法で必要と
される検体血清の特別な前処理が、本発明で
は不要であることを如実に示している(表中
の数値の単位はmg/である)。
生理食塩液 − − 50μ 50μ
に見られる4種の液を調製し、各液を37℃でイ
ンキユベートした後に波長340nmでの吸光度を
測定し、検体血清の吸光度を式 ACRP=AT−ASB−(ARB−ABB) により算定し、一方上記と同様にして但し血清
の代りにCRP2次標準液を用いて操作して吸光
度−CRP濃度に関する検量線を作成し、上記
算定吸光度値に該当するCRP値を上記検量線
を利用して求めることにより測定する。 e) 結果 ) 経時変化 CRP2次標準液を用いそのCRP濃度が164
mg/(a)、63mg/(b)、15mg/(c)及び4
mg/(d)の場合の吸光度変化(AT−ASB)に
ついて、又ARB−ABB(e)について120分間に亘
り追究した処、反応は略々15分間で一定とな
り、その後は吸光度が変化しないことが判明
した(第1図参照)。これはインキユベート
時間が15分程度で充分なことを示している。 ) 沈降素曲線 抗血清使用液f及び希釈抗血清使用液g
(検体ブランク緩衝液にて抗血清使用液を
1/2に希釈したもの)を用いて沈降素曲線
を追究した処、第2図に見られる通りであ
り、曲線は比較的緩やかであり、従つてこの
抗血清は免疫比濁法に使用するに当つて充分
な高力価を有し且つ測定範囲の汎いものであ
ることが判る。 ) 検 線 CRP2次標準液を用いてそのCRP濃度が
8.0,29.5,65.0,114.5,164.0及び220.0mg/
のものを調製し、1日1回とし5日間に亘
り吸光度を測定し、その平均値をCRP値に
関してプロツトした処、第3図に示される通
りであり極めて安定した直線性が得られた。 尚CRP値が220mg/以上となると次第にスロ
ープを呈する。 ) 測定値と算定値との相関性 CRP2次標準液を希釈してCRP値が7段階
の検体(即ちCRP値が220,163,122,62,
36,17及び9mg/のもの)を調製し、測定
値と算定値との関係につき5回の平均値をプ
ロツトした処、第4図に見られる通り安定し
た直線が得られた。 このことは、本方法がCRP値が220mg/
又はそれ以下の検体を良好な精度で測定し得
ることを示している。 ) 干渉物質の影響 ビリルビン及びヘモグロビンを血清に添加
して測定したが、これら添加物質がCRP値
に及ぼす影響は第5図a及びbに示されるよ
うに殆んど見られなかつた。 尚、脂濁血清、黄疸血清及び溶血血清に関
する本方法による測定値は次の各表に示され
る通りSRID法による測定値と類似した値を
示した(レーザー比濁法による測定値とも相
関関係の存在を示している。但し脂濁血清に
関してはレーザー比濁法では測定不能であつ
た)。 これらの事実は、レーザー比濁法で必要と
される検体血清の特別な前処理が、本発明で
は不要であることを如実に示している(表中
の数値の単位はmg/である)。
【表】
【表】
叙上のように、本発明方法では測定値と計算値
とが極めて良好な直線的相関関係を呈するので、
機器として分光光度計さえあれば血清CRPの定
量測定が可能であり、これに検量線記憶、自動ブ
ランク補正、プリントアウト等の装置が付属して
いれば、その測定を迅速ならしめることができ、
更には測定自体の自動化が可能である。
とが極めて良好な直線的相関関係を呈するので、
機器として分光光度計さえあれば血清CRPの定
量測定が可能であり、これに検量線記憶、自動ブ
ランク補正、プリントアウト等の装置が付属して
いれば、その測定を迅速ならしめることができ、
更には測定自体の自動化が可能である。
第1図はCRP濃度と吸光度との経時変化を示
すグラフ、第2図は抗血清液の沈降素曲線を示す
グラフ、第3図は検量線をその経日測定再現性と
共に示すグラフ、第4図は測定値と計算値との関
係を示すグラフ、第5図は干渉物質のCRP値に
及ぼす影響を示すグラフであつて、第5図a及び
第5図bは干渉物質としてそれぞれビリルビン及
びヘモグロビンを添加した場合を示したグラフで
ある。
すグラフ、第2図は抗血清液の沈降素曲線を示す
グラフ、第3図は検量線をその経日測定再現性と
共に示すグラフ、第4図は測定値と計算値との関
係を示すグラフ、第5図は干渉物質のCRP値に
及ぼす影響を示すグラフであつて、第5図a及び
第5図bは干渉物質としてそれぞれビリルビン及
びヘモグロビンを添加した場合を示したグラフで
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 検体血清と抗血清使用液との混合液である被
験液Tと、検体血清と検体ブランク緩衝液との混
合液である検体ブランク液SBと、生理食塩液と
抗血清使用液との混合液である試薬ブランク液
RBと、生理食塩液と検体ブランク緩衝液との混
合液である緩衝液ブランク液BBとを調製し、こ
れらをそれぞれインキユベートしてプラトーに達
せしめた後に、それぞれの液の吸光度(A、TASB、
ARB及びABB)を測定し、CRPによる検体血清の
吸光度(ACRP)を式 ACRP=AT−ASB−(ARB−ABB) として算定し、一方上記と同様に、但し検体血清
の代わりに各種濃度のCRP標準液を用いて吸光
度―CRP値の関係を示す検量線を予め作成して
おき、上記の算定吸光度値に該当するCRP値を
上記の検量線から求めることを特徴とする、免疫
比濁法による血清CRPの簡易迅速定量法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9403882A JPS58211659A (ja) | 1982-06-03 | 1982-06-03 | 免疫比濁法による血清crpの簡易迅速定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9403882A JPS58211659A (ja) | 1982-06-03 | 1982-06-03 | 免疫比濁法による血清crpの簡易迅速定量法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS58211659A JPS58211659A (ja) | 1983-12-09 |
JPH049262B2 true JPH049262B2 (ja) | 1992-02-19 |
Family
ID=14099391
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9403882A Granted JPS58211659A (ja) | 1982-06-03 | 1982-06-03 | 免疫比濁法による血清crpの簡易迅速定量法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS58211659A (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6125061A (ja) * | 1984-07-13 | 1986-02-03 | Nitsusui Seiyaku Kk | 免疫比濁法による血清crpの改良定量法 |
JPS61243363A (ja) * | 1985-04-22 | 1986-10-29 | Nitsusui Seiyaku Kk | Crpの高感度定量法 |
JP2607363B2 (ja) * | 1986-02-20 | 1997-05-07 | 日水製薬 株式会社 | 免疫比濁法によるcrpの測定法 |
EP0264866A3 (de) * | 1986-10-24 | 1990-12-27 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von diagnostisch relevanten Substanzen, insbesondere Antikörpern oder Antigenen nach der ELISA-Methode durch photometrische Auswertung |
US6777198B2 (en) | 2000-10-11 | 2004-08-17 | Pharmacia Diagnostics Ab | Assay method and kit therefor |
SE0003662D0 (sv) * | 2000-10-11 | 2000-10-11 | Pharmacia Diagnostics Ab | Assay method and kit therefor |
JP4604231B2 (ja) * | 2008-08-01 | 2011-01-05 | 国立大学法人 岡山大学 | タンパク質製造方法,融合タンパク質及び抗血清 |
-
1982
- 1982-06-03 JP JP9403882A patent/JPS58211659A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS58211659A (ja) | 1983-12-09 |
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