JPH0235088A - ペクチンリアーゼ遺伝子およびペクチンリアーゼの製造法 - Google Patents
ペクチンリアーゼ遺伝子およびペクチンリアーゼの製造法Info
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- JPH0235088A JPH0235088A JP18344588A JP18344588A JPH0235088A JP H0235088 A JPH0235088 A JP H0235088A JP 18344588 A JP18344588 A JP 18344588A JP 18344588 A JP18344588 A JP 18344588A JP H0235088 A JPH0235088 A JP H0235088A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ペクチンリアーゼ酵素の遺伝子工学による製
造分野に関する。ペクチンリアーゼはかんきつ類のひょ
うのう除去、植物細胞からの有用成分の抽出等、植物組
織崩壊による食品飼料薬剤等の製造、あるいは洗剤の添
加剤などに用いられている。
造分野に関する。ペクチンリアーゼはかんきつ類のひょ
うのう除去、植物細胞からの有用成分の抽出等、植物組
織崩壊による食品飼料薬剤等の製造、あるいは洗剤の添
加剤などに用いられている。
各種微生物例えば、細菌ではエルビニア属(Erwin
ia )等、糸状菌ではアスパラギラス属(Asper
gillus)に属する微生物等がペクチンリアーゼを
生産することは既に知られている(例えば、後藤正夫著
新植物細菌病学、p61−64、ソフトサイエンス社
、1981年、及びS、 l5hiiand T、Yo
kotsuka、 Agr、 Biol、 Chem
、、Vol。
ia )等、糸状菌ではアスパラギラス属(Asper
gillus)に属する微生物等がペクチンリアーゼを
生産することは既に知られている(例えば、後藤正夫著
新植物細菌病学、p61−64、ソフトサイエンス社
、1981年、及びS、 l5hiiand T、Yo
kotsuka、 Agr、 Biol、 Chem
、、Vol。
36、p、 L46−153..972)。しかしなが
ら、これらの微生物をその生産源として用いる場合には
、複数のペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ボリ
ガラクッロナーゼなどの混合物として得うれ、精製が難
しいという欠点があり、又、その生産量が少ないという
欠点をも有する。特にエルビニア属等の細菌を生産源と
する場合、ペクチン酸リアーゼが主として生産されペク
チンリアーゼとしては少ない。本発明は、それらの欠点
を解決するものである。
ら、これらの微生物をその生産源として用いる場合には
、複数のペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ボリ
ガラクッロナーゼなどの混合物として得うれ、精製が難
しいという欠点があり、又、その生産量が少ないという
欠点をも有する。特にエルビニア属等の細菌を生産源と
する場合、ペクチン酸リアーゼが主として生産されペク
チンリアーゼとしては少ない。本発明は、それらの欠点
を解決するものである。
一般にいわゆるペクチナーゼとして、ペクチンリアーゼ
、ペクチン酸リアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、オリゴ
ガラクッロナーゼが知られている。上述したようにペク
チンリアーゼを生産する微生物は、複数のペクチンリア
ーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ポリガラクッロナーゼ、オ
リゴガラクッロナーゼをも生産することがらペクチンリ
アーゼのみの単H精製は容易ではなく、又、その生産量
も個々の酵素に関しては満足すべきものではない。
、ペクチン酸リアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、オリゴ
ガラクッロナーゼが知られている。上述したようにペク
チンリアーゼを生産する微生物は、複数のペクチンリア
ーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ポリガラクッロナーゼ、オ
リゴガラクッロナーゼをも生産することがらペクチンリ
アーゼのみの単H精製は容易ではなく、又、その生産量
も個々の酵素に関しては満足すべきものではない。
本発明は、遺伝子工学手法を用いることによりこれらの
問題を解決したものである。即ち、組替えDNA技術に
より、エルビニア属mwのペクチンリアーゼ遺伝子を各
々の宿主中で動く強力なプロモーター及びSD配列を配
置したプラスミドに組入れ該プラスミドによりエシェリ
シャ尿細菌、バチルス属細菌等の蛋白質発現の為に開発
された宿主細菌を形質転換することにより該プラスミド
含有細菌を得る。これらの細菌を培養しペクチンリアー
ゼを得る事ができるものである。
問題を解決したものである。即ち、組替えDNA技術に
より、エルビニア属mwのペクチンリアーゼ遺伝子を各
々の宿主中で動く強力なプロモーター及びSD配列を配
置したプラスミドに組入れ該プラスミドによりエシェリ
シャ尿細菌、バチルス属細菌等の蛋白質発現の為に開発
された宿主細菌を形質転換することにより該プラスミド
含有細菌を得る。これらの細菌を培養しペクチンリアー
ゼを得る事ができるものである。
以下詳しく本発明について記述する。
第1図は、pL71の制限酵素地図を示す図。
第2図は、pUp17の作成方法及び制限酵素地図を示
す図。
す図。
第3図は、ペクチンリアーゼ活性のpH変化を示すグラ
フである。
フである。
まず、ペクチンリアーゼ遺伝子のクローニングについて
は以下の方法で行えば良い。エシェリシャ・コリを宿主
とするクローニングベクタ、例えばpBR322を適当
な制限酵素により消化しアルカリホスファターゼと反応
させる事により5”末端のリン酸基を取除く。制限酵素
としては:例えばpBR322上の1カ所の部位を消化
する8gmHr、EcoRI、Hindrll、5al
lなどが好適に使用され、エルビニア属細菌の染色体D
NAを同一の制限酵素で消化した後、 pBR322と
T 4DNAリガーゼにより再環化する。ついで、再環
化反応溶液でエシェリシャ尿細菌を形質転換し、得られ
た形質転換株の中からペクチンリアーゼ遺伝子を持つ菌
株を選択するものである。また、ペクチンリアーゼ遺伝
子をもつ菌株の検出は以下に示す方法で行うことができ
る。即ち、ペクチンを含む軟寒天培地に形質転換した菌
株を均一に巻き、37℃にて−ないし2日培養を行う。
は以下の方法で行えば良い。エシェリシャ・コリを宿主
とするクローニングベクタ、例えばpBR322を適当
な制限酵素により消化しアルカリホスファターゼと反応
させる事により5”末端のリン酸基を取除く。制限酵素
としては:例えばpBR322上の1カ所の部位を消化
する8gmHr、EcoRI、Hindrll、5al
lなどが好適に使用され、エルビニア属細菌の染色体D
NAを同一の制限酵素で消化した後、 pBR322と
T 4DNAリガーゼにより再環化する。ついで、再環
化反応溶液でエシェリシャ尿細菌を形質転換し、得られ
た形質転換株の中からペクチンリアーゼ遺伝子を持つ菌
株を選択するものである。また、ペクチンリアーゼ遺伝
子をもつ菌株の検出は以下に示す方法で行うことができ
る。即ち、ペクチンを含む軟寒天培地に形質転換した菌
株を均一に巻き、37℃にて−ないし2日培養を行う。
ペクチンリアーゼ遺伝子を持ち尚且つペクチンリアーゼ
を生産する菌は、その周囲が陥没するのでほかの菌株と
区別できる。
を生産する菌は、その周囲が陥没するのでほかの菌株と
区別できる。
以下にペクチン軟寒天培地の組成を示す。
ペクチン 22g
ペプトン 20g
K2HPO41,5g
門gsO40,7g
グリセリン 10g
寒天 4g
以上の薬品を水10100Oに溶解しl)Hを7.2に
調整した後オートクレーブ滅菌を行なう。本発明では、
このような方法を用いてペクチンリアーゼ遺伝子を含む
ベクターpL71を得る。なお、ベクターρ1,71お
よびペクチンリアーゼ遺伝子の制限酵素地図は実施例の
項で記載する。
調整した後オートクレーブ滅菌を行なう。本発明では、
このような方法を用いてペクチンリアーゼ遺伝子を含む
ベクターpL71を得る。なお、ベクターρ1,71お
よびペクチンリアーゼ遺伝子の制限酵素地図は実施例の
項で記載する。
次にエシェリシャ尿細菌によるペクチンリアーゼの大量
生産について記述する。
生産について記述する。
まず、エシェリシャ尿細菌、特にエシェリシャ・コリに
おいて働く強力なプロモーターをペクチンリアーゼ遺伝
子の前に配置したプラスミドを作成する。プロモーター
としては、たとえばlac、tac、PL、PR,Ip
p+colicin Elプロモーター等が好ましく、
これらのプロモーターの下流に、先にクローニングした
ペクチンリアーゼ遺伝子を含むDNA断片を正の向きに
配置する。
おいて働く強力なプロモーターをペクチンリアーゼ遺伝
子の前に配置したプラスミドを作成する。プロモーター
としては、たとえばlac、tac、PL、PR,Ip
p+colicin Elプロモーター等が好ましく、
これらのプロモーターの下流に、先にクローニングした
ペクチンリアーゼ遺伝子を含むDNA断片を正の向きに
配置する。
例えば、第2図に示すようにベクターとしてpUc9を
制限酵素EcoRIで消化した後にアルカリフォスタフ
アーゼ処理したのち、ペクチンリアーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドpL71をEco RIで消化し3.5キロベ
ース対のDNA断片を抽出し、アルカリフォスファター
ゼ処理pUc9DNAとT4DNAリガーゼにより再環
化を行う。この耳遠化反応溶液によりエシェリシャ・コ
リ細菌を形質転換し、得られた転換株の中からプロモー
ターと正方向にペクチンリアーゼ遺伝子が配列したプラ
スミドを持つ菌を選び出す。
制限酵素EcoRIで消化した後にアルカリフォスタフ
アーゼ処理したのち、ペクチンリアーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドpL71をEco RIで消化し3.5キロベ
ース対のDNA断片を抽出し、アルカリフォスファター
ゼ処理pUc9DNAとT4DNAリガーゼにより再環
化を行う。この耳遠化反応溶液によりエシェリシャ・コ
リ細菌を形質転換し、得られた転換株の中からプロモー
ターと正方向にペクチンリアーゼ遺伝子が配列したプラ
スミドを持つ菌を選び出す。
以上の様にして得られた発現用プラスミドを保持するエ
シェリシャ属細菌をLB培地もしくはM9mE培地など
で0D600が0.4−0.5になるまで培養する。そ
の後イソプロピルβ、D−チオガラクトピラノシド(I
PTG)を最終濃度が1m旧こなるように添加し更に数
時間培養を続ける。それ以後は菌体からの一般的な蛋白
抽出方法によりペクチンリアーゼを得ることができる。
シェリシャ属細菌をLB培地もしくはM9mE培地など
で0D600が0.4−0.5になるまで培養する。そ
の後イソプロピルβ、D−チオガラクトピラノシド(I
PTG)を最終濃度が1m旧こなるように添加し更に数
時間培養を続ける。それ以後は菌体からの一般的な蛋白
抽出方法によりペクチンリアーゼを得ることができる。
第3図は本発明にかかるペクチンリアーゼの活性を示し
たものであってpH7〜8で高い活性を示すものである
。
たものであってpH7〜8で高い活性を示すものである
。
本発明のペクチンリアーゼ遺伝子を含むプラスミド、発
現用プラスミドの典型的なものは、各種のエシェリシャ
属細菌に導入し、昭和63年7月18日付で微工研に寄
託、以下の寄託番号が付されている。
現用プラスミドの典型的なものは、各種のエシェリシャ
属細菌に導入し、昭和63年7月18日付で微工研に寄
託、以下の寄託番号が付されている。
エシェリシャ・フリ(Escherichia co
li) RRI/pL71微工研菌寄第10146
号(FER門P−10146)エシェリシt’ コリ
(Escherichia coli) RB7
91/pUPL7微工研菌寄第10147号(FERM
P−10147)以下に実施例を示すが、本発明は以
下の実施例に限定されるものではない。
li) RRI/pL71微工研菌寄第10146
号(FER門P−10146)エシェリシt’ コリ
(Escherichia coli) RB7
91/pUPL7微工研菌寄第10147号(FERM
P−10147)以下に実施例を示すが、本発明は以
下の実施例に限定されるものではない。
実施例中で用いた培地などの組成は以下のとおりである
。
。
LB amp培地;
NaCl 5 g
ペプトン Log
酵母エキス 5g
アンピシリン 25mg
000m1
水
LB amp寒天培地;
前記LB amp培地の各成分の他、寒天15gを含有
。
。
M9mE培地;
X10M9塩 100m1
酵母エキス 1g
グリセリン 4g
水 900m1
なお、スクリーニング培地にはLB amp寒天培地を
、増殖用培養液にはLB amp培地: M9mE培地
を用いた。
、増殖用培養液にはLB amp培地: M9mE培地
を用いた。
実施例1
エルビニア・カロトボーラ・サプスビ・力ロトボーラ(
Erivinia carotovora 5ubsp
、carotovora)IFO−14082株の染色
体DNAl0μgを制限酵素Bamt(I 10uと5
0μlの反応液(100mM NaC1,50mMTr
ts−HCI pH7,5,10mM MgCl2.1
mMデチオスレイトール)中で37℃にて1時間反応さ
せた。エタノールで沈殿させた後、乾燥し、20μlの
TEバッフy −(10mM Tris−HCI pH
7,5,1mM EDTA)に溶解した(A液)。プラ
スミドpBR3222ggを同様の方法でBamHI
15uと反応させた後、20μIのTEバッファー に
溶解した(B液)。
Erivinia carotovora 5ubsp
、carotovora)IFO−14082株の染色
体DNAl0μgを制限酵素Bamt(I 10uと5
0μlの反応液(100mM NaC1,50mMTr
ts−HCI pH7,5,10mM MgCl2.1
mMデチオスレイトール)中で37℃にて1時間反応さ
せた。エタノールで沈殿させた後、乾燥し、20μlの
TEバッフy −(10mM Tris−HCI pH
7,5,1mM EDTA)に溶解した(A液)。プラ
スミドpBR3222ggを同様の方法でBamHI
15uと反応させた後、20μIのTEバッファー に
溶解した(B液)。
8μmのA液と2μIのB液とをT4DNAリガーゼ5
uと共に20μlの反応液中で16℃にて8時間反応さ
せた。反応液によりエシェリシャ・コリRRI株を形質
転換させた。アンピシリン506 g/mlを含むLB
プレート上に生えた菌の中から、ペクチンリアーゼ分離
用プレート上で周囲が陥没した菌株を得た。この菌の保
有するプラスミドをpL71と命名した。プラスミドp
L71の制限酵素地図を第1図に示す。
uと共に20μlの反応液中で16℃にて8時間反応さ
せた。反応液によりエシェリシャ・コリRRI株を形質
転換させた。アンピシリン506 g/mlを含むLB
プレート上に生えた菌の中から、ペクチンリアーゼ分離
用プレート上で周囲が陥没した菌株を得た。この菌の保
有するプラスミドをpL71と命名した。プラスミドp
L71の制限酵素地図を第1図に示す。
実施例2
プラスミドpL715μgを制限酵素EcoRI 10
uと20μlの反応液(100mM NaCl、50m
M Tris−HCIpH7,5,10mM−gc12
,1mM ジチオスレイトール)中で37℃にて1時間
反応させた。反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ約
3500塩基対のDNA断片を抽出し、フェノール処理
、エタノール沈殿の後20μlのTEバッファーに溶解
した(C液)。
uと20μlの反応液(100mM NaCl、50m
M Tris−HCIpH7,5,10mM−gc12
,1mM ジチオスレイトール)中で37℃にて1時間
反応させた。反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ約
3500塩基対のDNA断片を抽出し、フェノール処理
、エタノール沈殿の後20μlのTEバッファーに溶解
した(C液)。
一方、プラスミドp[Ic93μgをEcoRr 10
uと20μlの反応液中、37℃にて1時間反応させた
。
uと20μlの反応液中、37℃にて1時間反応させた
。
エタノール沈殿後、20μIのTEバッファーに溶解し
、1/10ffiのバッフy −(0,5MTris−
HCI pit8.5.)を加えた後アルカリフォスフ
ァターゼ2uと共に37°Cにて1時間反応を行った。
、1/10ffiのバッフy −(0,5MTris−
HCI pit8.5.)を加えた後アルカリフォスフ
ァターゼ2uと共に37°Cにて1時間反応を行った。
フェノール処理、エタノール沈殿後、20μlのTEバ
ッファーに溶解した(D液)。
ッファーに溶解した(D液)。
10μlのC液と2μmのD液とを、T4DNAリガー
ゼ5uと共に20μlの反応液中で16℃にて8時間反
応させた。反応液によりエシェリシャ・コリR8791
株を形質転換させた。7ノビシリン50μg/mlを含
むLBプレート上に生えた菌の中から、第2図に示すプ
ラスミドpUPL7を保持する菌株を得た。
ゼ5uと共に20μlの反応液中で16℃にて8時間反
応させた。反応液によりエシェリシャ・コリR8791
株を形質転換させた。7ノビシリン50μg/mlを含
むLBプレート上に生えた菌の中から、第2図に示すプ
ラスミドpUPL7を保持する菌株を得た。
実施例3
アンピシリン(50μg#nl)を含むLB培地5ml
中でエシェリシャ・コリ RB791/pUPL7を3
7°Cで一夜培養した後、培養液0.1mlをM9mE
培地(アンピシリン50μg/ml)に入れて振盪培養
を続けた。0D600が約0.5になった時点で最終濃
度が1mM ?こなるようにIPTGを加えた。更に5
時間の振の培養の後、水中に培養液を置いた。1ml菌
体培地をエソペンドルフチューブに採取した後遠心し、
培地液と菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットを
1mlのTEバッファーに溶解し超音波により菌体を破
砕した。ペクチンリアーゼ活性の各pHにおける活性を
第3図に示す。
中でエシェリシャ・コリ RB791/pUPL7を3
7°Cで一夜培養した後、培養液0.1mlをM9mE
培地(アンピシリン50μg/ml)に入れて振盪培養
を続けた。0D600が約0.5になった時点で最終濃
度が1mM ?こなるようにIPTGを加えた。更に5
時間の振の培養の後、水中に培養液を置いた。1ml菌
体培地をエソペンドルフチューブに採取した後遠心し、
培地液と菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットを
1mlのTEバッファーに溶解し超音波により菌体を破
砕した。ペクチンリアーゼ活性の各pHにおける活性を
第3図に示す。
pH8,0では菌体中に2.57u/m l (1uは
、1分間に0D235を1.00上げる酵素活性)、培
地中に0.98u/m+存在した。又、分子量は約33
000を示した。
、1分間に0D235を1.00上げる酵素活性)、培
地中に0.98u/m+存在した。又、分子量は約33
000を示した。
本発明によれば、従来技術では単独に生産することが難
しかつたペクチンリアーゼを大量に供給することができ
る。
しかつたペクチンリアーゼを大量に供給することができ
る。
第1図は、pL71の制限酵素地図を示す図。
第2図は、pUp17の作成方法及び制限酵素地図を示
す図。
す図。
Claims (6)
- (1)エルビニア(Erwinia)属細菌由来のペク
チンリアーゼ遺伝子をコードするDNA断片。 - (2)細菌がエルビニア・カロトボーラ(Erwini
acarotovora)である請求項1記載のペクチ
ンリアーゼ遺伝子をコードするDNA断片。 - (3)請求項1記載のDNA断片を含むプラスミドを保
持するエシェリシャ(Escherichia)属細菌
。 - (4)請求項2記載のDNA断片を含むプラスミドを保
持するエシェリシャ(Escherichia)属細菌
。 - (5)請求項3記載の細菌を用いることを特徴とするペ
クチンリアーゼの製造法。 - (6)請求項4記載の細菌を用いることを特徴とするペ
クチンリアーゼの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18344588A JPH0235088A (ja) | 1988-07-25 | 1988-07-25 | ペクチンリアーゼ遺伝子およびペクチンリアーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18344588A JPH0235088A (ja) | 1988-07-25 | 1988-07-25 | ペクチンリアーゼ遺伝子およびペクチンリアーゼの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0235088A true JPH0235088A (ja) | 1990-02-05 |
Family
ID=16135896
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18344588A Pending JPH0235088A (ja) | 1988-07-25 | 1988-07-25 | ペクチンリアーゼ遺伝子およびペクチンリアーゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0235088A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003529623A (ja) * | 1999-01-14 | 2003-10-07 | ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー | ペクチン酸リアーゼおよびブリーチ系を含有した洗剤組成物 |
US8245398B2 (en) | 2009-03-04 | 2012-08-21 | Nok Corporation | Method of shape forming a seal-ring |
-
1988
- 1988-07-25 JP JP18344588A patent/JPH0235088A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003529623A (ja) * | 1999-01-14 | 2003-10-07 | ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー | ペクチン酸リアーゼおよびブリーチ系を含有した洗剤組成物 |
US8245398B2 (en) | 2009-03-04 | 2012-08-21 | Nok Corporation | Method of shape forming a seal-ring |
US8342835B2 (en) | 2009-03-04 | 2013-01-01 | Nok Corporation | Seal-ring shape forming apparatus |
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