JPH0235088A - ペクチンリアーゼ遺伝子およびペクチンリアーゼの製造法 - Google Patents
ペクチンリアーゼ遺伝子およびペクチンリアーゼの製造法Info
- Publication number
- JPH0235088A JPH0235088A JP18344588A JP18344588A JPH0235088A JP H0235088 A JPH0235088 A JP H0235088A JP 18344588 A JP18344588 A JP 18344588A JP 18344588 A JP18344588 A JP 18344588A JP H0235088 A JPH0235088 A JP H0235088A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pectin lyase
- plasmid
- bacterium
- genus
- dna fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010029182 Pectin lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 17
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 claims abstract description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 3
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 3
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 3
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 108010073254 Colicins Proteins 0.000 description 1
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 1
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588699 Erwinia sp. Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ペクチンリアーゼ酵素の遺伝子工学による製
造分野に関する。ペクチンリアーゼはかんきつ類のひょ
うのう除去、植物細胞からの有用成分の抽出等、植物組
織崩壊による食品飼料薬剤等の製造、あるいは洗剤の添
加剤などに用いられている。
造分野に関する。ペクチンリアーゼはかんきつ類のひょ
うのう除去、植物細胞からの有用成分の抽出等、植物組
織崩壊による食品飼料薬剤等の製造、あるいは洗剤の添
加剤などに用いられている。
各種微生物例えば、細菌ではエルビニア属（Ｅｒｗｉｎ
ｉａ ）等、糸状菌ではアスパラギラス属（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ）に属する微生物等がペクチンリアーゼを
生産することは既に知られている（例えば、後藤正夫著
新植物細菌病学、ｐ６１−６４、ソフトサイエンス社
、１９８１年、及びＳ、 ｌ５ｈｉｉａｎｄ Ｔ、Ｙｏ
ｋｏｔｓｕｋａ、 Ａｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
、、Ｖｏｌ。
ｉａ ）等、糸状菌ではアスパラギラス属（Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ）に属する微生物等がペクチンリアーゼを
生産することは既に知られている（例えば、後藤正夫著
新植物細菌病学、ｐ６１−６４、ソフトサイエンス社
、１９８１年、及びＳ、 ｌ５ｈｉｉａｎｄ Ｔ、Ｙｏ
ｋｏｔｓｕｋａ、 Ａｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ
、、Ｖｏｌ。
３６、ｐ、 Ｌ４６−１５３．．９７２）。しかしなが
ら、これらの微生物をその生産源として用いる場合には
、複数のペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ボリ
ガラクッロナーゼなどの混合物として得うれ、精製が難
しいという欠点があり、又、その生産量が少ないという
欠点をも有する。特にエルビニア属等の細菌を生産源と
する場合、ペクチン酸リアーゼが主として生産されペク
チンリアーゼとしては少ない。本発明は、それらの欠点
を解決するものである。
ら、これらの微生物をその生産源として用いる場合には
、複数のペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ボリ
ガラクッロナーゼなどの混合物として得うれ、精製が難
しいという欠点があり、又、その生産量が少ないという
欠点をも有する。特にエルビニア属等の細菌を生産源と
する場合、ペクチン酸リアーゼが主として生産されペク
チンリアーゼとしては少ない。本発明は、それらの欠点
を解決するものである。
一般にいわゆるペクチナーゼとして、ペクチンリアーゼ
、ペクチン酸リアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、オリゴ
ガラクッロナーゼが知られている。上述したようにペク
チンリアーゼを生産する微生物は、複数のペクチンリア
ーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ポリガラクッロナーゼ、オ
リゴガラクッロナーゼをも生産することがらペクチンリ
アーゼのみの単Ｈ精製は容易ではなく、又、その生産量
も個々の酵素に関しては満足すべきものではない。
、ペクチン酸リアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、オリゴ
ガラクッロナーゼが知られている。上述したようにペク
チンリアーゼを生産する微生物は、複数のペクチンリア
ーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ポリガラクッロナーゼ、オ
リゴガラクッロナーゼをも生産することがらペクチンリ
アーゼのみの単Ｈ精製は容易ではなく、又、その生産量
も個々の酵素に関しては満足すべきものではない。
本発明は、遺伝子工学手法を用いることによりこれらの
問題を解決したものである。即ち、組替えＤＮＡ技術に
より、エルビニア属ｍｗのペクチンリアーゼ遺伝子を各
々の宿主中で動く強力なプロモーター及びＳＤ配列を配
置したプラスミドに組入れ該プラスミドによりエシェリ
シャ尿細菌、バチルス属細菌等の蛋白質発現の為に開発
された宿主細菌を形質転換することにより該プラスミド
含有細菌を得る。これらの細菌を培養しペクチンリアー
ゼを得る事ができるものである。
問題を解決したものである。即ち、組替えＤＮＡ技術に
より、エルビニア属ｍｗのペクチンリアーゼ遺伝子を各
々の宿主中で動く強力なプロモーター及びＳＤ配列を配
置したプラスミドに組入れ該プラスミドによりエシェリ
シャ尿細菌、バチルス属細菌等の蛋白質発現の為に開発
された宿主細菌を形質転換することにより該プラスミド
含有細菌を得る。これらの細菌を培養しペクチンリアー
ゼを得る事ができるものである。
以下詳しく本発明について記述する。
第１図は、ｐＬ７１の制限酵素地図を示す図。
第２図は、ｐＵｐ１７の作成方法及び制限酵素地図を示
す図。
す図。
第３図は、ペクチンリアーゼ活性のｐＨ変化を示すグラ
フである。
フである。
まず、ペクチンリアーゼ遺伝子のクローニングについて
は以下の方法で行えば良い。エシェリシャ・コリを宿主
とするクローニングベクタ、例えばｐＢＲ３２２を適当
な制限酵素により消化しアルカリホスファターゼと反応
させる事により５”末端のリン酸基を取除く。制限酵素
としては：例えばｐＢＲ３２２上の１カ所の部位を消化
する８ｇｍＨｒ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｒｌｌ、５ａｌ
ｌなどが好適に使用され、エルビニア属細菌の染色体Ｄ
ＮＡを同一の制限酵素で消化した後、 ｐＢＲ３２２と
Ｔ ４ＤＮＡリガーゼにより再環化する。ついで、再環
化反応溶液でエシェリシャ尿細菌を形質転換し、得られ
た形質転換株の中からペクチンリアーゼ遺伝子を持つ菌
株を選択するものである。また、ペクチンリアーゼ遺伝
子をもつ菌株の検出は以下に示す方法で行うことができ
る。即ち、ペクチンを含む軟寒天培地に形質転換した菌
株を均一に巻き、３７℃にて−ないし２日培養を行う。
は以下の方法で行えば良い。エシェリシャ・コリを宿主
とするクローニングベクタ、例えばｐＢＲ３２２を適当
な制限酵素により消化しアルカリホスファターゼと反応
させる事により５”末端のリン酸基を取除く。制限酵素
としては：例えばｐＢＲ３２２上の１カ所の部位を消化
する８ｇｍＨｒ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｒｌｌ、５ａｌ
ｌなどが好適に使用され、エルビニア属細菌の染色体Ｄ
ＮＡを同一の制限酵素で消化した後、 ｐＢＲ３２２と
Ｔ ４ＤＮＡリガーゼにより再環化する。ついで、再環
化反応溶液でエシェリシャ尿細菌を形質転換し、得られ
た形質転換株の中からペクチンリアーゼ遺伝子を持つ菌
株を選択するものである。また、ペクチンリアーゼ遺伝
子をもつ菌株の検出は以下に示す方法で行うことができ
る。即ち、ペクチンを含む軟寒天培地に形質転換した菌
株を均一に巻き、３７℃にて−ないし２日培養を行う。
ペクチンリアーゼ遺伝子を持ち尚且つペクチンリアーゼ
を生産する菌は、その周囲が陥没するのでほかの菌株と
区別できる。
を生産する菌は、その周囲が陥没するのでほかの菌株と
区別できる。
以下にペクチン軟寒天培地の組成を示す。
ペクチン ２２ｇ
ペプトン ２０ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４１，５ｇ
門ｇｓＯ４０，７ｇ
グリセリン １０ｇ
寒天 ４ｇ
以上の薬品を水１０１００Ｏに溶解しｌ）Ｈを７．２に
調整した後オートクレーブ滅菌を行なう。本発明では、
このような方法を用いてペクチンリアーゼ遺伝子を含む
ベクターｐＬ７１を得る。なお、ベクターρ１，７１お
よびペクチンリアーゼ遺伝子の制限酵素地図は実施例の
項で記載する。
調整した後オートクレーブ滅菌を行なう。本発明では、
このような方法を用いてペクチンリアーゼ遺伝子を含む
ベクターｐＬ７１を得る。なお、ベクターρ１，７１お
よびペクチンリアーゼ遺伝子の制限酵素地図は実施例の
項で記載する。
次にエシェリシャ尿細菌によるペクチンリアーゼの大量
生産について記述する。
生産について記述する。
まず、エシェリシャ尿細菌、特にエシェリシャ・コリに
おいて働く強力なプロモーターをペクチンリアーゼ遺伝
子の前に配置したプラスミドを作成する。プロモーター
としては、たとえばｌａｃ、ｔａｃ、ＰＬ、ＰＲ，Ｉｐ
ｐ＋ｃｏｌｉｃｉｎ Ｅｌプロモーター等が好ましく、
これらのプロモーターの下流に、先にクローニングした
ペクチンリアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を正の向きに
配置する。
おいて働く強力なプロモーターをペクチンリアーゼ遺伝
子の前に配置したプラスミドを作成する。プロモーター
としては、たとえばｌａｃ、ｔａｃ、ＰＬ、ＰＲ，Ｉｐ
ｐ＋ｃｏｌｉｃｉｎ Ｅｌプロモーター等が好ましく、
これらのプロモーターの下流に、先にクローニングした
ペクチンリアーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を正の向きに
配置する。
例えば、第２図に示すようにベクターとしてｐＵｃ９を
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後にアルカリフォスタフ
アーゼ処理したのち、ペクチンリアーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドｐＬ７１をＥｃｏ ＲＩで消化し３．５キロベ
ース対のＤＮＡ断片を抽出し、アルカリフォスファター
ゼ処理ｐＵｃ９ＤＮＡとＴ４ＤＮＡリガーゼにより再環
化を行う。この耳遠化反応溶液によりエシェリシャ・コ
リ細菌を形質転換し、得られた転換株の中からプロモー
ターと正方向にペクチンリアーゼ遺伝子が配列したプラ
スミドを持つ菌を選び出す。
制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後にアルカリフォスタフ
アーゼ処理したのち、ペクチンリアーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドｐＬ７１をＥｃｏ ＲＩで消化し３．５キロベ
ース対のＤＮＡ断片を抽出し、アルカリフォスファター
ゼ処理ｐＵｃ９ＤＮＡとＴ４ＤＮＡリガーゼにより再環
化を行う。この耳遠化反応溶液によりエシェリシャ・コ
リ細菌を形質転換し、得られた転換株の中からプロモー
ターと正方向にペクチンリアーゼ遺伝子が配列したプラ
スミドを持つ菌を選び出す。
以上の様にして得られた発現用プラスミドを保持するエ
シェリシャ属細菌をＬＢ培地もしくはＭ９ｍＥ培地など
で０Ｄ６００が０．４−０．５になるまで培養する。そ
の後イソプロピルβ、Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ
ＰＴＧ）を最終濃度が１ｍ旧こなるように添加し更に数
時間培養を続ける。それ以後は菌体からの一般的な蛋白
抽出方法によりペクチンリアーゼを得ることができる。
シェリシャ属細菌をＬＢ培地もしくはＭ９ｍＥ培地など
で０Ｄ６００が０．４−０．５になるまで培養する。そ
の後イソプロピルβ、Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ
ＰＴＧ）を最終濃度が１ｍ旧こなるように添加し更に数
時間培養を続ける。それ以後は菌体からの一般的な蛋白
抽出方法によりペクチンリアーゼを得ることができる。
第３図は本発明にかかるペクチンリアーゼの活性を示し
たものであってｐＨ７〜８で高い活性を示すものである
。
たものであってｐＨ７〜８で高い活性を示すものである
。
本発明のペクチンリアーゼ遺伝子を含むプラスミド、発
現用プラスミドの典型的なものは、各種のエシェリシャ
属細菌に導入し、昭和６３年７月１８日付で微工研に寄
託、以下の寄託番号が付されている。
現用プラスミドの典型的なものは、各種のエシェリシャ
属細菌に導入し、昭和６３年７月１８日付で微工研に寄
託、以下の寄託番号が付されている。
エシェリシャ・フリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ） ＲＲＩ／ｐＬ７１微工研菌寄第１０１４６
号（ＦＥＲ門Ｐ−１０１４６）エシェリシｔ’ コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＲＢ７
９１／ｐＵＰＬ７微工研菌寄第１０１４７号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１０１４７）以下に実施例を示すが、本発明は以
下の実施例に限定されるものではない。
ｌｉ） ＲＲＩ／ｐＬ７１微工研菌寄第１０１４６
号（ＦＥＲ門Ｐ−１０１４６）エシェリシｔ’ コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＲＢ７
９１／ｐＵＰＬ７微工研菌寄第１０１４７号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１０１４７）以下に実施例を示すが、本発明は以
下の実施例に限定されるものではない。
実施例中で用いた培地などの組成は以下のとおりである
。
。
ＬＢ ａｍｐ培地；
ＮａＣｌ ５ ｇ
ペプトン Ｌｏｇ
酵母エキス ５ｇ
アンピシリン ２５ｍｇ
０００ｍ１
水
ＬＢ ａｍｐ寒天培地；
前記ＬＢ ａｍｐ培地の各成分の他、寒天１５ｇを含有
。
。
Ｍ９ｍＥ培地；
Ｘ１０Ｍ９塩 １００ｍ１
酵母エキス １ｇ
グリセリン ４ｇ
水 ９００ｍ１
なお、スクリーニング培地にはＬＢ ａｍｐ寒天培地を
、増殖用培養液にはＬＢ ａｍｐ培地： Ｍ９ｍＥ培地
を用いた。
、増殖用培養液にはＬＢ ａｍｐ培地： Ｍ９ｍＥ培地
を用いた。
実施例１
エルビニア・カロトボーラ・サプスビ・力ロトボーラ（
Ｅｒｉｖｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ５ｕｂｓｐ
、ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）ＩＦＯ−１４０８２株の染色
体ＤＮＡｌ０μｇを制限酵素Ｂａｍｔ（Ｉ １０ｕと５
０μｌの反応液（１００ｍＭ ＮａＣ１，５０ｍＭＴｒ
ｔｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２．１
ｍＭデチオスレイトール）中で３７℃にて１時間反応さ
せた。エタノールで沈殿させた後、乾燥し、２０μｌの
ＴＥバッフｙ −（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ
７，５，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した（Ａ液）。プラ
スミドｐＢＲ３２２２ｇｇを同様の方法でＢａｍＨＩ
１５ｕと反応させた後、２０μＩのＴＥバッファー に
溶解した（Ｂ液）。
Ｅｒｉｖｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ５ｕｂｓｐ
、ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）ＩＦＯ−１４０８２株の染色
体ＤＮＡｌ０μｇを制限酵素Ｂａｍｔ（Ｉ １０ｕと５
０μｌの反応液（１００ｍＭ ＮａＣ１，５０ｍＭＴｒ
ｔｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２．１
ｍＭデチオスレイトール）中で３７℃にて１時間反応さ
せた。エタノールで沈殿させた後、乾燥し、２０μｌの
ＴＥバッフｙ −（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ
７，５，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した（Ａ液）。プラ
スミドｐＢＲ３２２２ｇｇを同様の方法でＢａｍＨＩ
１５ｕと反応させた後、２０μＩのＴＥバッファー に
溶解した（Ｂ液）。
８μｍのＡ液と２μＩのＢ液とをＴ４ＤＮＡリガーゼ５
ｕと共に２０μｌの反応液中で１６℃にて８時間反応さ
せた。反応液によりエシェリシャ・コリＲＲＩ株を形質
転換させた。アンピシリン５０６ ｇ／ｍｌを含むＬＢ
プレート上に生えた菌の中から、ペクチンリアーゼ分離
用プレート上で周囲が陥没した菌株を得た。この菌の保
有するプラスミドをｐＬ７１と命名した。プラスミドｐ
Ｌ７１の制限酵素地図を第１図に示す。
ｕと共に２０μｌの反応液中で１６℃にて８時間反応さ
せた。反応液によりエシェリシャ・コリＲＲＩ株を形質
転換させた。アンピシリン５０６ ｇ／ｍｌを含むＬＢ
プレート上に生えた菌の中から、ペクチンリアーゼ分離
用プレート上で周囲が陥没した菌株を得た。この菌の保
有するプラスミドをｐＬ７１と命名した。プラスミドｐ
Ｌ７１の制限酵素地図を第１図に示す。
実施例２
プラスミドｐＬ７１５μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ １０
ｕと２０μｌの反応液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ７，５，１０ｍＭ−ｇｃ１２
，１ｍＭ ジチオスレイトール）中で３７℃にて１時間
反応させた。反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ約
３５００塩基対のＤＮＡ断片を抽出し、フェノール処理
、エタノール沈殿の後２０μｌのＴＥバッファーに溶解
した（Ｃ液）。
ｕと２０μｌの反応液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ７，５，１０ｍＭ−ｇｃ１２
，１ｍＭ ジチオスレイトール）中で３７℃にて１時間
反応させた。反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ約
３５００塩基対のＤＮＡ断片を抽出し、フェノール処理
、エタノール沈殿の後２０μｌのＴＥバッファーに溶解
した（Ｃ液）。
一方、プラスミドｐ［Ｉｃ９３μｇをＥｃｏＲｒ １０
ｕと２０μｌの反応液中、３７℃にて１時間反応させた
。
ｕと２０μｌの反応液中、３７℃にて１時間反応させた
。
エタノール沈殿後、２０μＩのＴＥバッファーに溶解し
、１／１０ｆｆｉのバッフｙ −（０，５ＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ ｐｉｔ８．５．）を加えた後アルカリフォスフ
ァターゼ２ｕと共に３７°Ｃにて１時間反応を行った。
、１／１０ｆｆｉのバッフｙ −（０，５ＭＴｒｉｓ−
ＨＣＩ ｐｉｔ８．５．）を加えた後アルカリフォスフ
ァターゼ２ｕと共に３７°Ｃにて１時間反応を行った。
フェノール処理、エタノール沈殿後、２０μｌのＴＥバ
ッファーに溶解した（Ｄ液）。
ッファーに溶解した（Ｄ液）。
１０μｌのＣ液と２μｍのＤ液とを、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ５ｕと共に２０μｌの反応液中で１６℃にて８時間反
応させた。反応液によりエシェリシャ・コリＲ８７９１
株を形質転換させた。７ノビシリン５０μｇ／ｍｌを含
むＬＢプレート上に生えた菌の中から、第２図に示すプ
ラスミドｐＵＰＬ７を保持する菌株を得た。
ゼ５ｕと共に２０μｌの反応液中で１６℃にて８時間反
応させた。反応液によりエシェリシャ・コリＲ８７９１
株を形質転換させた。７ノビシリン５０μｇ／ｍｌを含
むＬＢプレート上に生えた菌の中から、第２図に示すプ
ラスミドｐＵＰＬ７を保持する菌株を得た。
実施例３
アンピシリン（５０μｇ＃ｎｌ）を含むＬＢ培地５ｍｌ
中でエシェリシャ・コリ ＲＢ７９１／ｐＵＰＬ７を３
７°Ｃで一夜培養した後、培養液０．１ｍｌをＭ９ｍＥ
培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）に入れて振盪培養
を続けた。０Ｄ６００が約０．５になった時点で最終濃
度が１ｍＭ ？こなるようにＩＰＴＧを加えた。更に５
時間の振の培養の後、水中に培養液を置いた。１ｍｌ菌
体培地をエソペンドルフチューブに採取した後遠心し、
培地液と菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットを
１ｍｌのＴＥバッファーに溶解し超音波により菌体を破
砕した。ペクチンリアーゼ活性の各ｐＨにおける活性を
第３図に示す。
中でエシェリシャ・コリ ＲＢ７９１／ｐＵＰＬ７を３
７°Ｃで一夜培養した後、培養液０．１ｍｌをＭ９ｍＥ
培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）に入れて振盪培養
を続けた。０Ｄ６００が約０．５になった時点で最終濃
度が１ｍＭ ？こなるようにＩＰＴＧを加えた。更に５
時間の振の培養の後、水中に培養液を置いた。１ｍｌ菌
体培地をエソペンドルフチューブに採取した後遠心し、
培地液と菌体ペレットを得た。得られた菌体ペレットを
１ｍｌのＴＥバッファーに溶解し超音波により菌体を破
砕した。ペクチンリアーゼ活性の各ｐＨにおける活性を
第３図に示す。
ｐＨ８，０では菌体中に２．５７ｕ／ｍ ｌ （１ｕは
、１分間に０Ｄ２３５を１．００上げる酵素活性）、培
地中に０．９８ｕ／ｍ＋存在した。又、分子量は約３３
０００を示した。
、１分間に０Ｄ２３５を１．００上げる酵素活性）、培
地中に０．９８ｕ／ｍ＋存在した。又、分子量は約３３
０００を示した。
本発明によれば、従来技術では単独に生産することが難
しかつたペクチンリアーゼを大量に供給することができ
る。
しかつたペクチンリアーゼを大量に供給することができ
る。
第１図は、ｐＬ７１の制限酵素地図を示す図。
第２図は、ｐＵｐ１７の作成方法及び制限酵素地図を示
す図。
す図。
Claims (6)
- （１）エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌由来のペク
チンリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ断片。 - （２）細菌がエルビニア・カロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉ
ａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）である請求項１記載のペクチ
ンリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ断片。 - （３）請求項１記載のＤＮＡ断片を含むプラスミドを保
持するエシェリシャ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌
。 - （４）請求項２記載のＤＮＡ断片を含むプラスミドを保
持するエシェリシャ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌
。 - （５）請求項３記載の細菌を用いることを特徴とするペ
クチンリアーゼの製造法。 - （６）請求項４記載の細菌を用いることを特徴とするペ
クチンリアーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18344588A JPH0235088A (ja) | 1988-07-25 | 1988-07-25 | ペクチンリアーゼ遺伝子およびペクチンリアーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18344588A JPH0235088A (ja) | 1988-07-25 | 1988-07-25 | ペクチンリアーゼ遺伝子およびペクチンリアーゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0235088A true JPH0235088A (ja) | 1990-02-05 |
Family
ID=16135896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18344588A Pending JPH0235088A (ja) | 1988-07-25 | 1988-07-25 | ペクチンリアーゼ遺伝子およびペクチンリアーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0235088A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003529623A (ja) * | 1999-01-14 | 2003-10-07 | ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー | ペクチン酸リアーゼおよびブリーチ系を含有した洗剤組成物 |
| US8245398B2 (en) | 2009-03-04 | 2012-08-21 | Nok Corporation | Method of shape forming a seal-ring |
-
1988
- 1988-07-25 JP JP18344588A patent/JPH0235088A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003529623A (ja) * | 1999-01-14 | 2003-10-07 | ザ、プロクター、エンド、ギャンブル、カンパニー | ペクチン酸リアーゼおよびブリーチ系を含有した洗剤組成物 |
| US8245398B2 (en) | 2009-03-04 | 2012-08-21 | Nok Corporation | Method of shape forming a seal-ring |
| US8342835B2 (en) | 2009-03-04 | 2013-01-01 | Nok Corporation | Seal-ring shape forming apparatus |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vílchez et al. | Proline catabolism by Pseudomonas putida: cloning, characterization, and expression of the put genes in the presence of root exudates | |
| CN113227364A (zh) | 用于产生熊去氧胆酸及其前体的细胞和方法 | |
| JP2003289889A (ja) | シュードモナス・アエルギノザの外部膜タンパク質ｆ | |
| JP2021514679A (ja) | 糸状真菌宿主細胞によって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ | |
| CN110218736B (zh) | 一种改善PGPR产AcdS能力的改造方法 | |
| JPH11243961A (ja) | 新規なカタラーゼ、該カタラーゼの遺伝子及び該カタラーゼを含有する組成物、並びに遺伝子工学技術を用いてカタラーゼを調製する方法 | |
| JPH0235088A (ja) | ペクチンリアーゼ遺伝子およびペクチンリアーゼの製造法 | |
| JPH04218382A (ja) | 新規な宿主−ベクター系 | |
| Santhanam et al. | A reassessment of flocculosin-mediated biocontrol activity of Pseudozyma flocculosa through CRISPR/Cas9 gene editing | |
| JPS611384A (ja) | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 | |
| JPH0235087A (ja) | ペクチン酸リアーゼ遺伝子およびペクチン酸リアーゼの製造法 | |
| JPH0638751A (ja) | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 | |
| JPH07203976A (ja) | Ｎ−アセチルヘパロサン断片化用酵素をコードするｄｎａフラグメント、組換え酵素、およびそれを用いるｎ−アセチルヘパロサンの断片化方法 | |
| JPH0829083B2 (ja) | 中性プロテア−ゼの産生法 | |
| CN110468091A (zh) | 微生物及其用途 | |
| CN117051043B (zh) | 一种基于环状rna编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素及其应用 | |
| CN114507684B (zh) | 一种抑制地中海富盐菌中目的基因表达的方法 | |
| JPS6349075A (ja) | イプシロン―ポリ―ｌ―リシンを生産する菌株 | |
| JPS61280292A (ja) | 菌体外分泌による蛋白質の製造法 | |
| WO2020113365A1 (zh) | 一种高产脂肽的基因工程菌及其应用 | |
| JPH0928379A (ja) | 環状プラスミド | |
| JP3169927B2 (ja) | 水素光産生収率を向上したロドバクタースフェロイデスＲＶのポリヒドロキシアルカノイン酸類（ＰＨＡｓ）欠損株の単離 | |
| JPS60180590A (ja) | プラスミド | |
| CN117247882A (zh) | 一种组成型启动子改造的高产脂肽工程菌株及其构建方法 | |
| JPS62155080A (ja) | 新規な大腸菌宿主 |