CN110218736B

CN110218736B - 一种改善PGPR产AcdS能力的改造方法

Info

Publication number: CN110218736B
Application number: CN201910562494.5A
Authority: CN
Inventors: 邱立友; 刘文亮; 李涛; 高玉千; 戚元成; 王明道
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-06-26
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2039-06-26
Also published as: CN110218736A

Abstract

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一种改善PGPR产AcdS能力的改造方法。该方法通过同源重组替换启动子来提高PGPR菌的AcdS基因的表达量、AcdS酶活力和ACC代谢速率，进而提高PGPR菌对ACC的趋化强度。ACC是产AcdS的PGPR在根系定殖的关键趋化物之一，基于这一基础发明人以现有典型的恶臭假单胞菌UW4为例，对其进行了改造以提升其AcdS酶活，进一步对改造后菌株对ACC趋化强度进行实验后发现，相较于原始出发菌株，改造后菌株对ACC趋化强度得到了明显增强，而这可为PGPR在植物根际趋化定殖以及推进PGPR菌肥在农业生产中的应用奠定一定技术基础。

Description

一种改善PGPR产AcdS能力的改造方法

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一种改善PGPR产AcdS能力的改造方法。

背景技术

植物促生根际细菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是能够在植物根际定殖，提高植物营养的可给性、抑制病原菌的生长或产生某些特殊的促生物质，促进植物种子萌发和植物生长、发育的一类细菌。已有研究表明，使用PGPR菌肥，能够减少化肥用量20%-30%，减少农药用量30%以上，并且可使农作物增产10%-80%，在发展可持续农业中的作用越来越受到重视。

然而，PGPR在实际应用中的使用效果并不稳定，其主要原因在于：PGPR在植物根际的定殖量与促生效果呈显著正相关，因此影响PGPR使用效果的关键因素是在田间应用过程中能否在根际定殖并存活、并在与土著微生物竞争中取得优势。现有研究认为，PGPR在植物根际的定殖与其对植物根系分泌物的趋化反应有关。植物根系分泌物包括低分子量的有机酸、氨基酸、糖类等，高分子量的碳水化合物、蛋白质等。而对根际细菌产生趋化作用的主要是低分子量的氨基酸和有机酸，糖类往往没有表现出对细菌强的趋化作用。然而，以往研究中，人们在考察PGPR对这些根系分泌物的趋化时往往缺少同时考察土壤中非PGPR对这些分泌物的趋化性。理论而言，这些低分子量分泌物是微生物易于利用的营养物质，其也会吸引非PGPR趋化到达根系定殖，因此研究对于和确定吸引PGPR在根际趋化定殖的关键趋化物是改进和增强PGPR在根际定殖的重要前提之一。

对于PGPR研究表明，这类细菌除具有能够在根系定殖的共同特征外，另一个重要的特征是许多PGPR产1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）脱氨酶（ACC deaminase，AcdS），因此产AcdS的PGPR能够降解植物根系分泌的ACC为氨和α-酮丁酸。由于ACC是植物合成乙烯的前体物，而植物为了维持植物体内及生长环境中的乙烯的平衡就会持续地向根系分泌ACC，也因此，可利用PGPR通过控制生长环境中乙烯含量情况进而发挥调节植物生长的作用。换言之，通过改造PGPR的产AcdS能力进而改善PGPR对于植物的促生长作用也是一种可行的开发思路。

发明内容

本申请目的在于提供一种改善PGPR产AcdS能力的改造方法，从而为提高PGPR在植物根际的定殖能力奠定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种改善PGPR产AcdS能力的改造方法，该方法通过同源重组替换启动子（将原低表达启动子替换为高表达启动子方式，例如常用的细菌高表达组成型启动子（例如启动子Bra20）），来提高PGPR菌的AcdS基因的表达量、AcdS酶活力和ACC代谢速率，进而提高PGPR菌对ACC的趋化强度，有利于菌株在土壤植物根际趋化定殖竞争中取得优势，从而发挥根际定殖和促进植物生长的功能；

以典型恶臭假单胞菌UW4菌株为例，具体包括如下步骤：

（一）构建同源重组质粒pEX18Gm-Bra20

所构建的同源重组质粒pEX18Gm-Bra20由同源重组片段（UPD）与质粒pEX18Gm连接而成，其中同源重组片段（UPD）由二个DNA片段组成，一个是上游同源臂（UH），另一片段（PDH）是下游同源臂（DH）和启动子Bra20连接在一起的片段；具体构建过程介绍如下。

（1）获得上游同源臂UH片段

设计PCR扩增用引物序列如SEQ ID NO.1~2所示，具体如下：

上游引物F1：5′-CGGAATTCGCAGTTCCCAACCGAATCTGGAA-3′，

下游引物R1：5′-CAAAACGATTCAGGTTCATTCCCTGTGTAGCCTGGCTAGCCTTACAGATTTCGCATATTATATGTGAATCACAGTGATATGTCAAGTATT-3′；

以UW4 基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

（2）获得PDH片段

设计PCR扩增用引物序列如SEQ ID NO.3~4所示，具体如下：

上游引物F2：5′-AGCCAGGCTACACAGGGAATGAACCTGAATCGTTTTG-3′，

下游引物R2：5′-CGGGATCCGCCGGTCACCGAGCAGACCAC-3′；

以UW4 基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

（3）获得同源重组片段UPD

以步骤（1）中的上游引物F1和步骤（2）中的下游引物R2为引物对，同时以步骤（1）中的UH的PCR扩增产物和步骤（2）中PDH扩增产物为模板，进行融合PCR；

（4）EcoRI和BamHI的双酶切

对步骤（3）中构建的同源重组片段UPD和pEX18Gm质粒分别进行EcoRI和BamHI双酶切，并回收酶切产物；

（5）连接构建同源重组质粒pEX18Gm-Bra20

利用T4 ligase将步骤（4）中的酶切产物进行连接；

（二）转化

将步骤（一）中所构建的重组质粒pEX18Gm-Bra20转化大肠杆菌S17-1菌株，获得转化子；

（三）共培养进行杂交，并筛选获得启动子替换后的菌株UW4 Bra20-AcdS

将步骤（二）中的转化子与正常的UW4菌株进行共培养以杂交，培养结束后挑取能够在含有庆大霉素25μg/mL的ADF液体培养基中生长的转化子，再继培养于蔗糖含量为10%的LB平板上，能够生长的转化子即是所构建的AcdS基因启动子改造菌株UW4 Bra20-AcdS。

本申请中，基于已有研究，发明人认为：凡产生AcdS的非植物病原菌都可与植物形成紧密的互惠关系，其主要原因在于，通过AcdS酶可控制和减少植物乙烯的合成，进而解除乙烯对植物生长发育的抑制作用，从而发挥植物促生作用。基于这一结论，发明人以现有典型的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)UW4为例，对其进行了改造以提升其AcdS酶活，进一步对改造后菌株对ACC趋化强度进行实验后发现，相较于原始出发菌株，改造后菌株对ACC趋化强度得到了明显增强，而这可为PGPR在植物根际趋化定殖中取得优势奠定良好基础。

总体上，发明人认为：ACC是产AcdS的PGPR在根系定殖的关键趋化物之一，也因此，ACC属于一种代谢依赖型趋化物，基于这一基础发明人对现有菌株进行了一系列改造和实验，初步实验结果表明，相关改造明显提升了PGPR对于ACC的趋化强度，进而可为PGPR在植物根际定殖以及推进PGPR菌肥在农业生产中的应用奠定一定技术基础。

附图说明

图1为上下游同源臂的PCR扩增结果，其中：M：1kb DNA ladder；1：上游同源臂；2：下游同源臂；

图2为融合片段PCR结果，其中M：1kb DNA ladder；1：融合片段；

图3为同源重组片段UPD和pEX18Gm酶切检测结果，其中：M: 1kb DNA ladder ；1:pEX18Gm；2：融合片段；

图4为 pEX18Gm和pEX18GM-Bra20凝胶电泳检测结果，其中：M: 1kb DNA ladder；1: pEX18Gm；2：pEX18GM-Bra20；

图5为E.coliS17-1转化子中pEX18GM-Bra20凝胶电泳检测结果，其中： M:1kb DNAladder；1: pEX18GM-Bra20；

图6为单交换子检测结果，其中：A: SacB；B：AcdS基因及其原有启动子；C：融合片段

M：1kb DNA ladder；1：UW4基因组；2：pEX18GM-Bra20；3-4：单交换子基因组；

图7为启动子替换后的菌株UW4 Bra20-AcdS检测结果，其中：A: SacB;B； AcdS基因及其原有启动子；C: 融合片段；M：1kb DNA ladder；1：UW4基因组；2：质粒pEX18Gm--Bra20； 3-5：双交换子；

图8为恶臭假单胞菌UW4及其突变株UW4 Bra20-AcdS 的AcdS酶活力和ACC趋化圈直径；注：WT，恶臭假单胞菌UW4；Bra20-AcdS，UW4 Bra20-AcdS。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验材料、实验仪器等情况简要介绍说明如下。

生物材料：

恶臭假单胞菌UW4（Pseudomonas putida UW4）：一种美国农业研究菌种保藏中心保藏编号为NRRL B-50193（保藏日为2008年6月9日）的、可公开获得的常用菌株（美国农业研究菌种保藏中心，英文全称Agrieultutal Research Service Culture Colleetion，简称NRRL，该中心位于伊利诺伊州皮契里亚，为一个由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心）；

本申请中所涉及的引物序列合成及相关测序工作，由华大基因公司提供完成；

转化用S17-1菌株，购自北京北纳创联生物技术研究院；

主要培养基及实验试剂：

LB液体培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，去离子水1000 mL；

LB固体培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂 20 g，去离子水1000 mL；

DF液体培养基：

FeSO₄组分：FeSO₄·7H₂O 1 g溶于100 ml超纯水中，现用现配；

微量元素组分：MnSO₄·H₂O 11.19 mg，ZnSO₄·7H₂O 124.6 mg，H₃BO₃ 10 mg，CuSO₄·5H₂O 78.22 mg，MoO₃ 10 mg，溶于100 ml超纯水，过滤除菌，-4℃保存；

各取100 µl上述FeSO₄组分和微量元素组分，加入(NH₄)₂SO₄ 2.0 g，葡萄糖2.0 g，葡糖酸2.0 g，柠檬酸2.0 g，KH₂PO₄ 4.0 g，Na₂HPO₄ 6.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，超纯水1000ml，pH 7.2，121℃灭菌30 min，即制成DF液体培养基；

ADF培养基：

将DF液体培养基中所用的(NH₄)₂SO₄去除，使用ACC作氮源（ACC不能高温灭菌，提前配制，过滤器除菌），即按3.0 mmol/L的量添加ACC到经灭菌冷却后不含 (NH₄)₂SO₄的DF液体培养基中；

TB培养基：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，超纯水1000 ml，121℃灭菌30 min；

细菌趋化缓冲液（CMB）： K₂HPO₄ 14.03g，KH₂PO₄ 5.24g，EDTA 0.0372g，超纯水1000 ml，pH 7.0；121℃灭菌30 min；

细菌趋化培养基：K₂HPO₄ 14.03 g，KH₂PO₄ 5.24 g，EDTA 0.0372g，琼脂糖2 g，超纯水1000 ml，pH 7.0；121℃灭菌30 min。

实施例

本实施例主要是以恶臭假单胞菌UW4菌株为例，通过同源重组方式将UW4中acdS基因的启动子替换为高表达启动子Bra20，从而来提升恶臭假单胞菌UW4的产AcdS的能力，具体过程包括：构建同源重组质粒、杂交重组等步骤，详细过程介绍如下。

（一）构建同源重组质粒pEX18Gm-Bra20

（1）获得上游同源臂UH片段和下游同源臂PDH片段

设计PCR扩增用引物如下：

扩增UH片段用引物

上游引物F1：5′-CGGAATTCGCAGTTCCCAACCGAATCTGGAA-3′，

扩增PDH片段用引物

上游引物F2：5′-AGCCAGGCTACACAGGGAATGAACCTGAATCGTTTTG-3′，

下游引物R2：5′-CGGGATCCGCCGGTCACCGAGCAGACCAC-3′。

以UW4 基因组DNA为模板，进行PCR扩增，分别获得上游同源臂UH片段和下游同源臂PDH片段。

PCR扩增过程中，50μL扩增体系设计如下：

UW4基因组，0.5μL；

上游引物(20mmol/L)，0.5μL；

下游引物(20mmol/L)，0.5μL；

2×pfu PCR Master Mix，25μL

ddH₂O，补足至50μL；

PCR扩增程序为：94℃、3min；94℃、30s，63℃、30s，72℃、1min，33个循环，72℃、10min。

对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，结果如图1所示，可以看出，条带清晰，可以进行后续操作。进一步割取相应位置的条带通过DNA纯化试剂盒进行DNA片段纯化，以备进行后续操作。

需要说明的是，恶臭假单胞菌UW4基因组利用细菌基因组DNA小量提取试剂盒（上海莱枫生物科技有限公司产品）参考其说明书进行提取操作，具体可参考如下。

第一，将保存的UW4菌株在LB培养基中活化培养12h左右，然后以1:100的比例在新鲜LB培养基中（加有Amp浓度为100 μg/mL）培养至OD₆₀₀=1~1.5之间（或者确定细胞浓度为1.0×10⁹个细胞/ml菌液）；

第二，将菌液5000 g离心10 min，收集2×10⁹个左右菌体；加入150µL Buffer CS，用1mL枪头吹打或Vortex震荡充分悬浮细胞；

第三，加入5µL Proteinase K和300 µL Buffer CL，用力摇晃20次左右确保混合均匀，再置于70℃水浴10 min；

第四，离心、并将上清液转入另一个干净的1.5 mL离心管中（离心目的在于去除未消化细菌，因此勿将沉淀转移到离心管内，否则会堵塞DNA吸附柱-C30中的吸附膜，进而影响DNA产量和纯度）；加入230µL无水乙醇，用力摇晃10次左右确保混合均匀；

第五，将溶液转入DNA吸附柱-C30(置于收集管)，离心1 min，然后将DNA吸附柱-C30转入另一个干净的收集管中；

第六，加入500µL Buffer WAG，离心1 min进行清洗，重复一次；

第七，最后将DNA 吸附柱-C30 转入试剂盒携带的 1.5 mL离心管中，向硅胶膜的中央加不少于40µ的LTE ，室温放置1-2min，离心1 min进行洗脱，收集洗脱液，即为提纯的DNA模板。

（2）获得同源重组片段UPD

以步骤（1）中的上游引物F1和下游引物R2为引物对，同时以步骤（1）中回收纯化后的UH的扩增产物和PDH的PCR扩增产物为模板，进行融合PCR。

融合PCR时，第一轮PCR扩增时，25μL反应体系设计如下：

上游片段，1μL

下游片段，1μL

2×pfuPCRMasterMix，12.5μL；

ddH₂O，补足体系至25μL；

PCR反应程序为：94℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、2min40s，15个循环，72℃、10min；

第一轮反应结束后直接在原来的反应体系中继续添加上游引物F1、下游引物R2各1μL，2×pfu PCR Master Mix 25μL，最后ddH₂O补足体系至100μL；

反应程序与第一轮反应程序相同，反应循环数调整为30。

对融合PCR反应产物进行电泳检测，结果如图2所示。可以看出，条带清晰，可以进行下一步实验。进一步割取正确大小的融合片段条带，通过DNA纯化试剂盒进行DNA片段纯后，溶于ddH₂O中，-20℃保存备用。

（3）EcoRI和BamHI的双酶切

对步骤（2）中通过融合PCR所构建的同源重组片段UPD和pEX18Gm质粒分别进行EcoRI和BamHI双酶切，对酶切产物进行电泳检测（结果如图3所示），然后回收酶切后目标条带备用。

酶切时，50μL双酶切体系设计如下：

EcoRI，1μL；

BamHI，1μL；

质粒pEX18Gm（或重组片段UPD），1ng；

10×NEBuffer，5μL；

ddH2O，补足体系至50μL；

酶切反应条件：37℃酶切2h。

（4）连接并转化，以构建同源重组质粒pEX18Gm-Bra20

利用T4 ligase将步骤（3）中所回收的酶切产物进行连接，并转化，以获得的含有上下游融合片段的质粒，将此重组质粒命名为pEX18GM-Bra20。

对酶切产物进行连接时，10μL连接体系设计如下：

线性质粒pEX18GM，4μL；

融合片段，1μL；

T4 ligase，1μL；

5×T4 ligase Buffer，4μL；

16℃连接16h。

将连接产物进一步转化大肠杆菌感受态细胞，并进行筛选，具体操作参考如下：

将连接产物加入50μL的 E.coli. DH5α感受态细胞中，混合均匀后冰浴30min，热激1min后继续冰浴2min；

冰浴结束后加入1mL 的LB液体培养基于恒温摇床37℃、220rpm复苏1h；

然后将产物涂布于含有Amp抗性的LB平板上，37℃恒温培养箱静置培养12h左右；

进一步挑选阳性质粒涂布于Gm浓度为50ug/mL 的抗性LB平板上，37℃恒温培养箱静置培养14h；

挑取阳性转化子于含有50ug/mL的Gm抗性LB液体培养基中，37℃、220rpm培养12h，提取质粒后进行凝胶电泳检测分析。结果如图4所示，图中，相对于阴性对照质粒较为滞后的为阳性质粒，也即，重组的含有上下游融合片段的质粒，将此重组质粒命名为pEX18GM-Bra20。

（二）转化

为便于后续杂交操作，将步骤（一）中所构建的重组质粒pEX18Gm-Bra20转化大肠杆菌S17-1菌株，进一步扩增后，提取获得转化子质粒，备用。

具体转化时，采用热激法，参考步骤（一）中转化操作即可。

转化成功后对转化子进行电泳检测验证，结果如图5所示，并与步骤（一）中进行比对，确保转化子质粒构建正确。

将步骤（二）中含有转化子的大肠杆菌S17-1菌株与正常的UW4菌株进行共培养以杂交，培养结束后挑取能够在含有庆大霉素25μg/mL的ADF液体培养基中生长的转化子，再继培养于蔗糖含量为10%的LB平板上，能够生长的转化子即是所构建的AcdS基因启动子改造菌株UW4 Bra20-AcdS。具体操作过程参考如下。

（3.1）单交换子

（1）将转化后验证正确的E.coli S17-1菌株与UW4分别在30℃、220rpm条件下培养过夜；（E.coli S17-1菌株用培养基为含有50ug/mL的Gm抗性LB液体培养基；培养UW4菌株用培养基是ADF培养基）

（2）收集步骤（1）中E.coli S17-1菌株培养液1 mL于离心管中，12000rpm离心1min，弃上清，收集菌体；然后用500μL、0.85%的NaCl溶液重悬菌体，12000rpm离心1 min后弃上清；

（3）在步骤（2）的离心管中加入1.5mL恶臭假单胞菌菌液，12000rpm离心1 min后弃上清；

再用500μL、0.85%的NaCl溶液重悬菌体，并12000rpm离心1 min后弃上清，重复操作5次；

（4）用75μL、0.85%的NaCl溶液重悬菌体后，将该菌液滴加在硝酸纤维素膜上于LB培养基上30℃培养24h；

（5）培养结束后用750μL、0.85%的NaCl溶液将菌体从硝酸纤维素膜冲洗下来，取50μL重悬后的菌液涂布于含氨苄100ug/mL和庆大霉素25ug/mL的LB固体平板上，30℃静置培养12h。

培养结束后挑取基因组重组后菌株于含有庆大霉素25ug/mL的ADF液体培养基中30℃、220rpm培养24h，对在含抗性的ADF培养基中能够生长的菌株提取基因组，然后对其中的SacB、上下游融合片段、AcdS基因及其原有启动子进行PCR扩增验证，三种基因验证均呈现阳性的即为单交换子菌株，也即目的菌株，可用于后续实验进行二次交换。

验证SacB基因时，PCR验证用引物序列为：

SacB上游引物F3，5’-CGGGAGTCAGTGAACAGATACC-3’，

SacB下游引物R3，5’-CGAAAGAAACGAACCAAAAGCC-3’；

25μL扩增体系为：

基因组，1μL；

SacB上游引物F3，0.5μL；

SacB下游引物R3，0.5μL；

2×TaqPCR Master Mix，12.5μL；

ddH₂O，补足体系至25μL；

PCR反应程序为：94℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，33个循环，72℃、10min。

验证上下游融合片段（重组片段UPD）时，采用菌液PCR验证方式，25μL扩增体系为：

菌液，2μL；

上游引物F1(20mmol/L)，0.5μL；

下游引物R2(20mmol/L)，0.5μL；

2×Taq PCRMaster Mix，25μL；

ddH₂O，补足体系至25μL；

PCR反应程序为：94℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min20s，33个循环，72℃、10min。

验证AcdS基因及其原有启动子使用的引物时，PCR验证用引物序列为：

上游引物F4，5’- GTACGGAATAAAGCATCTATTAATTG-3’，

R4，5’- CCGAAAGCAAGGCATCACGCCATTCGGCG-3’；

25μL扩增体系为：

基因组，1μL；

上游引物F4，0.5μL；

下游引物R4，0.5μL；

2×TaqPCR Master Mix，12.5μL；

ddH₂O，补足体系至25μL；

PCR反应程序为：94℃、3min；94℃、30s，65℃、30s，72℃、2min10s，33个循环，72℃、10min。

对PCR扩增产物进行电泳检测，部分结果如图6所示。需要明确的是，若PCR均为阳性则可确定该菌株为单交换子结果。

（3.2）双交换子

在步骤（3.1）过程中，可以明确单交换后SacB基因已经整合到基因组中，而SacB基因在蔗糖存在的情况下能够分解蔗糖而产生一种毒素进而使细胞死亡，利用这一特性进一步进行双交换子的筛选。具体过程简介如下。

将步骤（3.1）中所筛选的单交换子于LB培养基中，30℃、220 rpm培养5 h后取100μL培养液涂布于蔗糖含量为10%的LB平板上，30℃恒温静置培养24 h。

进一步挑取单菌落，于LB液体培养基中30℃、220rpm培养12h后提取基因组，分别对上下游融合片段、SacB基因及AcdS基因及其原有启动子进行PCR扩增验证（具体操作参考（3.1）相关操作）。

部分PCR扩增产物电泳结果如图7所示。依据电泳结果，若上下游融合片段扩增条阳性，但SacB基因和AcdS基因及其原有启动子扩增为阴性，则为二次交换子，即目的菌株，也即为：启动子替换后的菌株UW4 Bra20-AcdS。

实验检测

进一步地，发明人对原始UW4菌株和改造后UW4 Bra20-AcdS菌株的产AcdS酶情况进行了测定。

AcdS酶活力测定方法如下：

将菌株UW4和UW4 Bra20-AcdS分别在LB培养基（添加ACC，浓度为3.0 mmol/L）中30℃培养10 h；

4℃离心收集菌体，用0.1 mol/L Tris-HCL缓冲液(pH =7.6)洗涤3次，然后重悬浮于600 µL 的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)中，再加入30 µL甲苯并迅速振荡30 s以破碎细胞，随后转移200 µL含甲苯的细胞提取物至新的离心管中，并加入20 µL的 0.5mol/L ACC混匀，同时设置不添加ACC的空白对照；30℃条件下温育15 min；

添加1 mL 的0.56 mol/L HCl，16000 g离心5 min；

取1mL上清液，加入800 µL 的0.56 mol/L HCl和300 µL的 2,4-二硝基苯肼，30℃条件下温育30 min；

加入2 mL 的2 mol/L NaOH，540 nm测吸光度。

蛋白质测定采用BioRad蛋白质微量测定法，以牛血清白蛋白为蛋白质标准。

ACC脱氨酶活力单位定义为：在30℃条件下，每分钟反应产生1 μmol l α-丁酮酸的酶量为1个单位。

具体的AcdS酶活力测定结果如图8（左图）所示。分析可以看出，改造后UW4 Bra20-AcdS菌株酶活力比UW4提高了28.9%。

实施例2

在实施例所构建的UW4 Bra20-AcdS菌株基础上，发明人采用游动平板法对其趋化情况做了进一步实验评价，具体实验情况简要介绍如下。

将改造后菌株UW4 Bra20-AcdS（以原始菌株UW4作为对照，同样操作）在LB培养基平板上28℃培养2 d；

挑取单菌落接入10 ml TB液体培养基中，于28℃、150 rpm条件下培养过夜；

取1 ml菌液于8000 rpm、4℃条件下离心5 min，弃上清，用1 ml无菌超纯水冲洗2次，最后悬浮于1 ml超纯水中；

取1 ml接种于入250 ml LB培养基（含0.3 mM ACC）中，在28℃、150 rpm条件下培养至OD₆₀₀=1左右；

取上述培养好的菌悬液250 ml于8000 rpm离心5 min，去上清；

使用4℃预冷的趋化缓冲液20 ml冲洗2次，最后悬浮于200 ml细菌趋化培养基（含0.3 mM ACC）中；每平板加入15 ml该趋化培养基，30℃培养时间24 h观察趋化现象并拍照。

趋化响应强度结果如图8（右图）所示。分析可以看出，改造后UW4 Bra20-AcdS菌株的趋化圈直径比原始菌株UW4提高34.3%。

综上结果可以看出，通过启动子的替换，进一步提高了AcdS基因的表达效率，进一步提高了AcdS酶的活力，进而提高了对ACC的趋化响应强度，而这种提高可为菌株在植物根际的定殖量的改善和促生效果的提高奠定良好基础。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 一种改善PGPR产AcdS能力的改造方法

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 1

cggaattcgc agttcccaac cgaatctgga a 31

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 2

caaaacgatt caggttcatt ccctgtgtag cctggctagc cttacagatt tcgcatatta 60

tatgtgaatc acagtgatat gtcaagtatt 90

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 3

agccaggcta cacagggaat gaacctgaat cgttttg 37

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 4

cgggatccgc cggtcaccga gcagaccac 29

Claims

1.一种改善PGPR产AcdS能力的改造方法，其特征在于，该方法通过同源重组替换启动子来提高PGPR菌的AcdS基因的表达量、AcdS酶活力和ACC代谢速率，进而提高PGPR菌对ACC的趋化强度，

所述PGPR菌为恶臭假单胞菌；

所述恶臭假单胞菌具体为恶臭假单胞菌UW4菌株；所述启动子为启动子Bra20；

具体操作步骤为：

（一）构建同源重组质粒pEX18Gm-Bra20

所构建的同源重组质粒pEX18Gm-Bra20由同源重组片段UPD与质粒pEX18Gm连接而成，其中同源重组片段UPD由二个DNA片段组成，一个是上游同源臂UH，另一片段PDH是下游同源臂DH和启动子Bra20连接在一起的片段；具体步骤为：

（1）获得上游同源臂UH片段

设计PCR扩增用引物，引物序列如SEQ ID NO.1~2所示，具体为：

上游引物F1：5′-CGGAATTCGCAGTTCCCAACCGAATCTGGAA-3′，

以UW4 基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

（2）获得PDH片段

设计PCR扩增用引物如SEQ ID NO.3~4所示，具体为：

上游引物F2：5′-AGCCAGGCTACACAGGGAATGAACCTGAATCGTTTTG-3′，

下游引物R2：5′-CGGGATCCGCCGGTCACCGAGCAGACCAC-3′；

以UW4 基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

（3）获得同源重组片段UPD

（4）EcoRI和BamHI的双酶切

（5）连接构建同源重组质粒pEX18Gm-Bra20

利用T4 ligase将步骤（4）中的酶切产物进行连接；

（二）转化

将步骤（一）中所构建的重组质粒pEX18Gm-Bra20转化大肠杆菌，获得转化子；

将步骤（二）中的转化子与正常的UW4菌株进行共培养以杂交，筛选获得AcdS基因启动子改造后的菌株。

2.如权利要求1所述改善PGPR产AcdS能力的改造方法，其特征在于，步骤（二）中，所述大肠杆菌采用大肠杆菌S17-1菌株。

3.如权利要求1所述改善PGPR产AcdS能力的改造方法，其特征在于，步骤（三）中，所述筛选，具体方式为：先筛选能够在含有庆大霉素的ADF液体培养基中生长的单交换的转化子，再对筛选所得单交换子利用含有蔗糖的LB平板进行双交换子的筛选。